Способ количественного определения классов липидов и подклассов фосфолипидов в биологических материалах

Авторы патента:

Зулев Григорий Сергеевич (RU)

Клепикова Элеанора Абульфатовна (RU)

Джавадов Абульфат Калвалы оглы (RU)

Клепиков Александр Валерьевич (RU)

G01N30/90 - плоскостная хроматография, например хроматография в тонком слое или бумажная хроматография

Владельцы патента RU 2517086:

Джавадов Абульфат Калвалы оглы (RU)

Настоящее изобретение относится к области биохимии и описывает способ количественного определения классов липидов и подклассов фосфолипидов в биологических материалах, заключающийся в том, что методом тонкослойной хроматографии разделяют общие липиды на классы и фосфолипиды на подклассы, проявляют их на хроматограмме и количество определяют с использованием денситометрии, причем липиды, остающиеся на старте после разделения общих липидов на классы, сдвигают на 0,5 см выше, проявляют классы липидов и подклассы фосфолипидов на хроматограмме парами йода и рассчитывают площади пиков, соответствующие интенсивности окраски треков на хроматограмме с помощью денситометра, а количество общих фосфолипидов, других классов липидов и подклассов фосфолипидов определяют расчетным методом, выделяя линиями каждый трек отдельно и производят суммарный расчет площадей треков, берут эту цифру за 100% и определяют процент каждого класса липидов от общих липидов или каждого подкласса фосфолипидов от общих фосфолипидов, составляя пропорцию. Способ обеспечивает упрощение процедуры определения содержания классов липидов и подклассов фосфолипидов в липидных экстрактах биологических материалов и повышение точности полученных результатов. 1 пр., 4 ил.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к методам исследования классов липидов и подклассов фосфолипидов в биологических материалах, и может найти применение в учебном процессе и при проведении научно-исследовательской работы.

Известен способ определения количества отдельных классов липидов в биологических материалах с применением биохимических методов (Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник / Кондрахин И.П., Архипов А.В. и др. - М.: Издательство «КолосС», 2004. - С.139-150.) - [1].

Недостаток данного способа в том, что при этом требуются многочисленные разные химические реактивы и посуда для определения разных классов липидов, что делает этот способ трудоемким и дорогостоящим.

Известен способ определения классов липидов и подклассов фосфолипидов в липидных экстрактах биологических материалов методом тонкослойной хроматографии с использованием пластинки тонкого закрепленного слоя силикагеля. При этом количество отдельных классов липидов и подклассов фосфолипидов после разделения их на тонком слое определяют химическим методом в соскобленных силикагелях с отдельными липидами от стеклянной пластинки (Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник / Кондрахин И.П., Архипов А.В. и др. - М.: Издательство «КолосС», 2004. - С.150-155) - [2].

Недостаток этого способа в том, что количество общих фосфолипидов определяют по содержанию фосфора в пробах, соскобленных со старта. На старте при разделении липидов на классы вместе с фосфолипидами остаются другие классы липидов (глюко- и галактолипиды и т.д.) и при этом их, количество не учитывается. Поэтому полученные данные о количестве отдельных классов липидов бывают неточными. Кроме того, не всегда удается полностью соскоблить силикагель от стекла с отдельными классами липидов, что отрицательно сказывается на точности полученных результатов исследований.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности признаков является способ определения классов липидов и подклассов фосфолипидов в липидных экстрактах биологических материалов методом тонкослойной хроматографии с использованием приготовленных и готовых пластин (Силуфол) с тонко закрепленным слоем и денситометра для расчета количества классов липидов после их проявления на хроматограмме. При этом процедура определения классов липидов значительно облегчается и упрощается. Определение количества общих фосфолипидов в липидых экстрактах по содержанию фосфора дает возможность определить их количество наиболее точно (7. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник / Кондрахин И.П., Архипов А.В. и др. - М.: Издательство «КолосС», 2004. - С.155-157.). 2. Джавадов А.К. Определение фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии с последующей денситометрией // Лабораторное дело, 2. Москва: Медицина, 1989. - с.28-29.) - [3].

