Биологически активный комплекс, обладающий противоаллергическим действием

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой комплекс биологически активных веществ для лечения аллергических заболеваний различного генеза, характеризующийся тем, что он выделен из печени рыб тресковых пород последовательным фракционированием от балластных липидов экстракцией двухфазным экстрагентом на основе масла и воды, центрифугированием и ультрафильтрацией или диафильтрацией через материал с пределом разделения 25 кДа и включает пептиды 30-55%, аминокислоты 40-65%, углеводы 2-8%, микро и макроэлементы 2-13%. Изобретение обеспечивает расширение спектра лекарственных средств. 8 пр., 3 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматовенерологии и аллергологии, и может быть использовано для лечения острых и хронических аллергических заболеваний различного генеза.

Заболевания аллергического характера, связанные с извращением иммунного ответа, становятся сегодня социальной проблемой. В разных странах и отдельных регионах аллергические проявления регистрируются с частотой от 1 до 50% и более. В среднем, по данным ВОЗ, аллергические болезни охватывают около 10% населения. В структуре аллергических заболеваний первое место занимают различные формы кожных аллергий - до 66%.

Для лечения аллергических заболеваний используют различные фармакотерапевтические средства, которые можно разделить на следующие группы: средства, подавляющие аллергическое воспаление (глюкокортикостероиды, кромоны), антимедиаторные средства (антигистаминные, антилейкотриеновые) и средства, препятствующие развитию патофизиологических эффектов (деконгестанты, бронхолитики, отхаркивающие).

Глюкокортикоиды являются во многих случаях весьма ценными терапевтическими средствами. Однако они вызывают ряд побочных эффектов, в том числе замедление процесса регенерации тканей с возможным образованием распространенных язв, появление отеков, задерживание синтеза и ускорение процесса распада белка. В связи с побочными эффектами глюкокортикоидные препараты применяются только при наличии четких показаний и под тщательным врачебным контролем, что резко ограничивает возможность их применения в составе безрецептурных средств.

В аллергологической и дерматологической практике наиболее изученными являются антигистаминные препараты, блокирующие H₁-рецепторы гистамина, первого поколения, которые зарекомендовали себя как универсальные и безопасные средства [Лусс Л.В. Выбор антигистаминных препаратов в лечении аллергических и псевдоаллергических реакций // Рос. аллергологический журнал. - 2009. - №1. - С.1-7.]. Препараты этой группы уменьшают реакцию организма на гистамин, предупреждают развитие и облегчают течение аллергических реакций. Наряду с противогистаминным действием, препараты этой группы обладают и другими фармакологическими свойствами. Некоторые из них оказывают седативное действие, что ограничивает в ряде случаев возможность их применения в амбулаторных условиях у больных, профессия которых требует быстрой психической или физической реакции.

За рубежом разработан и успешно применяется в клинической практике целый арсенал препаратов на основе комплекса биологически активных веществ, получаемых из экстрактов, вытяжек и лизатов органов и тканей животных (раверон, румалон, солкосерил, церебролизин и т.д.). В нашей стране выпуск подобных препаратов еще только осваивается, причем для получения препаратов из животного сырья используют экстракцию измельченных органов убойного скота. Однако получаемые таким способом препараты содержат значительное количество высокомолекулярных белковых примесей, обусловливающих их высокую реактогенность.

Мировой и отечественный опыт фармации свидетельствует об огромном потенциале морских гидробионтов как сырьевых источников для создания оригинальных фармацевтических субстанций и лекарственных средств. В отличие от показателей видового обилия, филогенетическое (макротаксономическое) разнообразие в море гораздо выше. По-видимому, благодаря адаптации к разнообразным факторам окружающей среды ряд морских животных и растений выработал способность к продукции уникальных вторичных метаболитов, многие из которых обладают высокой фармакологической активностью (Bhakuni D.S., Rawat D.S. Bioactive marine natural products: Anamaya Publishers, New Delhi, India. 2005. 382 p.). Биологически активные вещества морского происхождения могут использоваться в качестве фармацевтических субстанций и служить синтонами для получения лекарств с новыми или улучшенными фармакологическими характеристиками. Эти вещества являются вторичными метаболитами, то есть природными соединениями, не имеющими всеобщего распространения и присутствующими только у представителей отдельных таксонов.

