Способ получения средства, обладающего иммуномодулирующей активностью
Владельцы патента RU 2496510:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (ИОЭБ СО РАН) (RU)
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения средства, обладающего иммуномодулирующей активностью. Способ получения средства, обладающего иммуномодулирующей активностью, характеризующийся тем, что растительную композицию, состоящую из травы пустырника обыкновенного, травы горца птичьего, цветков ноготков лекарственных, корневищ с корнями солодки голой, корневищ с корнями вздутоплодника сибирского, плодов шиповника, плодов лимонника китайского, семян льна обыкновенного, последовательно экстрагируют 60-70% этиловым спиртом дважды, 40-50% этиловым спиртом - двукратно и водой очищенной - однократно, при определенных условиях, далее водно-спиртовые извлечения концентрируют под вакуумом, водные кубовые остатки объединяют с водным извлечением, фильтруют, упаривают, очищают сепарированием, доупаривают, высушивают в вакуум-сушильном шкафу с последующим измельчением. Вышеописанный способ позволяет получить средство, обладающее выраженной иммуномодулирующей активностью, с повышенным содержанием действующих веществ. 13 табл., 2 пр.
Изобретение относится к фармации и касается способа получения средства из растительной композиции, обладающего иммуномодулирующей активностью.
В последние десятилетия наблюдается значительное снижение показателей здоровья и рост заболеваемости населения вследствие ряда объективных причин, среди которых важное значение имеют ухудшение экологической обстановки, огромная информационная и нервно-эмоциональная нагрузка, снижение социальной защищенности широких слоев населения и многие другие факторы (злоупотребление лекарствами, табаком, алкоголем, нарушения в питании и др.), которые приводят к росту и тяжести иммунодефицитных состояний, обусловленных нарушениями в системе иммунитета. Люди с пониженной активностью иммунной системы входят в группу риска по состоянию здоровья, отмечается снижение естественной резистентности иммунологической реактивности организма, связанное с ослаблением иммунных, детоксикационных и других адаптационно-приспособительных механизмов [1, 2, 4].
Известны различные композиции лечебно-профилактических средств из растительного сырья, имеющие широкий диапозон лечебно-оздоровительного действия.
Известен способ получения комплекса, обладающего противовоспалительным, иммуномодулирующим и антигипоксическим действием (Патент РФ №2123349, А61К 35/78, 1998), полученный путем экстракции травы касатика молочно-белого 35-45% водным этанолом в течение 10-12 часов методом перколяции.
Известен сбор лекарственных растений, обладающий противовирусным, противомикробным и иммуномодулирующим действиями (Патент РФ №2160596, А61К 35/78, 2000), состоящий из смеси 18 лекарственных растений и применяемый в виде чая.
Известно противоопухолевое и иммуномодулирующее средство («Олексин»), представляющее собой водный экстракт листьев и цветков персика обыкновенного (Патент РФ №2132197, А61К 35/78, 1999).
Известно лекарственное средство, обладающее иммуномодулирующей активностью (Патент РФ №2133620, А61К 35/78), настойка золотого корня (1:5) на 40% спирте, полученная методом модифицированной мацерации в трех экстракторах, сочетающей экстракцию при комнатной температуре (2 раза) и при нагревании (1 раз) в течение 5 суток.
Известно лекарственное средство, обладающее противоопухолевым и иммуномодулирующим действием (Патент РФ №2356566, А61К 36/28, А61Р 35/00, А61Р 37/02, 2009), которое содержит настойку травы татарника колючего на 70% спирте (настаивают 7 суток в темном месте).
Известно лекарственное средство на основе растительного сырья, обладающего иммуномодулирующей активностью, включающий экстракцию корней цикория обыкновенного 60-70-80% спиртом этиловым при соотношении сырье гэкстрагент 1:(5-7), упаривание под вакуумом до соотношения сырье: концентрат 1:(0,8-1,3) и высушивание распылением. (RU 2173557 С2, 20.09.2001. А61К 35/78, B01D 11/02).
Недостатками методов являются длительность производства и низкий выход экстрактивных веществ, а также использование отдельных лекарственных растений не приводит к максимальному выходу групп биологически активных веществ.
Наиболее близким к заявленному изобретению по назначению [3] и по стадиям технологического процесса является по п.1 композиция, состоящая из растительного материала, включающая корневища девясила, плод фенхеля, ягоды можжевельника, корень солодки, трава душицы, цветы календулы, плод шиповника, трава тимьяна. Композиция по п.1, где экстракт представляет собой водный экстракт алкоголя. Спиртовой экстракт получен путем смешивания восьми видов растительного сырья, экстракции композиции 95% этиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент 1:5 выдерживания в течение двух дней с периодическим перемешиванием и с последующей фильтрацией. (Patent Pub. No.: US 2008/0166435 A1. JuI. 10.2008).
