Способ анализа транслокаций eml4-alk, ассоциированных с чувствительностью рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии
Владельцы патента RU 2509153:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" РАМН) (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) (RU)
Изобретение относится к молекулярной генетике. Способ включает: получение кДНК EML4-ALK с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) на матрице РНК гена EML4-ALK с использованием специфичных праймеров; амплификацию фрагментов гена EML4-ALK методом мультиплексной ПЦР на матрице кДНК, полученной на первом этапе ОТ-ПЦР, с помощью набора высокоспецифичных праймеров; получение флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта на втором этапе ОТ-ПЦР; создание биочипа для анализа транслокаций EML4-ALK, содержащего набор иммобилизованных зондов; гибридизацию флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта с зондами в гелевых ячейках на пластиковой подложке биочипа; регистрацию и интерпретацию результатов гибридизации. Способ предусматривает использование технологии ДНК-биочипов, сконструированных с целью определения 6 вариантов транслокаций EML4-ALK (V2, V3, V5, V4, V7, V1). Способ обладает высокой чувствительностью и специфичностью, универсален, его осуществление возможно с операционным материалом и опухолевой тканью, заключенной в парафиновые блоки; регистрацию результатов производят однократно в конце исследования, способ занимает менее 24 часов. 2 з.п. ф-лы, , 3 табл., 3 ил.
Изобретение относится к медицине, а именно к генетике, молекулярной биологии, онкологии, и касается способа определения чувствительности рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии, современного метода лечения с помощью препаратов, направленных на рецепторы опухолевых клеток.
Известен способ анализа транслокаций EML4-ALK с использованием набора праймеров, позволяющих амплифицировать исследуемый фрагмент и анализировать результат с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, капиллярного или обычного гель-электрофореза и набора антител для иммуногистохимического анализа, позволяющего идентифицировать мутантные белки (международная патентная заявка WO 2011087709).
Недостатки способа: данный способ имеет ограниченное применение ввиду дорогостоящих реактивов и оборудования для его осуществления.
Известен способ анализа транслокаций гена ALK, включая инверсию EML4-ALK, с использованием флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и ПЦР в реальном времени (международная патентная заявка WO 2011087709).
Недостатки способа: использование дорогостоящих реактивов и дорогого специфического оборудования, исследование занимает более 24 часов.
Известен способ анализа транслокации EML4-ALK для диагностики и терапии немелкоклеточного рака легких с использованием одностадийной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и набора антител к химерному белку (международная патентная заявка WO 2011095894).
Недостатки способа: осуществление данного способа требует дорогостоящих реактивов и оборудования.
Наиболее близким к заявляемому способу (прототипом) является способ анализа транслокации гена ALK, включая EML4-ALK, с использованием флуоресцентной гибридизации с биочипами. Прототип включает следующие приемы: выделение РНК-матрицы из биологического материала; двухэтапную стандартную ОТ-ПЦР; изготовление зондов, представляющих собой амплифицированные последовательности ДНК, комплементарные анализируемому участку гена; гибридизацию флуоресцентно-меченого продукта, полученного в ОТ-ПЦР, с зондом на биочипе; анализ результатов гибридизации с помощью сканера и специальных компьютерных программ (международная патентная заявка WO 2010132888).
Недостатки способа: для осуществления данного способа используют дорогостоящую тест-систему; анализ генетических изменений занимает более суток; не исключена неспецифическая гибридизация ПЦР-продукта с зондом, что снижает чувствительность и точность способа; требуется нефиксированный в формалине биологический материал.
Задачей заявляемого изобретения является создание нового, более точного, простого в исполнении, менее дорогостоящего и занимающего меньше времени способа анализа транслокаций EML4-ALK, ассоциированных с чувствительностью рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии.
Технический результат. Заявляемый способ прост в исполнении, является экономически оправданным, осуществляется без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, универсален, его осуществление возможно с операционным материалом и опухолевой тканью, заключенной в парафиновые блоки, регистрацию результатов производят однократно в конце исследования, способ занимает менее 24 часов.
Сущность заявляемого способа заключается в анализе транслокаций EML4-ALK, ассоциированных с чувствительностью рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии, с использованием технологии мультиплексной ОТ-ПЦР и последующей гибридизации флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта с биологическим микрочипом (биочипом), в ячейки которого нанесены высокоспецифичные зонды для дифференцировки сигналов гибридизации. Анализ результатов гибридизации осуществляется с помощью детектирующей системы, распознающей флуоресцентный сигнал портативным анализатором биочипов, снабженным ПЗС-камерой со специальным программным обеспечением.
Заявляемый способ анализа основан на определении 6 вариантов транслокаций EML4-ALK (V2, V3, V5, V4, V7, V1) с использованием мультиплексной ОТ-ПЦР и биочипа, содержащего набор иммобилизованных дифференцирующих зондов для гибридизации с ПЦР-продуктами.