Основным недостатком данного способа является то, что при этом также не удается определить количество других полярных липидов, которые остаются на старте с фосфолипидами и из-за этого данные, полученные о количестве отдельных классов липидов, бывают также неточными. Кроме того, количество общих фосфолипидов определяется химическим способом по содержанию фосфора в липидных экстрактах, что требует дополнительных реактивов и много времени.

Задачей изобретения является упрощение способа определения содержания классов липидов и подклассов фосфолипидов в липидных экстрактах биологических материалов и повышение точности полученных результатов.

Поставленная задача достигается благодаря тому, что в известном способе, заключающемся в том, что методом тонкослойной хроматографии разделяют общие липиды на классы, фосфолипиды на подклассы, проявляют отдельные классы липидов на хроматограмме и рассчитывают их количество с использованием денситометра, согласно изобретению для определения количества общих фосфолипидов и неизвестных липидов, которые остаются на старте после разделения общих липидов на классы, липиды, остающиеся на старте, сдвигают с места на 0,5 см выше, липиды проявляют парами йода и рассчитывают площади пиков, соответствующие интенсивности окраски пятен липидов на хроматограмме с помощью денситометра. Затем количество классов липидов и подклассов фосфолипидов определяют расчетным методом, составляя пропорцию.

Сущность предлагаемого способа представлена на чертежах, где:

на фиг.1 изображена хроматограмма классов липидов до сдвига ФЛ+НЛ фракции;

на фиг.2 - выделение трека после сдвига фракции ФЛ+НЛ;

на фиг.3 - расчет трека;

на фиг.4 - результаты расчета трека.

Способ осуществляют следующим образом.

В камеру для хромато граф ирования за 30 минут до начала исследования заливают подвижную фазу, состоящую из гексана, эфира и ледяной уксусной кислоты в соотношении 80:20:1. Заднюю внутреннюю стенку камеры покрывают чистой фильтровальной бумагой, чтобы создать хорошее насыщение камеры парами, что улучшает разделение классов липидов. Подвижную фазу наливают в таком объеме (10 мм), чтобы хорошо пропитать фильтровальную бумагу. Камеру закрывают притертой крышкой и ставят в вытяжной шкаф.

Количество общих липидов в биологических материалах определяют путем экстрагирования их с помощью смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1.

Далее на пластины марки Сорбфил размером 10×30 мм, отступая 12 мм от нижнего края, с помощью микрощприца в виде полосы наносят экстракт липидов, подготовленный для хроматографирования из расчета на 10 мг липидов 0,1 мл смеси хлороформа и метанола в соотношении 1:1.

После этого пластины ставят с небольшим наклоном (около 60°) к стенке камеры для хроматографирования и при подъеме фронта растворителей на высоту 9,5 см ее вынимают и сушат при комнатной температуре.

Затем пластину повторно переносят в камеру для хроматографирования с подвижной фазой, состоящей из хлороформа, метанола и воды в соотношении 65:25:4, подготовленной за 20 минут до начала исследования. После подъема фронта растворителей на высоту 3,0 см от нижнего края ее вынимают и снова сушат при комнатной температуре, после чего и помещают в эксикатор, содержащий кристаллы йода и закрывают крышкой. При такой двумерной хроматографии липиды, оставшиеся на старте, тоже поднимаются незначительно выше, и это позволяет избежать ошибки при определении интенсивности окрашивания пятен с парами йода.

На пластине пятна (треки) классов липидов располагаются в следующем порядке: фосфолипиды и некоторые другие липиды (ФЛ+НЛ), моноацилглицеролы (МГ), холестерол (ХЛ), диацилглицеролы (ДГ), неэтерифицированные жирные кислоты (НЭЖК), триацилглицеролы (ТГ) и эфиры холестерола (ЭХ).

