Способ обнаружения злокачественных опухолей

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для обнаружения злокачественных опухолей, включая рак молочной железы, рак почек. Для этого проводят измерение экспрессии полипептида, обладающего способностью связываться посредством реакции антиген-антитело с антителом против белка CAPRIN-1, имеющего любую из аминокислотных последовательностей с четными номерами SEQ ID NO:2-30 списка последовательностей, в образце, полученном из живого организма, посредством реакции антиген-антитело в образце, выделенном из живого организма. Также предложен агент для обнаружения злокачественной опухоли. Группа изобретений обеспечивает высокую чувствительность при диагностике злокачественных опухолей. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения злокачественной опухоли путем использования в качестве опухолевого маркера CAPRIN-1.

Предшествующий уровень техники

Злокачественные опухоли являются основной причиной смерти. Лечение, проводимое в настоящее время, представляет собой, главным образом, симптоматическую терапию, которая в основном состоит из хирургического вмешательства в сочетании с лучевой терапией и химиотерапией. Благодаря достижениям медицинской техники, злокачественные опухоли теперь стали практически излечимы при ранней диагностике. Следовательно, в настоящее время необходим способ выявления злокачественной опухоли, который легко осуществляется при использовании сыворотки, мочи или тому подобного, не требующий физических или экономических затрат со стороны пациента, страдающего злокачественной опухолью.

В качестве способа диагностики злокачественной опухоли с использованием крови или мочи в последнее время стал популярным способ измерения продукта опухоли, такого как опухолевый маркер. Термин «продукт опухоли» относится к антигену, связанному с опухолью, ферменту, специфическому белку, метаболиту, опухолевому гену, продукту опухолевого гена, гену-суппрессору опухоли и тому подобному. Карциноэмбриональный антиген CEA, гликопротеин CA19-9, CA125, простатспецифический антиген (PSA), кальцитонин, которые являются пептидными гормонами, продуцируемыми, например, щитовидной железой, и тому подобное, используются в качестве опухолевых маркеров для диагностики некоторых типов злокачественных опухолей. Однако опухолевые маркеры, используемые для диагностики злокачественной опухоли, отсутствуют для многих типов злокачественных опухолей. Также, наиболее известные в настоящее время опухолевые маркеры присутствуют в жидкостях организма только в следовых количествах (приблизительно порядка пг/мл). Следовательно, для обнаружения таких опухолевых маркеров необходимы высокочувствительные способы измерения или специальные методики. При сложившихся обстоятельствах ожидается, что новые способы диагностики злокачественных опухолей, способные обнаруживать различные типы злокачественных опухолей с высокой чувствительностью, станут удобными методами для диагностического использования в отношении различных типов злокачественных опухолей.

Также, такие способы диагностики очень могут быть крайне эффективны, если с их помощью можно обнаруживать не только злокачественные опухоли, но и диагностировать злокачественные опухоли в невидимых глазом местах, степень распространения злокачественной опухоли, злокачественность или послеоперационное течение злокачественного заболевания, рецидив, метастазирование и тому подобное.

В особенности, если диагностика злокачественной опухоли в невидимом глазом месте станет возможной, то такие способы диагностики злокачественной опухоли могут использоваться для раннего обнаружения злокачественной опухоли, например, во внутрибрюшинной части, которую трудно распознать. Также, можно будет обнаружить опухоль, которая не имеет макроскопически видимого размера, например злокачественную опухоль, которая не обнаруживается даже с помощью ультразвукового исследования, КТ (компьютерной томографии) или ЯМР (магнитно-резонансной визуализации).

Кроме того, степень распространения злокачественной опухоли классифицируется исходя из степени, до которой распространяется опухоль в первичном очаге, и наличия или отсутствия метастаз в региональные лимфоузлы или отдаленные органы. В основном, существует 5 стадий заболевания (каждая называется здесь «стадией») и чем больше номер стадии, тем сильнее прогрессировало заболевание. Строго говоря, стадия зависит от органов. Однако, например, злокачественная опухоль в 0 стадии представляет собой злокачественную опухоль, которая остается внутриэпителиальной, а злокачественная опухоль IV стадии представляет собой злокачественную опухоль, которая метастазировала в отдаленную локализацию. Если определена степень злокачественного заболевания, становится возможным принятие решения о соответствующих курсах лечения, а также об оценке терапевтических эффектов противоопухолевого средства. В качестве примеров принятия решения о ходе лечения в случае рака предстательной железы и тому подобного существуют виды, не требующие лечения, поскольку их злокачественность крайне низкая и почти никогда такие виды опухоли не будут прогрессировать. Напротив, существуют виды, требующие лечения, поскольку являются прогрессирующими, и метастазируют в кость или другие органы, и являются причиной мучительной смерти пациента. Все способы лечения, такие как гормональная терапия и радикальное хирургическое вмешательство, связаны с побочными реакциями. Таким образом, следует правильно определить и выбрать способы лечения. Также, если оценка, касающаяся выбора противоопухолевого средства, может быть правильно выполнена или если время или так далее об окончании введения противоопухолевого средства может быть корректно определено, то физические и экономические затраты пациентов также могут быть уменьшены. Следовательно, важно иметь возможность диагностировать степень распространения злокачественного заболевания.

Одним из характерных признаков злокачественных клеток является продолжение их бластогенеза; то есть отсутствие способности дифференцироваться. Кроме некоторых типов злокачественных опухолей, слабо дифференцированные или недифференцированные злокачественные клетки с низкой степенью дифференцировки быстро растут после метастазирования, что является плохим прогнозом для лечения. Говорят, что такие злокачественные опухоли имеют высокую злокачественность. Наоборот, высоко дифференцированные злокачественные клетки с высокой степенью дифференцировки сохраняют структурные и функциональные характеристики неповрежденных органов. Говорят, что такая злокачественная опухоль имеет относительно низкую злокачественность. Если можно определить злокачественность опухоли, то могут быть сделаны ее последующие измерения. Даже если опухоль небольшая, то широкий хирургический захват может обеспечить безопасность при удалении опухоли в тех случаях, если злокачественность опухоли высокая. Более того, последующие мероприятия могут быть сосредоточены на широком диапазоне периферических тканей.

Если можно оценить течение послеоперационного периода, в том числе рецидивирование и метастазирование, то можно оценить полноту удаления опухоли при хирургическом вмешательстве. Неполное удаление опухоли, вероятно, приведет к рецидиву. Следовательно, такая оценка может обеспечить критерий определения для более точного выполнения последующих мероприятий с короткими интервалами или для немедленного проведения повторной операции при необходимости. Также, в случае возникновения рецидива будет существовать большая вероятность раннего обнаружения. Если имеют место отдаленные метастазы, то их обнаружение зачастую отсрочено. Однако если можно диагностировать метастаз, то можно получить критерий, с помощью которого ряд исследований может быть расширен, включающий области, отличные от места удаления и его наружной границы.

Известно, что собаки стареют в 7 раз быстрее людей. В последнее время животные-компаньоны воспитываются и содержатся как члены семьи и зачастую ведут образ жизни и имеют привычки, сходные с образом жизни и привычками хозяев. Следовательно, предсказуем высокий риск развития злокачественного заболевания у хозяина, если у его животного-компаньона развивается злокачественная опухоль. Если правильная и точная диагностика злокачественного заболевания станет возможной для животного-компаньона, то можно ожидать, что она станет диагностическим критерием для профилактики развития злокачественных опухолей у хозяев.

В настоящее время говорят, что число домашних собак в Японии составляет примерно 6700000 и такая же цифра для США составляет примерно 17640000. Все большее распространение получают пятикратные, семикратные и восьмикратные комбинированные вакцины и тому подобное, кроме прививок от бешенства, и за счет этого уменьшается количество инфекционных заболеваний с высоким процентом летальности, такие как парвовирусная инфекция у собак, инфицирование вирусом чумы собак, парагрипп собак (кашель псарен), инфицирование собак аденовирусом-2 (кашель псарен), инфекционный гепатит собак, коронавирусная инфекция у собак и лептоспироз. Таким образом, увеличивается средняя продолжительность жизни собак. Немолодые собаки, которым семь лет или больше, составляют 35,5% всех домашних собак. Возрастают причины смерти домашних собак, сходные с таковыми у людей, такие как злокачественные заболевания, гипертензия и заболевания сердца. В США примерно у 4000000 миллионов собак ежегодно диагностируют злокачественные опухоли. Также в Японии говорят, что примерно 1600000 собак потенциально поражены опухолями.

Однако подходящие средства диагностики злокачественных опухолей у животных отсутствовали. Более того, при медицинском наблюдении за животными способы диагностики, которые включают фотосъемку или рентгенографию с использованием рентгеновских лучей, КТ сканирование, ЯМР сканирование или тому подобное, не были широко распространены. После проведения пальпации, общего анализа крови и диагностики с использованием рентгенофотографии диагноз в настоящее время зависит в значительной мере от опыта ветеринаров. Частично начали проводить способы диагностики с использованием сыворотки, но в этих способах используют опухолевые маркеры человека, поскольку не обнаружено опухолевых маркеров собак.

Для точной диагностики злокачественной опухоли требуется абдоминальная хирургия, которая связана со значительной физической нагрузкой для собаки и экономическими затратами для владельцев. Если диагностику злокачественной опухоли можно было бы провести животному-компаньону, такому как собаки и кошки, то это привело бы к ранней или точной диагностике злокачественной опухоли, и можно было бы предположить, что эти данные могли бы быть полезны для лечения злокачественных опухолей у животных компаньонов. Также, если такая удобная диагностика злокачественной опухоли с использованием сыворотки станет возможной, то можно ожидать, что она не только обеспечит диагностику злокачественной опухоли, но также внесет значительный вклад в регулярное медицинское обследование, предоперационную диагностику и принятие решения о стратегии лечения.

Медицинский осмотр для животных-компаньонов в отличие от ситуации с людьми широко не распространен. Следовательно, выявление злокачественной опухоли часто происходит слишком поздно, когда хозяин узнает о заболевании и приводит животное-компаньона в клинику, как правило, только после того, как опухоль стала большого размера. Если такая опухоль, которая увеличилась в размере, является злокачественной, зачастую это приводит к тому, что проведение лечения оказывается невозможным, даже если проводят хирургическое вмешательство, например операцию, или медикаментозное лечение с использованием противоопухолевого средства или тому подобное. Следовательно, в тех случаях, когда ветеринар определяет, что опухоль является злокачественной, лечение противоопухолевым средством, как правило, проводят без операции. Если операцию все-таки выполняют, то во время операции также следует учесть такие меры, как определение размера безопасного края, определение количества крови, необходимого во время операции, и меры против распространения клеток по организму. Желательно, чтобы лечение противоопухолевым средством назначалось сразу же после операции и чтобы последующее врачебное наблюдение проводилось с короткими интервалами. Ожидается, что включение вышеуказанной диагностики злокачественных опухолей в медицинское обследование собак, которые в последнее время все больше и больше распространены и называются полным медицинским обследованием собак, приведет к раннему выявлению злокачественных опухолей.

С другой стороны, в случае доброкачественной опухоли операция может быть рекомендована, даже если опухоль большого размера. После операции в уходе нуждаются только иссеченные области, без необходимости какого-либо дорогостоящего лечения с использованием противоопухолевых средств и без каких-либо опасений, относящихся к последующим врачебным наблюдениям.

В сложившейся ситуации разработка удобных способов обнаружения злокачественных опухолей с высокой чувствительностью, которые можно использовать для диагностики злокачественных опухолей у животных, обеспечивает точное и эффективное лечение и влечет за собой ряд преимуществ как для владельцев, так и для ветеринаров.

Белок 1, связанный с цитоплазмой и пролиферацией, (CAPRIN-1) представляет собой внутриклеточный белок, который экспрессируется, когда нормальные клетки фазы покоя активируются или подвергаются делению. Также известно, что CAPRIN-1 участвует в транспорте мРНК посредством внутриклеточного образования внутриклеточных стрессовых зерен с РНК и трансляционного контроля, например. При этом CAPRIN-1 имеет много различных названий. Примеры таких названий включают GPI-заякоренный мембранный белок 1 и белок 1 мембранного компонента поверхностного маркера (M11S1), как будто белок является мембранным белком. Эти различные названия происходят на основании данных (J Biol. Chem. 270:20717-20723 (1995)), что генная последовательность CAPRIN-1 исходно имеет GPI-связывающую область и CAPRIN-1 является мембранным белком, экспрессируемым в клеточных линиях, полученных из толстой кишки. Позже стало известно, что последовательность гена CAPRIN-1 в этом документе неверная; имеет место сдвиг рамки считывания за счет делеции 1 нуклеотида последовательности гена CAPRIN-1, в настоящее время зарегистрированного в GenBank или другом депозитарии, так что 80 аминокислот делетировано с С-конца и полученный в результате артефакт (74 аминокислоты) соответствует GPI-связывающей части предыдущего сообщения; и ошибка также сделана на 5' конце последовательности гена, и делеция 53 аминокислот с N-конца была доказана (J Immunol. 172:2389-2400 (2004)). Также сообщалось, что белок, кодируемый последовательностью гена CAPRIN-1, в настоящее время зарегистрированного в GenBank или другом депозитарии, не является мембранным белком (J Immunol. 172:2389-2400 (2004)).

Кроме того, на основании сообщения J Biol. Chem. 270:20717-20723 (1995), что CAPRIN-1 представляет собой белок клеточной мембраны, в US2008/0075722 и WO2005/100998 описано, что CAPRIN-1, называемый M11S1, может быть мишенью для лечения злокачественных опухолей в качестве белка клеточной мембраны (не указано в «Примерах»). Однако, как сообщалось в J Immunol. 172:2389-2400 (2004), на дату подачи US2008/0075722 и WO2005/100998 вплоть до настоящего времени было известно, что CAPRIN-1 не экспрессируется на клеточных поверхностях. Очевидно, что содержание US2008/0075722 и WO2005/100998, основанное только на ошибочной информации о том, что CAPRIN-1 является белком клеточной мембраны, не следует учитывать как документы уровня техники в данной области. Более того, никогда не сообщалось о том, что CAPRIN-1 экспрессируется на более высоких уровнях в клетках при раке груди или подобном, чем в нормальных клетках.

Краткое изложение сущности изобретения

Проблема, решаемая настоящим изобретением

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения злокачественных опухолей, который подходит для диагностики злокачественных опухолей.

Способы решения этой проблемы

В результате глубокого изучения авторы настоящего изобретения получили кДНК, кодирующую белок, который связывается с антителом, находящимся в сыворотке, полученной из живого организма, имеющего опухоль, с помощью способа SEREX, используя библиотеку кДНК, полученную из семенников собак и сыворотку собак, имеющих опухоль, и таким способом были получены белки CAPRIN-1 собак, имеющие аминокислотные последовательности, показанные в последовательностях SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 и 14 на основе кДНК. Также, авторы настоящего изобретения получили белки CAPRIN-1 человека, имеющие аминокислотные последовательности, показанные в последовательностях SEQ ID NO:2 и 4 на основании генов человека, гомологичных полученным генам. Авторы настоящего изобретения дополнительно обнаружили, что гены, кодирующие эти белки, специфически экспрессируются в семенниках собак и людей и злокачественных опухолевых клетках (см. пример 1, описанный позже); рекомбинантные полипептиды, полученные на основании аминокислотных последовательностей этих белков, специфически реагируют только с сыворотками из живых организмов, имеющих злокачественную опухоль; и CAPRIN-1 может быть специфически выявлен из живого организма, имеющего злокачественную опухоль, используя антитела, полученные с использованием рекомбинантных полипептидов. Таким образом, авторы настоящего изобретения создали это изобретение.

В частности, настоящее изобретение относится к способу обнаружения злокачественной опухоли, предусматривающем измерение экспрессии CAPRIN-1, которое проводится для образцов, выделенных из живых организмов. Также настоящее изобретение относится к агенту для обнаружения злокачественной опухоли, содержащему антитело, которое индуцируется in vivo против CAPRIN-1, и полипептид, который подвергается реакции антиген-антитело. Более того, настоящее изобретение относится к агенту для обнаружения злокачественной опухоли, содержащему антитело, которое подвергается реакции антиген-антитело с CAPRIN-1 или его антигенсвязывающий фрагмент. Более того, настоящее изобретение относится к агенту для обнаружения злокачественной опухоли, содержащему полинуклеотид, который специфически гибридизируется с частичной последовательностью из 15 или более нуклеотидов, предпочтительно от 20 до 25 или более нуклеотидов, и более предпочтительно 30 или более нуклеотидов в нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, или подобных в списке последовательностей.

В частности, настоящее изобретение характеризуется следующими признаками.

(1) Способ обнаружения злокачественной опухоли, предусматривающий измерение экспрессии полипептида, обладающего способностью связываться посредством реакции антиген-антитело с антителом против белка CAPRIN-1, имеющего любую из аминокислотных последовательностей с четными номерами SEQ ID NO:2-30 списка последовательностей, в образце, выделенном из живого организма.

(2) Способ по пункту (1), приведенному выше, где измеряемым полипептидом является белок CAPRIN-1, имеющий любую из аминокислотных последовательностей с четными номерами SEQ ID NO:2-30 (т.е. SEQ ID NO:2, 4, 6, 8,...,30) или полипептид, последовательность которого на 85% или более идентична белку CAPRIN-1.

