Способ прогнозирования сроков формирования абсцесса при остром панкреатите

Авторы патента:

G01N33/68 - с использованием протеинов, пептидов или аминокислот

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2508549:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (RU)

Изобретение относится к области медицинской диагностики и может быть использовано для прогнозирования сроков формирования абсцесса в фазу секвестрации острого панкреатита и, как следствие, неблагоприятного течения заболевания. Способ прогнозирования сроков формирования абсцесса в фазу секвестрации острого панкреатита включает выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ полиморфизма +250 A/G Ltα и при выявлении генотипов +250 GG или +250 AG Ltα прогнозируют риск раннего формирования абсцесса в фазу секвестрации острого панкреатита. 1 табл., 2 ил.

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования сроков формирования абсцесса в фазу секвестрации острого панкреатита и, как следствие, неблагоприятного течения заболевания.

Проблема острого панкреатита является одной из актуальнейших в экстренной хирургии. Это связано не только с тем, что заболевание очень распространено, но и с тем, что оно сложно в диагностике и в выборе лечебной тактики. Среди неотложных хирургических заболеваний органов брюшной полости острый панкреатит по частоте занимает 2-3-е место [1].

Острый панкреатит - поражение поджелудочной железы собственными активными ферментами - представляет непосредственную угрозу для жизни больного в результате выраженной интоксикации, нарушения гемодинамики и, как следствие, местных и общих осложнений, тяжелых функциональных сдвигов во всех органах и системах. Острый деструктивный панкреатит - первично асептический некроз поджелудочной железы с последующей воспалительной реакцией на очаги сформировавшегося некроза. Данное заболевание имеет фазовое течение: I фаза - ферментативная; II фаза - реактивная; III фаза - секвестрации и расплавления омертвевших участков. Неблагоприятным исходом острого панкреатита является инфицирование очагов некроза, приводящее к осложненному течению заболевания и в том числе к формированию панкреатического абсцесса в фазу секвестрации. Развитие абсцесса отягощает течение и исход заболевания, может приводить к полиорганной недостаточности и сепсису с летальным исходом. Раннее прогнозирование и своевременная диагностика гнойных осложнений при остром деструктивном панкреатите, позволяющая проводить адекватное лечение, является важнейшим звеном в лечении данной патологии.

Известен патент РФ №2312348 (С1) по заявке №2006109859/15 от 10.12.2007 (Рукосуева Мария Анатольевна (RU) и др.), где предложен способ прогнозирования риска возникновения, клинического течения и исхода острого алкогольного панкреатита, путем выделения ДНК из периферической венозной крови, исследования мутаций генов GSTM1 и GSTT1. При обнаружении «нулевого» генотипа GSTM1 или «нулевого» генотипа GSTT1 прогнозируют развитие деструктивной формы алкогольного панкреатита, а при обнаружении сочетания «нулевых» генотипов по генам GSTM1 и GSTT1 прогнозируют развитие тотального поражения поджелудочной железы. Способ позволяет выделить группу больных с высоким риском развития осложнений и обоснованно рекомендовать им проведение полномасштабной специализированной интенсивной терапии на ранних сроках; и определить оптимальную стратегию при лечении заболевания с точки зрения предикативной медицины и снизить или полностью исключить летальность у больных.

Недостатком прототипа является то, что исследование мутаций генов GSTM1 и GSTT1 не позволяет осуществить прогнозирование сроков формирования абсцесса при остром панкреатите.

Известно, что в ответ на формирование абсцесса происходит синтез таких провоспалительных медиаторов, как факторы некроза опухоли, в частности лимфотоксина α [2,3].

Согласно данным литературы лимфотоксин α, известный также как фактор некроза опухоли β, синтезируется в клетке в виде предшественника, построенного из 247 аминокислотных остатков. Зрелая форма состоит из 171 аминокислоты и имеет молекулярную массу 18,66 кД. Ген Lt α локализуется на 6 хромосоме в регионе р21.33. [4].