Технический результат изобретения - получение средства из растительной композиции, обладающего выраженной иммуномодулирующей активностью, которая достигается за счет создания многокомпонентной растительной композиции, состоящей из травы пустырника обыкновенного, травы горца птичьего, цветков ноготков лекарственных, корневищ с корнями солодки голой, корневищ с корнями вздутоплодника сибирского, плодов шиповника, плодов лимонника китайского, семян льна обыкновенного в следующих соотношениях (мас.ч.) 15:10:10:25:10:15:10:5 соответственно, и за счет повышения выхода экстрактивных и действующих веществ.
Поставленная задача реализуется предлагаемым способом в котором, измельченную растительную композицию экстрагируют 60-70% этиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент 1:(10-12) с учетом коэффициента водопоглощения при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Экстракцию повторяют дважды. Далее шрот последовательно экстрагируют 40-50% этиловым спиртом - двухкратно и водой очищенной - однократно в тех же условиях каждой экстракции, подавая каждый раз в экстрактор экстрагент в количестве, равном объему слитого извлечения. Время каждой экстракции в течение 1 часа. Спиртовые извлечения объединяют и упаривают под вакуумом на роторном испарителе. Водные кубовые остатки объединяют с водным извлечением, фильтруют и упаривают до 1/15 первоначального объема. Полученный продукт очищают сепарированием, доупаривают до 1/3 объема очищенного извлечения, высушивают в вакуум-сушильном шкафу и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Выход готового продукта составляет 30-34% по массе.
Выявленные отличительные признаки позволяют сделать вывод о соответствии предлагаемого технологического решения критерию «новизна».
Предложенный способ позволяет получить готовый продукт, представляющий собой аморфный гигроскопичный порошок коричневого цвета со специфическим запахом, горьковато-вяжущего вкуса. Потеря в массе при высушивании составляет 2,5-4%.
Нами разработано лекарственное средство растительного происхождения в виде экстракта сухого, условно названного «Иммунополифит», обладающего иммуномодулирующим действием [5].
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
250 г корневищ с корнями солодки голой, 100 г корневищ с корнями вздутоплодника сибирского измельчают до размера частиц диаметром 3 мм (сито №30 ГОСТ 214-83); 150 г травы пустырника обыкновенного, 100 г травы горца птичьего, 100 г цветков ноготков измельчают до размера частиц диаметром 5 мм (сито №50 ГОСТ 214-83); 150 г плодов шиповника, 100 г плодов лимонника и 50 г семян льна измельчают до размера частиц диаметром 1 мм (сито №10 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстрактор (с мешалкой, с ложным дном и внешним паровым обогревом), заливают 12,5 л 60% этилового спирта в соотношении сырье-экстрагент 1:10 с учетом коэффициента водопоглощения 1:2 и фильтрующего материала (серошинельное сукно), которое укладывают на ложное дно экстрактора. Экстрагируют при комнатной температуре и постоянном перемешивании в течение 1 часа. Первое извлечение сливают, одновременно фильтруя, в мерник. Вторую экстракцию повторяют в тех же условиях, подавая в экстрактор 60% этиловый спирт в количестве, равном объему слитого. 1 слив - 10,6 л, 2 слив - 10,4 л. Далее шрот последовательно экстрагируют 40% этиловым спиртом - два раза и водой очищенной - один раз в тех же условиях, подавая каждый раз в экстрактор экстрагент в количестве, равном объему слитого извлечения. 3 слив - 10,3 л; 4-й слив - 10,3 л; 5 слив - 10,4 л. Водно-спиртовые извлечения концентрируют под вакуумом. Водные кубовые остатки объединяют с водным извлечением, фильтруют и упаривают до 1/15 первоначального объема. Концентрированный экстракт очищают сепарированием, доупаривают до 1/3 полученного объема, сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 60°C в течение 5 часов и измельчают на мельнице. Получают 303 г готового продукта, что составляет 30,3% от массы исходного сырья.
Экстракт «Иммунополифит» сухой представляет собой аморфный порошок коричневого цвета, горьковато-вяжущего вкуса со специфическим запахом. Гигроскопичен. Потеря в массе при высушивании составляет 3,9%.
Пример 2.
