Способ моделирования гиперчувствительности замедленного типа у морских свинок на микобактерии m.bovis

Авторы патента:

A61K39/04 - Mycobacterium, например Mycobacterium туберкулеза

Владельцы патента RU 2517218:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к области аллергологии и иммунологии и предназначено для оценки влияния иммунобиологических препаратов на кожную реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Предложен способ моделирования ГЗТ у морских свинок на микобактерии М. bovis. Осуществляют внутрикожное введение альбиносам самкам морских свинок, полученных близкородственным скрещиванием брат х сестра (F₂), авирулентных микобактерий М. bovis штамм BCG с последующим формированием групп(-ы) животных по размеру воспалительной реакции в ответ на внутрикожное введение микобактерий М. bovis штамм BCG через 30-35 дней. Предлагаемый способ эффективен в изучении механизмов развития ГЗТ и оценке противотуберкулезных препаратов. 2 табл., 5 пр.

Изобретение относится к аллергологии и иммунологии, в частности к моделированию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на микобактерии в организме морских свинок. Предлагаемый способ может быть использован при оценке влияния иммунобиологических препаратов на кожную реакцию ГЗТ; изучении механизмов развития реакций ГЗТ; оценке противотуберкулезных препаратов.

Известен способ моделирования гиперчувствительности замедленного типа у морских свинок [OIE Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals - 6-th ed. - 2008. - Vol.l. -P. 693], который заключается в том, что животным внутримышечно вводят патогенные микобактерии на физиологическом растворе в минимальной инфицирующей дозе, что приводит к медленному прогрессированию инфекционного процесса.

Недостатком этого способа является эпидемиологическая опасность для персонала, вероятность рассеивания микобактерий в окружающей среде, трудность в подборе минимальной дозы микобактерий, не приводящей к гибели животных ранее чем предполагается проведение основного этапа исследования.

Известен способ моделирования гиперчувствительности замедленного типа у морских свинок [Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. 36-й доклад. Серия технических докладов 745. ВОЗ. Женева. 1988 г. С.43], который заключается в том, что животным внутримышечно вводят инактивированные микобактерии в адъюванте.

Недостатком данного способа являет развитие ГЗТ на измененные микобактериальные антигены, что снижает специфичность моделирования ГЗТ.

Известен способ моделирования гиперчувствительности замедленного типа у морских свинок, который был выбран за прототип [HBASAC- BCG combined vaccine for intracutaneous injection and preparation method and thereof, №US 7,579,003 B2, Aug. 25, 2009]. Сущность способа заключается во внутрикожном введении авирулентных микобактерии М. bovis штамм BCG на физиологическом растворе. В данном случае антигенный состав используемых аттенуированных микобактерий является близким по отношению к патогенным микобактериям, что обуславливает моделирование ГЗТ, адекватной инфекционному процессу.

Недостатком данного способа является широкая вариабельность кожных реакций ГЗТ в ответ на ППД для млекопитающих. Так, в экспериментальных группах рандинбредных морских свинок вариабельность кожных реакций ГЗТ колеблется: от 12,70% до 26,98%, (диапазон от средних Gv=11-25% до значительных Gv>25% значений), что не учитывается как значимый фактор, который может привести к получению недостоверных результатов, при реализации заявленных задач, а также необходимости перестановки эксперимента. В свою очередь, показатель коэффициент вариации характеризует воспроизводимость результатов эксперимента, в обратной зависимости: чем ниже коэффициент вариации, тем выше воспроизводимость результатов исследования [Г.Ф.Лакин. Биометрия. - М., Высшая школа, 1990. с 50-51].

Технической задачей является повышение воспроизводимости получаемых результатов при моделировании гиперчувствительности замедленного типа у морских свинок на микобактерии М. bovis штамм BCG.

Техническая задача достигается способом моделирования гиперчувствительности замедленного типа у морских свинок на микобактерии, включающим внутрикожное введение альбиносам самкам морских свинок, полученных близкородственным скрещиванием брат х сестра (F₂) авирулентных микобактерий М. bovis штамм BCG с последующем, формированием групп(-ы) животных по размеру воспалительной реакции в ответ на внутрикожное введение микобактерии М. bovis штамм BCG, через 30-35 дней.