Способ иллюстрируется фигурами 1-3 и таблицами 1-3.
На фиг.1 представлена схема биочипа для анализа транслокаций EML4-ALK.
На фиг.2 представлена картина гибридизации экспериментального образца опухоли, не несущей транслокаций EML4-ALK.
На фиг.3 - картина образца опухоли, несущей вариант транслокации EML4-ALK V3.
В табл.1 представлены выбранные последовательности прямого и обратного праймеров для ОТ-ПЦР.
В табл.2 представлены последовательности праймеров для первого этапа мультиплексной ПЦР (SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 18).
В табл.3 представлены последовательности набора 11 зондов, использованных для изготовления биочипа (SEQ ID NO: 21-31).
Заявляемый способ включает следующие приемы: получение кДНК EML4-ALK с помощью ОТ-ПЦР на матрице РНК гена EML4-ALK с использованием специфичных праймеров; амплификацию фрагментов гена EML4-ALK методом мультиплексной ПЦР на матрице кДНК, полученной на первом этапе ОТ-ПЦР, с помощью набора высокоспецифичных праймеров; получение флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта на втором этапе ОТ-ПЦР; создание биочипа для анализа транслокаций EML4-ALK, содержащего набор иммобилизованных зондов; гибридизацию флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта с зондами в гелевых ячейках на пластиковой подложке биочипа; регистрацию и интерпретацию результатов гибридизации.
Заявляемый способ осуществляется следующим образом. На первом этапе забирали биологический материал - опухолевую ткань, замороженную в жидком азоте или заключенную в парафин в виде блоков. Фрагменты опухолевой ткани измельчали или снимали стерильным скальпелем со стекол путем микродиссекции, суспендировали и выделяли тотальную РНК с помощью набора RNeasy FFPE Kit.
Анализируемые последовательности гена EML4-ALK амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР. Для амплификации гена EML4-ALK (V3a) использовали праймеры SEQ ID NO: 11, 15. ПЦР-смесь первого этапа общим объемом 25 мкл содержала 1 × ПЦР-буфер (трис-НСl - 67 мМ, рН 8.6, (NH4)2SO4 - 166 мМ, 0,01% Тритон Х-100), MgCl2 - 1,5 мМ, дНТФ - по 0,2 мМ, 2,5 Ед Taq-полимеразы, праймеры - по 0,2 мкМ (SEQ ID NO: 11, 15) и 20 нг ДНК. Амплификацию проводили по следующей схеме: денатурация при t=94°С в течение 3 мин 30 с и далее 35 циклов амплификации при t=94°C в течение 30 с, при t=62°C в течение 20 с, при t=72°C в течение 10 с и элонгация при t=72°C в течение 3 мин.
Смесь второго этапа ПЦР отличалась составом, концентрацией, температурой отжига праймеров и содержала прямой праймер - 0,2 мкМ (SEQ ID NO: 12), обратный праймер - 2 мкМ (SEQ ID NO: 16). Для флуоресцентного мечения ПЦР-продукта второго этапа в смесь добавляли флуоресцентно-меченый дУТФ-Су5 - 0,2 нМ, который встраивался в цепь в процессе амплификации. Для этого в стандартную реакционную смесь добавляли избыток одного из пары праймеров и флуоресцентной метки (дезоксинуклеотидтрифосфата Су5-дУТФ), получали избыток флуоресцентно-меченого одноцепочечного ПЦР-продукта - ампликона, способного к гибридизации с аллель-специфичными зондами, иммобилизованными в ячейках биочипа.
Полученную на первом этапе ОТ-ПЦР кДНК использовали как матрицу и проводили амплификацию по схеме: денатурация при t=94°С в течение 3 мин 30 с, далее 35 циклов амплификации при t=94°C в течение 30 с, при t=56°C в течение 20 с, при t=72°C в течение 10 с, затем элонгация при t=72°C в течение 3 мин.
Праймеры и зонды синтезировали с помощью фосфоамидитного метода на автоматическом ДНК/РНК синтезаторе. В табл.1 представлены выбранные последовательности прямого и обратного праймеров для ОТ-ПЦР. Модификацию зондов для введения активной группы проводили как в автоматическом режиме при синтезе с использованием широкого спектра коммерческих модификаторов, так и после синтеза, в ручном режиме. При синтезе зондов с помощью 3'-Amino-Modifier С7 CPG 500 на 3'-конец присоединяли последовательность-спейсер со свободной аминогруппой для последующей иммобилизации зонда в ячейке биочипа.