Одним из основных компонентов системы внутренних органов, богатых высококачественными протеинами, является печень. Содержание протеинов в печени, в зависимости от вида рыб, может достигать 20% (Bechtel et al. Chemical characterization of liver lipid and protein from cold-water fish species. J. Food Sci., 2006, 71 (6), 480-485). Печень различных рыб может служить источником большого количества, как низкомолекулярных веществ, так и целого набора пептидов, которые можно применять для получения лекарственных средств.

В качестве прототипа выбрано средство в виде геля, обладающего противовоспалительным, иммунотропным, противоаллергическим и ранозаживляющим действием, содержащим пептиды, ассоциированные с фосфолипидами из печени тресковых (Пат. RU 2457864 C1, опубл. 10.08.2012).

Недостатком данного средства являются то, что входящие в его состав ассоциированные фосфолипиды, не стабилизированные антиоксидантами, будут способствовать порче готовой продукции, а также узость применения - гель для наружного применения.

Целью изобретения является расширение спектра лекарственных средств, применяемых в дерматовенерологии и аллергологии.

Сущность изобретения состоит в использовании нового комплексного препарата, содержащего пептиды и такие биологически активные компоненты - аминокислоты, углеводы, микроэлементы для лечения аллергических заболеваний различного генеза, обладающего антигистаминных действием и не имеющим седативного эффекта. Весь перечисленный комплекс веществ в составе препарата представлен природными биологически активными веществами, выделенными из печени рыб тресковых пород. Печень экстрагируют от балластных липидов экстракцией двухфазным экстрагентом на основе масла и воды, водный экстракт отделяют центрифугированием и выделяют целевой продукт путем ультрафильтрации или диафильтрации через материал с пределом разделения 25 кДа и последующего высушивания.

Комплекс биологически активных веществ, выделенных из печени тресковых, содержит природные биологически активные вещества в следующих количествах (масс.% от сухого вещества):

- пептиды 30-55,

- аминокислоты 40-65,

- углеводы 2-8,

- микро и макроэлементы 2-13.

Комплекс биологически активных веществ, входящих в состав препарата, обеспечивает его высокую эффективность: пептиды выполняют роль биорегуляторов, аминокислоты стимулируют метаболические процессы, являясь пластическим материалом для синтеза белка, углеводы, основным компонентом которых является гиалуроновая кислота, обладают иммуномодулирующими свойствами, а макро и микроэлементы усиливают антиоксидантные свойства и активность.

Существенными отличиям комплексного препарата от прототипа является следующее:

1) комплекс представлен биологически активными веществами, выделенными из природного сырья оригинальным методом;

2) за исключением пептидов, все остальные ингредиенты не повторяют состав прототипа;

3) комплекс может быть использован для приготовления других лекарственных форм - растворов для ингаляционного и парентерального применения.

Преимущества перед прототипом состоят в следующем:

1) комплекс более стабилен вследствие отсутствия фосфолипидов, легко подверженных окислению:

2) комплекс может быть использован для приготовления раствора для ингаляционного применения и парентерального введения, которые обладает большей биологической доступностью;

3) комплекс природных веществ является сбалансированным и обеспечивающим синергизм их действия;

4) комплекс имеет направленное действие и предназначен для терапии аллергических заболеваний.

Технический результат изобретения заключается в получении безопасного средства в виде различных готовых лекарственных форм с выраженным терапевтическим эффектом для лечения аллергических реакций различного генеза.

В качестве противоаллергического средства комплекс биологически активных веществ, полученных из печени тресковых, можно использовать для профилактики и лечения различных заболеваний, таких как бронхиальная астма, аллергический бронхит, аллергический ринит, поллиноз, атопический дерматит, аллергический конъюнктивит, крапивница.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно - «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Возможность реализации заявляемого изобретения показана, но не ограничена, в примерах конкретного выполнения.

Пример 1. Раствор для ингаляционного применения (в г на 100 г).

Биологически активный комплекс - 0,01

Консерванты - q.s.

Вода для инъекций - до 100

Пример 2. Раствор для парентерального применения (в г на 100 г).

Биологически активный комплекс - 0,1

Хлорид натрия - 0,7

Консерванты - q.s.

