Способ лечения экспериментального туберкулеза у мышей линии c57bl/6(h-2b)
Владельцы патента RU 2496868:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза" Российской академии медицинских наук (RU)
Изобретение относится к области ветеринарии и клеточных технологий. Предложен способ лечения экспериментального туберкулеза легких у мышей с использованием трансплантации стволовых клеток путем введения в хвостовую вену мышей один раз в неделю суспензии стволовых клеток, выделенных из костей мышей гибридов, резистентных к туберкулезу, с генотипом "k" в области H-2E. 3 табл.
Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к способу лечения экспериментального туберкулеза легких у животных с использованием клеточных биотехнологий.
Известен способ лечения экспериментального туберкулеза легких у животных [SU 1727840, A1, A61K 35/39, 23.04.1992], заключающийся в том, что гомогенат замороженной ксеногенной поджелудочной железы размораживают до 37°C в течение 1,5 ч и вводят однократно подкожно в дозе 0,2-0,3 мл.
Недостатком способа является его относительно низкая эффективность лечения.
Известен также способ [RU 2436582, C1, A61K 31/7036, A61P 31/06, 20.12.2011], согласно которому животному вводят стрептомицин, обработанный 0,15±0,05%-ным раствором формалина при 40,0±2,0°C в течение 5-7 суток в суточной дозе 25 мг/кг веса животного внутримышечно.
Недостатком этого способа также является его относительно низкая эффективность лечения.
Кроме того, известен способ получения стимулированных дендритных клеток для индукции иммунного ответа против туберкулеза, также [RU 2401664, C1, A61K 39/00, C12N 5/0784, 20.10.2010], основанный на заборе у пациента незрелых дендритных клеток, их культивирования ex vivo для созревания и формирования аллостимуляторной активности, при этом, клетки дополнительно собирают антигеном и вводят их тому же пациенту для формирования адаптивного иммунитета, а при культивировании ex vivo незрелых дендритных клеток в культуральную среду вводят фрагментированную аллогенную двуцепочечную геномную ДНК с фрагментами, размером 200-6000 п.о. в количестве 5 мкг/мл среды.
Этот способ также характеризуется относительно низкой эффективностью лечения.
Кроме указанных направлений в способах лечения туберкулеза в последние годы разработаны и способы, основанные на применении клеток костномозгового происхождения для лечения туберкулезного процесса у человека и животных.
Одним из таких подходов является клеточная терапия стволовыми клетками, которая, с одной стороны, может позволить скорректировать несостоятельность иммунитета больных туберкулезом, а, с другой стороны, способствовать регенерации поврежденных тканей организма. Тем не менее, в современной клинической практике клеточная трансплантация редко используется для лечения инфекционных заболеваний и, в частности, туберкулеза. Отчасти это может быть связано с недостаточно изученными механизмами терапевтического действия стволовых клеток, а также с определенными методическими трудностями, связанными с получением и стандартизацией клеточного материала.
Также важной проблемой остается проявление реакции «трансплантат против хозяина».
Таким образом, необходимым условием широкого внедрения способов клеточной терапии туберкулеза является фундаментальное изучение механизмов, контролирующих реакцию «трансплантат против хозяина». Стоит отметить, что успешное внедрение в медицинскую практику методов клеточной терапии зависит, прежде всего, от правильного подбора клеточного материала, который был бы не только адекватен поставленной задаче, но и не вызывал бы иммунного ответа на введение в организм реципиента. Вместе с тем, механизмы взаимодействия трансплантированного клеточного материала с организмом реципиента до сих пор мало изучены. В то же время, отторжение трансплантата может привести к тяжелым осложнениям и даже смерти реципиента.
В настоящем изобретении используется выявленная роль сублокуса главного комплекса гистосовместимости H-2E мыши в проявлении положительного эффекта трансплантации мезенхимальных стволовых клеток зараженным микобактериями туберкулеза мышам, что позволяет повысить эффективность лечения туберкулеза легких у животных, который проявляется через объективный фактор увеличения длительности жизни после проведения процедур.
Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ лечения экспериментального туберкулеза у мышей [RU 2391397, C2, A61P 31/06, 10.06.2010], включающий введение мышам суспензии клеток костного мозга, выделенных из бедренной кости инбредной линии мышей AKR, резистентной к туберкулезу, в хвостовую вену один раз в неделю в дозе 6 млн. клеток на мышь в течение двух месяцев.
Недостатком способа является относительно высокая сложность, поскольку для его реализации необходима доза в 6 млн. клеток на мышь. Известный способ отличается также относительно узкой областью применения, поскольку терапия провидится только одной инбредной линией AKR.
Требуемый результат заключается в упрощении способа путем снижения дозы вводимых клеток за счет замены их клетками, которые могут культивироваться и более эффективно влиять на выживаемость, а также расширение области применения.
Авторами настоящего изобретения в процессе исследований in vivo и in vitro было обнаружено, что в качестве такого средства могут быть использованы специальные гибриды F1 от определенных рекомбинантных линий мышей для получения нужных сочетаний аллелей в сублокусе H-2E главного комплекса гистосовместимости мыши (аллель k).
Таким образом, требуемый результат достигается тем, что, в способе лечения экспериментального туберкулеза у мышей линии C57BL/6 (H-2b), основанном на трансплантации стволовых клеток путем введения в хвостовую вену мышей один раз в неделю суспензии стволовых клеток, выделенных из костей мышей, резистентных к туберкулезу, согласно изобретению в качестве стволовых клеток используют культивированные in vitro клеточные культуры мезенхимального происхождения с генотипом “k” сублокусе H-2E главного комплекса гистосовместимости, которые выделяют от следующих гибридов мышей: B10.A(5R), B10.S(9R), B10.A, A/Sn и от гибридов между ними и мышами линии AKR: (B10.A(5R)×В10.A) F1 (B10.S(9R)×B10.A) F1, (B10.A(5R)×A/Sn) F1, (B10.S(9R)×A/Sn) F1, a суспензию стволовых клеток вводят в хвостовую вену зараженным мышам в течение двух недель по одному разу в неделю в дозе 1 млн. клеток.
Эффективность трансплантации была подтверждена использованием культивированных in vitro мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга гибридов F1 от рекомбинантных линий мышей в условиях in vivo (выживаемость).
Исследования действия стволовых клеток проводились in vivo на мышиной модели активного экссудативно-некротического туберкулеза.
Определялся показатель выживаемости животных (инбредная линия мышей C57BL/6) после заражения их смертельной дозой микобактерий туберкулеза H37Rv.
Материал и методы.
Клетки костного мозга получали от мышей инбредной линии AKR и рекомбинантных линий B10.A(5R), B10.S(9R), B10.A, A/Sn и гибридов F1 между ними: (B10.A(5R)×В10.А) F1, (B10.S(9R)×В10.А) F1, (B10.A(5R)×A/Sn) F1, (B10.S(9R)×A/Sn) F1. Самцов 8-10 недельного возраста выводили из эксперимента разрушением шейного отдела спинного мозга. Стерильно извлекали бедренные кости, освобождали их от мягких тканей. Эпифизы полученных костей отделяли, а диафизы с помощью инсулиновых шприцов промывали ростовой средой, состоящей из DMEM (ПанЭко, РФ), содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки с подтвержденной способностью поддерживать рост мезенхимных стволовых клеток (БиоЛот, РФ), 40 ед./мл гентамицина (ПанЭко, РФ) и 12 мМ L-глютамина (ПанЭко, РФ). Выделенные из диафизов костей клетки помещали в конические пробирки (содержимое 1 кости в 1 пробирку), содержащие 5 мл ростовой среды, и центрифугировали 10 мин при 400g. Осадок из каждой пробирки слегка ресуспендировали, не добиваясь образования строго одноклеточной суспензии в ростовой среде, и высевали в 10 см чашки Петри (Costar,CUIA), содержащие 10 мл среды. Содержимое одной пробирки высевали на 3 чашки. Культивирование клеток проводили в специализированном CO2-инкубаторе (модель 484, ThermoForma, USA) в атмосфере, содержащей 5% CO2 и 3% кислорода.