Можно выделить несколько биологических эффектов при действии лимфотоксина α:

1) цитотоксическое действие. Lt α обладает способностью индуцировать апоптоз, а также вызывает генерацию в клеточной мембране активных форм кислорода, оксидрадикалов, окиси азота, приводящих к цитолизу опухолевых клеток;

2) влияние на развитие иммунного ответа, инициируя пролиферацию Т и В-лимфоцитов и препятствуя тем самым возникновению иммунологической толерантности;

3) регуляция иммуновоспалительного ответа, обусловленного активацией нейтрофилов, эндотелиальных клеток;

4) метаболические влияния через стимулирование катаболических процессов [5].

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования сроков формирования абсцесса при остром панкреатите по данным о генетическом полиморфизме +250 A/G Ltα.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска раннего формирования абсцесса в фазу секвестрации острого панкреатита.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования сроков формирования абсцесса в III фазу заболевания, т.е. в фазу секвестрации острого панкреатита включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфизма гена лимфотоксина α;

- прогнозирование риска раннего формирования абсцесса в фазу секвестрации острого панкреатита в случае выявления генотипов +250 GG или +250 AG Ltα.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза сроков формирования абсцесса в III фазе острого панкреатита по данным полиморфизма гена лимфотоксина а (полиморфизм +250 A/G Ltα).

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных острым панкреатитом в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (рН 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1).

Изучение полиморфного локуса лимфотоксина α в 1 интроне проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов (табл.1) с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 2,5 мМ MgCl₂, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 мМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°С) выполняли 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров - 1 мин при 50°С; денатурация - 15 сек при 95°С.

Таблица 1
Структура праймеров и зондов, используемых для генотипирования исследуемого ДНК-маркера
Ген	Полиморфизм и его локализация в гене	Структура праймеров	Литература
Ltα	+250A/G (1 интрон)	F: 5'-CAGTCTCATTGTCTCTGTCACACATT-3'	(Т. Kim et al., 2003)
		R: 5'-ACAGAGAGAGACAGG AAGGGAACA-3'
		5' -FAM:CCATGGTTCCTCTC-RTQ1-3'
5' -ROX:CTGCCATGATTCC-RTQ1-3'

Изобретение характеризуется на следующих графических материалах.

На Фиг.1 представлена дискриминация аллелей по локусу +250 A/G Ltα, где • - гомозиготы +250GG, - гомозиготы +250АА, ▲ - гетерозиготы +250AG, которая осуществляется методом Tag Man зондов по данным величин RFU, где RFU это уровень относительной флуоресценции (УОФ) каждого зонда. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю А, зонд с красителем FAM - аллелю G.

На Фиг.2 иллюстрируются сроки формирования абсцесса в фазу секвестрации у больных острым панкреатитом в зависимости от генотипических вариантов локуса +250 A/G лимфотоксина α.

На фиг.1 две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием УОФ для одного флуорофора (на оси x) относительно УОФ для другого флуорофора (на оси у) на диаграмме дискриминации аллелей.

Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (AG).

Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю А (УОФ аллеля А отложены по оси у).

Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю G (RFU аллеля G отложены по оси x).

Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно (в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль).

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Ассоциации аллелей и генотипов изученного ДНК-маркера со сроками формирования абсцесса в фазу секвестрации острого панкреатита оценивали с помощью непараметрического метода - критерия Манна-Уитни. Для описания рассматриваемых количественных показателей применяли медиану (Me) и интерквартильный размах (Q25-Q75) [7].

Возможность использования предложенного способа для оценки риска раннего формирования абсцесса в III фазе острого панкреатита подтверждает анализ результатов наблюдений 195 больных острым панкреатитом. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования.

В исследуемую группу включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой.

