Способ получения водорастворимого бактерицидного препарата
Владельцы патента RU 2502259:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ордена Трудового Красного Знамени Институт химии силикатов им. И.В. Гребенщикова Российской академии наук (ИХС РАН) (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины "Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИЭМ" СЗО РАМН) (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к бактерицидным препаратам с лизоцимной активностью. Смешивают водные растворы нитрата серебра и лизоцима в заданном соотношении с получением восстановленного металлического серебра. Восстановленное металлическое серебро стабилизируют добавлением водного раствора желатина в заданном соотношении. Полученную смесь подергают УФ-облучению при непрерывном перемешивании в течение 25-30 минут, в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм. В течение 25-30 минут в диапазоне длинноволнового излучения 365 нм. В течение 55-60 минут в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм. Проводят диализ обработанной смеси в течение 24-30 часов при непрерывном перемешивании, с использованием бидистиллированной воды с последующей сушкой под вакуумом. Изобретение позволяет получить нетоксичный и стабильный в растворе хлорида натрия бактерицидный препарат. 2 табл. 3 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к бактерицидным препаратам с лизоцимной активностью, содержащим ферменты животного происхождения, и к способу их получения. Препарат может быть использован в медицине и ветеринарии в качестве аппликаций наружного применения, при лечении гнойно-септических осложнений ран, язв, пролежней, ожогов, бактериальных поражений слизистой глаз и полости рта, а также грибковых заболеваний. Его важным свойством является проявление активности как в отношении грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов.
Для оценки новизны и технического уровня изобретения рассмотрим ряд известных заявителю технических средств аналогичного назначения, характеризуемых совокупностью сходных с изобретением признаков, известных из сведений, ставших общедоступными до даты приоритета изобретения.
Использование лизоцима яичного белка в качестве бактериолитического фермента известно в медицине, см. Подборнов В.М. Сравнительная характеристика лизоцимов разного происхождения. - Антибиотики и химиотерапия, 1990, т.35, N 8, с 22-25.
К недостаткам использования лизоцима можно отнести узкий спектр его действия, так как он не оказывает литического действия на целый ряд микроорганизмов, в том числе и патогенных. В частности, он действует только против грамположительных бактерий.
Кроме того, антибиотическая активность природных антимикробных пептидов и белков, в том числе и лизоцима, в средах с повышенной концентрацией хлорида натрия снижается, что особенно неблагоприятно при использовании препаратов, в состав которых входят подобные полипептиды, при поражениях кожи, так как на поверхности кожи концентрация хлорида натрия на порядок превышает таковую в плазме крови.
Известен препарат для профилактики и лечения инфекционных болезней животных и человека (патент РФ №2169573), включающий лизоцим яичного белка и микробный лизоцим при соотношении ингредиентов 1:1-2 по активности.
В известном препарате в качестве исходного продукта использован лизоцим яичного белка. Недостаток лизоцима яичного белка как исходного продукта для изготовления препарата для профилактики и лечения инфекционных болезней заключается в том, что его активность проявляется в отношении инфекций, вызываемых грамположительными бактериями. Кроме того, он не может быть использован для лечения гнойно-септических осложнений ран, язв, пролежней, ожогов, бактериальных поражений слизистой глаз и полости рта, а также грибковых заболеваний и инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями.
Известен способ получения водорастворимой бактерицидной композиции (повиаргола), содержащей высокодисперсное металлическое серебро, стабилизированное защитным полимером. Композиция получена путем восстановления ионного серебра в водных растворах при нагревании с последующей сушкой. Восстановление ионного серебра ведут в атмосфере инертного газа при взаимодействии 0,025-29,73 мас. раствора нитрата серебра с 5,0-38,6 мас. водным раствором этилового спирта, содержащим 0,065-11,0 мас. поли-N-винилпирролидона-2, при этом реакцию проводят в темноте с нагреванием до 65-75°С (патент РФ №2088234).
Этот способ выбран в качестве прототипа заявляемого технического решения. Недостатком прототипа является то, что он не обеспечивает полное восстановление ионного серебра. Наличие ионного серебра в полученной водорастворимой бактерицидной композиции определяет токсичность полученного препарата и нестабильность в растворе хлорида натрия.
