Способ введения в культуру клеток льна многолетнего

Авторы патента:

A01H4/00 - Разведение растений из тканевых культур

Владельцы патента RU 2506741:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный машиностроительный университет (МАМИ)" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой получение каллуса на питательной среде Мурасиге-Скуга, доведенной до 1 литра водой, в течение одного пассажа, где в питательную среду добавляют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту с концентрациями 4-8 мг/л, культивируют семена льна многолетнего, в питательную среду Гамборга добавляют 6-бензиламинопурин с концентрацией 1-2 мг/л и α-нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и затем на питательную среду Гамборга пересаживают полученные каллусы для регенерации и культивируют в течение 2-4 пассажей, в жидкую питательную среду Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50% добавляют α-нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и на нее пересаживают растения-регенеранты и культивируют их в течение 2-4 пассажей. Изобретение позволяет ввести в культуру клетки льна многолетнего. 3 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в исследованиях в области физиологии растений, общей и городской экологии.

Известны работы по льну-долгунцу, который используется в сельском хозяйстве и в животноводстве, а так же в других отраслях промышленности (Поляков А.В. Биотехнология в селекции льна: Монография. - Тверь, 2000, с.139; Белоногова М.А. Генетическая трансформация льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) с использованием семядольных эксплантов. Автореферат дисс. на соискание уч. ст. канд. биол. наук, Москва, 2006, с.4).

Наиболее близким является способ введения в культуру клеток льна, заключающийся в получении каллуса на питательной среде Мурасиге-Скуга, доведенной до 1 литра водой, в течение одного пассажа (Гончарук Е.А., Калашникова Е.А., Дубравина Г.А., Загоскина Н.В. Влияние кадмия на морфологические и биохимические характеристики каллусных клеток чайного растения и льна-долгунца. С.-х. биотехнология. - М.: Воскресенье, Т.2, 2001, с.101). Для получения стерильных проростков использовали семена льна-долгунца (Linum usitatissimum L.). Семена стерилизовали 0,1% раствором сулемы в течение 10-12 мин, промывали в трех порциях стерильной дистиллированной воды, после чего культивировали на питательной среде Мурасиге-Скуга без регуляторов роста. Каллусную культуру получали из сегментов гипокотилей. Для этого гипокотили культивировали на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. Пересадку каллусной ткани осуществляли один раз в месяц. Для регенерации использовали питательную среду Мурасиге-Скуга с добавлением 1 мг/л 6-бензиламинопурина.

Однако в известных способах используется другой вид льна - лен-долгунец (Linum usitatissimum L.) и применение этого способа оказалось неэффективным для льна многолетнего (Linum perenne L.).

Среди недостатков способа-прототипа можно отметить получение каллусной ткани из сегментов гипокотилей, что затрудняло и увеличивало продолжительность культивирования. На этапах стерилизации семян не использован спирт, соответственно не было проведено обезжиривание семян, что в последующем уменьшает эффективность стерилизующего агента (сулемы). Использование 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты на этапе каллусообразования было неэффективным для льна многолетнего (процент каллусообразования - 9,4%), регенерация на среде Мурасиге-Скуга с 1 мг/л 6-бензиламинопурина была низкой (процент регенерации - 18,4%). Растения льна многолетнего с корневой системой получить не удалось.

Задачей метода было разработать способ введения в культуру клеток, регенерации и укоренения растений льна многолетнего.

Поставленная задача решается тем, что согласно изобретению на питательную среду Мурасиге-Скуга, доведенной до 1 литра водой, добавляют 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоту с концентрациями 4-8 мг/л, культивируют семена льна многолетнего (Linum perenne L.) в течение одного пассажа, в питательную среду Гамборга добавляют 6-бензиламинопурин с концентрацией 1-2 мг/л и α-нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и затем на питательную среду Гамборга пересаживают полученные каллусы для регенерации и культивируют в течение 2-4 пассажей, в жидкую питательную среду Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50% добавляют α-нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и на нее пересаживают растения-регенеранты и культивируют их в течение 2-4 пассажей.