250 г корневищ с корнями солодки голой, 100 г корневищ с корнями вздутоплодника сибирского измельчают до размера частиц диаметром 3 мм (сито №30 ГОСТ 214-83); 150 г травы пустырника обыкновенного, 100 г травы горца птичьего, 100 г цветков ноготков измельчают до размера частиц диаметром 5 мм (сито №50 ГОСТ 214-83); 150 г плодов шиповника, 100 г плодов лимонника и 50 г семян льна измельчают до размера частиц диаметром 1 мм (сито №10 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстрактор, заливают 14,5 л 70% этилового спирта в соотношении сырье-экстрагент 1:12 с учетом коэффициента водопоглощения 1:2 и ложного дна экстрактора. Экстрагируют при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 1 часа. Первое извлечение сливают, одновременно фильтруя, в мерник. Вторую экстракцию повторяют в тех же условиях, подавая в экстрактор 70% этиловый спирт в количестве, равном объему слитого. 1 слив - 12,3 л, 2 слив - 12,1 л. Далее шрот последовательно экстрагируют 50% этиловым спиртом - два раза и водой очищенной - один раз в тех же условиях, подавая каждый раз в экстрактор экстрагент в количестве, равном объему слитого извлечения. 3 слив-12,1 л; 4-й слив - 12,0 л; 5 слив - 12,1 л. Водно-спиртовые извлечения концентрируют под вакуумом. Водные кубовые остатки объединяют с водным извлечением, фильтруют и упаривают до 1/15 первоначального объема. Концентрированный экстракт очищают сепарированием, доупаривают до 1/3 полученного объема, сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 60°C в течение 5,5-6 часов и измельчают на мельнице.
Получают 341 г готового продукта, что составляет 34,1% от массы исходного сырья.
Экстракт «Иммунополифит» сухой представляет собой аморфный порошок светловато-коричневого цвета горьковато-вяжущего вкуса со специфическим запахом. Гигроскопичен. Потеря в массе при высушивании составляет 2,7%.
На основании качественного фитохимического анализа в полученном сухом экстракте установлено наличие:
1) 0,1 г сухого экстракта растворяют в 10 мл спирта 70% при нагревании. К 5 мл фильтрата прибавляют 0,03 порошка магния, 0,5 мл концентрированной хлористоводородной кислоты; при нагревании на водяной бане появляется красное окрашивание (флавоноиды).
0,05 г сухого экстракта растворяют в 10 мл спирта 70%. К 3 мл фильтрата прибавляют 1 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида, при слабом нагревании в течение 10-15 мин; раствор окрашивается в зеленовато-желтый цвет (флавоноиды).
0,05 г сухого экстракта растворяют в 10 мл воды при нагревании. К 5 мл фильтрата прибавляют 1-2 капли раствора железа окисного хлорида; появляется осадок черно-зеленого окрашивания (полифенольные соединения).
Методом хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) на пластинках «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ-254» (10×15 см) в системе растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2), просматривая в УФ-свете до и после обработки хроматограмм 3% спиртовым раствором алюминия хлорида, идентифицированы по ярко-желтой и зеленовато-желтой флюоресценции со стандартами: рутин - Rf~0,50; гиперозид - Rf~0,59; лютеолин - Rf~0,83.
Фенилпропанойды. Хроматографией в тонком слое сорбента на пластинках «Сорбфил» ПТСХ П-А-УФ-254» в системе растворителей хлороформ-этиловый эфир уксусной кислоты - муравьиная кислота (5:4:1); после проявления в парах аммиака, обнаружена кофейная кислота с Rf~0,87.
Углеводы. 0,05 г сухого экстракта растворяют в 10 мл воды при слабом нагревании. К 3 мл фильтрата прибавляют 6 мл спирта 96%, перемешивают; появляется хлопьевидный аморфный осадок (полисахариды).
В пробирке смешивают равные объемы водного извлечения экстракта и свежеприготовленного 0,1% водного раствора нингидрина; при нагревании образуется розовато-фиолетовое окрашивание (аминокислоты).
2) Идентификация фенольных соединений
Методом ВЭЖХ подтверждено наличие флавоноидов: гиперозида, рутина, лютеолина, мирицетина (табл.1); фенолкарбоновых кислот: галловой, коричной, кофейной (табл.2).
При анализе аминокислотного состава экстракта сухого на автоматическом аминокислотном анализаторе марки ААА-339 выявлено наличие большого набора свободных аминокислот, при этом идентифицировано около 23 аминокислот, в том числе 9 незаменимых аминокислот (табл.3).
3) Количественное определение. Результаты анализов количественного определения основных биологически активных веществ в экстракте сухом представлены в таблице 4.
Для стандартизации экстракта «Иммунополифит» сухого разработаны 2 методики.
1. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид-стандарт с применением метода дифференциальной спектрофотометрии.