Через 5 часов пластину вынимают из эксикатора и быстро помещают в осветительную камеру денситометра «Сорбфил» и получают изображение треков (пятен) на мониторе компьютера с помощью видеокамеры. Затем линиями выделяют каждый трек отдельно и производят их расчет, а далее получают результаты расчета треков, которые характеризуют площадь пиков и интенсивность окрашивания отдельных треков на пластине. Сумму полученных цифр берут за 100 процентов и определяют процентное отношение каждого класса липидов а, зная содержания общих липидов в исследуемом материале (мг/%), находят количество отдельных классов липидов.

Для определения количества общих ФЛ и их подклассов на пластины Сорбфил, размером 10×30 мм, отступая 12 мм от нижнего края, наносят с помощью микрощприца в виде полосы экстракт липидов, подготовленный для хроматографирования из расчета на 10 мг липидов 0,1 мл смеси хлороформа и метанола в соотношении 1:1.

Затем пластину ставят с небольшим наклоном (около 60°) к стенке камеры для хроматографирования с подвижной фазой, состоящей из хлороформа, метанола и воды в соотношении 65:25:4, подготовленной за 20 минут до исследования и закрывают притертой крышкой. После подъема фронта растворителей на высоту 9,5 см ее вынимают и сушат при комнатной температуре и также помещают в эксикатор, содержащий кристаллы йода.

На пластине пятна подклассов ФЛ по мере возрастания Rf располагаются в следующем порядке: лизофосфатидилхолин (ЛФХ), сфингомиелин (СМ), фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилинозитол (ФИ), фосфатидилэтаноамин (ФЭ) и кардиолипин (КЛ), а далее все остальные классы липидов в виде общего пятна.

Через 5 часов пластины вынимают из эксикатора и быстро денситометром определяют интенсивность окраски каждого отдельного трека подклассов ФЛ и треков всех нейтральных липидов выше указанным образом. Затем подсчитывают суммы цифр, отражающие интенсивность окраски всех подклассов ФЛ и прибавляют цифры, отражающие интенсивность окраски нейтральных липидов. Далее суммы двух цифр, отражающие интенсивность окраски всех треков на пластине, берут за 100% и, исходя из этого, подсчитывают процент общих фосфолипидов от общих липидов.

Зная количество общих липидов в пробах (мг/%), подсчитывают количество общих фосфолипидов а, учитывая процентное отношение подклассов фосфолипидов, подсчитывают их количество в мг в 100 мл или в 100 г сухого вещества, составляя пропорцию.

Применение предложенного способа определения классов липидов и подклассов фосфолипидов в липидных экстрактах биологических материалов методом тонкослойной хроматографии с использованием денситометра марки «Сорбфил» позволяет упразднить процедуру определения количества общих фосфолипидов, а также дает возможность определить количество других неидентифицированных классов липидов, которые при тонкослойной хроматографии классов липидов остаются на старте вместе с фосфолипидами и, следовательно, повышается точность полученных результатов исследований.

Пример. Допустим, после разделения общих липидов на классы (двумерной хроматографией) и проявления в парах йода на пластине ближе к старту обнаруживается пятно ФЛ+НЛ, чуть выше пятно МГ, затем ХЛ, ДГ, НЭЖК, ТГ и ЭХ (см. фиг.2). Далее быстро помещают пластину в. осветительную камеру денситометра «Сорбфил» и получают изображение треков на мониторе компьютера с помощью видеокамеры. Затем линиями выделяют каждый трек отдельно и производят их расчет, а далее получают результаты расчета треков, которые характеризуют площадь пиков и интенсивность окрашивания отдельных треков на пластине. Допустим, площадь пика (S), отражающая пятно ФЛ+НЛ составила 423,2, площадь пика МГ - 125,7; ХЛ - 367,9; ДГ - 235,8; НЭЖК - 126,6; ТГ - 467,9; а ЭХ - 897,5. После этого рассчитывают суммы площадей всех пиков (2645,0) и берут эту цифру за 100% и определяют процент каждого класса липидов от общих липидов, составляя пропорцию.