Установлено, что у пациентов с генотипами +250 GG или +250 AG лимфотоксина α в фазу секвестрации острого панкреатита абсцесс формируется на 14,50 сутки от начала заболевания (нижний квартиль 14,00 суток; верхний квартиль 18,00 суток), тогда как у индивидуумов с генотипом +250 АА Ltα абсцесс формируется лишь на 18,00 сутки (интерквартильный размах 14, 00-23,00 сутки, p=0,02). (фиг.2).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что генетические варианты +250 GG или +250 AG лимфотоксина α ассоциированы с ранним формированием панкреатического абсцесса в III фазу секвестрации заболевания.

Больным с острым панкреатитом при выявлении генетических факторов риска раннего образования панкреатических абсцессов (+250 GG или +250 AG лимфотоксина α) следует проводить ранний диагностический поиск данного осложнения острого панкреатита (клинико-лабораторный, ультразвуковой, методы компьютерной томографии) с целью своевременной диагностики и лечения панкреатических абсцессов при остром панкреатите.

Литература

1. Багненко, С.Ф., Толстой, А.Д. Острый панкреатит. Протоколы диагностики и лечения // Анналы хирургической гепатологии. 2006. Т.11. №1. С.60-66.

2. Dugernier, Т, Reynaert, М, Laterre, PF. Early multi-system organ failure associated with acute pancreatitis: a plea for a conservative therapeutic strategy // Acta Gastroenterol Belg. 2003. №66(2). P.177-183.

3. Zhang, XP, Wang, L, Zhang, J. Study progress on mechanism of severe acute pancreatitis complicated with hepatic injury // J Zhejiang Univ Sci B. 2007. №8(4). P.228-236.

4. Царегородцева T.M. Цитокины при гастроэнтерологической патологии // Медицинская газета. - 2005. - №63. - С.17-24.

5. Баранов B.C. Геном человека и гены «предрасположенности». (Введение в предиктивную медицину) / B.C. Баранов, Е.В. Баранова, Т.Е. Иващенко // СПБ: «Интермедика», 2000 - 272 с.

6. Polymorphisms of tumor necrosis factor (TNF) α and β genes in Korean patients with psoriasis / T. Kim [et al.] // Arch. Dermatol. Res. - 2003. - V.295. - P.8-13.

7. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA [Текст] / О.Ю. Реброва. - М.: Медиасфера, 2006. - 305 с.

Способ прогнозирования сроков формирования абсцесса в фазу секвестрации острого панкреатита, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, отличающийся тем, что проводят анализ полиморфизма +250 A/G Ltα и прогнозируют риск раннего формирования абсцесса в фазу секвестрации острого панкреатита в случае выявления генотипов +250 GG или +250 AG.

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике и психиатрии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития параноидной шизофрении.

Биомаркеры, пригодные при диагностике фиброза печени // 2505821

Настоящее изобретение относится к способам диагностики фиброза печени у субъекта, включающим определение уровней экспрессии плазминогена урокиназного типа, матричной металлопротеиназы 9 и β-2-микроглобулина, вычисление на их основании балльной оценки и постановку диагноза.

Способ комплексного определения генетической предрасположенности к развитию зависимости от психоактивных веществ // 2505820

Изобретение относится к области медицины и предназначено для комплексного определения генетической предрасположенности к развитию зависимости от психоактивных веществ.

Способ определения типа воспалительного ревматического заболевания с использованием синовиальной жидкости // 2504788

Изобретение относится к медицине и описывает способ определения in vitro типа воспалительного ревматического заболевания, а именно дифференциации ревматоидного артрита от реактивного артрита и артрита при кожных заболеваниях, где определяют присутствие или отсутствие белка Hdj2 в синовиальной жидкости на ранней стадии заболевания, т.е.

