Способ количественного определения клеток-предшественников (cd34+) в кроветворной ткани
Владельцы патента RU 2513511:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" РАМН) (RU)
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для количественного определения клеток-предшественников в кроветворной ткани. Для этого проводят окраску клеточного субстрата одновременно моноклональными антителами к антигену CD34 и нуклеотропным (ядерным) красителем Syto16, при этом подсчет клеток-предшественников (CD34+) осуществляют в пределах Syto16+ клеток. Использование данного способа позволяет количественно учесть всю популяцию CD34+CD45 клеток в пределах ядросодержащих Syto16+ без предварительного ограничения области анализа на основании экспрессии антигена CD45 и избежать занижения процента CD34+ клеток-предшественников. 1 пр., 2 ил.
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии и онкологии, и касается способа количественного определения клеточного состава кроветворной ткани.
В комплексном лечении злокачественных заболеваний и ряда наследственных, генетических болезней используется трансплантация кроветворных клеток. Успех трансплантации кроветворной ткани определяется количеством клеток-предшественников в донорской ткани. Поддержание и восстановление кроветворения обеспечивается пулом клеток-предшественников (CD34+). Количественный подсчет клеток-предшественников (CD34+) в кроветворной ткани стал возможным с момента открытия антигена, выявляемого на мембране стволовых клеток, молекулы CD34. [Civin C.I., Strauss L.S. J. Immunol. Antigenic analysis of hematopoiesis. III. A hematopoietic progenitor cell sutface antigen defined by a monoclonal antibody raised against KG-1 a cell. 1984, 133:157-164].
Содержание клеток-предшественников (CD34+) в кроветворной ткани представляет малую клеточную популяцию. Даже в условиях предварительной стимуляции кроветворения их содержание не превышает от 1,0 до 3,0%, поэтому их подсчет в каждой пробе предполагает анализ не менее 100000-150000 клеток.
Существует несколько способов количественного определения клеток-предшественников (CD34+) в кроветворной ткани.
Известен способ количественного определения клеток-предшественников (CD34+) в кроветворной ткани с использованием одинарной окраски. Способ основан на экспрессии на мембране клеток-предшественников антигена CD34 и заключается в том, что клетки инкубируют с моноклональными антителами к антигену CD34. Подсчет количества клеток-предшественников (CD34+) осуществляют с помощью проточной цитофлуориметрии. Область исследования, включающая клетки-предшественники (CD34+), ограничивается мононуклеарными клетками и выбирается на основании характеристик светорассеяния (SSC/FSC - боковое светорассеяние, отражающее гранулярность клеток, против прямого светорассеяния, отражающего размер клетки) [Civin С.I., Strauss L.S.; J. Immunol., Antigenic analysis of hematopoiesis. III. A hematopoietic progenitor cell sutface antigen defined by a monoclonal antibody raised against KG-1a cell, 1984, 133:157-164, Krause D.S., Fackler M.J., Civin C.I., CD34: structure, biology and clinical utility. Blood, 1996, 87:1-13; Андреева Л.Ю. Автореф. дисс. канд. мед. наук, Москва, 1999].
Недостатки способа: сложность в пересчете абсолютного количества клеток- предшественников (CD34+), контаминация клеточными обломками и эритроцитами, что приводит к занижению количества CD34+ клеток.
Известен способ количественного определения клеток-предшественников (CD34+) с использованием двойной окраски, при котором клеточный субстрат окрашивается одновременно моноклональными антителами (МКА) к антигену CD34 и к антигену CD45, который определяется на мембране всех клеток крови за исключением эритроцитов Область исследования ограничена только CD45+ клетками, в пределах этой популяции подсчитывают содержание клеток-предшественников (CD34+). Способ позволяет рассчитать относительное количество клеток-предшественников (CD34+) от количества лейкоцитов [Gratama J.W., Kraan J., Keeney M, and al. Validation of the single-platform ISHAGE method for CD34+ hematopoietic stem and progenitor cell enumeration in an international multicenter study. Cytotherapy. 2003, 5 (1) 55-65; Allan D.S., Keeney M., Howson-Jan K. Number of viable CD34+cells reinfused predict engraftment in autologous hematopoietic stem cell transplantation. Bone marrow Transplant. 2002, 29: 967-972]. Данный способ является прототипом заявляемого способа.
Недостатки способа: часть клеток-предшественников (CD34+) может не экспрессировать антиген CD45 или экспрессирует его с очень низкой плотностью, поэтому при подсчете возможны значительные потери количества клеток-предшественников (CD34+).
Задача заявляемого изобретения состоит в создании нового, более точного способа количественного определения клеток-предшественников (CD34+) в кроветворной ткани. Поставленная задача решается тем, что для количественного определения клеток-предшественников (CD34+) используют моноклональные антитела к антигену CD34 и нуклеотропный (ядерный) краситель Syto16, при этом подсчет CD34+ клеток осуществляют в пределах Syto16+ клеток.
Изобретение иллюстрировано фигурами 1 (А-Г) и 2 (А-Д).
Заявляемый способ осуществляется следующим образом.
Кроветворные клетки (костный мозг, пуповинная кровь, стимулированная периферическая кровь, цитаферезный продукт) больных и доноров в количестве 100 микролитров (мкл) помещали в пробирку и вносили 10 мкл моноклональных антител к антигену CD34, которые были конъюгированы с флуорохромными частицами фикоэритрина-РЕ, инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Далее добавляли 0,5 мл лизирующего раствора, не содержащего фиксирующих компонентов, и инкубировали в течение 5-7 минут в темноте при комнатной температуре. Клеточную суспензию доводили фосфатным буфером до объема от 4,5 до 10 мл, далее клетки осаждали центрифугированием при оборотах 500g в течение 5 минут, освобождались от надосадочной жидкости, добавляли 2 мкл рабочего раствора Syto16 в разведении 1:1000 и ресуспендировали. Подсчитывали количество клеток-предшественников (CD34+) на проточном цитофлуориметре без ограничения гейтов на всю клеточную популяцию, при этом в каждой пробе анализировали 100000-150000 клеток.