2645,0	100%
423,2	X

Отсюда, X=423,2·100/2645,0=16,0%

Где, X - процент ФЛ+НЛ фракций от общих липидов.

Таким же образом находят процентное отношение других остальных классов липидов от общих липидов.

Если содержание общих липидов в исследуемом материале составляет, например, 245,2 мг/% тогда содержание ФЛ+НЛ фракции составляет - 39,23 мг/%.

100%	245,2
16%	X

Отсюда X=16·245,2/100=39,23 мг/% или 39,23 мг в 100 мл (если материал жидкость)

При разделении общих ФЛ на подклассы и проявлении в парах йода на пластине ближе к старту находится пятно ЛФХ, чуть выше СМ, затем ФХ, и ФЭ, а далее пятно всех других классов липидов. Затем быстро помещают пластину в осветительную камеру денситометра «Сорбфил» и получают изображение треков на мониторе компьютера с помощью видеокамеры. Затем линиями выделяют каждый трек подклассов ФЛ отдельно и других классов липидов отдельно и производят их расчет, а далее получают результаты расчета треков, которые характеризуют площадь пиков и интенсивность окрашивания отдельных треков на пластине.

Допустим, площадь пика (S), отражающая пятно ЛФХ составила 213,6; СМ - 346,4; ФХ - 786,3; ФЭ - 156,3, а площадь пиков других классов липидов - 2145,3. Далее рассчитывают сумму площадей всех подклассов фосфолипидов (1502,6) и сумму площадей всех пиков на хромато грамме (3647,9).

Составляя пропорцию, рассчитывают процент общих ФЛ, от общих липидов следующим образом:

3647,9	100
1502,6	X

Отсюда X=1502,6·100/3647,9=41,19%

Зная количество общих липидов в исследуемом материале, определяют количество общих ФЛ в пробе. Если содержание общих липидов в исследуемом материале составляет, например, 245,2 мг/% тогда содержание общих ФЛ составляет - 100,9 мг/%.

100	245,2
41,19	X

Отсюда, X=41,19·245,2/100=100,9 мг/%.

Зная суммы площадей всех подклассов ФЛ, рассчитывают процентное отношение подклассов ФЛ (ЛФХ) следующим образом:

1502,6	100
213,6	X

Отсюда, X=213,6·100/1502,6=14.2%

Таким же образом рассчитывают процентное отношение других подклассов ФЛ.

Зная количества общих ФЛ в исследуемом материале, определяют количество отдельных подклассов ФЛ в пробе (мг/%).

Способ количественного определения классов липидов и подклассов фосфолипидов в биологических материалах, заключающийся в том, что методом тонкослойной хроматографии разделяют общие липиды на классы и фосфолипиды на подклассы, проявляют их на хроматограмме и количество определяют с использованием денситометрии, отличающийся тем, что липиды, остающиеся на старте после разделения общих липидов на классы, сдвигают на 0,5 см выше, проявляют классы липидов и подклассы фосфолипидов на хроматограмме парами йода и рассчитывают площади пиков, соответствующие интенсивности окраски треков на хроматограмме с помощью денситометра, а количество общих фосфолипидов, других классов липидов и подклассов фосфолипидов определяют расчетным методом, выделяя линиями каждый трек отдельно и производят суммарный расчет площадей треков, берут эту цифру за 100% и определяют процент каждого класса липидов от общих липидов или каждого подкласса фосфолипидов от общих фосфолипидов, составляя пропорцию.

Изобретение относится к области аналитической химии и предназначено для выделения монослоя вещества для целей последующего анализа свойств вещества. Способ выделения монослоя вещества включает нанесение жидкой пробы с растворенным в ней веществом на линию старта на хроматографическую пластину, содержащую слой сорбента.