Методика 1. Около 0,3 г (точная навеска) сухого экстракта помещают в стаканчик, приливают 30 мл спирта 70%, растворяют при слабом нагревании, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора спиртом 70% до метки. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в сухую колбу, отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А). 3 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 3 мл 5% спиртового раствора алюминия хлорида, доводят объем раствора спиртом 70% до метки и перемешивают (раствор Б). Через 30 минут измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 413 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 3 мл раствора А, 1-2 капель 1% уксусной кислоты помещенного в мерную колбу вместимостью 25 мл и доведенного спиртом 70% до метки. Параллельно, в тех же условиях, измеряют оптическую плотность раствора Б ГСО гиперозида, приготовленного аналогично испытуемому раствору.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид и абсолютно сухое вещество (X) в процентах вычисляют по формуле:
;
где D - оптическая плотность испытуемого раствора,
DO - оптическая плотность раствора ГСО гиперозида,
m - масса экстракта в граммах,
mO - масса ГСО гиперозида в граммах,
W - потеря в массе при высушивании экстракта в процентах.
2. Разработана методика определения суммы фенилпропаноидов в пересчете на кофейную кислоту методом прямой спектрофотометрии.
Методика 2. Около 0,1 г (точная навеска) сухого экстракта, помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 40 мл спирта 40%, доводят объем раствора спиртом 40% до метки. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в сухую колбу, отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А). 1,5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора спиртом 40% до метки и перемешивают (раствор Б). Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 322 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
В качестве раствора сравнения используют спирт 40%. Параллельно, в тех же условиях, измеряют оптическую плотность 0,02% раствора РСО кофейной кислоты, приготовленного аналогично испытуемому раствору.
Содержание суммы фенилпропаноидов в пересчете на кофейную кислоту и абсолютно сухое вещество (X) в процентах вычисляют по формуле:
;
где D - оптическая плотность испытуемого раствора,
DO - оптическая плотность раствора РСО кофейной кислоты,
m - масса экстракта в граммах,
mO - масса РСО кофейной кислоты в граммах,
W - потеря в массе при высушивании экстракта в процентах.
Содержание суммы флавоноидов и фенилпропаноидов в Иммунополифите регламентируется не менее 1% и 3% соответственно.
Метрологические характеристики методик представлены в таблице 5. Предлагаемый способ получения не требует сложной схемы очистки, позволяет извлечь максимальное количество действующих веществ благодаря применению 3 экстрагентов, позволяет получить продукт постоянного состава биологически активных веществ, что приводит к повышенной фармакологической активности. Технология может быть внедрена на предприятиях, выпускающих лекарственные препараты и профилактические средства.
Для установления оптимальных технологических режимов изучены основные факторы, влияющие на процесс экстрагирования растительной композиции: природа экстрагента, его соотношение с сырьем, степень измельчения сырья, продолжительность и количество экстракций.
Количественная оценка велась по выходу суммы экстрактивных веществ и суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид.
Одним из главных факторов, определяющих эффективность процесса экстрагирования биологически активных веществ из растительной композиции при производстве экстракционных препаратов, является подбор оптимального экстрагента. При изучении процесса экстрагирования исследуемой композиции в качестве экстрагентов были использованы вода очищенная (18-20)°С, горячая вода (80-90)°C, спирт этиловый в различных концентрациях: 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 96%. Результаты представлены в таблице 6. Как видно из экспериментальных данных, наиболее оптимальным экстрагентом является этиловый спирт в концентрации 60%, 50%, 70%. При экстракции водой на «горячей» водяной бане, извлечение желируется, а при сушке масса спекается, что отражается на выходе действующих веществ.
При уточнении температурного режима экстракции, установлено, что при нагревании образуется вязкое извлечение (за счет слизей), что препятствует выходу экстрактивных веществ и приводит к нарушению нормального хода технологического процесса в дальнейшем.
Экспериментальные данные показывают, что оптимальным является соотношение сырья и экстрагента 1:(10-12) для однократного залива сырья. Дальнейшее увеличение объема экстрагента нецелесообразно, так как не достигается эффективности экстрагирования, поскольку не наблюдается увеличения выхода извлекаемых веществ (табл.7).
В растительную композицию входят растения различного морфолого-анатомического строения. Размер частиц измельченности сырья играет важную роль для интенсификации процесса. Проведено изучение степени измельчения каждого вида сырья. Количественную оценку проводили по выходу экстрактивных веществ (табл.8). Измельчение каждого вида сырья следует проводить отдельно, до размера частиц: травы пустырника обыкновенного, травы горца птичьего и цветков ноготков лекарственных - 5 мм; корневища с корнями солодки голой и корневища с корнями вздутоплодника сибирского - 3 мм; плодов шиповника и плодов лимонника китайского, семян льна обыкновенного - 1 мм.