Способ диагностики уролитиаза // 2504786

Изобретение относится к медицине, а именно к урологии и нефрологии, и может быть использовано для диагностики мочекаменной болезни (уролитиаза). Сущность способа: исходную пробу мочи разделяют на два одинаковых образца, получают гистограммы распределения частиц по размерам, по которой определяют процентное содержание олигомерной формы Т&НЕ(7) белка Тамма-Хорсфалла и сравнивают гистограммы образцов.

Способ индивидуального назначения системной пульс-терапии глюкокортикостероидами пациентам с эндокринной офтальмопатией // 2503011

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии и офтальмологии, и может быть использовано для отбора пациентов с активной фазой эндокринной офтальмопатии, нуждающихся в системной пульс-терапии метилпреднизолоном.

Способ диагностики больных остеохондрозом поясничного отдела // 2503010

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии и ортопедии, и может быть использовано для диагностики остеохондроза поясничного отдела позвоночника и для дифференциальной диагностики между поясничным остеохондрозом и другими спондилогенными заболеваниями поясничного отдела.

Новые аллергены пшеницы // 2502742

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, конкретно к новым аллергенам, и может быть использовано в диагностике аллергии. Новые аллергены используют в способе диагностики IgE-опосредованной аллергии in vitro на пшеницу, включающем контактирование образца жидкости организма из млекопитающего, у которого предполагается наличие IgE-опосредованной аллергии на пшеницу, по меньшей мере, с одним полипептидом с SEQ ID NO: 2 или 8, или с его фрагментом или вариантом, имеющим общие эпитопы для антител с указанным полипептидом и имеющим последовательность, идентичную SEQ ID NO: 2 или 8 по крайней мере на 95%; и выявление присутствия в образце IgE-антител, специфично связывающихся с указанным полипептидом или полипептидами.

Способ получения терапевтического агента для лечения клещевого энцефалита // 2501862

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения терапевтического агента для лечения клещевого энцефалита людей. Способ включает получение аптамеров, которые способны образовывать комплекс с третичной структурой поверхностного белка вируса.

Способ прогнозирования тяжести течения эпилепсии // 2499262

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, в частности к способу прогнозирования тяжести течения эпилепсии. Сущность способа состоит в том, что определяют спектр молекул средней массы в сыворотке крови пациента до начала терапии.

Маркерные гены для применения в идентификации фенотипической стабильности хондроцитов и в скрининге факторов, влияющих на продуцирование хряща // 2508548

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования in vitro способности популяции клеток, полученных из сустава, продуцировать стабильный гиалиновый хрящ in vivo.

Способ диагностики вируса инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых методом полимеразной цепной реакции // 2508547

Изобретение относится к области молекулярной биологии и ветеринарии и предназначено для диагностики вируса инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых.

Способ прогнозирования риска развития диабетической ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2 типа // 2507520

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования риска развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа. Осуществляют выделение ДНК из периферической венозной крови, проводят анализ полиморфизма -308G/A гена фактора некроза опухоли α и при выявлении аллеля -308A TNFα прогнозируют повышенный риск развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа.

Способ прогнозирования течения острого панкреатита // 2507519

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования сроков наступления реактивной фазы острого панкреатита. Осуществляют выделение ДНК из периферической венозной крови, проводят анализ полиморфизма гена фактора некроза опухоли α и при выявлении генотипов -308 АА или -308 GA TNFα прогнозируют риск позднего наступления реактивной фазы острого панкреатита.

Способ определения водостойкости антиперспирантного продукта // 2505815

Изобретение относится к области косметики и представляет собой способ определения водостойкости антиперспиранта, включающий: a) отбор участников исследования; b) выполнение требований участниками исследования о не использовании каких-либо продуктов или использовании продуктов, не содержащих антиперспирант, в подмышечных областях в течение требуемого периода; c) очистку подмышечных областей каждого участника исследования; d) нанесение необходимого количества антиперспирантного продукта на одну подмышечную область и плацебо на другую подмышечную область каждого участника исследования; e) выполнение стадии d) до достижения необходимого числа нанесений, если выбирается более одного нанесения; f) после выполнения последнего нанесения проводят водное испытание, включающее круговое движение участников исследования в бассейне и/или плавание в течение периода времени активности в бассейне с глубиной воды, достаточной для смачивания подмышечных областей; g) проведение оценки потоотделения; и h) определение того, проявляет ли антиперспирантный продукт по меньшей мере стандартную антиперспирантную эффективность.

