Способ получения ингибитора гликозидаз
Владельцы патента RU 2495930:
Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых ароматизаторов, кислот и красителей Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИПАКК Россельхозакадемии) (RU)
Проводят ферментацию питательной среды на основе гидролизатов кукурузного крахмала актиномицетом. Проводят ультрафильтрацию полученного фильтрата культуральной жидкости с активностью 4250±250 ИЕ/см3 через мембраны с отсечением 5 кДа. Концентрируют под вакуумом 0,082 МПА при температуре 25-30°C полученный фильтрат. Осветляют его при температуре 30-40°C. Снова проводят его ультрафильтрацию через мембрану с отсечением 1 кДа. Полученный ингибитор гликозидаз сушат и измельчают. Изобретение позволяет получить ингибитор гликозидаз с повышенной активностью 3500000±50000. 1 табл., 4 пр.
Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно пищевой биотехнологии, и касается способа получения ингибитора гликозидаз, предназначенного для использования в качестве биологически активной и пищевой добавки специального назначения в функциональных продуктах диетического направления
Известен способ получения ингибитора гликозидаз углеводной природы из культуральной жидкости с активностью 3000±200 ИЕ/см3 или 6500±500 ИЕ/см3, полученной при использовании актиномицетов (Streptomyces BKM Ac 1328-D и Streptomyces 839/64), включающий подкисление культуральной жидкости до рН 3,6±0,1 ед., центрифугирование, ультрафильтрацию через ацетилцеллюлозную мембрану УАМ-300 (полые волокна) при давлении 2,5-3,0 атм, депигментацию на анионите, лиофилизацию, позволяющий получать препарат ингибитора с активностью 130±100 и 250±200 ИЕ/мг (Акулова Н.Ю. Ингибиторы α-глюкозидаз из Streptomyces. Выделение и свойства: автореф. дисс. … канд. биол. наук: 03.00.04; АООТ «НИИТИАФ». - СПб., 1993. - 20 с.).
Однако процессы подготовки ионитов и их регенерации, основанные на использовании, в частности, кислот и щелочей, являются трудоемкими и сопровождаются большим количеством отходов.
Наиболее близким предлагаемому изобретению является способ получения ингибитора гликозидаз из фильтрата культуральной жидкости, полученной при ферментации гидролизатов кукурузного крахмала актиномицетом (Streptomyces lucensis ВКПМ Ac-1734) и имеющей ингибиторную активность 3700±180 ИЕ/см3, включающий очистку фильтрата культуральной жидкости с содержанием белка 5,0±0,2 г/дм3, редуцирующих сахаров 6,0±0,3 г/дм3, цветностью 8,2±0,4 е.о.п. посредством ультрафильтрации на фильтрационном аппарате ВПУ-15ПА, оснащенном мембраной с отсечением 15 кДа (полые волокна), при температуре 20°С, концентрирование фильтрата при температуре 90°С, осветление при температуре 25°С, сушку при температуре 55±2°С и измельчение (Ходкевич О.А. Разработка технологии биосинтеза ингибитора α-гликозидаз актиномицетами рода Streptomyces и применение комплексной пищевой добавки на его основе в хлебопечении: автореф. дисс. … канд. техн. наук: 05.18.07; ГУ ВНИИПАКК, ГОУ ВПО «СПб ГУ НиПТ». - СПб., 2009. - 16 с.).
Известный способ позволяет получать препарат ингибитора гликозидаз с активностью 700000±1000 ИЕ/г. Однако ультрафильтрация через мембрану с отсечением 15 кДа не позволяет полностью отделить балластные белковые примеси, которые при высокой температуре в процессе последующего концентрирования денатурируют и осложняют процесс осветления. Кроме того, в результате концентрирования при высокой температуре цветность концентрата увеличивается не только за счет концентрирования окрашенных примесей, но и за счет карамелизации редуцирующих сахаров, что также снижает эффективность осветления. Указанная в способе последовательность стадий «концентрирование → осветление» не позволяет снизить содержание белка, который является примесью и мешает ингибиторному действию выделенного препарата.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение ингибитора гликозидаз с повышенной активностью.