С целью определения продолжительности и кратности числа экстракций было изучено время наступления равновесной концентрации в системе сырье-экстрагент. По методике: массу навески растительной композиции экстрагируют последовательно спиртом 60%, 40% и водой при соотношении сырье-экстрагент 1:10 при комнатной температуре в течение 90 мин на лабораторном «встряхивателе». Процесс повторяют трижды, заливая сырье новой порцией экстрагента в количестве, равном слитому извлечению. Через каждые 15 мин в течение каждого контакта фаз отбирают по 25 мл извлечения для определения количества экстрактивных веществ. Равновесное состояние в системе наступает через 60 мин при двух контактах фаз при экстракции спиртом 60% и 40%; водой - при первом контакте фаз через 60 мин (табл.9).
Предлагаемый способ получения по сравнению с известным (табл.10) позволяет получить препарат постоянного состава с выраженной иммуномодулирующей активностью благодаря многокомпонентности средства, использованию рациональной технологии и значительно большим содержанием действующих веществ, что определяет перспективность внедрения данного способа в фармацевтическую промышленность.
Источники информации
1. Дичев Т.Г. Адаптация и здоровье, выживание и экология человека (Социально-медицинские и психобиоэнергетические аспекты). - М.; «Витязь», 1994. - 325 с.
2. Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Актуальные проблемы оценки иммунной системы человека на современном этапе. //Иммунология." 1990. - №5. - С.4-7.
3. Pylypchuk Volodymyr. - Kiev (UA). Composition and methods of use of an immunomodulator. Patent Pub. No.: US 2008/0166435 A1/ JuI. 10.2008.
4. Сндоренко Г.И., Захарченко М.П., Морозов В.Г. и др. - Эколого-гигиенические проблемы исследования иммунного статуса человека и популяции. - М., 1992. - 103 с.
5. Хобракова В.Б., Нагаслаева О.В. Иммуномодулирующие свойства сухого экстракта «Иммунополифит» //Сибирский медицинский журнал №5. - Т. 63. - Иркутск, 2006. - С.72-74.
Фармакологическое изучение экстракта «Иммунополифит» сухого
Эксперименты проведены на мышах-самцах линий СВА и F1 (СВА×С57В1/6) массой 18-20 г. Действие исследуемого экстракта на показатели клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунитета было изучено на интактных животных, а также животных, находящихся в состоянии иммунодепрессии, вызванной цитостатиком азатиоприном, который вводили контрольной группе животных в дозе 50 мг/кг перорально 1 раз в сутки в течение 5 дней (Лазарева, Алехин, 1985).
Исследуемое средство вводили 1-ой опытной группе на фоне азатиоприна и 2-ой опытной группе интактных мышей в виде водного раствора в дозе 40 мг/кг перорально ежедневно в течение 14 дней. Интактная группа животных получала дистиллированную воду по аналогичной схеме.
Действие испытуемого средства на состояние клеточного звена иммунного ответа оценивали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) согласно стандартной методике локальной ГЗТ (Петров и др., 1987), гуморального звена - по количеству антителообразующих клеток, определяемых методом локального гемолиза по A.J.Cunningham (1965), макрофагального звена - в реакции фагоцитоза макрофагов в отношении Staphylococcus aureus in vitro no методике И.С. Фрейдлин (1976).
Достоверность экспериментальных данных определяли с помощью критерия Стыодента (Лакин, 1990).
Наиболее распространенный подход к изучению гуморального иммунитета заключается в инициации процесса антигензависимой дифференцировки предшественников антителообразующих клеток до В-клеток, продуцирующих антитела. Информативным показателем такой инициации может служить уровень антителообразующих клеток (АОК).
Введение азатиоприна животным вызывает снижение как абсолютного, так и относительного числа АОК на 53 и 38%, соответственно, по сравнению с данными в интактной группе. При введении мышам исследуемого средства на фоне иммунодепрессии наблюдали увеличение количества АОК как в абсолютных значениях, так и при расчете на 106 спленоцитов в 1,9 и 1,5 раза, соответственно, по сравнению с контролем (табл.10).
При введении экстракта «Иммунополифит» сухого мышам 2-й опытной группы установлено, что данное средство не изменяет показатели гуморального иммунитета у интактных животных.