Способ выявления мутации с.-53-2а>g в гене престина (slc26a5), вызывающей развитие несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты // 2505608

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ выявления мутации c.-53-2A>G в гене SLC26A5, сопровождающийся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты.

Способ прогнозирования риска раннего развития атеросклероза у больных хроническим простатитом // 2504782

Изобретение относится к области медицины, в частности к прогнозированию риска раннего развития атеросклероза у больных хроническим простатитом. Сущность способа состоит в том, что в сыворотке крови больных хроническим простатитом молодой возрастной группы определяют уровень общего тестостерона, секссвязывающего глобулина с последующим расчетом индекса свободного тестостерона, а также определяют содержание липопротеидов высокой плотности, триацилглицеридов и рассчитывают коэффициент атерогенного риска по формуле.

Способ диагностики предрасположенности пациента к наследственной макулодистрофии штаргардта // 2504781

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ диагностики предрасположенности пациента к наследственной макулодистрофии Штаргардта.

Способ оценки функционального состояния эндотелия экспериментальных животных после реконструктивных операций на брюшной аорте // 2503961

Изобретение относится к медицине, в частности к способу оценки функционального состояния эндотелия (ФСЭ) экспериментальных животных после реконструктивных операций на брюшной аорте.

Способы скрининга с использованием насекомых, имеющих гематоэнцефалический барьер // 2503004

Предлагаются модели на насекомых, предназначенные отображать проницаемость гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) у млекопитающего, в частности, человека. Изобретение касается способа оценки транспорта химического соединения через ГЭБ, а также применения насекомых в скрининге веществ, обладающих биологическим действием на мозг или центральную нервную систему и/или действующих на заболевание или нарушение, затрагивающее мозг или центральную нервную систему.

Способ выявления o-гликозилированных белков в составе клеточных гомогенатов, подготавливаемых к протеомному и фосфопротеомному анализу // 2509807

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа выявления O-гликозилированных белков в составе клеточных гомогенатов, подготавливаемых к протеомному и фосфопротеомному анализу. Предложенное изобретение может быть использовано для проведения протеомного и фосфопротеомного анализа. Способ включает проведение двумерного электрофореза с последующей идентификацией пятен методами спектроскопии MALDI-TOF или фосфопротеомики. Проводят обессоливание клеточных гомогенатов методом гель-хроматографии или диализа клеточных гомогенатов. Подвергают клеточные гомогенаты дегликозилированию по принципу β-элиминирования в растворе 0,05 М NaOH, который содержит 38 мг/мл NaBH4, в течение 16 часов при +45°C с последующим добавлением цианинового красителя JC-1 в концентрации 10-6 М. Инкубируют клеточные гомогенаты в течение 15 мин при комнатной температуре. Концентрируют гомогенаты осаждением 50% ацетоном, подвергают двумерному электрофорезу с образованием электрофореграмм, анализируемых на флуоресценцию при облучении на трансиллюминаторе синего цвета со светофильтром янтарного цвета, визуально проявляющуюся в виде светящихся в темноте полос. Данные полосы экстрагируют из геля и используют для проведения протеомного или фосфопротеомного анализа. Дополнительный анализ интенсивности и расположения экстрагируемых полос выполняют за счет сравнения окрашенных азотнокислым серебром электрофореграмм гомогенатов до и после процедуры дегликозилирования. Предложенное изобретение позволяет идентифицировать белки, меняющие состав или степень своего O-гликозилирования в результате какого-либо физиологического воздействия на клетку. 5 ил.