В табл.2 представлены последовательности праймеров для первого этапа мультиплексной ПЦР (SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 18). На втором этапе использовали праймеры SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 19, 20. Для оптимизации ПЦР использовали только праймеры, которые не образовывали между собой высокоэнергетических внутренних структур: шпилек и дуплексов, и обеспечивали специфичную амплификацию необходимого количества продукта. Отжиг праймеров осуществляли при одинаковой температуре. Оптимизировали такие параметры ПЦР, как концентрацию MgCl2 и праймеров в ПЦР-смеси, соотношение прямых и обратных праймеров, количество циклов амплификации, время элонгации, денатурации и отжига праймеров на первом и втором этапах ПЦР.
Зонды для иммобилизации на биочипе и праймеры подбирали так, чтобы идентифицировать все выбранные для анализа транслокации EML4-ALK варианты. Затем проводили гибридизацию флуоресцентно-меченых ПЦР-продуктов, полученных после второго этапа ОТ-ПЦР, с иммобилизованными в ячейках геля зондами - участками гена EML4-ALK, комплементарными последовательности гена дикого типа или мутантного гена.
Ампликоны денатурировали путем прогрева гибридизационной смеси при t=95°C в течение 5 мин с последующим быстрым охлаждением на льду 2 мин и затем проводили гибридизацию SSPE-буфере 1X. Состав буфера 20 X: NaCl - 174 г, Na3C6H5O7 - 88,2 г, деионизированной Н2О - 800 мл, ЭДТА - 7,4 г, доводили рН до 7,0 с помощью 1 ON раствора NaOH (6,5 мл), затем объем буфера доводили Н2О до 1 л и стерилизовали автоклавированием. Продолжительность гибридизации составляла 12-14 ч при t=37°C.
Анализ генотипов и аллелей в исследуемом образце проводили с учетом расположения зондов на биочипе, схема которого указывала на вариант транслокации. При наличии стабильных совершенных дуплексов между ПЦР-продуктом и зондом получали сигнал флуоресценции. При отсутствии комплементарности между ПЦР-продуктом и зондом сигнал флуоресценции отсутствовал.
Биочипы изготовливали путем последовательного нанесения ячеек акриламидного геля на пластиковую подложку матрицы с иммобилизацией зондов в соответствующих ячейках. Для иммобилизации использовали зонды, несущие по 5'- или 3'-концу активную группу. В табл.3 представлены последовательности набора 11 зондов, использованных для изготовления биочипа (SEQ ID NO: 21-31). Дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов проводили после отмывки биочипа, сравнивая интенсивность сигналов флуоресценции в соответствующих ячейках биочипа. Для этого биочип отмывали в буфере с добавлением соли: SSC 20Х: NaCl - 175, 3 г, Na3C6H5O7 - 88,2 г и деионизированной Н2О - 800 мл, доводили рН до 7,0 с помощью 10 N раствора NaOH и объем до 1 л, затем автоклавировали. Далее анализировали полученную флуоресцентную картину с помощью детектирующей системы, распознающей флуоресцентный сигнал - портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой и специальным программным обеспечением производства ООО «Биочип-ИМБ» (Россия), и делали вывод о генотипе опухоли в исследуемом образце.
Наличие транслокации ассоциировалось с чувствительностью рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии. Схема биочипа для анализа транслокаций EML4-ALK представлена на фиг.1. Праймеры в первых двух ячейках верхнего ряда соответствовали контрольной последовательности. В ячейки нижнего ряда нанесли праймеры, соответствующие участку гена ALK, в первом, втором и третьем ряду - праймеры, соответствующие различным вариантам транслокаций EML4-ALK. Картина гибридизации образца опухоли, не несущей транслокаций EML4-ALK, представлена на фиг.2. Флуоресцентный сигнал наблюдается только в ячейках биочипа с праймерами, контрольными для ОТ-ПЦР, следовательно, анализируемый образец не содержит транслокациий EML4-ALK. Картина образца опухоли, несущей вариант транслокации EML4-ALK V3, представлена на фиг.3. Флуоресцентный сигнал наблюдается в ячейках с праймерами, соответствующими транслокации EML4-ALK (V3a), анализируемый образец содержит этот вариант транслокации. При сравнении картин гибридизации образцов опухолей без транслокаций и образцов опухолей с транслокациями показано, что чувствительность и специфичность заявляемого способа составляет не более 1% клеток с мутацией (транслокацией AML4-ALK) на 99% клеток, не несущих транслокацию.