Влияние исследуемого экстракта на состояние клеточного звена иммунного ответа определяли по реакции ГЗТ. Азатиоприновая иммунодепрессия проявилась в угнетении индекса реакции ГЗТ (ИР ГЗТ) на 36% по сравнению с таковым в интактной группе. При использовании исследуемого средства на фоне описанной выше иммуносупрессии наблюдалось повышение ИР ГЗТ в 1,3 раза относительно контроля (табл.11).
При введении экстракта «Иммунополифит» сухого мышам 2-й опытной группы установлено, что данное средство не изменяет состояние клеточного иммунитета у интактных животных. Как следует из данных таблицы 12, введение азатиоприна приводило к угнетению функциональной активности макрофагов и выражалось в снижении активности (процент фагоцитирующих клеток из общего числа подсчитанных клеток) и интенсивности (среднее количество St. aureus, поглощенное одной клеткой) фагоцитоза на 45% и 41%, соответственно, по сравнению с таковыми в цптактной группе.
Введение испытуемого средства приводило к увеличению активности и интенсивности фагоцитоза в 1,4 и 1,3 раза, соответственно, по отношению к контролю.
При введении исследуемого экстракта животным 2-й опытной группы установлено, что данное средство не изменяет показатели макрофагального иммунитета у интактных животных.
Таким образом, экстракт «Иммунополифит» сухой обладает выраженной иммуномодулирующей активностью при азатиоприновой иммунодепрессии, что выражается в повышении показателей клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа. Исследуемый экстракт не изменяет показатели иммунитета у интактных мышей. Это свойство изучаемого экстракта очень важно, поскольку оно присуще лишь истинным иммуномодуляторам, обладающим активностью только в условиях повреждения иммунитета. За эффект экстракта «Иммунополифит» сухого ответственны группы биологически активных веществ: флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, аминокислоты, сапонины, кумарйны, каротиноиды, полиненасыщенные жирные кислоты, витамины. Все перечисленные биологически активные вещества обладают иммуномодулирующими свойствами (Бакуридзе А.Д. и др., 1993;. Толкачев О.Н. и др., 1999; BergP.A., 1988; Kraus J., Franz G., 1992).
Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что сухой экстракт «Иммунополифит» является эффективным иммуномодулирующим средством, что позволяет рекомендовать его для профилактики и лечения различных заболеваний, связанных с нарушением иммунной системы организма.
| Таблица 1 | |||
| Время удерживания и спектральные отношения флавоноидных гликозидов и их агликонов экстракта сухого | |||
| № п/п | Соединение | tR, мин | R=S330/S350 |
| 1 | Гиперозид | 9,30±0,09 | 1,63±0,09 |
| 2 | Рутин | 9,52±0,10 | 0,82±0,05 |
| 3 | Мирицетин | 11,34±0,11 | 0,98±0,05 |
| 4 | Лютеолин | 15,22±0,15 | 0,85±0,05 |
| Таблица 2 | ||
| Время удерживания и спектральные отношения фенолкарбоновых кислот стандартной смеси и экстракта сухого | ||
| Кислота | Время удерживания, мин | Спектральные отношения А272/А300 |
| галловая | 2,25; 2,25* | 0,38; 0,34* |
| кофейная | 7,82; 7,90* | 3,16; 2,93* |
| коричная | 18,15; 18,20* | 0,46; 0,51* |
| Таблица 3 | |||||
| Свободные аминокислоты экстракта сухого | |||||
| № | Аминокислота | нМ/мг | № | Аминокислота | нМ/мг |
| 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 |
| 1 | Треонин* | 0,88 | 12 | Метионин* | 2,82 |
| 2 | Серин | 5,20 | 13 | Изолейцин* | 2,04 |
| 3 | Аспаргин | 42,93 | 14 | Лейцин* | 0,81 |
| 4 | Глютаминовая к-та | 5,15 | 15 | Фенилаланин* | 2,23 |
| 5 | Глютамин | 3,66 | 16 | γ-аминомаслянная | 3,19 |
| 6 | Пролин | 84,33 | 17 | Этаноламин | 0,78 |
| 7 | Глицин | 2,41 | 18 | Орнитин | 0,15 |