(3) Способ по пункту (1) или (2), приведенному выше, где живым организмом является человек, собака или кошка.

(4) Способ по пункту (3), приведенному выше, где живым организмом является собака, а определяемый полипептид имеет аминокислотную последовательность с четными номерами SEQ ID NO:2-30.

(5) Способ по пункту (4), приведенному выше, где живым организмом является собака, а определяемый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14.

(6) Способ по пункту (3), приведенному выше, где живым организмом является человек, а определяемый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или 4.

(7) Способ по любому из пунктов (1)-(6), приведенному выше, в котором экспрессию полипептида измеряют с помощью иммуноанализа антитела, которое может содержаться в образце, и индуцируется in vivo против определяемого полипептида.

(8) Способ по любому из пунктов (1)-(7), приведенных выше, где образцом является сыворотка, плазма крови, асцитическая жидкость или плевральный выпот.

(9) Способ по любому из пунктов (1)-(6), приведенных выше, в котором экспрессию полипептида измеряют путем определения мРНК, кодирующей полипептид, который содержится в этом образце.

(10) Способ по пункту (9), приведенному выше, предусматривающий исследование существующего количества мРНК в образце, используя полинуклеотид, который специфически гибридизируется с частичной последовательностью из 15 или более нуклеотидов, предпочтительно от 20 до 25 или более нуклеотидов, и более предпочтительно из 30 или более нуклеотидов в нуклеотидной последовательности указанной выше мРНК.

(11) Способ по пункту (10), приведенному выше, в которым указанным выше живым организмом является собака, а указанный выше полинуклеотид представляет собой полинуклеотид, специфически гибридизирующийся с частичной последовательностью из 15 или более нуклеотидов, предпочтительно от 20 до 25 или более нуклеотидов, и более предпочтительно из 30 или более нуклеотидов в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5, 7, 9, 11 или 13.

(12) Способ по пункту (10), приведенному выше, где указанным выше живым организмом является человек и указанный выше полинуклеотид представляет собой полинуклеотид, специфически гибридизирующийся с частичной последовательностью из 15 или более нуклеотидов, предпочтительно от 20 до 25 или более нуклеотидов, и более предпочтительно из 30 или более нуклеотидов в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 или 3.

(13) Способ по любому из пунктов (9)-(12), приведенных выше, в котором указанным выше образцом является ткань или клетка.

(14) Способ по любому из пунктов (1)-(13), приведенных выше, в котором злокачественная опухоль представляет собой по меньшей мере один тип злокачественной опухоли, выбранный из группы, состоящей из опухоли головного мозга, сквамозно клеточной карциномы тканей головы, шеи, легких, матки или пищевода, меланомы, аденокарциномы легких или матки, рака почек, злокачественной смешанной опухоли, печеночно-клеточной карциномы, базальноклеточной карциномы, акантома-подобной опухоли десен, опухоли ротовой полости, перианальной аденокарциномы, опухоли анальной пазухи, апокринной аденокарциномы анальной пазухи, карциномы клеток сертоли, рака преддверия влагалища, сальной аденокарциномы, сальной эпителиомы, сальной аденомы, карциномы потовых желез, интраназальной аденокарциномы, назальной аденокарциномы, рака щитовидной железы, рака толстой кишки, аденокарциномы бронхов, аденокарциномы, карциномы из эпителия протоков, аденокарциномы молочной железы, аденокарциномы молочной железы составного типа, сложной злокачественной опухоли молочной железы, внутрипротоковой сосочковой аденокарциномы, фибросаркомы, гемангиоперицитомы, остеосаркомы, хондросаркомы, саркомы мягких тканей, ретикулоклеточной саркомы, миксосаркомы, недифференцированной саркомы, рака легких, мастоцитомы, лейомиомы кожи, внутрибрюшинной лейомиомы, лейомиомы, хронического лимфоцитарного лейкоза, лимфомы, гастроинтестинальной лимфомы, кишечной лимфомы, мелкоклеточной-промежуточноклеточной лимфомы, опухоли мозгового слоя надпочечников, гранулезоклеточной опухоли и феохромоцитомы.

(15) Способ по любому из пунктов (1)-(14), приведенных выше, предусматривающий дополнительное выявление злокачественности опухоли на основании того, что злокачественность опухоли выше, когда уровень экспрессии указанного выше полипептида выше, чем уровень экспрессии контроля.

(16) Способ по любому из пунктов (1)-(15), приведенному выше, предусматривающий дополнительное обнаружение прогрессирования злокачественной опухоли на основании показателя того, что степень злокачественной опухоли является прогрессирующей, когда уровень экспрессии указанного выше полипептида выше, чем уровень экспрессии контроля.

(17) Агент для обнаружения злокачественной опухоли, содержащий полипептид, который обладает способностью связываться посредством реакции антиген-антитело с антителом, которое индуцируется in vivo против белка CAPRIN-1, имеющего любую из аминокислотных последовательностей с четными номерами SEQ ID NO:2-30 списка последовательностей.

(18) Агент для обнаружения злокачественной опухоли, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое подвергается реакции антиген-антитело с полипептидом, где указанный полипептид обладает способностью связываться посредством реакции антиген-антитело с антителом против белка CAPRIN-1, имеющего одну из аминокислотных последовательностей с четными номерами SEQ ID NO:2-30 списка последовательностей и продуцируется in vivo (или в живом организме).

(19) Агент для обнаружения злокачественной опухоли по пункту (18), где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, которое подвергается реакции антиген-антитело с этим полипептидом, представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с поверхностью злокачественной клетки.

(20) Агент для обнаружения злокачественной опухоли по пункту (18) или (19), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое подвергается реакции антиген-антитело с этим полипептидом, обладает иммунологической реактивностью в отношении:

полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из 7 или более последовательных аминокислотных остатков в пределах области аминокислотных остатков №№ 50-98 или аминокислотных остатков №№ 233-305 в одной из аминокислотных последовательностей с четными номерами SEQ IDS NO:2-30 за исключением последовательностей SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:18; или

полипептида, содержащего этот полипептид в виде частичной последовательности.

(21) Агент для обнаружения злокачественной опухоли по любому из пунктов (18)-(20), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое подвергается реакции антиген-антитело с этим полипептидом, представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с последовательностью SEQ ID NO:43, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:44 и 45, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:44 и 46, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:44 и 47, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:44 и 48, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:49 и 50, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:51 и 52, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:53 и 54, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:55 и 56, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:57 и 58, или моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:59 и 60.

(22) Агент для обнаружения злокачественной опухоли, содержащий полинуклеотид, который специфически гибридизируется с частичной последовательностью из 15 или более нуклеотидов, предпочтительно от 20 до 25 или более нуклеотидов, и более предпочтительно из 30 или более нуклеотидов в одной из нуклеотидных последовательностей с нечетными номерами SEQ ID NO:1-29 (т.е. SEQ ID NO:1, 3, 5, 7,…,29) списка последовательностей.

Преимущество изобретения

Настоящее изобретение относится к новому способу обнаружения злокачественных опухолей. Как подробно описано в «Примерах», приведенных ниже, рекомбинантный полипептид, полученный на основе аминокислотной последовательности CAPRIN-1 (или также называемой Caprin-1), взаимодействует с антителом, которое специфически находится в сыворотке пациента со злокачественной опухолью. Следовательно, злокачественная опухоль, находящаяся в живом организме, может быть обнаружена путем определения антитела в образце способом по настоящему изобретению. Также, злокачественная опухоль, находящаяся в живом организме, может быть обнаружена путем определения собственно CAPRIN-1. В соответствии со способом по настоящему изобретению злокачественная опухоль небольшого размера является невидимой невооруженным глазом или злокачественная опухоль в глубине организма может быть обнаружена in vivo. Следовательно, способ по настоящему изобретению может использоваться для раннего обнаружения злокачественной опухоли во время медицинского осмотра или тому подобного. Более того, рецидивирующая злокачественная опухоль может быть обнаружена на ранней стадии способом по настоящему изобретению во время последующего наблюдения за пациентом после лечения злокачественной опухоли. Более того, в соответствии со способом по настоящему изобретению можно диагностировать степень злокачественной опухоли, например увеличение опухоли, инфильтрацию в периферические ткани и метастазирование злокачественной опухоли в лимфатические узлы и отдаленные органы. Также уровень антитела в сыворотке является более высоким у пациента с высокозлокачественной опухолью, чем у пациента с низкозлокачественной опухолью. В соответствии со способом по настоящему изобретению также может быть установлена злокачественность опухоли. Также, как описано в приведенных ниже “Примерах”, мРНК, кодирующая CAPRIN-1, специфически экспрессируется на высоких уровнях в семенниках и злокачественных клетках. Следовательно, злокачественные опухоли также могут быть обнаружены путем определения мРНК.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показаны профили экспрессии гена, кодирующего белок CAPRIN-1 в нормальных тканях и клеточных линиях опухолей. Контроль № 1 указывает на профили экспрессии гена, кодирующего белок CAPRIN-1. Контроль № 2 указывает на профили экспрессии гена GAPDH.

На фиг.2 показаны результаты обнаружения с помощью окрашивания Кумасси синим CAPRIN-1-производного полипептида собак, который является примером полипептидов, используемых в настоящем изобретении, которые получены и очищены с использованием Escherichia coli в “Примерах”. Контроль № 3 указывает полосу CAPRIN-1-производного полипептида собак.

На фиг.3 показаны некоторые результаты диагностики злокачественных опухолей собак, несущих злокачественные опухоли, с использованием CAPRIN-1-производных полипептидов, полученные в “Примерах”.

На фиг.4 показаны некоторые результаты тщательной диагностики злокачественной опухоли собак, несущих злокачественные опухоли, с использованием CAPRIN-1-производных полипептидов собак, полученные в “Примерах”.

Наилучший вариант осуществления изобретения

В соответствии со способом по настоящему изобретению экспрессию CAPRIN-1 определяют, используя образец, выделенный из живого организма. Примеры способа измерения экспрессии CAPRIN-1 включают способ (1-й способ), который включает иммуноанализ антитела против CAPRIN-1, содержащегося в образце, способ (2-й способ), который включает иммуноанализ самого CAPRIN-1, содержащегося в образце, и способ (3-й способ), который включает измерение мРНК, кодирующей CAPRIN-1, содержащейся в образце. В способе по настоящему изобретению экспрессия CAPRIN-1 может быть измерена любым из этих способов. В настоящем изобретении термин «измерение» относится к любому из обнаружения, качественного определения, количественного определения и полуколичественного определения.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14 представляет собой аминокислотную последовательность CAPRIN-1 собаки. CAPRIN-1 собаки с аминокислотной последовательностью был идентифицирован как полипептид, связывающийся с антителом, специфически находящимся в сыворотке, полученной от собак, страдающих злокачественной опухолью, способом SEREX, используя библиотеку кДНК из семенников собаки и сыворотку собак со злокачественной опухолью (см. пример 1). В частности, антитело против CAPRIN-1, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14, специфически индуцируется in vivo у собак со злокачественной опухолью. Следовательно, злокачественная опухоль у собак может быть обнаружена путем измерения указанного выше антитела против CAPRIN-1, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14, с использованием указанного 1-го способа (см. примеры 3 и 4). Злокачественная опухоль у собак также может быть обнаружена путем измерения самого CAPRIN-1 как антигена, показанного в последовательностях SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14, с использованием указанного выше 2-го способа (см. примеры 5 и 6). Также, злокачественная опухоль у собак может быть обнаружена, как описано в последующих “Примерах”, путем измерения мРНК, кодирующей CAPRIN-1, поскольку мРНК экспрессируется на значительно более высоких уровнях в семенниках и злокачественных клетках (см. пример 1).

Используемый в настоящем изобретении термин «имеющий аминокислотную последовательность» относится к аминокислотным остаткам, выровненным в релевантном порядке. Следовательно, например, выражение «полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2» относится к полипептиду, имеющему 709 аминокислотных остатков, который состоит из аминокислотной последовательности Met Pro Ser Ala···(сокращено)··Gln Gln Val Asn, показанной в последовательности SEQ ID NO:2. Также, например, выражение «полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2» также может быть сокращено как «полипептид последовательности SEQ ID NO:2». Тоже используется к выражению «имеющий нуклеотидную последовательность». В этом случае, термин «имеющий» может быть заменен выражениями «состоящий из».

Также, термин «полипептид», используемый в контексте настоящего изобретения, относится к молекуле, которая образована посредством пептидного связывания множества аминокислот. Примеры такой молекулы включают не только молекулы полипептидов с большим числом составляющих аминокислот, а также молекулы с низкой молекулярной массой (олигопептиды) с небольшим числом аминокислот и полноразмерные белки. Настоящее изобретение дополнительно охватывает полноразмерные белки CAPRIN-1, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность, с четными номерами ID последовательности из SEQ ID NO:2-30.

В способе по настоящему изобретению не только CAPRIN-1 собак последовательности SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14, а также CAPRIN-1 других млекопитающих (здесь и далее также может быть назван как «гомолог» для CAPRIN-1 собак. В тех случаях, когда называют просто «CAPRIN-1», CAPRIN-1 не только собак, а также другого млекопитающего также охватывается в настоящем изобретении) также подвергаются определению. Как подробно описано в следующих “Примерах”, мРНК, кодирующая CAPRIN-1 человека, в значительной степени экспрессируется на высоком уровне в семенниках человека и злокачественных клетках, как в случае CAPRIN-1 собак последовательности SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14. Однако в здоровом организме человека отсутствует антитело против CAPRIN-1 человека. Также, антитело против CAPRIN-1 кошек не определяется в организме здоровой кошки, а определяется только у кошек со злокачественной опухолью. Следовательно, злокачественная опухоль млекопитающего, отличного от собаки, может быть определена путем измерения экспрессии CAPRIN-1 у млекопитающего. Примеры CAPRIN-1 млекопитающих, отличных от собак, которые являются предметом определения в способе по настоящему изобретению, включают, но не только, CAPRIN-1 человека и CAPRIN-1 кошек. Нуклеотидная последовательность, кодирующая CAPRIN-1 человека и его аминокислотная последовательность, отдельно показаны в последовательностях SEQ ID NO:1 и 3, и 2 и 4, соответственно, в списке последовательностей. Идентичность последовательностей с CAPRIN-1 собак составляет 94% в отношении нуклеотидной последовательности и составляет 98% в отношении аминокислотной последовательности. Даже собаки и люди, которые являются генетически далекими млекопитающими, имеют идентичность последовательностей вплоть до 98% в отношении аминокислотной последовательности CAPRIN-1. Следовательно, считается, что собака и млекопитающее, отличное от человека; то есть CAPRIN-1 собаки и его гомолог, имеют высокую идентичность последовательностей примерно вплоть до 85% или более. Следовательно, CAPRIN-1, экспрессию которого измеряют в способе по настоящему изобретению, имеет, предпочтительно, 85% или более и, более предпочтительно, 95% или более идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью CAPRIN-1 собаки SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14. Однако такие примеры не ограничиваются конкретно этим.

В 1-м способе, приведенном выше, антитело, которое может находиться в образце, легко может быть определено с помощью иммуноанализа с использованием антигенного вещества, которое подвергается реакции антиген-антитело с этим антителом. Сам иммуноанализ является известным общепринятым способом, подробно описанным ниже. В качестве антигенного вещества для иммуноанализа может быть использован CAPRIN-1 собаки последовательности SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14, который вызывает индукцию антитела в организме собаки со злокачественной опухолью. Более того, это антитело обладает перекрестной реактивностью. Таким образом, даже молекула, отличная от антигенного вещества, фактически служащая в качестве иммуногена, может связываться с антителом, индуцированным против иммуногена посредством реакции антиген-антитело, при условии, что структура, аналогичная эпитопу иммуногена, находится на этой молекуле. В частности, белок млекопитающего и его гомолог другого млекопитающего имеют высокую идентичность аминокислотных последовательностей и зачастую имеют эпитопные структуры, аналогичные друг другу. Как подробно описано в следующих “Примерах”, CAPRIN-1 собаки последовательности SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14, подвергается реакции антиген-антитело не только с антителом, индуцированным против CAPRIN-1 собаки в организме собаки со злокачественной опухолью, а также с антителом, индуцированным против CAPRIN-1 кошки в организме кошки со злокачественной опухолью. Более того, CAPRIN-1 человека подвергается реакции антиген-антитело с указанным выше антителом, индуцированным в организме собаки со злокачественной опухолью или в организме кошки со злокачественной опухолью. Соответственно, в 1-м способе по настоящему изобретению CAPRIN-1 любого млекопитающего может быть использован в качестве антигена для иммуноанализа.

В основном, если антигенным веществом является белок или тому подобное вещество со сложной структурой и высокой молекулярной массой, то на молекуле находится множество сайтов, имеющих различные структуры. Следовательно, множество типов антител, способных распознавать и связываться с различными сайтами таких антигенных веществ, продуцируется in vivo. В особенности, антитело, которое продуцируется in vivo против антигенного вещества, такого как белок, является поликлональным антителом, которое представляет собой смесь множества типов антител. Антитело, описываемое авторами настоящего изобретения, также является поликлональным антителом. Оно специфически находится в сыворотке, полученной из живого организма со злокачественной опухолью, и специфически связывается с рекомбинантным белком CAPRIN-1 посредством реакции антиген-антитело. Термин «поликлональное антитело», используемый в настоящем изобретении, относится к антителу, которое находится в сыворотке, полученной из живого организма, содержащей антигенное вещество, и индуцируется in vivo против антигенного вещества.