| Таблица 1 | |||||
| Способ анализа транслокаций EML4-ALK, ассоциированных с чувствительностью рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии | |||||
| Название | SEQ | Последовательность, | Длина, | T | Размер |
| праймеров | ID NO: | 5'-3' | пар оснований | отжига,°С | ампликона, пар оснований |
| EML4-RT | 1 | GCTGCCCTCTTCAC | 14 | 40 | - |
| ALK-RT | 2 | CGAATGAGGGTGATG | 15 | 42 | - |
| Таблица 2 | ||||||
| Способ анализа транслокаций EML4-ALK, ассоциированных с чувствительностью рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии | ||||||
| Вариант | Название | SEQ | Последовательность, | Длина, | Т | Размер |
| праймеров | ID NО: | 5'-3' | пар оснований | отжига, °С | ампликона, пар оснований | |
| V1 | EML13-1 | 3 | GCCAAAATTTGTGCAGTGTTT | 21 | 63 | 249 |
| EML13-2 | 4 | GTGGAGTCATGCTTATATGG | 20 | 58 | 137 | |
| V2 | EML20-1 | 5 | CACACACCTTGACTGGTCC | 19 | 62 | 195 |
| EML20-2 | 6 | CTAACTCGGGAGACTATGAATTG | 23 | 58 | 101 | |
| V4 | EML15-1 | 7 | GGGATGTTATTAACTGGAGGA | 21 | 62 | 167 |
| EML15-2 | 8 | ATCTGAATCCTGAAAGAGAAG | 21 | 57 | 59 | |
| V7 | EML15-1 | 9 | GGGATGTTATTAACTGGAGGA | 21 | 63 | 191 |
| EML15-2 | 10 | ATCTGAATCCTGAAAGAGAAAT | 22 | 58 | 83 | |
| V3 | EML6-1 | 11 | CACATAATTCTTGGGAAAATTCA | 23 | 62 | 250 |
| EML6-2 | 12 | CACCCAAATTAATACCAAAAGT | 22 | 57 | 137 | |
| V5 | EML2-1 | 13 | GCTGATGTTTTGAGGCGTCTTG | 22 | 62 | 197 |
| EML2-2 | 14 | GAAGATCATGTGGCCTCAG | 19 | 57 | 114 | |
| ALK | ALKR-1 | 15 | CAAAGCAGTAGTTGGGGTTGT | 21 | 62 | |
| ALKR-2 | 16 | GCTCAGCTTGTACTCAGGGC | 20 | 62 | ||
| EML4 | K23F1 | 17 | CCCTGCTCCAAAGCAAAG | 18 | 64 | 349 |
| K23R1 | 18 | CACTTGGCTCCACAGTTTGTT | 21 | 63 | ||
| K23F2 | 19 | GGTGGAAAAGACATGAGCA | 19 | 56 | 194 | |
| K23R2 | 20 | CTTATTCTACTTTCCTCTTCAG | 20 | 56 |
| Таблица 3 | |||
| Способ анализа транслокаций EML4-ALK, ассоциированных с чувствительностью рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии | |||
| Вариант | SEQ | Последовательность зонда | Длина, |
| слияния | ID NO: | 5'-3' | п.о. |
| VI | 21 | CTACTGTAGAGCCCACACCT | 20 |
| V2 | 22 | ATGAAATATTGTACTTGTAC | 20 |
| V4 | 23 | AAATAGAGATATGCTGGATG | 20 |
| V7 | 24 | CACACTTTGTCAGATGAGAA | 20 |
| V3 | 25 | GTTACCAAAACTGCAGAC (V3a) | 18 |
| 26 | CCAAGCAAAAATGTCAACT (V3b) | 19 | |
| V5 | 27 | GAAAAAATCAGTCTCAAGTA | 20 |
| ALK К | 28 | AGCCATGCAGATGGA | 15 |
| 29 | CAGGAGCTGCAAGCC | 15 | |
| EML4K | 30 | TGAGACTGTAGCGGATAC | 18 |
| 31 | CACTGAAAGTGTCATCCAAT | 20 |
1. Способ анализа транслокаций EML4-ALK, ассоциированных с чувствительностью рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии, включает: получение кДНК EML4-ALK с помощью реакции ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) на матрице РНК EML4-ALK со специфичными праймерами (SEQ ID NO: 1-2); амплификацию фрагментов гена EML4-ALK методом мультиплексной ПЦР на матрице кДНК с наборами специфичных праймеров (SEQ ID NO: 3-20); получение флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта на втором этапе ОТ-ПЦР; создание биочипа для анализа 6 вариантов транслокаций EML4-ALK (V2, V3, V5, V4, V7, V1), содержащего набор иммобилизованных дифференцирующих зондов (SEQ ID NO: 21-31); гибридизацию флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта с зондами в ячейках биочипа; регистрацию и интерпретацию результатов гибридизации.
2. Способ по п.1, в котором для идентификации транслокаций EML4-ALK, амплифицированных с помощью набора специфичных праймеров, используют биочип, представляющий собой пластиковую подложку с гелевыми ячейками, содержащими набор иммобилизованных зондов, комплементарных анализируемым участкам гена EML4-ALK.
3. Способ по п.1, в котором регистрацию результатов гибридизации проводят с помощью портативного устройства, регистрирующего и записывающего сигналы флуоресценции.