Вода для инъекций - до 100

Пример 3. Гель для наружного применения (в г на 100 г).

Биологически активный комплекс - 0,02

Гидроксиэтилцеллюлоза - 0,65

Триэтаноламин - 0,55

Полиэтиленгликоль - 12,00

Консерванты - q.s.

Вода очищенная - до 100

Биологически активный комплекс из печени тресковых при местном применении обеспечивает транспортировку биологически активных пептидов в глубокие слои дермы без дополнительного использования транспортных структур типа липосом, наносом или микрокапсул.

При нанесении на кожу препарат в виде геля длительное время остается на ее поверхности, с одной стороны, образуя защитную пленку, с другой - депо, из которого активные ингредиенты постепенно поступают в кожу. Пленка создает эффект окклюзии, улучшая гидратацию кожи и повышая проницаемость рогового слоя для активных компонентов.

Пример 4. Исследование токсичности

При исследовании острой токсичности препаратов, приготовленных по примерам 1-3, на мышах и крысах при внутримышечном, внутривенном, эндотрахеальном и местном путях введения, установить значения ЛД₅₀ оказалось невозможным, ввиду отсутствия гибели животных. По степени воздействия на организм комплекс биологически активных веществ из печени тресковых относится к 4 классу опасности согласно ГОСТ 12.1.007 (вещества малоопасные). В рекомендуемых дозах не оказывает местно-раздражающего, эмбриотоксического и канцерогенного действия.

Пример 5. Противоаллергическое действие на модели экспериментального контактного аллергического дерматита на беспородных мышах-самцах.

В качестве аллергена использовали 1-хлор-2,4-динитробензол (ДНХБ, Sigma, США) в 95% этиловом спирте. На 1-е, 7 и 13 сутки эксперимента мышей сенсибилизировали путем однократного нанесения 100 мкл 2% раствора ДНХБ на выбритые участки спины. На 17-е сутки эксперимента дважды с интервалом 1 ч животным наносили разрешающую дозу аллергена 20 мкл 2% раствора ДНХБ на наружную и внутреннюю поверхности «опытного» уха. На 20 сутки эксперимента животных эвтаназировали в CO₂-камере и производили забор крови из сердца для оценки IgE методом твердофазного иммуноферментного анализа. «Опытное» ухо забиралось для гистологической оценки поражения и расчета индекса реакции (ИР) по формуле $$ИР=\frac{Моп-Мк}{Мк}\times 100\%$$ ,

где М_оп и М_к - масса «опытного» и «контрольного» уха, соответственно.

Лечебный эффект препаратов оценивали после развития аллергической реакции, т.е. после стадии разрешения. С этой целью лечение препаратами проводили с 7-х суток и последующие 12 суток эксперимента.

Средство по примеру 3 вводили внутримышечно в дозе 2 мг/кг и 8 мг/кг. В качестве препарата сравнения использовали Супрастин, раствор для инъекций. Супрастин вводили внутримышечно в дозе 22 мг/кг. Данные по оценке противоаллергического действия на модели контактного дерматита приведены в таблице 1.

Таблица 1
Оценка противоаллергического действия на модели контактного дерматита (М±m, N=10)
№ группы	Группа	Доза, мг/кг	Индекс реакции, %	Уровень IgE в сыворотке крови, нг/мл
1.	Интактная	-	7,2±1,8	1325±275
2.	Контроль	-	51,6±8,0*	2425±350*
3.	Плацебо	-	49,5±10,0*	1800±200
4.	Средство по пр.4	0,004	34,8±7,8* **	2250±250*
5.	0,008	21,8±7,5* **	925±200**
6.	Супрастин	22,0	11,4±8,4**	750±350**
* различия статистически значимы по сравнению с интактными животными по критерию Стьюдента, при p<0,05;
** - различия статистически значимы по сравнению с контрольными животными по критерию Стьюдента, при

В результате исследования установлено, что средство, содержащее биологически активный комплекс из печени тресковых имеет дозозависимый противоаллергический эффект - статистически значимое снижение ИР и концентрации IgE по сравнению с контрольным животными.