Syto16+ клетки определяли в диапазоне канала FL-1 проточного цитофлуориметра. Подсчет количества клеток-предшественников (CD34+) осуществляли непосредственно после окончания реакции, не позднее 24 часов с момента ее постановки. Пробирки с клеточной суспензией хранили в холодильнике при температуре 4°С.
Проведена сравнительная оценка количественного определения клеток-предшественников (CD34+) по заявляемому способу и прототипа на 25 образцах кроветворной ткани (лейкаферезный продукт) с использованием моноклональных антител к антигену CD34 и общелейкоцитарному антигену CD45 и нуклеотропного (ядерного) красителя Syto16.
Кроветворные клетки каждого образца были инкубированы одновременно с моноклональными антителами к антигенам CD34 и CD45, и по окончанию инкубации к клеткам добавлен нуклеотропный (ядерный) краситель Syto16.
Количественное определение клеток-предшественников (CD34+) проводили с помощью проточной цитофлуориметрии, производили подсчет количества клеток-предшественников CD34+CD45+ и CD34+Syto16+ (фиг.1 (А-Г) и фиг.2 (А-Д).
На фиг.1 (А-Г) представлена экспрессия общелейкоцитарного антигена CD45 клетками-предшественниками (CD34+).
На фиг.1А представлены все клетки образца, количество клеток-предшественников (CD34+) составило 0,33% (область R1): по оси абсцисс - экспрессия антигена CD34, по оси ординат - параметр бокового светорассеяния SSC.
На фиг.1Б представлена экспрессия общелейкоцитарного антигена CD45 (область R2 - CD45+ клетки): по оси абсцисс - экспрессия антигена CD45, по оси ординат - параметр бокового светорассеяния SSC.
На фиг.1В представлены только клетки-предшественники CD34+ (область R1 фиг.1А), из которых СD45-негативные клетки составили более 80% (нижний левый квадрант).
На фиг.1Г представлены CD45+ клетки (область R2 фиг.1Б), из которых содержание клеток-предшественников (CD34+) составило 0,05% (область R1): по оси абсцисс - CD34+ клетки, по оси ординат - параметр бокового светорассеяния SSC.
На фиг.2 (А-Д) представлено сопоставление количественного определения клеток-предшественников (CD34+) по заявляемому способу и прототипу.
На фиг.2А представлено количество ядросодержащих Syto16+ клеток в образце (область R2): по оси абсцисс - ядросодержащие Syto16+ клетки, по оси ординат - параметр бокового светорассеяния SSC.
На фиг.2Б представлена экспрессия антигена CD34 в пределах ядросодержащих Syto16+ клеток (область R2 фиг.2А), при этом количество Syto16+CD34+клеток составило 0,47% (область R3): пo оси абсцисс - CD34+ клетки, по оси ординат - параметр бокового светорассеяния SSC.
На фиг.2В представлено количество CD45+ клеток образца, составляющее 78,7% (область R1): по оси абсцисс - экспрессия общелейкоцитарного антигена CD45, моноклональные антитела конъюгированы с фикоэритрином Су5 (РЕ-Су5), по оси ординат - параметр бокового светорассеяния SSC.
На фиг.2Г представлено количество клеток-предшественников (CD34+) относительно пропорции CD45+ клеток образца: по оси абсцисс - клетки-предшественники CD34+, моноклональные антитела конъюгированы с фикоэритрином (РЕ), по оси ординат - параметр бокового светорассеяния SSC. Относительное число клеток-предшественников (CD34+) от количества лейкоцитов составило 0,47% (0,37%:(78,7%:100)=0,47%).
На фиг.2Д представлено количество клеток-предшественников (CD34+) относительно Syto16+ клеток (на фиг.2Д только клетки, попавшие в область R3 фиг.2Б): по оси абсцисс - Syto16+ клетки, по оси ординат - параметр бокового светорассеяния SSC. Все клетки-предшественники (CD34+) являются Syto16+.
Таким образом, показано, что количество клеток-предшественников (CD34+) относительно всей клеточной популяции составило 0,37% (фиг.2Г), а в пределах только ядросодержащих Syto16+ клеток их количество составило 0,47% (фиг 2Б), что соответствовало числу CD34+CD45+клеток (фиг 2В, Г). Все клетки-предшественники (CD34+) образца находились в области Syto16+ клеток (фиг.2Д).
Полученные данные позволяют оценивать количество клеток-предшественников (CD34+) в кроветворной ткани по заявляемому способу.
Способ количественного определения клеток-предшественников (CD34+) осуществляли на 585 образцах кроветворной ткани (костный мозг, пуповинная кровь, стимулированная периферическая кровь, цитаферезный продукт) больных и доноров.
Технический результат. Заявляемый способ количественного определения клеток-предшественников (CD34+) в кроветворной ткани является точным и позволяет избежать искусственного занижения или завышения их содержания.
Способ количественного определения клеток-предшественников (CD34+) в кроветворной ткани, включающий использование окраски клеточного субстрата одновременно моноклональными антителами к антигену CD34 и нуклеотропным (ядерным) красителем Syto16, при этом подсчет клеток-предшественников (CD34+) осуществляют в пределах Syto16+ клеток.