Через 24 часа чашки промывали 3 раза полной ростовой средой, смытые клетки удаляли. К оставшимся клеткам добавляли полную ростовую среду, которую меняли каждые три дня. Через 9 дней клетки для снятия с пластика два раза промывали теплым раствором, содержащим 0,25% раствора трипсина (ПанЭко, РФ) в смеси с Версеном (ПанЭко, РФ) в соотношении 1:1 и оставляли для снятия в третьей смене раствора. К снятым клеткам добавляли 10-кратный избыток среды с сывороткой. Эти клетки (мезенхимальные стволовые клетки) отмывали полной ростовой средой, осаждали, подсчитывали количество клеток, ресуспендировали в нужном объеме физиологического раствора и вводили внутривенно зараженным МБТ мышам в количестве 1×106 клеток в 0,3 мл физиологического раствора на мышь. Клетки этой фракции трансплантировали зараженным микобактериями туберкулеза (МБТ) мышам два раза - по одному разу в неделю через 7 дней после заражения.
После двух внутривенных трансплантаций первичных клеточных культур от мышей инбредной линии AKR и рекомбинантных линий мышей и их гибридов F1, было проведено наблюдение за сроками выживаемости зараженных мышей C57BL/6.
В таблице 1 приведены генотипы инбредной линии AKR и гибридов F1, полученных от скрещиваний рекомбинантных линий мышей, использованных в работе.
| Таблица 1 | ||||
| Генотипы линии AKR и гибридов F1, полученных от скрещиваний рекомбинантных линий мышей. | ||||
| Гибриды F1 | Генотип по H-2 гибридов F1 | |||
| K | A | E | D | |
| AKR | k | k | k | k |
| 5R×A/Sn |
|
|
|
|
| 5R×B10.A |
|
|
|
|
| 9R×A/Sn |
|
|
|
|
| 9R×B10.A |
|
|
|
|
В таблице 2 приведены сроки гибели зараженных МБТ мышей после трансплантации им первичных клеточных культур, полученных из костного мозга рекомбинантных линий. Как видно из таблицы, статистически достоверной разницы в сроках выживания опытных мышей по сравнению с контролем выявлено не было. Отличие составляла инбредная линия AKR, поскольку введение первичных клеточных культур из ККМ от мышей этой линий значительно увеличивала продолжительность жизни зараженных животных линии C57BL/6 по сравнению с контролем (р<0,0001).
| Таблица 2 | |||||
| Выживаемость (дни) зараженных мышей линии C57B L/6 после трансплантации им первичных мезенхимальных клеточных культур, полученных из ККМ от линии AKR и рекомбинантных линий мышей | |||||
| Контроль | AKR | A/Sn | В10.А | B10.A(5R) | B10.S(9R) |
| 18 | 38 | 16 | 16 | 18 | 19 |
| 22 | 42 | 18 | 19 | 20 | 20 |
| 24 | 42 | 18 | 24 | 20 | 20 |
| 25 | 42 | 20 | 24 | 21 | 24 |
| 26 | 42 | 23 | 26 | 22 | 24 |
| 27 | 42 | 27 | 28 | 24 | 26 |
| 29 | 44 | 28 | 29 | 28 | 27 |
| 24,4±1,3 | 41,7±0,68 | 21,4±1,7 | 23,7±1,7 | 21,8±1,2 | 24,8±1,2 |
| p<0,0001 |
В то же время трансплантация первичных клеточных культур от мышей инбредной линии AKR и от гибридов F1 (Табл.3) значительно увеличивала сроки жизни опытных мышей по сравнению с контролем. Разница во всех случаях была статистически достоверной. Исключение составляли первичные клеточные культуры мезенхимальных клеток от гибридов (B10.A(5R)×В10.А) F1, поскольку трансплантация этих клеток зараженным МБТ мышам продляла сроки жизни подопытных мышей не столь значительно по сравнению с контролем.