На практике стабильность антимикробных препаратов в присутствии хлорида натрия является необходимым условием их эффективности, поскольку в организме человека хлорид натрия присутствует в широком диапазоне концентраций в различных биологических жидкостях. Стабильность серебросодержащих препаратов при контакте с биологическими жидкостями также невысока. При их практическом применении в присутствии хлорида натрия происходит образование осадка, что не позволяет этим препаратам равномерно распределяться в жидкостях и тканях организма, что снижает их эффективность.
Задачей изобретения является создание способа получения нетоксичного, стабильного в растворе хлорида натрия бактерицидного препарата с расширенным спектром действия за счет обеспечения его активности по отношению к грамотрицательным бактериям, обеспечивающим повышение эффективности лечения гнойно-септических осложнений ран, язв, пролежней, ожогов, бактериальных поражений слизистой глаз и полости рта.
Сущность изобретения как технического решения выражается в следующей совокупности существенных признаков, достаточной для достижения указанного выше обеспечиваемого изобретением технического результата.
Способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, включающий смешение исходных компонентов, с последующей стабилизацией металлического серебра полимером путем восстановления ионного серебра в водных растворах с последующей сушкой, характеризуется тем, что восстановление ионного серебра в водном растворе ведут при взаимодействии нитрата серебра, лизоцима и желатина при следующем соотношении компонентов, мас.%: лизоцим 0,043-0,045, нитрат серебра - 0,073-0,085, желатин 0,071-0,080, вода - остальное, после чего полученную смесь подвергают чередующемуся воздействию УФ-облучения, затем проводят диализ и сушку под вакуумом.
Заявленное техническое решение характеризуется также наличием ряда факультативных признаков, а именно:
- полученную смесь исходных компонентов подвергают УФ-облучению при непрерывном перемешивании в течение 25-30 минут, в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм, затем в течение 25-30 минут в диапазоне длинноволнового излучения 365 нм и 55-60 минут в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм, а диализ обработанной смеси проводят в течение 24-30 часов при непрерывном перемешивании.
Наличие наночастиц серебра позволяет усилить бактерицидную способность лизоцима и получить водорастворимый бактерицидный препарат, обладающий активностью по отношению к грамотрицательным бактериям. Введение желатина позволяет стабилизировать серебро в форме наночастиц и улучшить активность получаемого препарата в растворах NaCl.
В таблице 1 приведены примеры составов исходного продукта для получения водорастворимого бактерицидного препарата.
| Таблица 1 | |||||
| Название компонентов | Составы исходного продукта для получения препарата, мас.% | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| лизоцим | 0.043 | 0.044 | 0.043 | 0.042 | 0.046 |
| желатин | 0.071 | 0.073 | 0.074 | 0.071 | 0.071 |
| нитрат серебра | 0.073 | 0.079 | 0.08 | 0.073 | 0.073 |
| вода | 99.813 | 99.804 | 99.803 | 99.814 | 99.810 |
| Продолжение таблицы 1 | ||||||
| Название компонентов | Составы исходного продукта для получения препарата, мас.% | |||||
| 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| лизоцим | 0.043 | 0.043 | 0.043 | - | - | 0.2 |
| желатин | 0.071 | 0.071 | 0.025 | 0.026 | - | - |
| нитрат серебра | 0.072 | 0.086 | 0.073 | 0.073 | 0.85 | - |
| вода | 99.814 | 99.803 | 99.816 | 99.904 | 99.15 | 99.8 |
В таблице 1 составы 1-3 подтверждают качественное и количественное соответствие заявленных компонентов, составы 4-8 количественно выходят за рамки заявленного диапазона, в составах 9-11 приведены примеры с наличием или отсутствием компонентов заявленных составов.
В сравнительной таблице 2 приведены свойства водорастворимого бактерицидного препарата в соответствии с составами исходного продукта для его получения.