Таким образом, сущность изобретения состоит в том, что в качестве первичных эксплантов использовали семена льна многолетнего (Linum perenne L.), процесс каллусообразования происходил на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) в концентрациях 4-8 мг/л в течение 1 пассажа, затем регенерация на питательной среде Гамборга с добавлением 6-бензиламинопурина (БАП) с концентрацией 1-2 мг/л и α-нафтилуксусной кислоты (НУК) с концентрацией 0,1-0,5 мг/л, в течение 2-4 пассажей, укоренение растений на питательной среде Мурасиге-Скуга, с концентрацией всех компонентов 50%, с добавлением НУК с концентрацией 0,1-0,5 мг/л, в течение 2-4 пассажей.

Заявленные пределы определены следующим образом: при концентрации 2,4-Д менее 4 мг/л - процент каллусообразования незначительный и большая часть семян образует побеги; при увеличении концентрации 2,4-Д в питательной среде более 8 мг/л происходит уменьшение каллусообразования и существенное снижение морфогенетической активности в дальнейших пассажах. При концентрации БАП ниже 1 мг/л культивирование каллусов сопровождалось повышенным процессом ризогенеза у каллусных тканей и существенным снижением регенерационной способности; выше 2 мг/л - также происходило существенное снижение регенерационной способности. При концентрации НУК ниже 0,1 мг/л не образовывались морфогенные каллусы; культивирование на среде с 0,5 мг/л НУК сопровождалось снижением регенерационной способностью и повышенным процессом ризогенеза у каллусных тканей. На этапе укоренения на концентрациях выше или ниже 0,1-0,5 мг/л практически не образовывались растения с корневой системой.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, результаты по примерам представлены в таблицах.

Пример 1

Для введения в культуру клеток льна многолетнего (Linum perenne L.) использовались семена растений. Предварительно семена стерилизовали однократной обработкой спиртом с последующей стерилизацией раствором, содержащим гипохлорит натрия (с содержанием активного хлора 75-95 г/дм³) в течение 15-20 мин. Затем их три раза промывали стерильной дистиллированной водой. Стерилизация семян в растворе, содержащим гипохлорит натрия, менее 15 мин была неэффективной, наблюдалась высокая зараженность семян при культивировании на питательной среде; более 20 мин - семена обесцвечивались и теряли жизнеспособность. Семена культивировали на питательной среде Мурасиге-Скуга видоизмененной добавлением 2,4-Д, каллус получали в течение одного пассажа.

Пример 2

Эмбриогенный каллус формировался с высокой частотой на семенах при концентрации 2,4-Д: 4; 6 и 8 мг/л (таблица 1) на питательной среде Мурасиге-Скуга в течение одного пассажа.

Таблица 1
Частота каллусообразования (%) льна многолетнего (Linum perenne L.) в зависимости от концентраций 2,4-Д в питательной среде Мурасиге-Скуга
Концентрация 2,4-Д, мг/л	Частота каллусообразования (%)
1	9,4±0,6
2	38,0±2,7
4	56,8±4,0
6	63,3±6,5
8	67,4±8,1
10	45,0±3,6

Пример 3

Культивирование каллуса на средах с высоким содержанием 2,4-Д (10 мг/л) приводило к существенному снижению способности к морфогенезу. Образовавшиеся каллусы пересаживают на питательную среду Гамборга видоизмененную добавлением БАП - 1-2 мг/л и НУК - 0,1-0,5 мг/л для культивирования морфогенных каллусов и регенерации в течение 2-4 пассажей. При культивировании более 4 пассажей существенно снижалась регенерационная способность, менее 2 пассажей прирост каллусной ткани был незначительный. Полученные регенеранты для укоренения помещали в пробирки на мостики из фильтровальной бумагой, с жидкой питательной средой Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50% видоизмененную добавлением НУК - 0,1-0,5 мг/л.