В “Примерах”, описанных ниже, полипептиды последовательности SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:8 (CAPRIN-1 собаки), полипептид последовательности SEQ ID NO:2 (CAPRIN-1 человека) получали в качестве антигенов для иммуноанализа специфических антител у живых животных со злокачественными опухолями. Затем подтверждали реакционноспособность между этими полипептидами и указанным выше антителом в сыворотке, полученной из живого организма со злокачественной опухолью. Однако указанное выше антитело является поликлональным антителом, так что оно по своей природе связывается с полипептидом, состоящим из гомолога последовательности SEQ ID NO:6, 8 или 2. Даже в случае фрагмента указанных полипептидов он может связываться с указанным выше антителом, содержащимся в сыворотке, полученной из живого организма со злокачественной опухолью, поскольку поликлональное антитело может содержать антитело, способное распознавать структуру релевантного фрагмента. То есть либо полипептид (то есть полноразмерный белок CAPRIN-1) гомолога последовательности SEQ ID NO:6, 8 или 2, либо его фрагмент может быть аналогичным образом использован для определения указанного выше поликлонального антитела, содержащегося специфически в сыворотке живого организма со злокачественной опухолью, и применим для обнаружения злокачественной опухоли. Следовательно, примеры полипептида, используемого в качестве антигена для иммуноанализа в 1-м способе по настоящему изобретению, включают не только полипептид, который состоит из полноразмерной области CAPRIN-1 (например, SEQ ID NO:6, 8 или 2), а также фрагмент полипептида, который состоит из последовательных 7 или более, предпочтительно последовательных 8 или более, 9 или более, или 10 или более аминокислот в аминокислотной последовательности CAPRIN-1 и подвергается реакции антиген-антитело с поликлональным антителом против CAPRIN-1 (здесь и далее для удобства может называться «специфически реагирующим частичным полипептидом»). Из уровня техники известно, что полипептид примерно из 7 или более аминокислотных остатков обладает антигенностью. Однако, если число аминокислотных остатков, составляющих полипептид, является слишком низким, такой полипептид с высокой вероятностью перекрестно реагирует с антителами, которые присутствуют в образце, против белков, отличных от CAPRIN-1. На этом основании, принимая во внимание повышение точности иммуноанализа, желаемым числом аминокислотных остатков фрагмента полипептида может быть, предпочтительно, 30 или более, или 50 или более, более предпочтительно 100 или более, или 150 или более, более предпочтительно 300 или более, и, еще более предпочтительно, 600 или более, и, более предпочтительно, 1000 или более и 1500 или более.

Особенно предпочтительные примеры полипептидов, используемых в качестве антигенов, представляют собой полипептиды с четными номерами SEQ ID NO:2-30 или их фрагменты.

Нуклеотидные последовательности полинуклеотидов, кодирующих белки, состоящие из аминокислотных последовательностей с четными номерами SEQ ID NO:2-30 (то есть SEQ ID NO:2, 4, 6···28, 30) показаны в последовательностях с нечетными номерами SEQ ID NO:1-29 (то есть SEQ ID NO:1, 3, 5··27, 29).

В основном, специалистам в области белковых антигенов хорошо известно, что даже если в аминокислотной последовательности белка заменено несколько аминокислотных остатков, делетировано, добавлено или вставлено, то полученный в результате белок может сохранять антигенность, почти эквивалентную антигенности исходного белка. Следовательно, полипептид с последовательностью, в которой сделаны замены, делеции и/или вставки небольшого количества (предпочтительно, одного или нескольких) аминокислотных остатков по сравнению с аминокислотной последовательностью CAPRIN-1 и имеет 80% или более, 85% или более, предпочтительно 90% или более, более предпочтительно 95% или более, и более предпочтительно 98% или более идентичность последовательностей с первоначальной последовательностью; и специфически связываются с поликлональным антителом против CAPRIN-1 посредством реакции антиген-антитело (здесь и далее может для удобства называться «специфически реагирующим модифицированным полипептидом»), может быть использован для обнаружения злокачественной опухоли способом, аналогичным способу для указанных выше полипептидов. Предпочтительно, специфически реагирующий модифицированный полипептид имеет аминокислотную последовательность, в которой сделана замена, делеция, добавление и/или вставка одного или нескольких аминокислотных остатков в отношении аминокислотной последовательности CAPRIN-1. Термин «несколько», используемый в контексте настоящего изобретения, относится к целому числу от 2 до 10, предпочтительно целому числу от 2 до 6, и более предпочтительно целому числу от 2 до 4.

Термин «идентичность последовательностей (аминокислотных последовательностей)», используемый в контексте настоящего изобретения, получен путем выравнивая двух аминокислотных последовательностей, подлежащих сравнению, так чтобы аминокислотные остатки соответствовали, насколько это возможно, вычитая число аминокислотных остатков, которые совпали, из общего числа аминокислотных остатков, а затем выражая результат в виде процентов. После указанного выше выравнивания при необходимости разрывы соответствующим образом встраивают в одну или обе последовательности, подлежащие сравнению. Такое выравнивание последовательностей можно осуществлять, используя известную программу, такую как BLAST, FASTA или CLUSTAL W (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:2264-2268, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997).

Двадцать типов аминокислот, составляющих природные белки, могут быть разделены на группы нейтральных аминокислот, имеющих боковые цепи с низкой полярностью (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met и Pro), нейтральных аминокислот, имеющих гидрофильные боковые цепи (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr и Cys), кислые аминокислоты (Asp и Glu), основные аминокислоты (Arg, Lys и His) и ароматические аминокислоты (Phe, Tyr, Trp и His), в которых представители каждой группы имеют свойства, аналогичные друг другу. Известно, что замена среди этих аминокислот (то есть консервативная замена) редко изменяет свойства полученного в результате полипептида. Следовательно, в тех случаях, когда аминокислотные остатки CAPRIN-1 являются замещенными, замену проводят среди представителей одной и той же группы, так что возможность сохранения связывания с соответствующим антителом становится выше. Однако в настоящем изобретении указанный выше вариант может включать неконсервативную замену, при условии что передается иммуно-индуцирующая активность, эквивалентная или почти эквивалентная таковой неизмененного полипептида.

Полипептид (здесь и далее для удобства может называться «специфически реагирующим дополнительным полипептидом»), который содержит в качестве частичной последовательности указанный выше полипептид, используемый в настоящем изобретении (то есть полученный путем добавления другого (поли)пептида к одному концу или обоим концам полипептида, используемого в настоящем изобретении) и специфически связывается с поликлональным антителом против CAPRIN-1 посредством реакции антиген-антитело, также может быть использован для обнаружения злокачественной опухоли способом, аналогичным таковому для указанных выше полипептидов.

Указанные выше полипептиды, используемые в настоящем изобретении, могут быть синтезированы в соответствии со способом химического синтеза, такого как способ Fmoc (флуоренилметоксикарбонильный способ) и tBoc способ (трет-бутокси-карбонильный способ) (Ed., The Japanese Biochemical Society, Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimental Lecture Series) 1, Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, TOKYO KAGAKU DOZIN CO., LTD (Japan), 1981). Также, полипептиды могут быть синтезированы общепринятым способом с использованием различных коммерчески доступных синтезаторов пептидов. Альтернативно, полипептиды легко могут быть получены с использованием известных способов генной инженерии (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, и тому подобные). Например, из РНК, экстрагированной из ткани, экспрессирующей ген, кодирующий CAPRIN-1 человека с последовательностью SEQ ID NO:2 или его гомолог, кДНК этого гена получают с помощью ОТ-ПЦР. Полноразмерную последовательность или желаемую частичную последовательность кДНК встраивают в вектор экспрессии, а затем этот вектор вводят в клетки-хозяева, так чтобы можно было получить интересующий полипептид. Нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующие CAPRIN-1 собаки с последовательностью SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 и 14 показаны в последовательностях SEQ ID NO:5, 7, 9, 11 и 13 соответственно. Гомологичные им факторы человека, то есть нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующие CAPRIN-1 человека, последовательностей SEQ ID NO:2 и 4 показаны в последовательностях SEQ ID NO:1 и 3 соответственно. Следовательно, праймеры, используемые для ОТ-ПЦР, легко могут быть сконструированы применительно к этим нуклеотидным последовательностям. Также, как описано далее, ген, кодирующий CAPRIN-1 млекопитающего, не являющегося человеком, может быть амплифицирован с использованием праймеров, созданных применительно к нуклеотидным последовательностям с нечетными номерами SEQ ID NO:1-29. Например, кДНК, кодирующая CAPRIN-1 кошки, легко может быть получена с помощью методик, аналогичных указанным выше методикам. Экстракция РНК, ОТ-ПЦР, встраивание кДНК в вектор и введение вектора в клетки-хозяева, могут быть выполнены известными способами, например, как описано ниже. Также, векторы и клетки-хозяева, используемые в настоящем изобретении, также являются известными, и различные векторы и клетки-хозяева являются коммерчески доступными.

Указанными выше клетками-хозяевами могут быть любые клетки, при условии что они могут экспрессировать указанные выше полипептиды. Примеры прокариотических клеток-хозяев включают Escherichia coli и тому подобные. Примеры эукариотических клеток-хозяев включают культивированные клетки млекопитающих, такие как клетки почек мартышки (COS1), ооциты китайского хомячка (CHO), клеточная линия эмбриональных почек человека (HEK293) и клеточная линия эмбриональной кожи мыши (NIH3T3), почкующиеся дрожжи, делящиеся дрожжи, клетки шелковичного червя и яйцеклетки Xenopus.

В тех случаях когда прокариотические клетки используют в качестве клеток-хозяев, используют вектор экспрессии, имеющий точку начала репликации в прокариотических клетках, промотор, сайт связывания с рибосомой, сайт множественного клонирования, терминатор, ген резистентности к лекарственным средствам, ауксотрофный комплементарный ген и тому подобное. В качестве векторов экспрессии для Escherichia coli pUC векторы, pBluescriptII, системы экспрессии pET, системы экспрессии pGEX и тому подобные могут быть приведены в качестве примера. ДНК, кодирующую указанный выше полипептид, встраивают в такой вектор экспрессии, прокариотические клетки-хозяева трансформируют этим вектором, а затем полученный таким образом трансформант культивируют, так чтобы полипептид, кодируемый этой ДНК, мог быть экспрессирован в прокариотических клетках-хозяевах. В это же время полипептид также может быть экспрессирован в виде слитого белка с другим белком. ДНК, кодирующая указанный выше полипептид, может быть получена путем получения кДНК с помощью ОТ-ПЦР, как описано выше, например. Более того, такая ДНК, кодирующая указанный выше полипептид, также может быть синтезирована общепринятым способом с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеиновых кислот, как описано ниже. Нуклеотидные последовательности кДНК генов, кодирующих CAPRIN-1, последовательностей SEQ ID NO:2 и 4 показаны в SEQ ID NO:1 и 3 соответственно в списке последовательностей.

В тех случаях когда эукариотические клетки используют в качестве клеток-хозяев, используют векторы экспрессии для эукариотических клеток, имеющих промотор, область сплайсинга, дополнительный участок поли(A) и тому подобное. Примеры таких векторов экспрессии включают pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV вектор, pRS, pcDNA3 и pYES2. Аналогично указанному выше, ДНК, кодирующая полипептид, используемый в настоящем изобретении, встраивают в такой вектор экспрессии, эукариотические клетки-хозяева трансформируют этим вектором, а затем полученный таким образом трансформант культивируют, так чтобы полипептид, кодируемый указанной выше ДНК, мог быть экспрессирован в эукариотических клетках-хозяевах. В тех случаях когда pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 или тому подобное используют в качестве вектора экспрессии, указанный выше полипептид может быть экспрессирован в виде слитого белка с различными метками, таким как His (например, (His)₆ - (His)₁₀), FLAG, myc, HA и GFP.

Для введения вектора экспрессии в клетку-хозяина, могут быть использованы известные способы, такие как электропорация, метод с фосфатом кальция, липосомный способ, способ DEAE декстран, микроинъекция, вирусное инфицирование, липофекция и связывание с пептидом, проникающим через клеточную мембрану.

Выделение и очистка полипептида, представляющего интерес, из клеток-хозяев, могут быть выполнены известными способами выделения в сочетании. Примеры таких известных способов включают обработку с использованием денатурирующего вещества, такого как мочевина или поверхностно-активное вещество, обработка ультразвуком, ферментативное расщепление, высаливание, фракционирование с селективным растворителем и преципитация, диализ, центрифугирование, ультрафильтрация, гель-фильтрация, SDS-PAGE, изоэлектрическое фокусирование, ионнно-обменная хроматография, хроматография гидрофобных взаимодействий, аффинная хроматография и хроматография с обращенной фазой.

Полипептиды, полученные указанными выше способами, включают полипептиды в виде слитых белков с любыми другими белками. Примеры такого слитого белка включают слитый белок с глутатион-S-трансферазой (GST), His меткой, или подобным. Полипептиды в виде таких слитых белков также являются примерами описанных выше специфически реагирующих дополнительных полипептидов и могут быть использованы для 1-го способа обнаружения по настоящему изобретению. Более того, полипептид, экспрессируемый в трансформированных клетках, может подвергаться различным типам модификации в клетках после трансляции. Такой полипептид, который модифицирован после трансляции, может быть использован в 1-м способе обнаружения по настоящему изобретению, при условии что он способен связываться с поликлональным антителом против CAPRIN-1. Примеры такой пост-трансляционной модификации включают удаление N-концевого метионина, N-концевое ацетилирование, гликозилирование, ограниченный протеолиз под действием внутриклеточной протеазы, миристилирование, изопренилирование и фосфорилирование.

Антитело в образце легко можно определить с помощью иммуноанализа с использованием указанного выше полипептида в качестве антигена. Иммуноанализ известен из уровня техники. Иммуноанализы классифицируют на метод сэндвича, конкурентный метод, метод агглютинации, вестен-блоттинг и подобные исходя из типа реакции. Также, иммуноанализ классифицируют в зависимости от меток на радиоиммуноанализ, флуоресцентный иммуноанализ, ферментативный иммуноанализ, иммуноанализ с биотином, например. Иммуноанализ указанного выше антитела может быть выполнен с использованием любого из этих способов. Сэндвич ELISA или метод агглютинации предпочтительно используют в качестве методики иммуноанализа для указанного выше антитела в способе по настоящему изобретению, поскольку процедуры этих способов удобны и не требуют больших приборов и подобного. Но эти методики не ограничиваются ими. В тех случаях, когда используют фермент в качестве метки для антитела, такой фермент конкретно не ограничен, при условии что он удовлетворяет таким условиям, как: высокая производительность; остается стабильным, даже если связан с антителом, он специфически вызывает развитие цветовой реакции субстрата, и подобным. Примеры ферментов, которые могут быть использованы для общего ферментного иммуноанализа, включают пероксидазу, β-галактозидазу, щелочную фосфатазу, глюкозоксидазу, ацетилхолинэстеразу, дегидрогеназу глюкозо-6-фосфорилирования и дегидрогеназу яблочной кислоты. Также могут быть использованы фермент-ингибирующие вещества, коэнзимы и тому подобное. Связывание этих ферментов с антителами может быть выполнено известными способами с использованием поперечно-сшивающего вещества, такого как малеимидное соединение. В качестве субстрата известное вещество может быть использовано в зависимости от типа используемого фермента. Например, в тех случаях, когда используют пероксидазу в качестве фермента, может быть использован 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. Также, в тех случаях, когда в качестве фермента используют щелочную фосфатазу, может быть использован пара-нитрофенол или тому подобное. В качестве радиоактивного изотопа может быть использован радиоизотоп, который в основном используют для радиоиммуноанализа, такой как ¹²⁵I и ³H. В качестве флуоресцентного красителя может быть использован флуоресцентный краситель, который используют для основных методик флуоресцентных антител, например изотиоцианат флуоресценции (FITC) и тетраметилродамин изотиоцианат (TRITC).

Нет необходимости описывать указанные выше методики иммуноанализа, поскольку они хорошо известны. Однако в тех случаях, когда эти методики иммуноанализа кратко описываются, метод сэндвича включает иммобилизацию указанного выше полипептида, используемого в качестве антигена, на твердой фазе, взаимодействие его с образцом, таким как сыворотка, промывание, взаимодействие с соответствующим вторичным антителом, промывание, а затем измерение вторичного антитела, связанного с твердой фазой, например. Несвязанное вторичное антитело легко может быть удалено путем иммобилизации антигенного полипептида на твердой фазе. Следовательно, это предпочтительно в качестве варианта осуществления способа обнаружения злокачественной опухоли по настоящему изобретению. В качестве вторичного антитела, может быть использовано антитело против IgG собаки, если образец получен у собаки. Вторичное антитело предварительно метят метящим веществом, примеры которого приведены выше, так чтобы можно было определить связывание вторичного антитела с твердой фазой. Измеренное таким образом количество вторичного антитела соответствует количеству указанного выше антитела в образце сыворотки. В тех случаях когда фермент используют в качестве метящего вещества, количество антитела может быть измерено путем добавления субстрата, который расщепляется с развитием окраски под действием фермента, а затем оптического измерения количества расщепленного субстрата. В тех случаях когда в качестве метящего вещества используют радиоизотоп, количество излучения из радиоизотопа может быть измерено с использованием сцинтилляционного счетчика или тому подобного.