Основанием предлагаемого способа являются исследования, проведенные на детях, вакцинированных авирулентными микобактериями М. bovis штамм BCG (вакцина BCG), у которых была показана корреляционная зависимость между интенсивностью кожной реакции ГЗТ, развивающейся в ответ на введение туберкулина, и размером поствакцинального рубчика на месте введения микобактерий М. bovis штамм BCG [Клименко Л.И., Полякова Т.С., Бучковская И.Ю./ Оценка качества вакцинации БЦЖ по развитию поствакцинального знака / Запорожский медицинский журнал №1 (70). 2012. С.86-88]. При этом корреляционная зависимость, полученная на детях, предполагает подобную зависимость у лабораторных животных - альбиносов самок морских свинок, полученных близкородственным скрещиванием брат х сестра (F2). Так, проведенные исследования продемонстрировали, что между размером воспалительной реакции, в ответ на внутрикожное введение микобактерий М. bovis штамм BCG, и воспалительной реакцией на внутрикожное введение ППД для млекопитающих имеется положительная корреляционная зависимость, соответствующая 0,85 (р>0,01). В свою очередь, высокий показатель коэффициента корреляции позволяет получать группы животных с близкими значениями воспалительной реакции, в ответ на внутрикожное введение ППД для млекопитающих, при использовании интервальных оценок.

Заявленное изобретение отличается от прототипа тем, что для сенсибилизации количество животных определяют по таблице 1 с учетом частоты (интервала) и после развития состояния ГЗТ, перед проведением исследования осуществляют подбор животных, полученных близкородственным скрещиванием брат х сестра (F₂) в группы(-у) по размеру воспалительной реакции на месте введения микобактерий М. bovis штамм BCG, согласно таблице 1.

Реализация предлагаемого способа возможна в двух вариантах.

При реализации первого варианта предполагается использовать количество животных для сенсибилизации не менее 15 голов с использованием 3 номера интервала воспалительной реакции на введение М. bovis штамм BCG и наибольшей частотой интервала - (0,4).

При осуществлении второго варианта предполагается использование всех номеров интервалов, поэтому для сенсибилизации животных используется не менее 100 голов, что обеспечит распределение по всем интервалам воспалительной реакции на введение М. bovis штамм BCG и количество животных не менее 10 голов.

Способ осуществляется следующим образом. Определяют количество животных (альбиносов, самок морских свинок, полученных близкородственным скрещиванием брат x сестра (F₂), массой 500-600 г), необходимое для осуществления исследования (при этом n≥6; при n=6, количество животных необходимое для сенсибилизации будет соответствовать 15), по формуле (I):

$N = \frac{n}{f}, (I)$

где:

N - количество животных, необходимое для сенсибилизации;

n - количество животных, необходимое для постановки эксперимента;

f - частота интервала (табличное значение).

Приготавливают суспензию с содержанием количеств мг микобактерий в физиологическом растворе, соответствующем 0,2 мг/ 0,1 см³, рассчитывая количество биомассы микобактерий М. bovis штамм BCG и объем физиологического раствора, необходимые для приготовления требуемого количества суспензии.

Количество биомассы микобактерий М. bovis штамм BCG, необходимое для сенсибилизации морских свинок, рассчитывается по формуле (II).

$M = 0,2 \cdot N, (I I) .$

где:

M - биомасса микобактерии (мг) М. bovis штамм BCG

0,2 - доза микобактерии (мг), необходимая для сенсибилизации одного животного;

N - количество животных, необходимое для сенсибилизации;

Объем физиологического раствора, необходимый для приготовления суспензии, рассчитывается по формуле (III).

$V = \frac{0,2 \cdot N}{2}, (I I I)$

где:

V - объем физиологического раствора (см³), необходимый для приготовления суспензии;

0,2 - доза микобактерии (мг), необходимая для сенсибилизации одного животного;

N - количество животных, необходимое для сенсибилизации;

2 - коэффициент перевода расчетной массы микобактерий М. bovis штамм BCG в объем суспензии.