| Таблица 2 | |||||
| Замеряемые параметры | Примеры составов исходного продукта и их антимикробная активность | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| Стабильность в NaCl (0.15М) | +++ | +++ | +++ | + | - |
| Антимикробная активность (МИК), мкг/мл: | |||||
| Ecsherichia coli ML35p | 31 | 31 | 31 | 55 | 18 |
| Acinetobacter baumannii (клиничекий изолят) | 8 | 8 | 8 | - | - |
| Stahylococcus aureus SG511 | |||||
| MRSA ATCC 33591 | 31 | 31 | 31 | 110 | 18 |
| 62 | 62 | 62 | 110 | 36 | |
| Токсичность для фибробластов человека | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| для нейтрофилов человека | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 |
| Продолжение таблицы 2 | ||||||
| Замеряемые параметры | Примеры составов исходного продукта и их антимикробная активность | |||||
| 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| Стабильность в NaCl (0.15М) | + | - | - | + | - | +++ |
| Антимикробная активность (МИК), мкг/мл: | ||||||
| Ecsherichia coli ML35p | 65 | 24 | 32 | 31 | 6 | 2100 |
| Acinetobacter baumannii (клиничекий изолят) | - | - | - | 6 | - | |
| Stahylococcus aureus SG511 | 65 | 48 | 32 | 80 | 6 | 60 |
| MRSA ATCC 33591 | не акт. | 96 | 64 | 80 | 6 | 2100 |
| Токсичность для фибробластов человека | 1 | 2 | 2 | 1 | 4 | 0 |
| для нейтрофилов человека | 2 | 2 | 2 | 2 | 4 | 0 |
Результаты исследований составов исходного продукта для получения водорастворимого бактерицидного препарата, описанных выше, представлены следующими характеристиками: антимикробная активность, токсичность, стабильность в 150 мм растворе хлорида натрия NaCl.
Антимикробная активность представлена как минимальная ингибирующая рост микробов концентрация (МИК) препаратов, в мкг/мл. Антимикробную активность образцов, полученных по заявляемому способу, изучали методом серийных разведений в питательной среде. Антимикробную активность исследовали в отношении грамотрицательных бактерий - Escherichia coli ML35p, Acinetobacter baumannii, грамположительных бактерий Staphylococcus aureus SG511 и MRSA АТСС 33591.
Также была исследована токсичность полученных образцов для фибробластов и нейтрофилов человека. Для оценки цитотоксичности препаратов для культивируемых клеток использовали следующую шкалу: 0 баллов - отсутствие цитотоксического действия; 1 балл - слабое токсическое действие (20-25% гибель клеток); 2 балла - мягкое токсическое действие (50% гибель клеток); 3 балла - умеренное токсическое действие (70-75% гибель клеток); 4 балла - тяжелое токсическое действие (100% гибель клеток) - при использовании препаратов в концентрациях, в 5 раз превышающих МИК.
При проведении исследований были использованы следующие нормативные документы:
“Оценка токсичности и опасности дезинфицирующих средств” Методические указания МУ 1.2.1105-02 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 10 февраля 2002 г.).
Методические указания по использованию культуры диплоидных клеток человека, рекомендуемых для токсиколого-гигиенических исследований. Утверждены МЗ СССР 18.09.91 №15-6/21. М., 1991. 20 с.
Образец удовлетворяет требованиям безопасности, если ни одна из опытных клеточных культур не имеет степень более 1.
Стабильность известных ранее серебросодержащих препаратов при контакте с биологическими жидкостями также невысока. При их практическом применении в присутствии хлорида натрия NaCl происходит образование осадка, что не позволяет этим препаратам равномерно распределяться в жидкостях и тканях организма, что снижает их эффективность.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что составы №1-3, представляющие собой сочетание лизоцима, желатина и нитрата серебра в заявленных соотношениях, подтверждают возможность решения поставленных нами задач и достижения указанного технического результата, а именно получены образцы, стабильные в растворе хлорида натрия, они обладают антимикробной активностью широкого спектра действия и не являются токсичными. Заявленные составы исходного продукта для получения водорастворимого бактерицидного являются оптимальными и в сравнении с чистым лизоцимом (состав №11), раствором нитрата серебра (состав №10), а также с наночастицами серебра (состав №9), стабилизированными желатином.
Состав №4, содержащий меньше лизоцима, чем составы №1-2-3, обладает меньшей антимикробной активностью. Увеличение содержания лизоцима (состав №5) приводит к нестабильности получаемого препарата в растворе NaCl. Снижение количества нитрата серебра (состав №6) приводит к снижению антимикробной активности препарата, увеличение же его содержания (состав №7) ведет к возникновению нестабильности в растворе NaCl. Уменьшение количества желатина ниже 0.071 мас.% (состав №8) приводит к снижению стабильности препарата в среде NaCl.
Кроме того, были проведены дополнительные испытания (пример не включен в таблицу №1) с увеличением содержания желатина до величин, превышающих 0.8 мас.%, что приводит к нежелательному гелированию получаемой композиции, и как следствие, к снижению технологичности процесса.