| 8 | Аланин | 6,39 | 19 | Лизин* | 0,73 |
| 9 | Цитруллин | 0,09 | 20 | Гистидин* | 1,06 |
| 10 | α-аминомасляная | 3,38 | 21 | Аргинин* | 7,33 |
| 11 | Валин* | 3,43 | 22 | Фосфоэтаноламин | 10,93 |
| 23 | Аспарагиновая к-та | 0,82 | |||
| * - незаменимые аминокислоты |
| Таблица 4 | |
| Определение содержания БАВ в экстракте сухом, % | |
| Дубильные вещества | 9,65±0,35 |
| Полисахариды (восст. моносахара) | 8,12±0,26 |
| Свободные аминокислоты | 5,02±0,15 |
| Глицирризиновая кислота | 8,05±0,16 |
| Аскорбиновая кислота | 4,55±0,10 |
| Органические кислоты | 17,11±0,88 |
| Таблица 5 | |||||
| Метрологические характеристики методик количественного определения фенольных соединений в экстракте сухом (f=6, Р=95%, t(P,f)=2,45) | |||||
| Содержание: | х | S2 | S | Δх | Е, % |
| флавоноиды | 2,14 | 1,13·10-3 | 3,36·10-2 | 8,24·10-2 | ±3,85 |
| фенилпропаноиды | 4,16 | 2,24·10-3 | 4,74·10-2 | 1,16·10-1 | ±2,79 |
| Таблица 6 | ||
| Выход суммы экстрактивных веществ и суммы флавоноидов при экстракции композиции различными экстрагентами* | ||
| Экстр агент | Выход суммы экстрактивных веществ, % | Содержание суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид-стандарт |
| Вода (18-20)°C | 19,57 | 0,22 |
| Вода (80-90)°С | 11,65 | 0,16 |
| Спирт 30% | 22,15 | 0,38 |
| Спирт 40% | 22,06 | 0,41 |
| Спирт 50% | 21,84 | 0,57 |
| Спирт 60% | 20,68 | 0,63 |
| Спирт 70% | 19,13 | 0,54 |
| Спирт 80% | 16,97 | 0,48 |
| Спирт 96% | 12,70 | 0,27 |
| * - среднее значение из трех определений |
| Таблица 7 | ||||||||
| Выход суммы экстрактивных веществ и суммы флавоноидов в зависимости от соотношения сырье - экстрагент* | ||||||||
| Соотношение сырье - экстрагент (спирт 60%) | Выход суммы экстрактивных веществ, % | Содержание суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид-стандарт | ||||||
| 1:7 | 17,50 | 0,33 | ||||||
| 1:10 | 21,36 | 0,60 | ||||||
| 1:12 | 20,87 | 0,53 | ||||||
| 1:15 | 19,16 | 0,46 | ||||||
| 1:20 | 16,88 | 0,37 | ||||||
| * - среднее значение из трех определений | ||||||||
| Таблица 8 | ||||||||
| Выход суммы экстрактивных веществ в зависимости от размера частиц сырья* | ||||||||
| Диаметр частиц сырья, мм | Корни солодки голой, % | Плоды шиповни ка, % |
Трава пустырни ка об., % |
Плоды лимонника кит., % | Трава горца птичьего, % | Цветки ноготков, % | Корни вздутоплодника сиб., % | Семена льна обыкнов., % |
| 0,5 | 22,43 | 51,61 | 19,21 | 21,58 | 15,17 | 24,26 | 23,27 | 21,55 |
| 1 | 24,63 | 51,14 | 21,07 | 21,70 | 15,63 | 25,96 | 24,75 | 21,91 |
| 2 | 21,73 | 45,25 | 23,15 | 20,17 | 16,86 | 26,83 | 26,90 | 16,39 |
| 3 | 26,09 | 37,64 | 25,81 | 18,16 | 17,55 | 27,95 | 27,19 | 6,52 |
| 5 | 21,76 | 21,28 | 26,52 | 13,76 | 19,89 | 29,78 | 22,45 | - |
| 7 | 16,32 | 10,33 | 24,18 | - | 17,18 | 26,78 | 15,11 | - |
| *- среднее значение из трех определений |
| Таблица 9 | ||||||||
| Выход суммы экстрактивных веществ в зависимости от времени и кратности экстрагирования* | ||||||||
| Время экстракции, мин | Выход экстрактивных веществ, % | |||||||
| Спирт 60% | Спирт 40% | Вода | ||||||
| контакты фаз | контакты фаз | контакты фаз | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | |
| 30 | 7,11 | 1,81 | 0,20 | 4,63 | 1,25 | 0,31 | 5,12 | 0,05 |
| 45 | 9,63 | 3,28 | 0,64 | 7,15 | 2,58 | 0,00 | 6,15 | 0,08 |
| 60 | 11,18 | 3,98 | 0,00 | 9,16 | 3,12 | 0,00 | 7,60 | 0,10 |
| 75 | 10,03 | 3,85 | 0,00 | 9,11 | 3,03 | 0,00 | 6,47 | - |
| 90 | 10,11 | 2,63 | - | 8,82 | 3,00 | - | 5,45 | - |
| Суммарный выход | 15,16 | 12,28 | 7,61 | |||||
| * - среднее значение из трех определений |
| Таблица 10 | ||
| Сравнительная характеристика заявленного способа с выбранным прототипом | ||