Пример 4

Регенерацию льна многолетнего проводят на питательной среде Гамборга. В качестве фитогормонов используют БАП (1-2 мг/л) и НУК (0,1-0,5 мг/л). Использование среды Мурасиге-Скуга было менее эффективным, так как процент морфогенных каллусов был ниже, чем на среде Гамборга. Например, при концентрации 1 мг/л БАЛ и 0,1 мг/л НУК максимальный процент морфогенных каллусов на среде Гамборга составлял 63,5%, а на среде Мурасиге-Скуга - 42,1% (таблица 2).

Таблица 2
Доля каллусов с побегами (%) льна многолетнего (Linum perenne L.) в зависимости от концентраций БАП и НУК в питательной среде
Концентрация БАЛ+НУК, мг/л	Доля каллусов с побегами (%) на среде Мурасиге-Скуга	Доля каллусов с побегами (%) на среде Гамборга
1+0	18,4±2,1	34,2±3,8
1+0,1	42,1±2,7	63,5±4,9
1+0,5	36,4±3,9	50,8±5,2
1+1,0	11,2±1,6	14,2±1,6
2+0,1	32,5±3,7	46,0±4,5
2+0,5	24,9±2,8	30,7±2,8

Пример 5

Укоренение проводят на жидкой питательной среды Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50% и видоизмененную добавлением НУК с концентрациями 0,1-0,5 мг/л в течение 2-4 пассажей. При культивировании в течение 1 пассажа корни практически не образовывались, а культивирование более 4 пассажей не приводило к увеличение количества укореняемых растений.

Таблица 3
Доля растений-регенерантов с корнями (%) у льна многолетнего (Linum perenne L.) в зависимости от концентраций НУК в жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50%
Концентрация НУК, мг/л	Доля растений-регенерантов (%)
0	28,1±1,4
0,1	63,8±7,2
0,5	52,4±6,3
1	36,2±2,9
6	0

Техническим результатом изобретения является то, что частота каллусообразования составляет от 56,1% до 67,4%, регенерационная способность от 30,7% до 63,5%, укоренение от 52,4% до 63,8%. Результаты изобретения показывают высокую эффективность данного метода, который позволил получить высокий процент регенерации и укоренения растений.

Результаты показывают, что данный метод является эффективным, так как каллус образуется с высокой частотой, процент регенерации и укоренения in vitro высокий. Процесс получения растений из семян занимает 7-8 месяцев.

Все перечисленное выше позволяют рекомендовать данный метод для введения в культуру клеток льна многолетнего (Linum perenne L.).

Поставленная задача достигнута существенным повышением частоты каллусообразования и регенерации льна многолетнего.

Способ введения в культуру клеток льна многолетнего, заключающийся в получении каллуса на питательной среде Мурасиге-Скуга, доведенной до 1 литра водой, в течение одного пассажа, отличающийся тем, что в питательную среду добавляют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту с концентрациями 4-8 мг/л, культивируют семена льна многолетнего, в питательную среду Гамборга добавляют 6-бензиламинопурин с концентрацией 1-2 мг/л и α-нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и затем на питательную среду Гамборга пересаживают полученные каллусы для регенерации и культивируют в течение 2-4 пассажей, в жидкую питательную среду Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50% добавляют α-нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и на нее пересаживают растения-регенеранты и культивируют их в течение 2-4 пассажей.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ поверхностной стерилизации эксплантов и апикальных почек земляники садовой, винограда, хурмы сорта «Королек» in vitro.

Способ укоренения сенполии узамбарской // 2489848

Изобретение относится к способу укоренения черенков сенполии узамбарской и может быть использовано для цветочной рассады. .

Способ микроклонального размножения картофеля // 2487532

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, семеноводству картофеля, картофелеводству. .

Питательная среда для размножения яблони и груши in vitro // 2486237

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в процессе клонального микроразмножения яблони и груши на этапе собственно микроразмножения. .

Питательная среда для ризогенеза яблони и груши in vitro // 2485768

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой питательную среду для укоренения побегов яблони и груши in vitro. .

Способ адаптации пробирочных растений к нестерильным условиям // 2483530

Изобретение относится к адаптации растений к нестерильным условиям. .