Далее животных внутрикожно в депелированный участок на брюшной стенке сенсибилизируют микобактериями М. bovis штамм BCG. Через 30-35 дней животных нумеруют и на месте введения микобактерии М. bovis штамм BCG, определяют линейные размеры воспалительной реакции, (сумма продольного и поперечного диаметров, деленная на 2), результаты протоколируются и согласно таблице 1 (графа интервалы воспалительных реакций на введение М. bovis штамм BCG) формируется группа(-ы). Данных животных используют для проведения исследования.

Пример выполнения предлагаемого способа.

Пример 1. В работе предполагается проведение исследования на одной группе животных в количестве 10 голов. Расчеты предполагается осуществлять с использованием номера интервала 3.

По таблице 1 (графа частота интервала - f) рассчитывается общее количество животных, необходимое для сенсибилизации. Так, для получения 10 животных, подставляем значение 10 в формулу I, и получаем расчетное значение 25 голов.

Пример 2. Приготавливается суспензия микобактерий М. bovis штамм BCG на физиологическом растворе. Для этого определяют количество мг микобактерий, необходимое для сенсибилизации группы животных (N=25), по формуле (II), в результате получают значение 5 мг. После этого определяют объем физиологического раствора, на котором приготавливается суспензия, по формуле (III), и получают значение 2,5 см³.

Пример 3. Осуществляют внутрикожную сенсибилизацию 25 голов альбиносов самок морских свинок, полученных близкородственным скрещиванием брат х сестра (F₂), массой 500-600 гр, в дозе 0,1 см³, в депилированный участок кожи на брюшной стенке.

Пример 4. Через 30-35 дней после сенсибилизации формируют группу животных согласно таблице 1, с значениями воспалительной реакций на введение М. bovis штамм BCG, входящими в интервал 13,0-13,5 мм.

Пример 5. На сформированной группе осуществляется постановка эксперимента.

В таблице 2 приведены результаты вариации аллергических реакций ГЗТ прототипа и предлагаемого способа: группа 1 сформирована случайным образом, без подборки по воспалительной реакции на месте введения микобактерий М. bovis BCG; группа 2 сформирована по размеру воспалительной реакции на внутрикожное введение микобактерий М. bovis BCG.

Из полученных данных видно, что значение коэффициента вариации на дозы ППД для млекопитающих значимо ниже в группе животных, сформированной в соответствии с предлагаемым способом, в сравнении с группой, сформированной по способу-прототипа (р>0,05).

В зависимости от планируемого эксперимента предлагаемый способ предполагает следующие варианты использования.

1. При проведении единичных сравнительных исследований целесообразно использование небольшого количества животных центрального номера интервала 3, обеспечивающего частоту интервала, равную 0,4.

2. При проведении масштабных, в том числе фундаментальных исследований, сравнительных исследований, целесообразным является сенсибилизация не менее 100 голов животных, что обеспечит получение в группах количества животных от 10 и более и все номера интервалов.

Результатом предлагаемого способа является повышение воспроизводимости результатов исследований при оценке влияния иммунобиологических препаратов на кожную реакцию ГЗТ, изучении механизмов развития реакций ГЗТ и оценке противотуберкулезных препаратов.

Таблица 1
Интервалы воспалительной реакции на внутрикожное введение микробактерий M.Bovis штамм BCG и ППД для млекопитающих
Номер интервала	Интервалы суммы аллергической реакции на введение ППД для млекопитающих (мм)	Интервалы воспалительной реакции на введение М. bovis штамм BCG (мм)	Частота интервала ГО
1	38,0-39,5	10,0-10,5	0,1
2	40,0-42,5	11,0-12,5	0,2
3	43,0-45,5	13,0-13,5	0,4
4	46,0-48,5	14,0-15,5	0,2
5	49,0-50,5	16,0-16,5	0,1
Таблица 2
Вариация значений аллергической туберкулиновой реакции ГЗТ в группах морских свинок, сформированных различными способами
№	Группа 1	Группа 2
жи	25 ME	5 ME	1 ME	Сумм.	25 ME	5 ME	1 ME	Сумм.
вот ного	(мм)	(мм)	(мм)	р-я (мм)	(мм)	(мм)	(мм)	р-я (мм)
1	17,0	11,0	10,5	38,5	14,5	13,0	11,0	38,5
2	21,5	15,5	13,0	50,0	15,5	12,5	11,0	39,0
3	17,5	13,5	11,0	42,0	16,0	12,5	11,0	39,5
4	15,5	16,0	14,0	45,5	15,5	12,5	10,0	38,0
5	16,0	15,0	10,5	41,5	17,0	11,0	10,5	38,5
6	17,0	18,5	13,0	48,5	16,0	12,0	11,5	39,5
7	20,0	16,5	15,5	52,0	16,5	12,5	10,5	39,5
8	17,5	17,0	12,5	47,0	15,5	15,0	9,0	39,5
9	19,0	15,0	13,0	47,0	15,0	14,0	10,5	39,5
10	16,5	12,5	10,5	39,5	18,0	12,0	9,5	39,5
Gv	10,56	14,73	13,77	9,60	6,35	8,74	7,29	1,45