Способ хроматографического анализа органических веществ // 2512252

Изобретение относится к области хроматографического анализа веществ и позволяет осуществить анализ органических веществ. Способ хроматографического анализа органических веществ включает растворение исследуемого органического вещества в летучем растворителе с получением раствора пробы, последующее нанесение капли раствора пробы на хроматографическую пластину со слоем сорбента, при этом в качестве растворителя выбирают вещество, не вступающее в химическое взаимодействие с пробой и сорбентом, последующий качественный и количественный анализ проявившихся колец.

Сэндвич-камера с контрпластинкой для тонкослойной хроматографии // 2494393

Изобретение относится к тонкослойной хроматографии (TCX) и может быть использовано в аналитической химии и в физической химии. Сэндвич-камера с контрпластинкой для TCX содержит разделяющую хроматографическую пластинку с адсорбционным слоем на подложке и контрпластинку - хроматографическую пластинку с адсорбционным слоем на подложке.

Способ разделения методом тонкослойной хроматографии // 2494392

Изобретение относится к тонкослойной хроматографии (ТСХ) и может быть использовано в аналитической химии. Способ разделения исследуемой смеси методом тонкослойной хроматографии включает нанесение исследуемой смеси на разделяющую хроматографическую пластинку и последующее разделение компонентов исследуемой смеси подвижной фазой в сэндвич-камере, включающей разделяющую хроматографическую пластинку и сухую контрпластинку, которая не касается подвижной фазы.

Способ хроматографического анализа в закрытом тонком слое сорбента и устройство для его осуществления // 2494391

Способ и устройство могут использоваться в различных научных и практических областях медицины, биологии, химии, пищевой промышленности, охране окружающей среды и других отраслей народного хозяйства для анализа смесей органических и неорганических веществ методом тонкослойной хроматографии.

Способ определения имидаклоприда в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии // 2484458

Изобретение относится к ветеринарной токсикологии и санитарии, а именно к определению остаточных количеств инсектицида в органах и тканях животных при подозрении на отравление имидаклопридом, а также в продуктах животного происхождения.

Способ определения имидаклоприда в биологических объектах с использованием тонкослойной хроматографии // 2467323

Изобретение относится к ветеринарной токсикологии и санитарии, а именно к определению остаточных количеств имидаклоприда в органах или тканях животных при подозрении на отравление инсектицидом, а также продуктах животного происхождения.

Способ многомерной тонкослойной хроматографии // 2435162

Сэндвич-камера малого объема для тонкослойной хроматографии // 2428685

Изобретение относится к тонкослойной хроматографии (ТСХ) и может быть использовано в аналитической химии. .

Способ идентификации природного красителя кармина в присутствии сульфоазокрасителей // 2414702

Изобретение относится к аналитической химии органических соединений и может быть использовано для идентификации природного красителя кармина в присутствии сульфоазокрасителей Е102, Е110, Е122, Е124 и Е129 при аналитическом контроле пищевых продуктов и фармацевтических препаратов.

Способ определения кодеина // 2523408

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано для обнаружения и количественного определения кодеина в различных объектах, в частности в лекарственных препаратах. Способ определения кодеина включает разделение компонентов смеси методом тонкослойной хроматографии с выделением хроматографической зоны кодеина реактивом Драгендорфа, при этом количественное определение кодеина проводят в области его проявленной зоны непосредственно в твердой фазе путем измерения коэффициента диффузного отражения при длине волны 520 нм. Изобретение обеспечивает сокращение времени обнаружения и количественного определения кодеина, уменьшение трудоемкости процесса, уменьшение вероятности потерь целевого компонента. 2 табл., 3 пр.