Во 2-м способе по настоящему изобретению измеряют CAPRIN-1, который может содержаться в образце, полученном из живого организма. Как описано выше, среди пациентов со злокачественными опухолями количество антитела, которое подвергается реакции антиген-антитело с CAPRIN-1 собаки, человека или тому подобного, значительно выше. Это указывает на то, что количество CAPRIN-1, накопленного в качестве антигена, значительно выше в злокачественных клетках. Злокачественная опухоль также может быть обнаружена путем непосредственного измерения CAPRIN-1, как описано в приведенных ниже “Примерах”. Следовательно, злокачественная опухоль может быть обнаружена in vivo путем измерения самого CAPRIN-1, аналогично приведенному выше 1-му способу.

Полипептид в образце легко может быть измерен с помощью хорошо известных методик иммуноанализа. В частности, например, получают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который подвергается реакции антиген-антитело с CAPRIN-1, иммуноанализ проводят с использованием этого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, а затем может быть измерен CAPRIN-1, который может находиться в образце. Как описано выше, антитело обладает перекрестной реактивностью. Следовательно, например, путем использования антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое подвергается реакции антиген-антитело с CAPRIN-1 собаки последовательности SEQ ID NO:6, может быть измерен не только CAPRIN-1 собаки последовательности SEQ ID NO:6, а также его гомолог у других млекопитающих (например, CAPRIN-1 человека последовательности SEQ ID NO:2 или 4 и CAPRIN-1 кошки). Сама методика иммуноанализа представляет собой известную общепринятую методику, как описано выше.

В этом исследовании обнаружено, что CAPRIN-1 представляет собой белок клеточной мембраны, который экспрессируется на поверхностях злокачественных клеток. Живой организм со злокачественной опухолью содержит различные виды протеаз. В частности, в живом организме со злокачественной опухолью внеклеточно экспрессируемая часть последовательности CAPRIN-1 отделяется от злокачественных клеток путем деградации, так что такая часть присутствует на уровне, более высоком, чем внутриклеточно экспрессируемая часть последовательности CAPRIN-1. Следовательно, когда используется антитело против CAPRIN-1 или его антигенсвязывающий фрагмент, используемые в этом определении, которые связываются с поверхностью злокачественной клетки, CAPRIN-1 может быть обнаружен на более высоких уровнях и злокачественная опухоль может быть диагностирована с более высокой чувствительностью. Следовательно, в настоящем изобретении предпочтительно используют антитела, связывающиеся с частью белка CAPRIN-1, находящейся на поверхностях злокачественных клеток. Примером частичного пептида белка CAPRIN-1, находящегося на поверхности злокачественных клеток, является полипептид, содержащий последовательность из последовательных 7 или более аминокислотных остатков в области аминокислотных остатков №№ (aa) 50-98 или аминокислотных остатков №№ (aa) 233-305 в аминокислотных последовательностях с четными номерами SEQ ID NO:2-30 списка последовательностей за исключением SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:18. Его конкретным примером является аминокислотная последовательность SEQ ID NO:43 или SEQ ID NO:61 (в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:61, область аминокислотной последовательности SEQ ID NO:62 или SEQ ID NO:63 является предпочтительной) или аминокислотная последовательность, которая на 80% или более, предпочтительно на 85% или более, более предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более идентична релевантной аминокислотной последовательности. Примеры антитела, используемого в настоящем изобретении, включают все антитела, связывающиеся с этими пептидами. Особые примеры антитела включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с последовательностью SEQ ID NO:43, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:44 и 45, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:44 и 46, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:44 и 47, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:44 и 48, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:49 и 50, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:51 и 52, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:53 и 54, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:55 и 56, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:57 и 58, или моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:59 и 60.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент», используемый в настоящем изобретении, относится к фрагменту антитела, способному связываться с антигеном, таким как фрагмент Fab и фрагмент F(ab')₂, находящийся в молекуле антитела. Антитело, используемое в настоящем изобретении, может быть поликлональным антителом или моноклональным антителом. Для иммуноанализа и других аналогичных анализов, предпочтительными является моноклональное антитело с высокой воспроизводимостью. Способ получения поликлонального антитела и моноклонального антитела с использованием полипептида в качестве иммуногена известен и без труда может быть выполнен с помощью общепринятого способа. Например, CAPRIN-1 связывается с белком-носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (KLH), казеин или сывороточный альбумин, а затем животное иммунизируют полученным в результате соединением в качестве иммуногена вместе с адъювантом, и посредством этого может быть индуцировано антитело против CAPRIN-1. Антитело-продуцирующие клетки, такие как спленоциты или лимфоциты, полученные от иммунизированного животного, сливают с клетками миеломы для получения гибридом, а затем гибридомы, продуцирующие антитела, которые связываются с CAPRIN-1, отбирают и затем выращивают, так чтобы моноклональное антитело, соответствующим антигеном которого является CAPRIN-1, могло быть получено из культурального супернатанта. Указанный выше способ является известным общепринятым способом.

В 3-м способе по настоящему изобретению измеряют мРНК, кодирующую CAPRIN-1, который может находиться в образце, полученном из живого организма. Как подробно описано в приведенных ниже «Примерах», мРНК, кодирующая CAPRIN-1 собаки последовательности SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14, или CAPRIN-1 человека последовательности SEQ ID NO:2 или 4 экспрессируется на значительно более высоком уровне в злокачественных клетках. Следовательно, злокачественная опухоль может быть обнаружена in vivo путем измерения такой мРНК в образце.

мРНК в образце может быть количественно определена с помощью общепринятого способа, такого как ОТ-ПЦР определение в режиме реального времени с использованием мРНК в качестве матрицы, например. Такая мРНК в основном может быть определена количественно на основании интенсивности окрашивания или тому подобного в Нозерн-блоттинге, который является общепринятым способом. Последовательности кДНК, кодирующей полипептиды CAPRIN-1 с четными номерами SEQ ID NO:2-30, показаны в последовательностях с нечетными номерами SEQ ID NO:1-29 соответственно. Следовательно, исходя из этих последовательностей получают полинуклеотид, специфически гибридизирующийся с частичной областью в любой нуклеотидной последовательности с нечетными номерами SEQ ID NO:1-29 (здесь и далее называемый «полинуклеотидом для обнаружения злокачественной опухоли»), а затем количество мРНК в образце может быть измерено с использованием этого полинуклеотида в качестве зонда или праймера для способа амплификации нуклеиновой кислоты. Как описано далее, если этот полинуклеотид, специфически гибридизирующийся с частичной областью в любой нуклеотидной последовательности с нечетными номерами SEQ ID NO:1-29, также может быть обнаружена мРНК, кодирующая CAPRIN-1 у млекопитающих, отличных от собак и людей. Кроме того, в настоящем изобретении полинуклеотид может представлять собой РНК или ДНК.

Термин «специфически гибридизирующаяся с», используемый в контексте настоящего изобретения, относится к тому, что в общих условиях гибридизации субъект гибридизируется только с частичной областью-мишенью, но по существу не гибридизируется с другими областями.

Термин «(в) общих условиях гибридизации», используемый в контексте настоящего изобретения, относится к условиям, используемым для отжига в обычной ПЦР или обнаружения с использованием зонда. Например, в случае ПЦР с использованием Taq полимеразы этот термин относится к условиям, при которых реакцию проводят при соответствующей температуре отжига в диапазоне примерно от 54°C до 60°C с использованием обычного буфера, такого как 50 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,3-9,0) и 1,5 мМ MgCl₂. Также в случае Нозерн-гибридизации, например, этот термин относится к условиям, при которых реакцию проводят с использованием обычного гибридизационного раствора, такого как 5 × SSPE, 50% формамид, 5 × раствора Денхардта и 0,1% SDS-0,5% SDS или 0,1-5 × SSC и 0,1-0,5% SDS при соответствующей температуре гибридизации в диапазоне примерно от 42°C до 65°C. Более того, после гибридизации промывание проводят с использованием 0,1-0,2 × SSC и 0,1% SDS, например. Однако, соответствующие температуры отжига или температуры гибридизации не ограничиваются указанными выше примерами и определяются исходя из величины Tm для полинуклеотида для обнаружения злокачественной опухоли, который используется в качестве праймера или зонда, и эмпирического правила специалиста, проводящего эксперимент. Специалисты в данной области без труда могут определить такой диапазон температур.

Выражение «по существу не гибридизируется с», используемое в контексте настоящего изобретения, относится к тому, что субъект действительно не гибридизируется с частичной областью-мишенью или субъект гибридизируется с частичной областью-мишенью в существенно низком количестве; то есть в относительно ничтожно малом количестве, даже если гибридизируется с частичной областью-мишенью. Примером полинуклеотида, специфически гибридизирующегося в таких условиях, является полинуклеотид, идентичность последовательности которого находится на уровне или превышающем идентичность нуклеотидной последовательности частичной области-мишени. В конкретном примере такой полинуклеотид имеет 70% или более, предпочтительно 80% или более, 85% или более, более предпочтительно 90% или более, более предпочтительно 93% или более, более предпочтительно 95% или более, и еще более предпочтительно 98% или более идентичность последовательностей. Наиболее предпочтительно, этот полинуклеотид имеет нуклеотидную последовательность, идентичную нуклеотидной последовательности частичной области-мишени. Идентичность последовательности определяют тем же образом, что и идентичность последовательности указанной выше аминокислотной последовательности. Даже если концевая область полинуклеотида для обнаружения злокачественной опухоли содержит область, не гибридизирующуюся с субъектом, в случае зонда, она может использоваться для обнаружения, при условии что область гибридизации содержит вплоть до половины или более всего зонда. Также, в случае праймера она может быть использована для обнаружения, при условии что область гибридизации занимает примерно вплоть до половины или более всего праймера и расположена на 3'-конце, поскольку имеет место нормальный отжиг и реакция элонгации. Как описано выше, в тех случаях, когда конец полинуклеотида для обнаружения злокачественной опухоли содержит негибридизирующуюся область, идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью мишенью вычисляют, обращая особое внимание только на область гибридизации, не принимая во внимание негибридизирующуюся область.

Термин «частичная последовательность» в настоящем изобретении относится к частичной последовательности в нуклеотидных последовательностях с нечетными номерами SEQ ID NO:1-29, в частности, частичной последовательности, имеющей последовательность из непрерывных 15 или более нуклеотидов, предпочтительно непрерывных 18 или более нуклеотидов, более предпочтительно непрерывных 20 или более нуклеотидов или 25 или более нуклеотидов, и также, предпочтительно, непрерывных 30, 40 или 50 или более нуклеотидов. Выражение «нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:5», используемое в настоящем изобретении, относится помимо нуклеотидной последовательности, фактически показанной в последовательности SEQ ID NO:5, к последовательности, комплементарной этой последовательности. Следовательно, например, выражение «полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5», относится к одноцепочечному полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность, фактически показанную в последовательности SEQ ID NO:5, к одноцепочечному полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность, комплементарную таковой, показанной в последовательности SEQ ID NO:5, и к двухцепочечному полинуклеотиду, содержащему их. В тех случаях, когда получают полинуклеотид, используемый в настоящем изобретении, или получают полинуклеотид, кодирующий полипептид, используемый в настоящем изобретении, соответственно, выбирают любую нуклеотидную последовательность, и этот отбор легко может быть сделан специалистом в данной области.

Число нуклеотидов в полинуклеотиде для обнаружения злокачественной опухоли, предпочтительно, составляет 18 или более нуклеотидов, принимая во внимание обеспечение специфичности. При использовании в качестве зонда, размер полинуклеотида, предпочтительно, составляет 18 или более нуклеотидов, также, предпочтительно, составляет 20 или более нуклеотидов и полноразмерную кодирующую область или менее. При использовании в качестве праймера размер полинуклеотида, предпочтительно, составляет 18 или более нуклеотидов и 50 или менее нуклеотидов. Предпочтительным примером полинуклеотида для обнаружения злокачественной опухоли является полинуклеотид, содержащий непрерывных 18 или более нуклеотидов в любой нуклеотидной последовательности с нечетными номерами SEQ ID NO:1-29.

Специалистам в данной области, которым адресовано это описание, очевидно, что полинуклеотид, специфически гибридизирующийся с частичной областью в последовательности SEQ ID NO:5, 7, 9, 11 или 13, используется для измерения количества мРНК, кодирующей CAPRIN-1 собаки, последовательности SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14 соответственно; и полинуклеотид, специфически гибридизирующийся с частичной областью в SEQ ID NO:1 или 3, используют для измерения количества мРНК, кодирующей CAPRIN-1 человека, последовательности SEQ ID NO:2 или 4 соответственно. Однако белок, полученный у млекопитающего, и его гомолог, полученный у другого млекопитающего, в большинстве случаев имеет высокую идентичность последовательностей, даже на уровне нуклеотидной последовательности. Таким образом, идентичность последовательности среди последовательностей с нечетными номерами SEQ ID NO:1-13, также является очень высокой, например от 94% до 100%. Соответственно, полинуклеотид, специфически гибридизирующийся с частичной областью последовательности SEQ ID NO:5, также может специфически гибридизироваться с частичной областью, соответствующей релевантной частичной области любой из последовательностей с нечетными номерами SEQ ID NO:1-29.

Фактически, как описано в приведенных ниже «Примерах», пара праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:33 и 34 соответственно, специфически гибридизируется как с частичной областью любой из последовательностей с нечетными номерами SEQ ID NO:1-29, так и частичной областью последовательности SEQ ID NO:5, так что могут быть измерены и мРНК, кодирующая CAPRIN-1 собаки, последовательности SEQ ID NO:6, и мРНК, кодирующая его гомолог, например. Соответственно, например, с использованием полинуклеотида, специфически гибридизирующегося с частичной областью последовательности SEQ ID NO:5, может быть измерена не только мРНК, кодирующая CAPRIN-1 собаки последовательности SEQ ID NO:6, а также мРНК, кодирующая CAPRIN-1 человека, последовательности SEQ ID NO:2 или 4. Аналогичным образом, также может быть измерена мРНК, кодирующая CAPRIN-1 другого животного, такого как кошка. В тех случаях когда получают полинуклеотид для обнаружения злокачественной опухоли, желательно выбирать частичные области, имеющие специфически высокую идентичность последовательностей между последовательностями SEQ ID номеров (последовательности с нечетными номерами SEQ ID NO:1-29) (предпочтительно, нуклеотидные последовательности являются одинаковыми). Если присутствует частичная область, имеющая особенно высокую идентичность последовательностей между собакой и человеком, ожидается, что область, имеющая очень высокую идентичность последовательностей с этой областью, присутствует в гомологичном гене других видов животных. Путем отбора таких частичных областей, может быть повышена точность измерения мРНК, кодирующей CAPRIN-1 видов животных, отличных от собак и людей.

Способ измерения тестируемой нуклеиновой кислоты с использованием полинуклеотида, специфически гибридизирующегося с частичной областью тестируемой нуклеиновой кислоты в качестве праймера или зонда для способа амплификации нуклеиновой кислоты, такого как ПЦР, является хорошо известным. Примеры такого способа включают помимо ОТ-ПЦР, который подробно описан в приведенных ниже «Примерах», Нозерн-блоттинг и гибридизацию in situ. В тех случаях когда количество мРНК измеряют в настоящем изобретении, могут быть использованы все эти известные способы измерения.