Способ микроклонального размножения ириса сибирского (i.sibirica l.) // 2479992

Изобретение относится к цветоводству и биотехнологии, может быть использовано для массового размножения ценных декоративных сортов и гибридов ириса сибирского, освобождения их от системных патогенов, а также в селекционной практике для создания новых улучшенных сортов.

Способ повышения коэффициента размножения меристемных клубней картофеля // 2479983

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к семеноводству картофеля при подготовке оздоровленного посадочного материала. .

Способ предпосевной обработки семян селекционных образцов зерновых культур // 2461185

Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства. .

Способ микроклонального размножения лиственницы сибирской в культуре in vitro через соматический эмбриогенез на среде аи для плантационного лесовыращивания // 2456344

Изобретение относится к лесному хозяйству, а именно к созданию сортового плантационного лесовыращивания на основе современных инновационных биотехнологий. .

Способ микроклонального размножения ольхи черной in vitro // 2515385

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к микроклональному размножению in vitro. В способе культивируют каллусные культуры из стерильных эксплантов стеблевых сегментов, листьев, листовых черешков. Используют базовые питательные среды Мурасиге-Скуга, Вуди Плант Медиум с содержанием и соотношением регуляторов роста: 6-бензиламинопурин - 0,2-1,5 мг/л, α-нафтилуксусная кислота - 0,2-0,5 мг/л, индолилмасляная кислота - 2 мг/л. Далее проводят адаптацию при освещенности 2000 люкс и питательном режиме регенерантов в теплице с получением посадочного материала для лесных культур. Способ позволяет получать посадочный материал с высокими наследственными свойствами. 2 табл.

Способ получения растений-регенерантов земляники (in vitro) // 2516341

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растений-регенерантов земляники in vitro, включающий в себя введение эксплантов в культуру, размножение и укоренение вновь образованных in vitro побегов, где в качестве эксплантов используют фрагменты цветоложа и цветоножки из цветов земляники, взятых в фазе бутонизации, которые промывают под проточной водой в течение 15-25 минут, стерилизуют 0,1% раствором сулемы 10 минут, затем трижды промывают стерильной дистиллированной водой, цветоложе освобождают от чашелистиков и лепестков, разрезают на фрагменты 5×5 мм и помещают срезом на питательную среду, цветоножку отделяют от цветка, отрезают фрагмент длиной 5 мм и также помещают на питательную среду. Изобретение позволяет получить увеличенное количество растений-регенерантов от одного экспланта. 1 табл., 2 ил.

Способ микрочеренкования винограда in vitro // 2521992

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к виноградарству. Способ включает микроразмножение пробирочных растений и высадку их на жидкую питательную среду с добавлением макроэлементов, витаминов и биопрепаратов. При этом на основе субстрата Мурасиге-Скуга исключают активированный уголь, снижают содержание солей и кислот в 2-4 раза и добавляют Гумат+7B в количестве 5-10 мл/л. Способ позволяет повысить эффективность и ускорить размножение оздоровленных от вирусной инфекции перспективных сортов винограда. 2 табл., 1 пр.

Способ длительного хранения in vitro растений осины // 2522823

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ хранения растений осины в условиях in vitro, включающий культивирование микропобегов осины на питательной среде WPM с добавлением сахарозы 10-20 г/л, агар-агара 9 г/л и витаминов MS 1 мл/л, сорбитола 5-10 г/л и маннитола 5-10 г/л, причем хранение растений осуществляют при температуре +4°С в режиме освещения 8 ч день/16 ч ночь с интенсивностью 2000 люкс. Изобретение позволяет повысить сохранность in vitro культур ценных селекционных генотипов и генетически модифицированных клонов осины. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.

Способ микроклонального размножения подвоев яблони // 2523305

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ микроклонального размножения подвоев яблони, где на этапах введения в культуру и собственно микроразмножения в среду Мурасиге-Скуга в качестве стимулятора роста добавляется препарат фуролан в концентрации 0,004 мг/л. Изобретение позволяет повысить ряд показателей качества эксплантов подвоев яблони. 1 табл., 3 пр.