Способ определения жирорастворимых витаминов а, d2, е и в-каротина при совместном присутствии методом тонкослойной хроматографии // 2530620

Изобретение относится к способам стандартизации лекарственных препаратов, биологически активных добавок, премиксов, лекарственного растительного сырья, растительных масел, масляных экстрактов, изделий пищевой, химической и косметологической отраслей промышленности по содержанию основных жирорастворимых витаминов и может быть использовано в фармацевтической, химической, косметологической и пищевой отраслях промышленности для определения подлинности и степени чистоты жирорастворимых витаминов A, D2, E и β-каротина при совместном присутствии в одно- и многокомпонентных препаратах. Способ определения жирорастворимых витаминов A, D2, E и β-каротина при совместном присутствии включает выделение жирорастворимых витаминов из субстанции экстракцией 96%-ным этанолом, отделение спиртового экстракта витаминов с помощью делительной воронки, последовательное хроматографирование с использованием силикагелевых пластинок марки «Sorbfil» ПТСХ-П-А на полимерной подложке при участии двух элюентов с различной величиной пробега, время насыщения камеры парами элюента - 20 мин, время элюирования - 55 мин; высушивание при температуре не менее 80°C пластин в термостате в течение 3-5 мин, обработку пластины проявителем - 5%-ным спиртовым раствором кислоты фосфорномолибденовой, согласно изобретению в качестве элюентов использованы гексан:хлороформ (19:1) и гексан:хлороформ (3:1), а детектирование хроматографической зоны β-каротина проводят до обработки пластины проявителем при дневном свете. Способ обеспечивает упрощение и ускорение процесса определения жирорастворимых витаминов. 10 ил., 3 пр.

Способ определения подлинности сиропа пижмы обыкновенной // 2572337

Изобретение относится к способу определения подлинности сиропа пижмы обыкновенной. Указанный способ предполагает определение в сиропе методом тонкослойной хроматографии доминирующего компонента цветков пижмы обыкновенной - флавоноида тилианина, который предварительно извлекают путем обработки сиропа равным количеством ацетона. Изобретение характеризуется упрощенной стадией пробоподготовки, а также улучшенной методикой определения подлинности сиропа пижмы обыкновенной и позволяет объективно оценивать качество данной лекарственной формы. 1 ил., 1 пр.

Способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии // 2633013

Изобретение относится к ветеринарной токсикологии и может быть использовано при определении содержания левомицетина в кормах животного происхождения. Заявленный способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии включает отбор пробы корма массой от 200 до 500 мг, гомогенизацию, экстракцию 95% этанолом, фильтрацию экстракта, обезвоживание сернокислым натрием, упаривание, растворение сухого остатка в этилацетате, введение растворенного сухого остатка в жидкостный хроматограф с детектором спектрофотометрическим UVV 104М и колонкой Диасфер-110С-16 (150×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм, с использованием элюента: смеси ацетонитрил-вода-диэтиламин в соотношении 30:70:0,1, обработку результатов анализа. Технический результат – повышение чувствительности и избирательности способа, а также сокращение длительности проведения анализа. 1 табл.

Способ определения простых сахаров в тонком слое сорбента // 2642264

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам стандартизации лекарственных препаратов, лекарственного растительного сырья, фитопрепаратов и биологически активных добавок по содержанию моносахаридов (глюкозы, ксилозы и рамнозы), и может быть использовано в фармацевтическом анализе, в химико-фармацевтической промышленности. Способ определения простых сахаров в тонком слое сорбента характеризуется тем, что навеску исследуемого препарата обрабатывают водой в присутствии концентрированной кислоты хлористоводородной при кипячении на водяной бане с последующим хроматографированием в элюенте н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2), детектированием раствором, содержащим 0,86 г сульфаниламида и 0,83 г о-фталевой кислоты в 50 мл 95% этилового спирта и высушиванием при температуре 103±2°С в течение 3-5 минут до проявления хроматографических зон; после проявления хроматографических зон пластины сканируют с помощью планшетного сканера, а полученные изображения обрабатывают известной компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer», зоны простых сахаров идентифицируются по характерному значению величины Rf и рассчитывают их количественное содержание в пробе. 3 пр., 5 ил., 3 табл.