Технический результат предлагаемого изобретения достигается способом получения ингибитора гликозидаз из фильтрата культуральной жидкости, полученной при ферментации питательной среды на основе гидролизатов кукурузного крахмала актиномицетом, включающим ультрафильтрацию фильтрата культуральной жидкости, осветление и последующую сушку и измельчение, в котором согласно изобретению фильтрат культуральной жидкости используют с активностью 4250±250 ИЕ/см3, ультрафильтрацию проводят через мембраны с отсечением 5 кДа, осветление ультрафильтрата осуществляют непосредственно после ультрафильтрации при температуре 30-40°С, затем проводят концентрирование под вакуумом 0,082 МПа при температуре 25-30°С и ультрафильтрацию через мембрану с отсечением 1 кДа.
Сведения, подтверждающие возможность достижения технического результата предлагаемого изобретения, представлены в примерах.
В примерах используют фильтрат культуральной жидкости, который получают ферментацией среды на основе гидролизата кукурузного крахмала актиномицетом Streptomyces lucensis ВКПМ Ac-1734 или Streptomyces violaceus ВКПМ Ac-1743 и фильтрованием культуральной жидкости.
Фильтрат культуральной жидкости представляет собой жидкость, значение ингибиторной активности в которой составляет 4100-4500 ИЕ/см3, содержание белка 2-6 г/дм3, содержание редуцирующих сахаров 5-10 г/дм3 оптическая плотность D при λmax 360 нм равна 8,1-11,3 е.о.п., характеризующая цветность раствора.
Пример 1
Используют фильтрат культуральной жидкости с ингибиторной активностью 4100 ИЕ/см3, содержанием белка 2 г/дм3, содержанием редуцирующих сахаров 5 г/дм3, D при λmax 360 нм равно 8,1 е.о.п.
Фильтрат культуральной жидкости в количестве 1000 см3 очищают ультрафильтрацией через мембрану с отсечением 5 кДа и получают раствор объемом 0,9 дм3. Ультрафильтрат осветляют, смешивая с его с суспензией активного угля из расчета 0,5 г угля на 1 дм3 раствора, при температуре 40°С, и полученную суспензию перемешивают в течение 30 минут. Суспензию фильтруют и осветленный раствор концентрируют при вакууме 0,082 МПа (615 мм рт.ст.) и температуре 25°С до объема 0,2 дм3. Полученный концентрат очищают ультрафильтрацией через мембрану с отсечением 1 кДа и получают раствор объемом 0,15 дм3, который высушивают при температуре 40°С и измельчают. В сухом препарате ингибитора определяют ингибиторную активность.
Результаты опыта представлены в таблице 1.
Пример 2
Очистку фильтрата культуральной жидкости, концентрирование, очистку концентрата концентрата, высушивание и измельчение проводят согласно примеру 1.
Используют фильтрат культуральной жидкости с ингибиторной активностью 4300 ИЕ/см3, содержанием белка 6 г/дм3, содержанием редуцирующих сахаров 10 г/дм3, D при λmax 360 нм равно 11,3 е.о.п.
Осветление ультрафильтрата проводят активным углем в количестве 1,0 г на 1 дм3 раствора при температуре 30°С в течение 60 минут.
Данные опыта представлены в таблице 1.
Пример 3.
Очистку ультрафильтратов, осветление, высушивание и измельчение проводят согласно примеру 1.
Используют фильтрат культуральной жидкости с ингибиторной активностью 4500 ИЕ/см3, содержанием белка 4 г/дм3, содержанием редуцирующих сахаров 8 г/дм3, D при λmax 360 нм равно 8,2 е.о.п.
Концентрирование проводят при температуре 30°С.
Данные опыта представлены в таблице 1.
Пример 4 (по прототипу)
Используют фильтрат культуральной жидкости с ингибиторной активностью 4100 ИЕ/см3, с содержанием белка 5 г/дм3, содержанием редуцирующих сахаров 6 г/дм3, D при λmax 360 нм равно 10,5 е.о.п.
Очистку фильтрата культуральной жидкости и осветление ультрафильтрата осуществляют согласно примеру 1. Для ультрафильтрации используют мембрану с отсечением 15 кДа. Затем ультрафильтрат концентрируют при температуре 90°С до объема 0,1 дм3 и осветляют при температуре 25°С. Осветленный раствор высушивают при температуре 55°С и измельчают. В сухом препарате ингибитора определяют ингибиторную активность.
Данные опыта представлены в таблице 1.