Способ амплификации, такой как ПЦР, хорошо известен из уровня техники и, следовательно, наборы агентов и приборы являются коммерчески доступными, так что этот способ может быть легко выполнен. В частности, например, стадии денатурации, отжига и элонгации каждую проводят с использованием тестируемой нуклеиновой кислоты (например, кДНК гена, кодирующего белок, имеющий любую аминокислотную последовательность с четными номерами SEQ ID NO:2-30) в качестве матрицы, и пары нуклеотидов (праймеров) для обнаружения злокачественной опухоли в известном буфере в присутствии термостабильной ДНК полимеразы, такой как Taq полимераза или Pfu полимераза и dNTP (в настоящем описании N=A, T, C или G) путем изменения температуры реакционного раствора. В основном, стадию денатурации проводят при 90°C-95°C, стадию отжига проводят при Tm или близкой, матрицы и праймеров (предпочтительно, в пределах ±4°C), и стадию элонгации проводят при 72°C, которая является оптимальной температурой для термостабильной ДНК полимеразы, такой как Taq полимераза или Pfu полимераза, или температуре, близкой к оптимальной температуре. Каждую стадию проводят примерно в течение 30 секунд - 2 минут, как выбрано соответствующим образом. Этот цикл нагревания повторяют примерно от 25 до 40 раз, например, так чтобы амплифицировалась матричная область нуклеиновой кислоты, фланкированная парой праймеров. Способ амплификации нуклеиновой кислоты не ограничивается ПЦР, и любые другие способы амплификации нуклеиновых кислот, известные в данной области, могут быть использованы в настоящем изобретении. Как описано выше, в тех случаях, когда способ амплификации нуклеиновой кислоты проводят с использованием пары полинуклеотидов для обнаружения злокачественной опухоли в качестве праймеров, а тестируемой нуклеиновой кислоты в качестве матрицы амплифицируется тестируемая нуклеиновая кислота. Однако, если тестируемая нуклеиновая кислота не содержится в образце, амплификация не происходит. Следовательно, путем обнаружения продуктов амплификации может быть подтверждено наличие или отсутствие тестируемой нуклеиновой кислоты в образце. Продукт амплификации может быть обнаружен способом, который предусматривает электрофорез реакционного раствора после амплификации, а затем окрашивание полосы этидия бромидом или подобным, или проведение способа, который предусматривает иммобилизацию продукта амплификации после указанного электрофореза на твердой фазе, такой как нейлоновая мембрана, проводя гибридизацию с метящим зондом, который специфически гибиридизируется с тестируемой нуклеиновой кислотой, промывание, а затем обнаружение метки. Также, именно ПЦР обнаружение в режиме реального времени проводят с использованием гасителя флуоресцентного красителя и репортерного флуоресцентного красителя, и посредством этого количество тестируемой нуклеиновой кислоты в образце может быть определено количественно. Поскольку наборы для ПЦР определения в режиме реального времени являются коммерчески доступными, ПЦР определение в режиме реального времени может быть проведено без труда. Более того, полуколичественное определение тестируемой нуклеиновой кислоты также возможно исходя из интенсивности электрофоретической полосы. Тестируемая нуклеиновая кислота может быть либо мРНК, либо кДНК, полученная из мРНК посредством обратной транскрипции. В тех случаях когда мРНК амплифицируют в качестве тестируемой нуклеиновой кислоты, также может быть использован способ NASBA (3SR способ или TMA способ) с использованием указанной выше пары праймеров. Сам способ NASBA хорошо известен, и наборы для этого способа также являются коммерчески доступными, так что этот способ может быть без труда выполнен с использованием указанной выше пары праймеров.

В качестве зонда может быть использован меченый зонд, который получен путем мечения полинуклеотида для обнаружения злокачественной опухоли флуоресцентной меткой, радиометкой, биотиновой меткой или подобными. Способ мечения полинуклеотида хорошо известен. Наличие или отсутствие тестируемой нуклеиновой кислоты в образце может быть исследовано путем иммобилизации тестируемой нуклеиновой кислоты или продукта ее амплификации, проводя гибридизацию с меченым зондом, промывания, а затем измерения метки, связанной с твердой фазой. Альтернативно, полинуклеотид для обнаружения злокачественной опухоли иммобилизуют, с ним гибридизируют тестируемую нуклеиновую кислоту, а затем тестируемая нуклеиновая кислота, связанная с твердой фазой, может быть определена с меченым зондом или тому подобным. В таком случае, полинуклеотид для обнаружения злокачественной опухоли, связанный с твердой фазой, также называют зондом. Способ измерения тестируемой нуклеиновой кислоты с использованием полинуклеотидного зонда также известен из уровня техники. Этот способ может быть выполнен путем контактирования в буфере полинуклеотидного зонда с тестируемой нуклеиновой кислотой при Tm или близко к Tm (предпочтительно, в пределах ±4°C) для гибридизации, промывания, а затем измерения меченого зонда, который гибридизировался, или матричной нуклеиновой кислоты, связанной с твердофазным зондом. Примеры такого способа включают хорошо известные способы, такие как нозерн-блоттинг, гибридизация in situ и саузерн-блоттинг. В настоящем изобретении можно использовать любой хорошо известный способ.

Способом обнаружения по настоящему изобретению определяется наличие или отсутствие у исследуемого животного злокачественной опухоли на основании уровня экспрессии CAPRIN-1, измеренного, как указано выше. Злокачественная опухоль может быть обнаружена только путем измерения экспрессии CAPRIN-1 у исследуемого животного. Однако предпочтительно с точки зрения повышения точности обнаружения исследовать уровни экспрессии (уровень антител, уровень полипептида или уровень мРНК) CAPRIN-1 в одном или во множестве образцов здоровых пациентов, с тем чтобы получить стандартное значение у здоровых пациентов, а затем сравнить измеренное значение у исследуемого животного со стандартным значением, полученным у здоровых пациентов. Для дальнейшего повышения точности обнаружения уровни экспрессии CAPRIN-1 исследуют в отношении образцов, полученных от многих пациентов, у которых обнаружена злокачественная опухоль, с тем чтобы получить стандартное значение для пациентов со злокачественными опухолями, а затем измеренное значение исследуемого животного можно сравнить с обоими стандартными значениями здоровых пациентов и стандартным значением пациентов со злокачественными опухолями. Указанные выше стандартные значения могут быть определены путем количественного определения уровня экспрессии CAPRIN-1 в каждом образце, а затем вычисления его среднего значения, например. Стандартное значение здоровых пациентов и стандартное значение пациентов со злокачественными опухолями может быть определено заранее путем исследования уровней экспрессии CAPRIN-1 у многих здоровых пациентов и пациентов со злокачественными опухолями. Следовательно, при сравнении со стандартным значением в способе по настоящему изобретению может быть использовано заранее определенное стандартное значение.

В способе обнаружения по настоящему изобретению диагноз на основании других антигенов злокачественной опухоли или маркеров злокачественных опухолей может быть использован в сочетании. Таким образом, точность обнаружения злокачественной опухоли может быть дополнительно повышена. Например, в тех случаях когда антитело, специфически находящееся у пациентов со злокачественными опухолями, определяют способом по настоящему изобретению, другой полипептид, который зачастую экспрессируется в злокачественной ткани, может быть использован в сочетании в качестве антигена способом, аналогичным способу для полипептидов, описанным выше. Также, способ по настоящему изобретению и диагностика с использованием ранее известного маркера злокачественной опухоли может быть выполнен в сочетании.

Злокачественная опухоль может быть обнаружена in vivo способом обнаружения по настоящему изобретению. В частности, как описано в приведенных ниже «Примерах», даже опухоль небольшого размера, которая невидима невооруженным глазом, или опухоль в глубине может быть обнаружена in vivo в соответствии со способом по настоящему изобретению. Таким образом, способ по настоящему изобретению подходит для раннего обнаружения злокачественной опухоли. Также путем использования способа обнаружения по настоящему изобретению у пациента во время последующего наблюдения после лечения злокачественной опухоли злокачественная опухоль может быть обнаружена рано, если имел место рецидив злокачественной опухоли.

Также, в живом организме со злокачественной опухолью, поскольку количество злокачественных клеток, экспрессирующих CAPRIN-1, измеренное в настоящем изобретении, увеличивается, количества белка и его мРНК, накопленное в живом организме, увеличивается и количество продуцируемого антитела против CAPRIN-1 в сыворотке увеличивается. При этом с уменьшением количества злокачественных клеток уменьшается количество белка и его мРНК, накопленных in vivo, и уменьшается количество антитела против CAPRIN-1 в сыворотке. Следовательно, в тех случаях когда уровень экспрессии CAPRIN-1 выше контрольного, можно определить, что опухоль увеличивается или происходит метастазирование злокачественной опухоли; то есть прогрессирует распространение злокачественной опухоли. Фактически, как особо описано в приведенных ниже «Примерах», повышение уровня указанного выше антитела в сыворотке у живого организма со злокачественной опухолью наблюдалось в связи с прогрессированием злокачественной опухоли (малигнизацией), например увеличением опухоли и метастазированием. Как описано выше, распространение злокачественной опухоли также может быть определено способом по настоящему изобретению.

Также, как описано в приведенных ниже «Примерах», среди опухолей одного и того же типа, уровни указанного выше антитела в опухолях злокачественного типа были значительно выше, чем в опухолях доброкачественного типа. В соответствии с этим в тех случаях когда уровень экспрессии CAPRIN-1 является высоким, можно определить, что злокачественность опухоли является высокой. В особенности, злокачественность опухоли также может быть определена способом по настоящему изобретению.

Злокачественная опухоль, рассматриваемая в способе обнаружения злокачественной опухоли по настоящему изобретению, представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую CAPRIN-1. Примеры таких злокачественных опухолей включают, но не только, опухоль головного мозга, сквамозно клеточную карциному тканей головы, шеи, легких, матки или пищевода, меланому, аденокарциному легких или матки, рак почек, злокачественную смешанную опухоль, печеночно-клеточную карциному, базальноклеточную карциному, акантома-подобную опухоль десен, опухоль ротовой полости, перианальную аденокарциному, опухоль анальной пазухи, апокринную аденокарциному анальной пазухи, карциному клеток сертоли, рак преддверия влагалища, сальную аденокарциному, сальную эпителиому, сальную аденому, карциному потовых желез, интраназальную аденокарциному, назальную аденокарциному, рак щитовидной железы, рак толстой кишки, аденокарциному бронхов, аденокарциному, карциному из эпителия протоков, аденокарциному молочной железы, аденокарциному молочной железы составного типа, сложную злокачественную опухоль молочной железы, внутрипротоковую сосочковую аденокарциному, фибросаркому, гемангиоперицитому, остеосаркому, хондросаркому, саркому мягких тканей, ретикулоклеточную саркому, миксосаркому, недифференцированную саркому, рак легких, мастоцитому, лейомиому кожи, внутрибрюшинную лейомиому, лейомиому, хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфому, гастроинтестинальную лимфому, кишечную лимфому, мелкоклеточную-промежуточноклеточную лимфому, опухоль мозгового слоя надпочечников, гранулезоклеточную опухоль и феохромоцитому. Также, живым организмом, для которого предназначен способ по настоящему изобретению, является млекопитающее, и предпочтительно человек, собака или кошка.

Примеры образца, подвергаемого способу по настоящему изобретению, включают жидкости организма, такие как кровь, сыворотка, плазма крови, асцитические жидкости и плевральный выпот, ткани и клетки. В частности, в 1-м способе и во 2-м способе указанных выше, могут быть предпочтительно использованы сыворотка, плазма крови, асцитические жидкости и плевральный выпот, а в 3-м способе, указанном выше, для измерения мРНК предпочтительными являются образцы ткани и образцы клеток.

Указанные выше полипептиды, используемые в качестве антигенов для иммуноанализа в 1-м способе (то есть CAPRIN-1 собаки последовательности SEQ ID NO:2 и его гомолог, специфически реагирующий частичный полипептид, специфически реагирующий модифицированный полипептид и специфически реагирующий дополнительный полипептид), могут быть представлены в качестве агентов для обнаружения злокачественной опухоли. Агент может состоять только из указанного полипептида или может содержать различные добавки или тому подобное, например, подходящие для стабилизации полипептида. Также, агент может быть представлен в форме, иммобилизованной на твердой фазе, такой как планшет или мембрана. Предпочтительные примеры полипептида описаны выше.

Антитело, которое подвергается реакции антиген-антитело с CAPRIN-1, или его антигенсвязывающий фрагмент, который используют для иммуноанализа самого CAPRIN-1 во 2-м способе, также может быть представлен в виде агента для обнаружения злокачественной опухоли. Агент для обнаружения злокачественной опухоли в этом случае также может состоять только из указанного выше антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или может содержать различные добавки или тому подобное, подходящие для стабилизации и подобного, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Также, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может быть в форме, связанной с металлом, например марганцем или железом. В тех случаях когда такое связанное с металлом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в тело живого организма, связанное с металлом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент накапливается на повышенном уровне в том месте, где антигенный белок находится на более высоком уровне. Следовательно, металл определяется с помощью ЯМР или подобного, и посредством этого можно обнаружить присутствие злокачественных клеток, продуцирующих антигенный белок.

Боле того, указанный выше полинуклеотид для обнаружения злокачественной опухоли, используемый для измерения мРНК в 3-м способе, также может быть представлен в качестве агента для обнаружения злокачественной опухоли. Агент для обнаружения злокачественной опухоли в этом случае также может состоять только из полинуклеотида или может содержать различные добавки и тому подобное, подходящие для стабилизации полинуклеотида и подобного. Полинуклеотид для обнаружения злокачественной опухоли, содержащийся в агенте, предпочтительно представляет собой праймер или зонд. Условия и предпочтительные примеры полинуклеотида для обнаружения злокачественной опухоли описаны выше.

Примеры

Настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры, изложенные ниже; однако технический объем настоящего изобретения не ограничен примерами.

Пример 1

Получение нового антигенного белка злокачественной опухоли способом SEREX

(1) Конструирование библиотеки кДНК

Суммарную РНК экстрагировали из ткани семенников здоровой собаки способом кислого гуанидия-фенол-хлороформа, а затем полиА РНК очищали, используя набор для очистки Oligotex-dT30 mRNA (Takara Shuzo Co., Ltd.) в соответствии с протоколами, включенными в набор.

Фаговую библиотеку кДНК семенников собаки синтезировали, используя полученную таким образом мРНК (5 мкг). Фаговую библиотеку кДНК конструировали, используя набор для синтеза кДНК, ZAP-cDNA Synthesis Kit и набор для клонирования ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE) в соответствии с протоколами, включенными в эти наборы. Размер сконструированной таким образом фаговой библиотеки кДНК составил 7,73×10⁵ бляшкообразующих единиц/мл.

(2) Скрининг библиотеки кДНК с использованием сыворотки

Иммунологический скрининг проводили с использованием указанной выше фаговой библиотеки кДНК семенников собаки. В частности, клетка-хозяин Escherichia coli (XL1-Blue MRF') была инфицирована фагом на NZY агарозном планшете (Φ90×15 мм) так, чтобы получить 2210 клонов. Клетки E. coli культивировали при 42°C в течение 3-4 часов для образования бляшек. Планшет покрывали нитроцеллюлозной мембраной (Hybond C Extra: GE Healthcare Bio-Science), пропитанной IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозидом) при 37°C в течение 4 часов, так чтобы белок был индуцирован, экспрессирован, а затем перенесен на эту мембрану. После этого мембрану собирали, а затем погружали в TBS (10 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl и pH 7,5), содержащий 0,5% сухого обезжиренного молока, с последующим встряхиванием в течение ночи при 4°C, тем самым подавляя неспецифическую реакцию. Проводили реакцию фильтра с разведенной в 500 раз сывороткой пациента-собаки при комнатной температуре в течение 2-3 часов.

В качестве указанной выше сыворотки пациента-собаки была использована сыворотка, полученная от пациента-собаки с раком молочной железы. Эти сыворотки хранили при -80°C, а затем подвергали предварительной обработке непосредственно перед использованием. Способ предварительной обработки сыворотки представляет собой следующее. В частности, клетка-хозяин Escherichia coli (XL1-Blue MRF') была инфицирована фагом λ ZAP Express phage, в который чужеродный ген не был встроен, а затем культивирована в течение ночи на NZY среде для чашек Петри при 37°C. После этого буфер (0,2 M NaHCO₃ и pH 8,3), содержащий 0,5 M NaCl, добавляли в чашку, чашку оставляли стоять при 4°C в течение 15 часов, а затем супернатант собирали в виде Escherichia coli /фаговый экстракт. Далее, полученный таким образом Escherichia coli /фаговый экстракт наносили на NHS-колонку (GE Healthcare Bio-Science), так чтобы был иммобилизован белок, происходящий из фага Escherichia coli. Сыворотку пациента-собаки наносили на колонку с иммобилизованным белком для взаимодействия, а затем Escherichia coli и антитело, адсорбированное на фаге, удаляли из сыворотки. Фракцию сыворотки, которая прошла через колонку, разбавляли в 500 раз с использованием TBS, содержащего 0,5% сухого обезжиренного молока. Полученное в результате соединение использовали в качестве материала для иммуноскрининга.

Мембрана, на которую переносили обработанную сыворотку и указанный выше слитый белок, промывали 4 раза с использованием TBS-T (0,05% Tween20/TBS), а затем подвергали реакции с антителами козы против IgG собаки (Goat anti-Dog IgG-h+I HRP conjugated (BETHYL Laboratories)), разбавленными в 5000 раз с использованием TBS, содержащего 0,5% сухого обезжиренного молока в качестве вторичного антитела в течение 1 часа при комнатной температуре. Обнаружение проводили посредством цветовой ферментативной реакции с использованием реакционного раствора NBT/BCIP (Roche). Колонии, которые соответствовали участкам, положительным для цветовой реакции, собирали с NZY агарозных чашек (Φ90×15 мм), а затем суспендировали в 500 мкл SM буфера (100 мМ NaCl, 10 мМ MgClSO₄, 50 мМ Tris-HCl, 0,01% желатина, и pH 7,5). До тех пор пока колонии, положительные для цветовой реакции, не были единообразными, вторичный и третичный скрининг повторяли способом, аналогичным описанному выше, так чтобы 30940 фаговых колоний, взаимодействующих с сывороточным IgG, были подвергнуты скринингу. Таким образом, было выделено 5 позитивных клона.