| Таблица 3 | |||||
| Выживаемость (дни) зараженных мышей линии C57BL/6 после трансплантации им первичных мезенхимальных клеточных культур, полученных из ККМ линии AKR и гибридов F1 от рекомбинантных линий мышей. | |||||
| Контроль | AKR | (B10.A(5R)×A/Sn) F1 | (B10.S(9R)×A/Sn) F1 | (B10.A(5R)×В10.A) F1 | (B10.S(9R)×D10.А) F1 |
| 18 | 38 | 28 | 28 | 24 | 32 |
| 22 | 42 | 28 | 49 | 24 | 33 |
| 24 | 42 | 28 | 50 | 25 | 34 |
| 25 | 42 | 42 | 53 | 25 | 35 |
| 26 | 42 | 56 | 56 | 28 | 39 |
| 27 | 42 | 57 | 59 | 30 | 43 |
| 29 | 44 | 57 | 68 | 34 | 46 |
| 24,4±1,3 | 41,7±0,68 | 42,3±5,4 | 51,9±4,7 | 27,1±1,4 | 37,4±2,0 |
| p<0,0001* | p<0,0077* | p<0,0001* | p<0,0002* | ||
| * - p по сравнению с контролем |
Увеличение сроков жизни зараженных мышей линии C57BL/6 после трансплантации им первичных клеточных культур от гибридов F1 в отличие от родительских рекомбинантных линий, объясняется генетической комплементацией, произошедшей в сублокусе H-2E главного комплекса гистосовместимости H-2 мыши после получения гибридов F1 в результате чего этот сублокус стал иметь в генотипе аллель “k” в транс-положении и функциональность этого сублокуса была восстановлена (см. таблицу 1). Мыши инбредной линии AKR имеют с сублокусе H-2E аллель “k”.
Таким образом, благодаря усовершенствованию известного способа, достигается требуемый результат, заключающийся в упрощении способа и расширении области применения, что проявляется в уменьшении дозы вводимых стволовых клеток и обеспечивается действием положительного эффекта аллогенной трансплантации первичных клеточных культур мезенхимального происхождения, имеющих генотип Н-2k (мыши линии AKR и гибриды F1 от рекомбинантных линий мышей), зараженным мышам линии C57BL/6 (H-2b). Помимо этого, при помощи использования специальных гибридов F1 от рекомбинантных линий мышей, показано, что положительные результаты аллогенной трансплантации контролируются сублокусом H-2E главного комплекса гистосовместимости мыши, несущим аллель “k”.
Способ лечения экспериментального туберкулеза у мышей линии C57BL/6(H-2b), основанный на трансплантации стволовых клеток путем введения в хвостовую вену мышей один раз в неделю суспензии стволовых клеток, выделенных из костей мышей, резистентных к туберкулезу, отличающийся тем, что в качестве стволовых клеток используют культивированные in vitro клеточные культуры мезенхимального происхождения с генотипом "k" в сублокусе Н-2Е главного комплекса гистосовместимости, которые выделяют от следующих гибридов мышей: B10.A(5R), B10.S(9R), В10.A, A/Sn, и от гибридов между ними и мышами линии AKR: (B10.A(5R)×B10.A)F1, (B10.S(9R)×B10.A)F1, (B10.A(5R)×A/Sn)F1, (B10.S(9R)×A/Sn)F1, а суспензию стволовых клеток вводят в хвостовую вену зараженным мышам в течение двух недель по одному разу в неделю в дозе 1 млн клеток.