Пример 6. Седативное действие Седативное действие оценивали в тесте «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт» с учетом ориентировочно-исследовательского эмоционального, стереотипного и двигательного компонентов по поведенческому атласу для грызунов [Пошивалов, В.П. Фармакоэтология (сборник статей) - СПб: Изд. СПГМУ, 1997. - 140 с]. Исследование проведено на 60 аутбредных крысах, массой 180-220 г (Питомник лабораторных животных РАМН «Рапполово», Ленинградская область). Биологически активный комплекс вводили внутрижелудочно через атравматичный зонд в широком диапазоне доз от 10000 до 60000 мг/кг. Препарат для введения растворяли в воде. В качестве контроля использовали воду.

При тестировании в «открытом поле» и «приподнятом крестообразном лабиринте» животные после однократного внутрижелудочного введения исследуемого биологически активного комплекса из печени тресковых демонстрировали преимущественно уравновешенный тип поведения, с умеренной локомоторной и поисковой активностью без проявления признаков тревожности. Биологически активный комплекс из печени тресковых хорошо растворим в воде и не растворяется в липофильных растворителях. Таким образом, не обладая липофильностью, он не проникает через гематоэнцефалический барьер и не блокируют H₁-гистаминовые рецепторы головного мозга, а также центральные серотониновые и м-холинорецепторы, т.е. не обладает седативным действием, характерным для антигистаминных препаратов 1-го поколения.

Пример 7. Влияние средства на чувствительность H₁-гистаминовых рецепторов in situ.

Способность средства связываться с Н1-гистаминовыми рецепторами оценивали методом гистамин-индуцированного сокращения подвздошной кишки морской свинки.

Эксперименты с изолированными тканями позволяют получать полноценные и точные данные о направленности и механизме действия тех или иных медиаторов непосредственно на рецепторный аппарат тканей и органов.

Подвздошную кишку извлекали из брюшной полости наркотизированных животных и помещали в емкость с охлажденным до +4°C буфером Кребса-Хенселейта. Затем подвздошную кишку разрезали на фрагменты около 1 см длиной, фрагменты закрепляли в проточных камерах и перфузировали оксигенированным буфером Кребса-Хенселейта при температуре +30°C в течение 60 минут, после этого проточные камеры заполняли 80 мM KCl, что вызывало сильное сокращение сегментов кишки. Полученные результаты в дальнейшем принимались за 100% сокращения.

Возобновляли перфузию оксигенированным буфером Кребса-Хенселейта при температуре +30°C для отмывки тканей и восстановления их способности к сокращению. Через 60 минут отмывки проводили перфузию раствором средства в буфере Кребса-Хенселейта. В качестве препарата сравнения использовали пириламина малеат (0,005 мкг/мл). После тридцатиминутного инкубационного периода, растворы сливали, а проточные камеры заполняли водным раствором гистамина (10^-6 М). В течение 10 минут осуществляли регистрацию силы сокращения, оценивали амплитуду и время наступления максимального ответа (Таблица 2).

Таблица 2
Амплитуда гистамин-индуцированного сокращения и время наступления максимального ответа (Me±Q, N=8)
Группа	Концентрация	Показатели
Амплитуда (% от 80 мМ KCl)	Время (долей от 80 мМ KCl)
Гистамин	10-6 М	100,8±10,3	1,0±0,2
Пириламина малеат	0,005 мкг/мл	5,7±4,8*	57,4±17,1*
	4 мкг/мл	101,6±7,6**	1,0±0,1**
8 мкг/мл	94,5±5,2**	2,7±0,8* **
Средство по пр.2	16 мкг/мл	54,5±7,6* **	15,5±3,0* **
	32 мкг/мл	40,8±13,6***	26,3±4,2* **
	64 мкг/мл	25,0±9,1* **	36,9±6,0* **
128 мкг/мл	6,5±4,5*	56,5±15,0*
Примечание: * статистически значимое отличие от показателей контрольной группы (гистамин), при p<0,05
** статистически значимое отличие от показателей группы пириламина малеата, при p<0,05

Установлено, что средство по примеру 2 дозозависимо блокировало Н₁-гистаминовые рецепторы сарколеммы гладких мышц подвздошной кишки. Эффективная доза (ЭД₅₀) составила 24,73 мкг/мл. Таким образом, средство является эффективным блокатором H₁-гистаминовых рецепторов.