Результаты, полученные в примерах 1-4 по предлагаемому способу и в примере 5 - по прототипу, показывают, что последовательность «ультрафильтрация → осветление» и использование мембран с отсечением 5 и 1 кДа в примерах 1-4 позволяют полностью удалить балластную белковую фракцию и снизить цветность растворов. Использование предлагаемого способа обеспечивает улучшение качества препарата ингибитора, а именно увеличение ингибиторной активности в 8,6-11,4 раз, по сравнению с примером по прототипу и полное удаление белка, снижающего ингибиторное действие.
| Таблица 1 | |||||
| Показатели процесса выделения ингибитора гликозидаз | |||||
| № примера | Наименование полупродукта или продукта | Наименование показателя | |||
| Массовая концентрация, г/дм3, г/г* | Показатель цветности, D при λmax 360 нм, е.о.п. | Ингибиторная активность ИЕ/см3; ИЕ/г* | |||
| белка | редуцирующих сахаров | ||||
| Фильтрат культуральной жидкости | |||||
| 2,0 | 5,0 | 8,10 | 4100 | ||
| Ультрафильтрат (отсечение мембраны 5 кДа) | |||||
| 1,2 | 0,7 | 0,15 | 4100 | ||
| 1 | Осветленный ультрафильтрат | ||||
| 0,8 | 0,7 | 0,03 | 4100 | ||
| Концентрат | 4,1 | 3,2 | 0,05 | 20400 | |
| Ультрафильтрат (отсечение мембраны 1 кДа) | |||||
| отсутствует | 3,2 | 0,01 | 20400 | ||
| Высушенный ультрафильтрат | |||||
| отсутствует | 0,7 | отсутствует** | 3000000 | ||
| Фильтрат культуральной жидкости | |||||
| 6,0 | 10,0 | 11,3 | 4250 | ||
| 2 | Ультрафильтрат (отсечение мембраны 5 кДа) | ||||
| 3,5 | 1,5 | 0,25 | 4250 | ||
| Осветленный ультрафильтрат | 0,9 | 1,5 | 0,03 | 4250 | |
| Концентрат | 4,5 | 7,5 | 0,07 | 21500 | |
| Ультрафильтрат (отсечение мембраны 1 кДа) | |||||
| отсутствует | 7,5 | 0,01 | 21500 | ||
| Высушенный ультрафильтрат | |||||
| отсутствует | 0,8 | отсутствует** | 3500000 | ||
| 3 | Фильтрат культуральной жидкости | ||||
| 4,0 | 8,0 | 8,2 | 4500 | ||
| Ультрафильтрат (отсечение мембраны 5 кДа) | |||||
| 2,4 | 1,2 | 0,20 | 4500 | ||
| Осветленный ультрафильтрат | |||||
| 0,8 | 1,2 | 0,02 | 4500 | ||
| Концентрат | 4,0 | 6,0 | 0,05 | 22500 | |
| Ультрафильтрат (отсечение мембраны 1 кДа) | |||||
| отсутствует | 6,0 | 0,01 | 22500 | ||
| Высушенный ультрафильтрат | |||||
| отсутствует | 0,8 | отсутствует** | 4000000 | ||
| Фильтрат культуральной жидкости | |||||
| 5 | 6 | 10,5 | 4100 | ||
| 4 (по прототипу) | Ультрафильтрат (отсечение мембраны 15 кДа) | ||||
| 3,2 | 3,5 | 0,65 | 4100 | ||
| Концентрат | 31,5 | 33,6 | 4,8 | 30600 | |
| Осветленный ультрафильтрат | 30,6 | 0,65 | 30600 | ||
| 10,6 | |||||
| Высушенный ультрафильтрат | 0,5 | 0,4 | 1,3** | 350000 | |
| Примечание: * - для высушенного препарата, ** - показатель цветности определен для раствора высушенного ультрафильтрата с массовой долей 1%. |
Способ получения ингибитора гликозидаз из фильтрата культуральной жидкости, полученной при ферментации питательной среды на основе гидролизатов кукурузного крахмала актиномицетом, включающий ультрафильтрацию фильтрата культуральной жидкости, концентрирование ультрафильтрата, осветление, последующую сушку и измельчение полученного ингибитора, отличающийся тем, что фильтрат культуральной жидкости используют с активностью 4250±250 ИЕ/см3, ультрафильтрацию проводят через мембраны с отсечением 5 кДа, осветление ультрафильтрата осуществляют непосредственно после ультрафильтрации при температуре 30-40°C, а затем проводят концентрирование под вакуумом 0,082 МПа при температуре 25-30°C и ультрафильтрацию через мембрану с отсечением 1 кДа.