(3) Исследование гомологии для выделенного гена антигена

Для анализа нуклеотидной последовательности 5 позитивных клонов, выделенных указанным выше способом, проводили процедуру конверсии из фаговых векторов в плазмидные векторы. В частности, было получено 200 мкл раствора, содержащего клетку-хозяина Escherichia coli (XL1-Blue MRF'), так, чтобы поглощение OD₆₀₀ равнялось 1,0. Этот раствор перемешивали с 250 мкл очищенного фагового раствора, а затем с 1 мкл хелперного фага ExAssist helper phage (STRATAGENE), с последующим взаимодействием в течение 15 минут при 37°C. Добавляли три миллилитра среды LB, а затем проводили культивирование при 37°C в течение 2,5-3 часов. Сразу же после культивирования температуру раствора поддерживали при 70°C с помощью водяной бани в течение 20 минут, центрифугирование проводили при 4°C и 1000×g в течение 15 минут, а затем супернатант собирали в виде раствора фагемиды. После этого получали 200 мкл раствора, содержащего клетку-хозяина фагемиды Escherichia coli (SOLR), так чтобы поглощение OD₆₀₀ равнялось 1,0. Этот раствор перемешивали с 10 мкл очищенного раствора фага с последующим взаимодействием в течение 15 минут при 37°C. Раствор (50 мкл) высевали на LB агаровую среду, содержащую ампициллин (до конечной концентрации 50 мкг/мл), а затем культивировали в течение ночи при 37°C. Трансформированные SOLR одиночные колонии собирали, а затем культивировали в среде LB, содержащей ампициллин (конечная концентрация: 50 мкг/мл) при 37°C. Плазмидную ДНК, содержащую представляющую интерес вставку, очищали, используя набор QIAGEN plasmid Miniprep Kit (QIAGEN).

Очищенную плазмиду подвергали анализу полноразмерной последовательности способом «блуждающей затравки», используя T3 праймер в соответствии с SEQ ID NO:31 и праймер T7 в соответствии с SEQ ID NO:32. В результате анализа последовательностей были получены генные последовательности в соответствии с SEQ ID NO:5, 7, 9, 11 и 13. Программа исследования гомологии, BLAST search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), была выполнена с использованием нуклеотидных последовательностей генов и аминокислотных последовательностей (SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 и 14) белков, кодируемых этими генами. В результате исследования гомологии с известными генами было установлено, что все из 5 полученных генов кодировали CAPRIN-1. Что касается областей, транслируемых в белки, идентичность последовательности среди 5 генов составила 100% в отношении нуклеотидной последовательности и 99% в отношении аминокислотной последовательности. Также, что касается областей, транслируемых в белки, идентичность последовательности между этими генами и генами, кодирующими их гомолог у человека, составила 94% в отношении нуклеотидной последовательности и 98% в отношении аминокислотной последовательности. Нуклеотидные последовательности гомолога человека показаны в SEQ ID NO:1 и 3 и их же аминокислотные последовательности показаны в SEQ ID NO:2 и 4. Также, что касается областей, транслируемых в белки, идентичность последовательности между полученными генами собак и геном, кодирующим гомолог у крупного рогатого скота, составляла 94% в отношении нуклеотидной последовательности и 97% в отношении аминокислотной последовательности. Нуклеотидная последовательность гомолога крупного рогатого скота показана в SEQ ID NO:15 и его аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:16. Что касается областей, транслируемых в белки, идентичность последовательности между генами, кодирующими гомолог человека, и геном, кодирующим гомолог у крупного рогатого скота, была 94% в отношении нуклеотидной последовательности, и в интервале от 93% до 97% в отношении аминокислотной последовательности. Также, что касается областей, транслируемых в белки, идентичность последовательности между полученными генами собаки и геном, кодирующим гомолог у лошадей, была 93% в отношении нуклеотидной последовательности и 97% в отношении аминокислотной последовательности. Нуклеотидная последовательность гомолога лошадей показана в SEQ ID NO:17 и его аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:18. Что касается областей, транслируемых в белки, идентичность последовательности между генами, кодирующими гомолог человека, и геном, кодирующим гомолог у лошади, была 93% в отношении нуклеотидной последовательности и 96% в отношении аминокислотной последовательности. Также, что касается областей, транслируемых в белки, идентичность последовательности между полученными генами собаки и генами, кодирующими гомолог мыши, была в интервале от 87% до 89% в отношении нуклеотидной последовательности и в интервале от 95% до 97% в отношении аминокислотной последовательности. Нуклеотидные последовательности гомолога мыши показаны в SEQ ID NO:19, 21, 23, 25 и 27 и их же аминокислотные последовательности показаны в SEQ ID NO:20, 22, 24, 26 и 28. Что касается областей, транслируемых в белки, идентичность последовательности между генами, кодирующими гомолог человека, и генами, кодирующими гомолог у мыши, была в интервале от 89% до 91% в отношении нуклеотидной последовательности и в интервале от 95% до 96% в отношении аминокислотной последовательности. Также, что касается областей, транслируемых в белки, идентичность последовательности между полученными генами собаки и геном, кодирующим гомолог цыпленка, была 82% в отношении нуклеотидной последовательности и 87% в отношении аминокислотной последовательности. Нуклеотидная последовательность гомолога цыпленка показана в SEQ ID NO:29 и его аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:30. Что касается областей, транслируемых в белки, идентичность последовательности между генами, кодирующими гомолог человека, и геном, кодирующим гомолог у цыпленка, была в интервале от 81% до 82% в отношении нуклеотидной последовательности и была 86% в отношении аминокислотной последовательности.

(4) Анализ экспрессии гена в каждой ткани

Экспрессию генов, полученных указанным выше способом, в нормальных тканях собак и людей и различных клеточных линиях исследовали способом ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией). Реакцию обратной транскрипции проводили следующим образом. В частности, суммарную РНК экстрагировали из каждой ткани (50 мг - 100 мг) и каждой клеточной линии (5-10×10⁶ клеток) с использованием агента TRIZOL (Invitrogen Corporation) в соответствии с протоколами, включенными с этим агентом. кДНК синтезировали с использованием суммарной РНК и системы синтеза Superscript First-Strand Synthesis System для ОТ-ПЦР (Invitrogen Corporation) в соответствии с протоколами, включенными с этой системой. ПЦР проводили следующим образом с использованием праймеров, специфичных в отношении полученных генов (в соответствии с SEQ ID NO:33 и 34). В частности, ПЦР проводили путем получения реакционного раствора, доведенного до общего количества 25 мкл путем добавления каждого агента, и включенного буфера (0,25 мкл образца, полученного путем реакции обратной транскрипции, указанные выше праймеры (2 мкМ каждого), dNTP (0,2 мМ каждого) и 0,65 Ед ExTaq полимеразы (Takara-baio Co., Ltd.)), а затем путем взаимодействия раствора, а затем путем взаимодействия раствора посредством повторения 30 раз цикла 94°C/30 секунд, 60°C/30 секунд и 72°C/30 секунд, используя термоциклер (BIO RAD). Ген-специфичные праймеры, упомянутые выше, использовали для амплификации области между нуклеотидом 206 и нуклеотидом 632 в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5 (ген CAPRIN-1 собаки) и области между нуклеотидом 698 и нуклеотидом 1124 в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 (ген CAPRIN-1 человека). Одновременно для контроля использовали GAPDH-специфичные праймеры (соответствующие последовательностям SEQ ID NO:35 и 36). В результате, как показано на фиг.1, наблюдалась сильная экспрессия в семенниках в случае здоровых тканей собаки, хотя экспрессия наблюдалась в тканях рака молочной железы собаки и аденокарциномы. Более того, была подтверждена экспрессия гомолога полученных генов человека. В результате, аналогично случаю с генами CAPRIN-1 собаки, экспрессия могла быть подтверждена только в семенниках в случае нормальных тканей. Однако в случае злокачественных клеток экспрессия была обнаружена во многих типах линий злокачественных клеток, таких как клеточные линии рака молочной железы, опухоли головного мозга, лейкоза, рака легких и рака пищевода. Экспрессия была подтверждена в особенно большом числе клеточных линий рака молочной железы. На основании этих результатов было подтверждено, что экспрессия CAPRIN-1 не наблюдалась в нормальных тканях, отличных от тканей семенников, тогда как CAPRIN-1 экспрессировался во многих злокачественных клетках и, в особенности, в линиях злокачественных клеток молочной железы.

Кроме того, на фиг.1 стандарт № 1 вдоль продольной оси показывает профиль экспрессии каждого из идентифицированных выше генов и стандарт № 2 вдоль той же оси показывает профиль экспрессии гена GAPDH для контроля.

(5) Иммуногистохимическое окрашивание

(5)-1 Экспрессия CAPRIN-1 в нормальных тканях мышей и собак

Мышей (Balb/c, самки) и собак (собаки породы бигль, самки) обескровливали под эфирным наркозом и кетамин/изофлурановым наркозом. После лапаротомии органы (желудок, печень, глазные яблоки, тимус, мышцы, костный мозг, матку, тонкий кишечник, сердце, почки, слюнные железы, молочные железы, головной мозг, легкие, кожу, надпочечники, яичники, поджелудочную железу, селезенку и мочевой пузырь) переносили в 10 см чашку, содержащую PBS. Каждый орган вскрывали в PBS, а затем фиксировали перфузией в течение ночи 0,1 M фосфатным буфером (pH 7,4), содержащим 4% параформальдегида (PFA). Перфузат отбрасывали, поверхность ткани каждого органа промывали PBS, а затем в 50 мл центрифужную пробирку добавляли раствор PBS, содержащий 10% сахарозу. Затем каждую ткань помещали в каждую пробирку, а затем встряхивали с использованием ротора при 4°C в течение 2 часов. Каждый раствор заменяли раствором PBS, содержащим 20% сахарозу, а затем оставляли стоять при 4°C до преципитации тканей. Каждый раствор заменяли раствором PBS, содержащим 30% сахарозу, а затем оставляли стоять при 4°C до преципитации тканей. Каждую ткань удаляли, и необходимую часть отделяли хирургическим скальпелем. Далее, соединение OCT (Tissue Tek) наносили и распределяли по поверхности каждой ткани, а затем ткани помещали на Cryomold. Cryomold помещали на сухой лед для быстрого замораживания. Из ткани получали тонкие срезы 10-20 мкм длиной, используя криостат (LEICA), а затем тонкие срезы ткани сушили на воздухе на предметных стеклах в течение 30 минут, используя фен, с получением предметных стекол, на которые были нанесены тонкие срезы тканей. Далее, каждое предметное стекло помещали в сосуд для окрашивания, наполненный PBS-T (солевой раствор, содержащий 0,05% Tween20), так чтобы процедура, предусматривающая замену PBS-T каждые 5 минут, была выполнена 3 раза. Избыток воды вокруг каждого образца удаляли, используя Kimwipes, а затем каждый срез обогащали, используя DAKOPEN (DAKO). В качестве блокирующих растворов MOM блокирующий агент Ig мыши (VECTASTAIN) наносили на ткань мыши и раствор PBS-T, содержащий 10% эмбриональную сыворотку теленка, наносили на ткань собаки. Полученные в результате образцы оставляли стоять во влажной камере при комнатной температуре в течение 1 часа. Далее, раствор, полученный с использованием блокирующего раствора в отношении 10 мкг/мл моноклонального антитела против CAPRIN-1 (моноклональное антитело #8), имеющего вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:55 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:56, которые взаимодействуют с поверхностями злокачественных клеток, полученных в примере 3, наносили на каждое предметное стекло, а затем оставляли стоять во влажной камере при 4°C в течение ночи. После 3 промываний по 10 минут с использованием PBS-T, MOM биотин-меченное антитело против IgG (VECTASTAIN), разбавленное 250 раз блокирующим раствором, наносили на каждое предметное стекло, а затем оставляли стоять во влажной камере при комнатной температуре в течение 1 часа. После 3 раз 10 минутных промываний с использованием PBS-T наносили авидин-биотиновый ABC агент (VECTASTAIN), а затем оставляли стоять во влажной камере при комнатной температуре в течение 5 минут. После 3 раз 10 минутных промываний с использованием PBS-T наносили окрашивающий раствор DAB (DAB 10 мг + 30% H₂O₂ 10 мкл/0,05 M Tris-HCl (pH 7,6) 50 мл), а затем предметные стекла оставляли стоять во влажной камере при комнатной температуре в течение 30 минут. Предметные стекла промывали дистиллированной водой, а затем наносили гематоксилиновый агент (DAKO). После выдерживания при комнатной температуре в течение 1 минуты предметные стекла промывали дистиллированной водой. Предметные стекла погружали в 70%, 80%, 90%, 95% и 100% растворы этанола в таком порядке в течение 1 минуты каждое, а затем оставляли стоять в ксилене в течение ночи. Предметные стекла удаляли, заклеивали средой Glycergel Mounting Medium (DAKO), а затем изучали. В результате наблюдали экспрессию CAPRIN-1 до незначительной степени в клетках во всех слюнных железах, почках, толстом кишечнике и тканях желудка, но экспрессия CAPRIN-1 никогда не наблюдалась на клеточных поверхностях. Также, абсолютное отсутствие экспрессии CAPRIN-1 наблюдалось в тканях из других органов.

(5)-2 Экспрессия CAPRIN-1 в злокачественных тканях молочной железы собаки

Используя 108 замороженных образцов злокачественной ткани молочной железы собак, у которых диагностирована злокачественная опухоль молочной железы, получали замороженные срезы, способом, аналогичным описанному выше, и иммуногистохимическое окрашивание проводили, используя моноклональное антитело #8, полученное в примере 3. В результате экспрессия CAPRIN-1 была подтверждена в 100 из 108 образцов (92,5%). CAPRIN-1 особенно сильно экспрессировался на поверхностях сильно атипичных злокачественных клеток.

(5)-3 Экспрессия CAPRIN-1 в злокачественной ткани молочной железы человека

Иммуногистохимическое окрашивание проводили, используя 188 образцов злокачественной ткани молочной железы, заключенных в парафин злокачественных тканей в виде матрицы (BIOMAX). После 3 часов обработки при 60°C матрицу образцов злокачественной ткани молочной железы человека погружали в сосуд для окрашивания, заполненный ксиленом, а затем каждые 5 минут замену ксилена проводили 3 раза. Далее, аналогичную процедуру проводили с использованием этанола и PBS-T вместо ксилена. Матрицу с образцами злокачественной ткани молочной железы погружали в сосуд для окрашивания, заполненный 10 мМ цитратным буфером (pH 6,0), содержащим 0,05% Tween20, обрабатывали в течение 5 минут при 125°C, а затем оставляли стоять при комнатной температуре в течение 40 минут или более. Избыток воды вокруг каждого образца удаляли из матрицы, используя Kimwipes, каждый срез обогащали, используя DAKOPEN (DAKO), а затем соответствующее количество Peroxidase Block (DAKO) добавляли по каплям на матрицу. Матрицу оставляли стоять при комнатной температуре в течение 5 минут, а затем погружали в окрашивающий сосуд, наполненный PBS-T. Замену PBS-T каждые 5 минут проводили 3 раза. В качестве блокирующего раствора раствор PBS-T, содержащий 10% FBS, наносили на матрицу, а затем эту матрицу оставляли стоять во влажной камере при комнатной температуре в течение 1 часа. Далее, наносили моноклональное антитело #8, полученное в примере 3, доведенное до 10 мкг/мл с использованием раствора PBS-T, содержащего 5% FBS, а затем эту матрицу оставляли стоять в течение ночи во влажной камере при 4°C. После промывания 3 раза по 10 минут PBS-T соответствующее количество Peroxidase Labeled Polymer Conjugated (DAKO) добавляли по каплям на матрицу, а затем эту матрицу оставляли стоять при комнатной температуре в течение 30 минут во влажной камере. После 3 промываний по 10 минут PBS-T, окрашивающий раствор DAB (DAKO) наносили на матрицу, а затем эту матрицу оставляли стоять при комнатной температуре в течение 10 минут. Окрашивающий раствор DAB удаляли из матрицы, а затем 3 раза проводили 10 минутное промывание с использованием PBS-T. Матрицу промывали дистиллированной водой, а затем погружали в 70%, 80%, 90%, 95% и 100% растворы этанола в таком порядке на 1 минуту каждый, а затем оставляли стоять в ксилене в течение ночи. Матрицу удаляли, заклеивали средой Glycergel Mounting Medium (DAKO), а затем изучали. В результате сильная экспрессия CAPRIN-1 наблюдалась в 138 (73%) из всех 188 образцов злокачественной ткани молочной железы.

(5)-4 Экспрессия CAPRIN-1 в злокачественной опухоли головного мозга человека

Используя 247 образцов злокачественной опухоли головного мозга человека заключенных в парафин тканей злокачественной опухоли головного мозга человека, в виде матриц (BIOMAX), иммуногистохимическое окрашивание проводили способом, аналогичным способу по приведенному выше пункту (5)-3, используя моноклональное антитело #8, полученное в примере 3. В результате сильная экспрессия CAPRIN-1 наблюдалась в 227 (92%) из всех 247 образцов ткани злокачественной опухоли головного мозга человека.

(5)-5 экспрессия CAPRIN-1 в лимфатическом узле метастаз злокачественной опухоли молочной железы человека

Используя 150 образцов ткани метастаз в лимфатические узлы злокачественной опухоли молочной железы человека, заключенных в парафин тканей лимфатического узла с метастазами злокачественной опухоли молочной железы человека в виде матриц (BIOMAX), иммуногистохимическое окрашивание проводили способом, аналогичным способу по пункту (5)-3, описанному выше, используя моноклональное антитело #8, полученное в примере 3. В результате сильная экспрессия CAPRIN-1 наблюдалась в 136 (90%) из всех 150 образцов лимфатических узлов с метастазами злокачественной опухоли молочной железы человека. В частности, было обнаружено, что CAPRIN-1 также сильно экспрессировался в злокачественной опухоли ткани, которая метастазировала из злокачественной опухоли молочной железы.