Примечание: Gv- коэффициент вариации

Сумм, р-я - суммарная реакция

Способ моделирования гиперчувствительности замедленного типа у морских свинок на микобактерии М. bovis, включающий внутрикожное введение альбиносам самкам морских свинок, полученных близкородственным скрещиванием брат x сестра (F₂), авирулентных микобактерий М. bovis штамм BCG, отличающийся тем, что из совокупности сенсибилизированных животных формируют группу(-ы) животных по размеру воспалительной реакции в ответ на внутрикожное введение микобактерий М. bovis штамм BCG через 30-35 дней.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к средству, обладающему адаптогенной и иммуномодулирующей активностью. Средство, обладающее адаптогенной и иммуномодулирующей активностью, содержащее соцветия календулы лекарственной; корни и корневища левзеи сафлоровидной; корневища девясила высокого; плоды мускатного ореха; плоды кардамона; корни аира болотного; корни алтея аптечного; корневища имбиря; траву горца птичьего; кору коричного дерева; плоды граната; плоды перца длинного; плоды можжевельника; листья черные бадана толстолистного; хитозан, взятые в определенном количестве.

Способы лечения воспалительных заболеваний ободочной кишки // 2515156

Группа изобретений относится к медицине, в частности к гастроэнтерологии, и касается лечения язвенного колита или болезни Крона. Способ лечения включает введение в организм терапевтически эффективного количества прикрепляющихся клеток из плаценты, культивированных таким образом, что не дифференцируются в адипоциты или остеоциты.

Способ лечения недоношенных новорожденных детей с низкой массой тела // 2514346

Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии и неонатологии, и может быть использовано для лечения глубоконедоношенных новорожденных детей в период стационарного этапа выхаживания.

Полисахарид из штамма bifidobacterium infantis и его применение для лечения или предупреждения воспалительных расстройств. // 2511044

Группа изобретений относится к области битехнологии и медицины. Предложен полисахарид, выделенный из штамма Bifidobacterium infantis NCIMB 41003 и имеющий структуру [-β(1,3)-D-GalpNAc-β(1,4)-D-Glcp-]n, где данная дисахаридная единица повторяется n раз, что дает полисахарид с молекулярной массой более 100000 Да.

Производные стерина и их синтез и применение // 2507211

Изобретение относится к соединению CL168, представленному общей структурной формулой I, где R представляет собой кислород. Также изобретение относится к способу получения соединения формулы I и к применению соединения формулы I при получении лекарственного средства для предупреждения и лечения опухолевых и иммунологических заболеваний.

Иммуномодулятор // 2504371

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к иммуномодулятору. Иммуномодулятор для иммунокоррекции при комплексной терапии хронических неспецифических заболеваний легких, хронической обструктивной болезни легких, синдрома бронхиальной обструкции, хронической бронхопневмонии, пневмосклероза, трахеобронхита, хронического ларингита, рака легких, трахеи и гортани получен путем смешивания водного настоя листьев кипрея и водного настоя травы донника лекарственного желтого, взятых в равных соотношениях, с порошком из легких и гортани крупного рогатого скота, настаивания полученной смеси, выдерживания на кипящей водяной бане, охлаждения, далее смесь фильтруют, в полученный раствор добавляют сыворотку крови крупного рогатого скота, содержащую антитела к онковирусам лейкоза, настойку болиголова, аскорбиновую, сорбиновую кислоту до полного растворения всех компонентов, полученный раствор помещают в водяную баню, охлаждают, фильтруют, стерилизуют при определенных условиях.