Пример 8. Противоаллергическое действие на модели аллергической бронхиальной астмы у морских свинок.

Сенсибилизация проводилась путем однократного интраперитонеального введения овальбумина 100 мкг/мл в 0,5 мл физиологического раствора, содержащего 100 мг/мл Al(ОН)₃. Провокация гиперреактивности дыхательных путей производилась в течение 3 последовательных дней 44-46 путем ингаляции раствора овальбумина с возрастающей концентрацией 0,1; 0,3 и 0,5 мг/мл с помощью ингалятора ультразвукового «Муссон 2» - 03 (Kinematica, Швейцария). Ингаляция проводилась в течение 5 минут или до появления признаков асфиксии (чихание, кашель, падение на бок). На 47-й день проводилась разрешающая ингаляция раствора овальбумина с концентрацией 1 мг/мл.

Введение исследуемого средства по примеру 2, препаратов сравнения и плацебо началось через 3 недели после сенсибилизации и закончилось за день до ингаляции разрешающей дозы овальбумина. В ходе эксперимента исследовались количество лейкоцитов и формула крови и гистологические изменения легочной ткани (Табл.3).

Таблица 3
Оценка результатов гистологического исследования легких морских свинок на модели экспериментальной бронхиальной астмы (n=6)
Группа	Доза, мг/кг	Количество слизистых пробок в просветах бронхов (на 3 бронха у морской свинки), Ме(Q1; Q2)	Количество эозинофилов в стенке бронха на 1 мм, M±m	Количество бокаловидных клеток на 1 мм слизистой бронха, M±m
Нет пробок	Пробки заполняют < ½ просвета	Пробки заполняют > ½ просвета
Интактные	-	3 (3; 3)	0 (0; 0)	0 (0; 0)	0,3±0,3	13,2±1,2
Контроль	-	0 (0; 1)*	1(1; 2)*	2(1; 2)*	32,2±1,4*	40,3±1,1*
Кромогексал	6,9	1 (1; 1)*	1,5 (1; 2)*	0(0; 1)**	11,3±0,8* **	28,7±1,3* **
Дексаметазон	0,7	2 (1; 3)* **	1 (0; 1)*	0 (0; 0)**	15,7±1,4* **к	29,8±1,3* **
Ср-во по пр.2	0,5	1 (0; 1)*	1 (1; 2)*	1 (1;1 )*	19,7±1,2* **к	32,8±1,1* **
Ср-во по пр.2	1,0	1 (1; 2)*	1 (1; 2)*	0,5 (0; 1)	18,0±1,1* **к	31,2±1,6* **
Ср-во по пр.2	2,0	1,5 (1; 2)* **	1 (1; 1)*	0,5 (0; 1)**	19,2±0,9* **к	30,7±1,2* **
Примечание: * - различия статистически значимы согласно критериям Манна-Уитни и Стьюдента по сравнению с интактной группой, при (р<0,05)
*- различия статистически значимы согласно критериям Манна-Уитни и Стьюдента по сравнению с группой контроль, при (р<0,05);
к - различия статистически значимы согласно критерию Стьюдента по сравнению с группой кромогексал, при (р<0,05).

Было установлено, что средство, приготовленное по примеру 2 во всех исследуемых дозах 0,5; 1,0 и 2,0 мг/кг обладает противоаллергическим действием ввиду его способности снижать количество главных эффекторных клеток аллергического воспаления - эозинофилов, а также количество слизистых пробок в просветах бронхов.

Таким образом, в результате проведенных испытаний средства, содержащего комплекс биологически активных веществ из печени тресковых установлено, что препарат является перспективным в терапии аллергических заболеваний различного генеза: наряду с высокой эффективностью обладает хорошей переносимостью и безопасностью и не обладает седативным действием.

Комплекс биологически активных веществ для лечения аллергических заболеваний различного генеза, характеризующийся тем, что он выделен из печени рыб тресковых пород последовательным фракционированием от балластных липидов экстракцией двухфазным экстрагентом на основе масла и воды, центрифугированием и ультрафильтрацией или диафильтрацией через материал с пределом разделения 25 кДа и включает пептиды 30-55%, аминокислоты 40-65%, углеводы 2-8%, микро- и макроэлементы 2-13%.