Пример 2

Получение новых антигенных белков злокачественных опухолей собак и людей

(1) Получение рекомбинантного белка

Рекомбинантный белок получали следующим способом на основании гена последовательности SEQ ID NO:5, полученного в примере 1. ПЦР проводили путем получения реакционного раствора, доведенного до общего объема 50 мкл путем добавления каждого агента и включенного буфера (1 мкл вектора, полученного из раствора фагемиды, полученного в примере 1, а затем подвергнутого анализу последовательности, 2 типов праймеров (0,4 мкМ каждого; в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:37 и 38), содержащих последовательности, узнаваемые рестриктазами Nde I и Kpn I, 0,2 мМ dNTP, 1,25 Ед PrimeSTAR HS полимеразы (Takara-baio Co., Ltd.)), а затем путем взаимодействия раствора посредством повторения 30 раз цикла 98°C/10 секунд и 68°C/1,5 минуты, используя термоциклер (BIO RAD). Указанные выше 2 типа праймеров использовали для амплификации области, кодирующей полноразмерную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 (P47). После ПЦР, амплифицированную таким образом ДНК подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, а затем фрагмент ДНК примерно 1,4 тыс. пар нуклеотидов очищали из геля, используя набор QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).

Очищенный фрагмент ДНК лигировали в клонирующий вектор pCR-Blunt (Invitrogen Corporation). Этот вектор трансформировали в Escherichia coli, а затем получали плазмиду. На основании последовательности было подтверждено, что амплифицированный фрагмент гена соответствовал последовательности-мишени. Плазмиду, которая соответствует интересующей последовательности, обрабатывали рестриктазами Nde I и Kpn I, а затем полученный в результате продукт очищали, используя набор QIAquick Gel Extraction Kit. Затем интересующую последовательность гена встраивали в вектор экспрессии pET30b (Novagen) для Escherichia coli, обработанный рестриктазами Nde I и Kpn I. Рекомбинантный белок, слитый с His меткой, может быть получен с использованием этого вектора. Плазмиду трансформировали в Escherichia coli BL21 (DE3) для экспрессии, а затем проводили индукцию экспрессии, используя 1 мМ IPTG, так чтобы целевой белок экспрессировался в Escherichia coli.

Также, рекомбинантный белок гомологичного гена собаки получали следующим способом на основании гена последовательности SEQ ID NO:7. ПЦР проводили путем получения реакционного раствора, доведенного до общего количества 50 мкл посредством добавления каждого агента и включенного буфера (1 мкл кДНК из числа кДНК различных тканей и/или клеток, сконструированных в примере 1, для которых экспрессия могла быть подтверждена методом ОТ-ПЦР, 2 типов праймеров (0,4 мкМ каждого; в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:39 и 40), содержащих последовательности, узнаваемые рестриктазами Nde I и Kpn I, 0,2 мМ dNTP, 1,25 Ед полимеразы PrimeSTAR HS (Takara-baio Co., Ltd.)), а затем путем проведения реакции раствора посредством повторения 30 раз цикла 98°C/10 секунд и 68°C/2,5 минут, используя термоциклер (BIO RAD). Указанные выше 2 типа праймеров использовали для амплификации области, кодирующей полноразмерную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8. После ПЦР амплифицированную таким образом ДНК фракционировали, используя электрофорез в 1% агарозном геле, а затем фрагмент ДНК примерно 2,2 тыс. пар нуклеотидов очищали, используя набор QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).

Очищенный фрагмент ДНК лигировали в клонирующий вектор pCR-Blunt (Invitrogen Corporation). Вектор трансформировали в Escherichia coli и затем получали плазмиду. Затем подтверждали на основании последовательности, что амплифицированный генный фрагмент соответствовал интересующей последовательности. Плазмида, которая соответствовала последовательности, представляющей интерес, обрабатывали рестриктазами Nde I и Kpn I, а затем полученный в результате продукт очищали, используя набор QIAquick Gel Extraction Kit. Затем последовательность гена, представляющую интерес, встраивали в вектор экспрессии pET30b (Novagen) для Escherichia coli, обработанный рестриктазами Nde I и Kpn I. Рекомбинантный белок, слитый с His меткой, может быть получен с использованием этого вектора. Плазмида была трансформирована Escherichia coli BL21 (DE3) для экспрессии, а затем проводили индукцию экспрессии, используя 1 мМ IPTG, так чтобы белок, представляющий интерес, экспрессировался в Escherichia coli.

Также, рекомбинантный белок гомологичного гена человека получали следующим способом на основании гена последовательности SEQ ID NO:1. ПЦР проводили путем получения реакционного раствора, доведенного до общего количества 50 мкл посредством добавления каждого агента и включенного буфера (кДНК (1 мкл) из числа кДНК различных тканей и/или клеток, сконструированных в примере 1, для которых экспрессия могла быть подтверждена методом ОТ-ПЦР, 2 типов праймеров (0,4 мкМ каждого; в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:41 и 42), содержащими последовательности, узнаваемые рестриктазами Sac I и Xho I, 0,2 мМ dNTP, 1,25 Ед полимеразы PrimeSTAR HS (Takara-baio Co., Ltd.)), а затем путем реакции раствора посредством повторения 30 раз цикла 98°C/10 секунд и 68°C/2,5 минут, используя термоциклер (BIO RAD). Указанные выше 2 типа праймеров использовали для амплификации области, кодирующей полноразмерную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. После ПЦР амплифицированную таким образом ДНК подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, а затем фрагмент ДНК примерно 2,1 тыс. пар нуклеотидов очищали, используя набор QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).

Очищенный фрагмент ДНК лигировали в клонирующий вектор pCR-Blunt (Invitrogen Corporation). Этот вектор трансформировали в Escherichia coli, а затем получали плазмиду. Затем подтверждали на основании последовательности, что амплифицированный генный фрагмент соответствовал последовательности, представляющей интерес. Плазмиду, которая соответствовала последовательности, представляющей интерес, обрабатывали рестриктазами Sac I и Xho I, а затем полученный в результате продукт очищали, используя набор QIAquick Gel Extraction Kit. Затем последовательность гена, представляющего интерес, встраивали в вектор экспрессии pET30a (Novagen) для Escherichia coli, обработанный рестриктазами Sac I и Xho I. Рекомбинантный белок, слитый с His меткой, может быть получен с использованием этого вектора. Плазмиду трансформировали в Escherichia coli BL21 (DE3) для экспрессии, а затем проводили индукцию экспрессии, используя 1 мМ IPTG, так чтобы белок, представляющий интерес, экспрессировался в Escherichia coli.

(2) Очистка рекомбинантного белка

Полученную выше рекомбинантную Escherichia coli, экспрессирующую последовательности SEQ ID NO:1, 5 или 7, культивировали при 37°C в LB среде, содержащей 30 мкг/мл канамицина до достижения поглощения при 600 нм примерно 0,7. Затем изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид добавляли до конечной концентрации 1 мМ с последующим культивированием 4 часа при 37°C. После этого клетки собирали 10 минутным центрифугированием при 4800 об/мин. Клеточный осадок суспендировали в фосфатно-буферном солевом растворе, а затем центрифугировали при 4800 об/мин в течение 10 минут для промывания клеток.

Клетки суспендировали в фосфатно-буферном солевом растворе, а затем подвергали ультразвуковому воздействию на льду. Таким образом, обработанный ультразвуком раствор Escherichia coli центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут. Полученный таким образом супернатант использовали в качестве растворимой фракции, и полученный таким образом преципитат использовали в качестве нерастворимой фракции.

Растворимую фракцию наносили на никель-хелатную колонку (носитель: Chelating Sepharose (TradeMark) Fast Flow (GE Healthcare), емкость колонки: 5 мл, 50 мМ хлористоводородного буфера (pH 8,0) в качестве равновесного буфера)), полученную в соответствии с общепринятым способом. Несвязанную фракцию промывали 50 мМ хлористоводородным буфером (pH 8,0) в количестве, 10-кратном емкости колонки и 20 мМ фосфатным буфером (pH 8,0), содержащим 20 мМ имидазол. Сразу же после промывания 6 слоев элюировали с использованием 20 мМ фосфатного буфера (pH 8,0), содержащего 100 мМ имидазола. После элюции белка, представляющего интерес, подтвержденного окрашиванием Кумасси, фракцию элюции 20 мМ фосфатного буфера (pH8,0), содержащего 100 мМ имидазола наносили на сильную анионообменную колонку (носитель: Q сефароза (TradeMark) Fast Flow (GE Healthcare), емкость колонки: 5 мл, и 20 мМ фосфатный буфер (pH 8,0) в качестве равновесного буфера). Несвязанную фракцию промывали 20 мМ фосфатным буфером (pH7,0) в количестве, 10-кратном емкости колонки, и 20 мМ фосфатным буфером (pH7,0), содержащим 200 мМ хлорида натрия. Сразу же после промывания 5 слоев элюировали с использованием 20 мМ фосфатного буфера (pH 7,0), содержащего 400 мМ хлорида натрия. Таким образом, были получены очищенные фракции белков, каждый с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, 6 или 8. Эти очищенные фракции затем использовали в качестве веществ для исследования введения. На фиг.2 показан результат для белка последовательности SEQ ID NO:2, фракционированного с помощью электрофореза и выявленного с помощью окрашивания Кумасси.

200 мкл каждого очищенного препарата, полученного указанным выше способом, разливали в 1 мл реакционного буфера (20 мМ Tris-HCl, 50 мМ NaCl, 2 мМ CaCl₂ pH 7,4), а затем добавляли 2 мкл энтерокиназы (Novagen). Препарат оставляли стоять при комнатной температуре в течение ночи для реакции, His метка расщеплялась, а затем проводили очистку в соответствии с включенными протоколами, используя набор Enterokinase Cleavage Capture Kit (Novagen). Далее, 1,2 мл каждого очищенного препарата, полученного указанным выше способом, заменяли физиологическим фосфатным буфером (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) с помощью ультрафильтрации NANOSEP 10K OMEGA (PALL). Стерильную фильтрацию проводили, используя 0,22 мкм HT Tuffryn Acrodisc (PALL), а затем полученные в результате продукты использовали для последующих экспериментов.

Пример 3

Получение антитела против CAPRIN-1

(1) Получение поликлонального антитела против пептида, производного CAPRIN-1

Для получения антитела, связывающегося с CAPRIN-1, синтезировали CAPRIN-1-производный пептид (Arg-Asn-Leu-Glu-Lys-Lys-Lys-Gly-Lys-Leu-Asp-Asp-Tyr-Gln (SEQ ID NO:43)). Один миллиграмм пептида в качестве антигена перемешивали с раствором неполного адъюванта Фрейнда (IFA) в количестве, эквивалентном этому пептиду. Эту смесь вводили подкожно кроликам 4 раза каждые 2 недели. После этого брали кровь, так чтобы была получена антисыворотка, содержащая поликлональные антитела. Далее, антисыворотку очищали, используя носитель белок G (GE Healthcare Bio-Sciences), а затем получали поликлональное антитело против CAPRIN-1-производного белка. Далее, исследовали реакционную способность полученного поликлонального антитела в отношении поверхности злокачественных клеток молочной железы. В частности, 10⁶ клеток линии злокачественных клеток молочной железы человека MDA-MB-231V подвергали центрифугированию в 1,5 мл микроцентрифужной пробирке. Раствор PBS, дополненный 0,1% эмбриональной сывороткой теленка (FBS), содержащей поликлональное антитело, добавляли в эту пробирку. Раствор оставляли стоять на льду в течение 1 часа. После промывания PBS, FITC-меченное антитело козы против IgG мыши (Invitrogen Corporation), разбавленное в 500 раз PBS, содержащим 0,1% FBS, добавляли в этот раствор, а затем этот раствор оставляли стоять на льду в течение 1 часа. После промывания PBS интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FACS Calibur (Becton, Dickinson и Company). При этом проводили процедуру, аналогичную описанной выше, так чтобы получить контроль путем добавления PBS, содержащего 0,1% FBS вместо поликлонального антитела. В результате было обнаружено, что интенсивность флуоресценции была сильнее в клетках, обработанных поликлональным антителом, чем интенсивность флуоресценции в контрольных клетках. Следовательно, было показано, что полученное поликлональное антитело связывается с поверхностью злокачественных клеток молочной железы.

(2) Получение моноклонального антитела против белка CAPRIN-1

Антигенный белок (CAPRIN-1 человека) (100 мкг), показанный в SEQ ID NO:2, полученный в примере 2, перемешивали с MPL+TDM адъювантом (Sigma) в количестве, эквивалентном количеству антигенного белка. Эту смесь использовали в качестве антигенного раствора на одну мышь. Антигенный раствор вводили внутрибрюшинно мышам Balb/c в возрасте 6 недель (Japan SLC Inc.), а затем дополнительно вводили 3 раза каждую неделю. Селезенку удаляли на 3 день после конечной иммунизации, а затем заключали между двумя стерильными предметными стеклами. Полученный в результате препарат промывали PBS (-) (Nissui), а затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут, так чтобы процедура для удаления супернатантов повторялась 3 раза. Таким образом, были получены клетки селезенки. Полученные таким образом клетки селезенки перемешивали с миеломными клетками мыши SP2/0 (приобретенными из ATCC) в соотношении 10:1. Раствор PEG, полученный путем смешивания 200 мкл среды RPMI1640, содержащей 10% FBS, нагретой при 37°C, и 800 мкл PEG1500 (Boehringer) добавляли к клеткам. Этот раствор оставляли стоять в течение 5 минут для слияния клеток. Центрифугирование проводили при 1700 об/мин в течение 5 минут для удаления супернатантов. Клетки суспендировали в 150 мл среды RPMI1640 (селективная среда HAT), содержащей 15% FBS, в которую было добавлено 2% эквивалентного раствора HAT (Gibco), а затем высевали на пятнадцать 96-луночных планшетов (Nunc) по 100 мкл на лунку. Клетки культивировали в течение 7 дней в условиях 37°C и 5% CO₂, так чтобы были получены гибридомы, полученные в результате слияния клеток селезенки с миеломными клетками.

Гибридомы отбирали, используя в качестве показателя аффинность связывания антитела, продуцированного полученными таким образом гибридомами, в отношении белка CAPRIN-1. Раствор белка CAPRIN-1 (1 мкг/мл), полученный в примере 2, добавляли в концентрации 100 мкл на лунку 96-луночных планшетов, а затем оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку промывали 3 раза PBS-T, а затем добавляли 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) (Sigma) по 400 мкл на лунку, и затем планшенты оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор удаляли, а затем каждую лунку промывали 3 раза с использованием 400 мкл PBS-T. Культуральный супернатант каждой гибридомы, полученной выше, добавляли по 100 мкл на лунку, а затем оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку промывали 3 раза PBS-T, добавляли HRP-меченное антитело против IgG (H+L) мыши (Invitrogen Corporation), разбавленное в 500 раз PBS, по 100 мкл на лунку, а затем оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку промывали 3 раза с использованием PBS-T, раствор субстрата TMB (Thermo) добавляли по 100 мкл на лунку, а затем оставляли стоять в течение 15-30 минут, так чтобы осуществлялась цветовая реакция. После развития окраски добавляли 1 н. серную кислоту по 100 мкл на лунку для остановки реакции. Поглощение измеряли при 450 нм и 595 нм, используя абсорбционный спектрометр. В результате было отобрано множество гибридом, продуцирующих антитела с высокой абсорбцией.

Отобранные таким образом гибридомы добавляли по 0,5 гибридом на лунку 96-луночных планшетов, а затем культивировали. Через 1 неделю наблюдались гибридомы, образующие единичные колонии в лунках. Клетки в этих лунках культивировали далее. Гибридомы выбирали, используя показатель аффинности связывания антитела, продуцированного клонированными гибридомами для белка CAPRIN-1. Раствор белка CAPRIN-1 (1 мкг/мл), полученного в Примере 2, добавляли по 100 мкл на лунку 96-луночных планшетов, а затем оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку промывали 3 раза PBS-T. 0,5% раствор BSA добавляли по 400 мкл на лунку, а затем оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор удаляли, а затем каждую лунку промывали 3 раза, используя 400 мкл PBS-T. Культуральный супернатант каждой гибридомы, полученной выше, добавляли по 100 мкл на лунку, а затем оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку промывали 3 раза, используя PBS-T. Антитело против IgG мыши, меченное HRP (H+L) (Invitrogen Corporation), разбавленное 5000 раз PBS, добавляли по 100 мкл на лунку, а затем оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку промывали 3 раза, используя PBS-T, раствор субстрата TMB (Thermo) добавляли по 100 мкл на лунку, а затем оставляли стоять в течение 15-30 минут, так чтобы осуществлялась цветовая реакция. После развития окраски 1 н. серную кислоту добавляли по 100 мкл на лунку для остановки реакции. Поглощение измеряли при 450 нм и 595 нм, используя абсорбционный спектрометр. В результате было получено множество гибридомных клеточных линий, продуцирующих моноклональные антитела, проявляющих реакционную активность в отношении белка CAPRIN-1. Культуральные супернатанты гибридом очищали, используя носитель белок G, так чтобы было получено 150 моноклональных антител, связывающихся с белком CAPRIN-1.