Способ размножения цимбидиума in vitro // 2523604

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения цимбидиума in vitro включающий введение стерильных эксплантов в культуру in vitro, микроразмножение путем отделения псевдобульб от экспланта и посадки на питательную среду Мурасиге-Скуга, укоренение псевдобульб в грунте, где после введения в культуру in vitro образовавшиеся псевдобульбы отделяют от экспланта и переносят на агаризованную питательную среду Мурасиге-Скуга,содержащую 30 г/л сахарозы и раствор препарата эпибрассинолида в концентрации 0,001 мг/л, затем псевдобульбы, имеющие корнепобеги, отделяют от эксплантов, обрабатывают раствором индолилуксусной кислоты в концентрации 1,0 мг/л в течение 15 минут и укореняют в условия ex vitro в грунте с добавлением мха и древесной коры. Изобретение позволяет повысить выход размножаемого материала за счет увеличения количества образующихся псевдобульб, при положительном влиянии оптимальных концентраций регуляторов роста.3 табл.

Способ получения форм картофеля in vitro, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза // 2524424

(57) Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Листовые экспланты, вычлененные из тридцатидневных асептических растений исходных сортов, выращенных в сосудах 1 л, помещают в чашки Петри с жидкой средой определенного состава и прединкубируют, кокультивируют и культивируют на питательных средах определенного состава. При появлении регенерантов размером не менее 10 мм их срезают и переносят на среду определенного состава. Проводят первый этап отбора форм, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза, путем культивирования срезанных регенерантов на среде МС с 50 мл/л канамицина сульфата в течение 30-45 дней при 22-25°C и освещенности 6000-10000 лк при 16-часовом фотопериоде с последующим отбором укоренившихся регенерантов картофеля с зелеными листьями и стеблями. Проводят второй этап отбора форм, устойчивых к возбудитялям фитофтороза и альтернариоза, включающий проверку укоренившихся растений методом ПЦР на наличие целевой ДНК и размножение регенерантов с подтвержденной ПЦР вставкой целевой ДНК микрочеренкованием. Использование заявленного способа позволяет получить устойчивые к возбудителям фитофтороза и альтернариоза формы картофеля. 5 табл.

Способ получения лапчатки белой (potentilla alba) // 2525676

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения растений лапчатки белой (Potentilla alba) методом культуры in vitro, включающий отделение вегетативных почек от корневища, стерилизацию, высаживание на питательные среды, микроразмножение побегов, укоренение побегов, адаптацию растений-регенерантов к нестерильным условиям. Использование заявленного способа позволяет получить более 150 тысяч саженцев в год от одного экспланта. 5 ил., 1 табл.

Способ регенерации микропобегов hyssopus officinalis l. в условиях in vitro // 2529837

Способ регенерации адвентивных микропобегов Hyssopus officinalis L. в условиях in vitro включает отделение листьевых дисков от микропобегов после 4-5 пассажа, полученных в культуре in vitro, дальнейшее культивирование их на модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга с половинной концентрацией макроэлементов и дополненной веществом цитокининового типа действия, а именно тидиазуроном, при этом культивирование проводят при пониженной интенсивности освещения. 4 табл.

Способ повышения коэффициента размножения капусты белокочанной в условиях in vitro // 2538163

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к селекции. Изобретение представляет собой способ повышения коэффициента размножения капусты белокочанной в условиях in vitro, включающий выращивание эксплантов, культирование их на питательной среде Мурасиге-Скуга, внесение в нее регуляторов роста тидиазурон в концентрации 1 мг/л в сочетании с индолил-3-уксусной кислотой - 0,5 мг/л, при использовании цветолож размером 0,2-0,3 мм, изолированных из бутонов длиной 0,5-0,7 мм, где цветоложе используют за 1-2 дня до распускания цветков и после выращивания их на питательных средах культивируют до образования почек в течение 14-21 суток. Способ позволяет получить большое количество растений-регенерантов с признаками ЦМС и получить генетически стабильный урожай селекционных образцов. 3 табл.