Таким образом, именно сочетание нитрата серебра, лизоцима и желатина в заявленных соотношениях, а именно, мас.%: лизоцим 0.043-0.045, нитрат серебра (AgNO3) 0.073-0.085, желатин 0.071-0.080, вода H2O - остальное - позволяет достигнуть требуемого технического результата - получение нетоксичного, стабильного в растворе хлорида натрия NaCl препарата, расширение спектра действия препарата за счет активности по отношению к грамотрицательным бактериям и повышение эффективности лечения гнойно-септических осложнений ран, язв, пролежней, ожогов, бактериальных поражений слизистой глаз и полости рта.
Техническая сущность способа поясняется приведенными ниже примерами №1-3.
Пример 1. Восстановление ионного серебра ведут при смешении 3 мл 0.073 мас.% водного раствора нитрата серебра и 3 мл 0.043 мас.% водного раствора лизоцима. Восстановленное металлическое серебро стабилизируют добавлением 1 мл 0.071 мас.% водного раствора желатина.
Полученную смесь подвергают УФ-облучению при непрерывном перемешивании в течение 25 минут, в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм, затем 25 минут в диапазоне длинноволнового излучения 365 нм и 55 минут в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм.
Затем проводят диализ полученного образца, для чего помещают в диализный мешок с микропорами 14000 Да в течение 24 часов при непрерывном перемешивании, с использованием бидистиллированной воды 1000 мл. Сушку проводят под вакуумом.
Пример 2. Восстановление ионного серебра ведут при смешении 3 мл 0.079 мас.% водного раствора нитрата серебра и 3 мл 0.044 мас.% водного раствора лизоцима. Восстановленное металлическое серебро стабилизируют добавлением 1 мл 0.073 мас.% водного раствора желатина.
Полученную смесь подвергают УФ-облучению при непрерывном перемешивании: в течение 25 минут в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм, затем 25 минут в диапазоне длинноволнового излучения 365 нм и 55 минут в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм.
Затем проводят диализ полученного образца, для чего помещают в диализный мешок с микропорами 14000 Да в течение 28 часов при непрерывном перемешивании, с использованием бидистиллированной воды 1000 мл. Сушку проводят под вакуумом.
Пример 3. Восстановление ионного серебра ведут при смешении 3 мл 0.08 мас.% водного раствора нитрата серебра и 3 мл 0.043 мас.% водного раствора лизоцима. Восстановленное металлическое серебро стабилизируют добавлением 1 мл 0.074 мас.% водного раствора желатина.
Полученную смесь подвергают УФ-облучению при непрерывном перемешивании в течение 25 минут, в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм, затем 25 минут в диапазоне длинноволнового излучения 365 нм и 55 минут в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм.
Затем проводят диализ полученного образца, для чего помещают в диализный мешок с микропорами 14000 Да в течение 30 мин при непрерывном перемешивании, с использованием бидистиллированной воды 1000 мл, далее сушку вакуумом.
Результаты исследований полученных образцов в различных условиях показали, что с увеличением времени УФ-обработки выпадает осадок и наблюдается нестабильность полученных композиций в растворе хлорида натрия NaCl. Условия получения, описанные в примерах реализации способа 1-3, наиболее оптимальны для решения поставленной задачи и позволяют получить технический результат.
Возможность промышленного применения заявленного технического решения подтверждается известными и описанными в заявке средствами и методами, с помощью которых возможно осуществление изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в формуле изобретения.
Способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, включающий смешивание исходных компонентов, с последующей стабилизацией металлического серебра полимером путем восстановления ионного серебра в водных растворах с последующей сушкой, отличающийся тем, что восстановление ионного серебра в водном растворе ведут при взаимодействии нитрата серебра, лизоцима и желатина при следующем соотношении компонентов, мас.%: лизоцим 0,043-0,045, нитрат серебра (AgNO3) 0,073-0,085, желатин 0,071-0,080, вода - остальное, полученную смесь исходных компонентов подвергают УФ-облучению при непрерывном перемешивании в течение 25-30 минут в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм, затем в течение 25-30 минут в диапазоне длинноволнового излучения 365 нм и 55-60 минут в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм, а диализ обработанной смеси проводят в течение 24-30 часов при непрерывном перемешивании.