Иммуномодулирующие экстракты из бактерий lactobacillus и способы их получения и применения // 2500412

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к экстракту одного или более бактериальных штаммов Lactobacillus. Экстракт одного или более бактериальных штаммов Lactobacillus, представляющий собой растворимый экстракт, где экстракт содержит химически модифицированные бактериальные молекулы, полученные в результате воздействия щелочной среды на один или более бактериальных штаммов Lactobacillus, экстракт полезен в лечении заболеваний, связанных с дисбалансом продукции противовоспалительных цитокинов.

Иммуномодуляторные соединения и лечение заболеваний, связанных со сверхпродукцией воспалительных цитокинов // 2498813

Группа изобретений относится к медицине, а именно к применению, по меньшей мере одного иммуномодулирующего соединения общей формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата или изомера для изготовления фармацевтической композиции для лечения заболевания или расстройства, выбранного из астмы, атопического дерматита, аллергического ринита, воспалительного заболевания кишечника, диабета или ревматоидного артрита у теплокровных животных, включая человека.

Легко проникающий через биологические мембраны мылкий амфифильный индуктор интерферона γ // 2496783

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению интерфероногенных противовирусных препаратов на основе дрожжевой РНК, и может быть использовано в медицине.

Способ получения средства, обладающего иммуномодулирующей активностью // 2496510

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения средства, обладающего иммуномодулирующей активностью. Способ получения средства, обладающего иммуномодулирующей активностью, характеризующийся тем, что растительную композицию, состоящую из травы пустырника обыкновенного, травы горца птичьего, цветков ноготков лекарственных, корневищ с корнями солодки голой, корневищ с корнями вздутоплодника сибирского, плодов шиповника, плодов лимонника китайского, семян льна обыкновенного, последовательно экстрагируют 60-70% этиловым спиртом дважды, 40-50% этиловым спиртом - двукратно и водой очищенной - однократно, при определенных условиях, далее водно-спиртовые извлечения концентрируют под вакуумом, водные кубовые остатки объединяют с водным извлечением, фильтруют, упаривают, очищают сепарированием, доупаривают, высушивают в вакуум-сушильном шкафу с последующим измельчением.

Способ определения антител к mycobacterium leprae // 2500423

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения антител к Mycobacterium leprae. Способ включает выявление в сыворотках крови антител к Mycobacterium leprae с помощью иммуноферментного метода.

Расширение спектра т клеток для включения субдоминантных эпитопов путем вакцинации с антигенами, доставленными как белковые фрагменты или пептидные коктейли // 2490024

Фармацевтическая композиция и способ стимулирования иммунного ответа к мусоbacterium avium подвида paratuberculosis // 2489165

Способ получения специфического иммуномодулятора // 2478399

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и касается способа получения специфического иммуномодулятора. .

Вакцина mycobacterium tuberculosis // 2473365

Вектор для переноса и вакцина против туберкулеза // 2453603

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. .

Противотуберкулезная вакцина // 2443773

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению вакцинных микроорганизмов, и может быть использовано в медицине. .

Способ изготовления аллергена для дифференциальной диагностики парааллергических реакций у крупного рогатого скота на ппд туберкулин для млекопитающих // 2443428

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии. .

Способ определения сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий // 2438700

Изобретение относится к области ветеринарии. .

Способ получения антигенного препарата из mycobacterium tuberculosis с расширенным спектром серопозитивных фракций в реакции иммуноблотинга // 2431675

Изобретение относится к области медицины для диагностики туберкулеза и изучения гуморального иммунного ответа в реакции иммуноблотинга. .

Профилактическая вакцина от туберкулеза // 2526910

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения лекарственного средства для профилактического лечения туберкулеза. Иммунотерапевтическое средство содержит фрагменты клеточной стенки комплекса Mycobacterium tuberculosis (МТВ-С). Указанное средство получают способом, включающим следующие стадии: культивирование вирулентного штамма МТВ-С в течение периода, равного или большего чем три недели, и гомогенизация культуры клеток в присутствии неионного поверхностно-активного вещества. 13 з.п. ф-лы, 2 пр., 2 табл.