| Параметры сравнения | Известный способ | Заявляемый способ |
| Растительное сырье | Растительный материал (корневища девясила, плод фенхеля, ягоды можжевельника, корень солодки, трава душицы, цветы календулы, плод шиповника, трава тимьяна) | Растительная композиция (корни солодки голой и вздутоплодника сибирского; плоды шиповника и лимонника китайского; травы пустырника обыкновенного и горца птичьего; цветки ноготков лекарственных, семена льна обыкновенного) |
| Экстрагент | 95% этиловый спирт | Спирт 60-70%, 40-50% и вода очищенная |
| Соотношение сырье - экстрагент | 1:5 | 1: (10-12) |
| Степень измельчения сырья, мм | Трава, цветки - 5 мм; корневище с корнями - 3 мм; плоды, семена - 1 мм | |
| Температура экстракции, °С | 18-20 | 18-20 |
| Лекарственная форма | Жидкий экстракт 1:5 | Экстракт «Иммунополифит» сухой |
| Фармакологическая активность | Иммуномодулирующее действие | Иммуномодулирующее действие |
| Выход конечного продукта | в мл, 500 | по массе, % 30-34 |
| Стандартизация готового продукта | Спектрофотометрически, по сумме флавоноидов и фенилпропаноидов |
| Таблица 11 | ||
| Влияние экстракта «Иммунополифит» сухого на антителообразование | ||
| Группы животных | Количество АОК | |
| на селезенку | на 106 спленоцитов | |
| Интактная (n=8) | 70773±3061 | 440±33 |
| Контрольная (Азатиоприн - Аз) (n=8) | 33075±2831*1 | 271±18*1 |
| 1 Опытная (Аз+«Иммунополифит») (n=8) | 61393±4262*2 | 402±28*2 |
| 2 Опытная («Иммунополифит») (n=8) | 60770±3421 | 364±34 |
| Примечание: n - количество животных в группе, различия достоверны при р<0.05: *1 - по сравнению с данными в интактной группе, *2 - по сравнению с контролем. |
Влияние экстракта «Иммунополифит» сухого на выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа
| Таблица 12 | |
| Группы животных | ИР ГЗТ, % |
| Интактная (n=10) | 22,12±1,80 |
| Контрольная (Азатиоприн - Аз) (n=10) | 14,22±1,27*1 |
| 1 Опытная (Аз+«Иммунополифит») (n=10) | 18,8±1,44*2 |
| 2 Опытная («Иммунополифит») (n=10) | 19,3±1,85 |
| Таблица 13 | ||
| Влияние экстракта «Иммунополифит» сухого на функциональную активность перитонеальных макрофагов | ||
| Группы животных | Показатели фагоцитоза | |
| Активность | Интенсивность | |
| Интактная (n=8) | 80,33±3,08 | 7,9±0,43 |
| Контрольная (Азатиоприн - Аз) (n=8) | 48,75±4,39*1 | 4,1±0,17*1 |
| 1 Опытная (Аз+«Иммунополифит») (n=8) | 67,75±3,17*2 | 5,3±0,34*2 |
| 2 Опытная («Иммунополифит») (n=8) | 72,5±5,12 | 5,9±0,30 |
Способ получения средства, обладающего иммуномодулирующей активностью, характеризующийся тем, что растительную композицию, состоящую из травы пустырника обыкновенного, травы горца птичьего, цветков ноготков лекарственных, измельченных до размера частиц 5 мм; корневищ с корнями солодки голой, корневищ с корнями вздутоплодника сибирского, измельченных до размера частиц 3 мм; плодов шиповника, плодов лимонника китайского, семян льна обыкновенного, измельченных до размера частиц 1 мм, взятых в соотношении 15:10:10:25:10:15:10:5 соответственно, последовательно экстрагируют 60-70%-ным этиловым спиртом в соотношении сырье:экстрагент 1:(10-12) - дважды, 40-50%-ным этиловым спиртом двукратно и водой очищенной однократно, подавая каждый раз в экстрактор экстрагент в количестве, равном объему слитому извлечения, по 1 ч каждой экстракции при комнатной температуре и постоянном перемешивании, далее водно-спиртовые извлечения концентрируют под вакуумом, водные кубовые остатки объединяют с водным извлечением, фильтруют, упаривают до 1/15 первоначального объема, очищают сепарированием, доупаривают до 1/3 объема очищенного извлечения, высушивают в вакуум-сушильном шкафу с последующим измельчением.