Далее, из числа этих моноклональных антител были выбраны моноклональные антитела, проявляющие реакционную активность в отношении поверхности злокачественных клеток молочной железы, экспрессирующих CAPRIN-1. В частности, 10⁶ клеток линии злокачественных клеток молочной железы человека MDA-MB-231V подвергали центрифугированию с использованием 1,5 мл микроцентрифужной пробирки. Добавляли супернатант (100 мкл) каждой гибридомы, описанной выше, а затем оставляли стоять на льду в течение 1 часа. После промывания PBS добавляли антитело козы против IgG мыши, меченное FITC (Invitrogen Corporation), разбавленное 500 раз PBS, содержащим 0,1% эмбриональную сыворотку теленка, а затем оставляли стоять на льду в течение 1 часа. После промывания с использованием PBS интенсивность флуоресценции измеряли с помощью FACS Calibur (Becton, Dickinson и Company). При этом проводили процедуру, аналогичную указанной выше, так чтобы был получен контроль, дополненный средой, вместо антитела. В результате были выбраны 10 моноклональных антител (#1-#10), имеющих более сильную интенсивность флуоресценции, чем интенсивность флуоресценции контроля; то есть взаимодействующие с поверхностями злокачественных клеток молочной железы. Вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи этих моноклональных антител были показаны в последовательностях SEQ ID NO:44-60. Указанное выше моноклональное антитело #1 содержит вариабельную область тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:44 и вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:45, моноклональное антитело #2 содержит вариабельную область тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:44 и вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:46, моноклональное антитело #3 содержит вариабельную область тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:44 и вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:47, моноклональное антитело #4 содержит вариабельную область тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:44 и вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:48, моноклональное антитело #5 содержит вариабельную область тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:49 и вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:50, моноклональное антитело #6 содержит вариабельную область тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:51 и вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:52, моноклональное антитело #7 содержит вариабельную область тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:53 и вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:54, моноклональное антитело #8 содержит вариабельную область тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:55 и вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:56, моноклональное антитело #9 содержит вариабельную область тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:57 и вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:58, и моноклональное антитело #10 содержит вариабельную область тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:59 и вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:60.

(3) Идентификация пептида в белке CAPRIN-1, с которым связывается антитело против CAPRIN-1, взаимодействующее с поверхностью злокачественных клеток

Используя моноклональные антитела #1-#10 против CAPRIN-1, взаимодействующие с поверхностями злокачественных клеток, полученных выше, были идентифицированы частичные последовательности в белке CAPRIN-1, распознаваемые этими моноклональными антителами.

Сначала, DTT (Fluka) добавляли к 100 мкл раствора рекомбинантного белка CAPRIN-1, содержание белка в котором было доведено до концентрации 1 мкг/мкл с использованием PBS до конечной концентрации 10 мМ, с последующей 5 минутной реакцией при 95°C, так чтобы осуществлялось восстановление дисульфидных связей в белке CAPRIN-1. Далее, добавляли йодацетамид (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) с конечной концентрацией 20 мМ, а затем проводили реакцию алкилирования для тиольных групп при 37°C в течение 30 минут в затемненных условиях. Пятьдесят микрограмм каждого из моноклональных антител #1-#10 против CAPRIN-1 добавляли к 40 мкг полученного таким образом восстановленного-алкилированного белка CAPRIN-1. Объем смеси доводили до 1 мл 20 мМ фосфатным буфером (pH7,0), а затем смесь оставляли взаимодействовать в течение ночи при 4°C при вращении и перемешивании каждой смеси.

Далее, трипсин (Promega) добавляли до конечной концентрации 0,2 мкг. Через 1 час, 2 часа, 4 часа, а затем 12 часов взаимодействия при 37°C полученные в результате продукты перемешивали со стеклянными бусами с белком А (GE), предварительно блокированными PBS, содержащим 1% BSA (Sigma,) и промытыми PBS в 1 мМ карбонате кальция и NP-40 буфере (20 мМ фосфатный буфер (pH7,4), 5 мМ EDTA, 150 мМ NaCl и 1% NP-40) с последующим 30 минутным взаимодействием.

Каждый реакционный раствор промывали 25 мМ карбонат-аммонийным буфером (pH 8,0), а затем комплексы антиген-антитело элюировали, используя 100 мкл 0,1% муравьиной кислоты. LC-MS анализ проводили для элюатов, используя Q-TOF Premier (Waters-MicroMass) в соответствии с протоколами, включенными в этот прибор.

В результате полипептид последовательности SEQ ID NO:61 идентифицировали в качестве частичной последовательности CAPRIN-1, которая распознавалась всеми моноклональными антителами #1-#10 против CAPRIN-1. Более того, пептид последовательности SEQ ID NO:62 был идентифицирован как частичная последовательность в полипептиде SEQ ID NO:61, указанном выше, которая распознавалась моноклональными антителами #1-#4, #5-#7 и #9. Дополнительно было обнаружено, что моноклональные антитела #1-#4 распознавали пептид SEQ ID NO:63, который был его частичной пептидной последовательностью.

Пример 4

Диагностика злокачественного заболевания с использованием полипептида CAPRIN-1

(1) Диагностика злокачественного заболевания у собак

Кровь брали у 342 собак, у которых было подтверждено наличие злокачественных или доброкачественных опухолей, и 6 здоровых собак и отделяли сыворотку. С использованием полипептида CAPRIN-1 собаки (SEQ ID NO:8) и антитела против IgG собаки, полученного в примере 2, титр сывороточного антитела IgG, специфически взаимодействующего с этим полипептидом, измеряли методом ELISA.

Иммобилизацию полученного таким образом полипептида проводили путем добавления раствора рекомбинантного белка, разбавленного до 5 мкг/мл фосфатно-буферным солевым раствором, в 96-луночные планшеты Immobilizer Amino Plates (Nunc) по 100 мкг/лунку, а затем оставляя планшеты стоять при 4°C в течение ночи. Блокирование проводили путем добавления 50 мМ раствора бикарбонатнатриевого буфера (pH 8,4) (здесь и далее блокирующий раствор), содержащего 0,5% BSA (бычьего сывороточного альбумина) (Sigma Aldrich Japan) по 100 мкл/лунку, а затем встряхивания этого раствора при комнатной температуре в течение 1 часа. Сыворотку, разбавленную в 1000 раз блокирующим раствором, добавляли по 100 мкг/лунку, а затем эту смесь встряхивали при комнатной температуре в течение 3 часов для взаимодействия. Реакционные растворы промывали 3 раза, используя фосфатно-буферный солевой раствор (здесь и далее PBS-T), содержащий 0,05% Tween20 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). IgG антитело собаки, модифицированное HRP (антитело козы против IgG собаки-h+I HRP конъюгированное: BETHYL Laboratories), разбавленное в 3000 раз блокирующим раствором, добавляли по 100 мкл/лунку с последующим 1 часовым взаимодействием при комнатной температуре при встряхивании раствора. После 3 промываний с использованием PBS-T, HRP субстрат TMB (1-стадийный Turbo TMB (тетраметилбензидин), PIERCE) добавляли по 100 мкл/лунку, а затем проводили фермент-субстратное взаимодействие при комнатной температуре в течение 30 минут. После этого 0,5 M раствор серной кислоты (Sigma Aldrich Japan) добавляли по 100 мкл/лунку для остановки реакции. Поглощение при 450 нм измеряли, используя микропланшетный ридер. В качестве контролей образец, применительно к которому не был иммобилизован полученный рекомбинантный белок, и образец, применительно к которому реакция с сывороткой собаки со злокачественной опухолью не проводилась, были аналогично подвергнуты указанной выше обработке и сравнению.

В результате патологической диагностики, используя иссеченную ткань опухоли, проводили точную диагностику, указывающую на то, что 215 из всех 342 образцов, использованных для диагностики злокачественных опухолей были злокачественными.

В частности, образцы диагностировали как имеющие злокачественные опухоли, такие как злокачественная меланома, злокачественная смешанная опухоль, печеночно-клеточная карцинома, базальноклеточная карцинома, акантома-подобная опухоль десен, опухоль ротовой полости, перианальная аденокарцинома, опухоль анальной пазухи, апокринная аденокарцинома анальной пазухи, карцинома клеток сертоли, рак преддверия влагалища, сальная аденокарцинома, сальная эпителиома, сальная аденома, карцинома потовых желез, интраназальная аденокарцинома, назальная аденокарцинома, рак щитовидной железы, рак толстой кишки, аденокарцинома бронхов, аденокарцинома, карцинома из эпителия протоков, аденокарцинома молочной железы, аденокарцинома молочной железы составного типа, сложная злокачественная опухоль молочной железы, внутрипротоковая сосочковая аденокарцинома, фибросаркома, гемангиоперицитома, остеосаркома, хондросаркома, саркома мягких тканей, ретикулоклеточная саркома, миксосаркома, недифференцированная саркома, рак легких, мастоцитома, лейомиома кожи, внутрибрюшинная лейомиома, лейомиома, хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфома, гастроинтестинальная лимфома, кишечная лимфома, мелкоклеточная-промежуточноклеточная лимфома, опухоль мозгового слоя надпочечников, гранулезоклеточная опухоль и феохромоцитома.

Было обнаружено, что сыворотки, полученные из живых организмов этих собак со злокачественными опухолями, имеют значительно более высокие титры антител против рекомбинантного белка, как показано на фиг.3. В тех случаях когда эталонные значения для злокачественной опухоли, касающиеся способа диагностики, были определены в два или более раз выше среднего значения для здоровых собак, было продемонстрировано, что злокачественность могла быть диагностирована для 108 образцов, что составляло 50,2% всех образцов. Типы злокачественных опухолей этих 108 образцов были следующими. Хотя развитие множества типов злокачественных опухолей показано для некоторых образцов, следующие численные значения представляют собой суммарные величины для каждого типа злокачественной опухоли:

6 случаев злокачественной меланомы, 11 случаев лимфомы, 1 случай гнойного воспаления, 1 случай гранулезнокленочной опухоли, 4 случая печеночноклеточной карциномы, 3 случая злокачественной опухоли семенников, 3 случая опухоли ротовой полости, 7 случаев перианальной аденокарциномы, 12 случаев саркомы, 35 случаев аденокарциномы молочной железы, 1 случай рака легких, 6 случаев карциномы протоков, 2 случая сальной аденокарциномы, 5 случаев мастоцитомы, 1 случай саркомы гладких мышц, 3 случая сквамозноклеточной карциномы, 2 случая злокачественной смешанной опухоли, 1 случай гемангиоперицитомы, 1 случай переходного эпителиального рака, 1 случай гемангиоперицитомы, 1 случай гемангиоперицитомы и 1 случай сальной эпителиомы.

В результате аналогичной диагностики с использованием плевральных выпотов и асцитических жидкостей, собранных у собак с терминальной стадией злокачественной опухоли, могли быть обнаружены величины, сходные с результатами, полученными диагностическим способом с использованием сыворотки, и могла быть проведена диагностика злокачественной опухоли.

Также, также было продемонстрировано, что применение этого диагностического способа обеспечивает диагностику злокачественной опухоли в локализации, невидимой невооруженным глазом, степень распространения злокачественной опухоли, злокачественность или послеоперационное течение злокачественного заболевания, рецидив, метастазирование и тому подобное. Некоторые конкретные примеры подробного диагноза, показанные на фиг.4, описаны ниже.

(2)-1 Диагностика злокачественных опухолей, невидимых невооруженным глазом

7 июня 2007, у 1 собаки не подтвердилось наличие опухолевого образования (гладкошерстный ретривер). Однако 20 дней спустя, 24 июня 2007, было обнаружено опухолевое образование на ножке диаметром 2 мм в десне в корне левого клыка верхней челюсти у собаки 1. В тот день, когда было обнаружено опухолевое образование, часть на ножке была лигирована и удалена оперативным путем. Поглощение при 450 нм составило 0,06 до того, как опухолевое образование могло быть верифицировано визуально, и это значение было почти таким же как 0,04, которое было установлено, когда была обнаружено опухоль. Этот результат также показал, что диагностика злокачественной опухоли в локализации, невидимой невооруженным глазом, например внутрибрюшинная злокачественная опухоль, возможна с использованием этой методики.

Кроме того, можно сказать, что с успехом был обнаружен предупредительный признак развития опухоли, поскольку повышение указанного выше уровня могло быть подтверждено до того, как опухоль могла быть верифицирована невооруженным глазом. Следовательно, было подтверждено, что эта методика также является применимой для медицинских осмотров, таких как обычные медицинские осмотры.

(2)-2 Диагностика степени распространения злокачественной опухоли

Степень распространения злокачественной опухоли основана на размере опухоли, глубине опухоли, как опухоль воздействует на периферическую ткань, и наличии или отсутствии метастаз. Было обнаружено, что более высокое значение было определено, когда появились метастазы или злокачественная опухоль прогрессировала.

(2)-3 Диагностика злокачественности опухоли

Базальноклеточные опухоли включают злокачественные базальноклеточные опухоли и доброкачественные базальноклеточные опухоли. В последнее время злокачественные базальноклеточные опухоли имеют тенденцию к классификации как примеры трихобластомы в соответствии с новой ВОЗ.

У собаки 2 (порода бигль) диагностировали базальноклеточную карциному (злокачественную), проводили серодиагностику при хирургическом вмешательстве, так что поглощение при 450 нм составляло 0,04. При этом у собаки 3 (беспородной) диагностировали трихобластому (доброкачественную), проводили серодиагностику при хирургическом вмешательстве, так что поглощение при 450 нм составляло 0, указывающее на отсутствие обнаружения. Следовательно, были показаны различные типы базальноклеточной опухоли, т.е. могут быть диагностированы злокачественная базальноклеточная карцинома и доброкачественная трихобластома, даже если они классифицируются как базальноклеточные опухоли.

Далее, примеры опухолей молочных желез представляют собой следующее. Опухоли молочных желез классифицируются как злокачественные опухоли, такие как аденокарцинома молочной железы и злокачественная смешанная опухоль молочной железы, и доброкачественные опухоли молочной железы, не демонстрирующие признаков злокачественности.

Собаку 4 (Шелти) подвергали хирургическому вмешательству 17 июля 2007 по поводу аденокарциномы молочной железы. У собаки 4 было 3 опухоли. Патологический диагноз с использованием выделенной ткани дал в результате тот же диагноз. Сильно атипичная и инвазивная ткань молочной железы претерпевала довольно распространенный папиллярно-аденоидный рост, и также для некоторых образцов была подтверждена сосудистая инвазия. Таким образом, у собаки 4 был диагностирован высоко злокачественный рак молочной железы. В результате серодиагностики с использованием крови, полученной при хирургической операции, поглощение при 450 нм составляло 0,41.

При этом собаке 5 (карликовый пудель) проводили радикальное хирургическое вмешательство 9 октября 2007 по случаю опухоли молочной железы. Патологический диагноз с использованием выделенных тканей в это же время показал, что хотя опухоли были образованы в той молочной железе, в которой росли эпителиальные клетки молочной железы и миоэпителиальные клетки, миоэпителиальные клеточные компоненты представляли собой однородные веретенообразные клетки и никакой злокачественности обнаружено не было; и эпителиальный клеточный компонент молочной железы демонстрировал, как наблюдалось, небольшое отличие по размеру и дискариоз. Следовательно, у собаки 5 диагностирована доброкачественная опухоль молочной железы, в отношении которой не было обнаружено злокачественности. В результате сбора крови и серодиагностики при хирургическом вмешательстве поглощение при 450 нм составляло 0.

Указанные выше результаты для 2 образцов показали, что малигнизация высоко злокачественной опухоли выше, чем доброкачественной низко злокачественной опухоли.

Также, было исследовано распределение диагноза для 54 образцов злокачественных опухолей (рак груди), таких как образцы аденокарциномы молочной железы или злокачественной смешанной опухоли молочной железы, и 21 образца доброкачественной опухоли молочной железы, не демонстрирующих злокачественности. Хотя образцы доброкачественной опухоли молочной железы показали распределение, аналогичное таковому в случае здоровых собак, образцы рака молочной железы показали распределение с высокими величинами.

(2)-4 Определение послеоперационного течения

Собака 6 (беспородная) находилась в больнице по поводу мастоцитомы, и ей было проведено радикальное хирургическое вмешательство 23 мая 2005. В результате серодиагностики, проведенной в это время, поглощение при 450 нм составляло 0,10. Мастоцитома представляет собой опухоль, которая повторно подвергается рецидиву или метастазированию при неполной резекции. Следовательно, важно, полная или неполная резекция достигается хирургическим путем. При последующем врачебном осмотре 19 декабря 2006 поглощение при 450 нм составляло 0,05, так что был подтвержден сниженный титр антител. В это же время рецидив не подтвердился. Следовательно, в случае собаки 6, можно сказать, что поскольку опухоль могла быть полностью удалена, результаты серодиагностики были ниже, чем при хирургическом вмешательстве.

Собака 7 (бигль) подверглась радикальному хирургическому вмешательству 14 февраля 2008 по поводу мастоцитомы. В результате серодиагностики, проведенной в это же время, поглощение при 450 нм составляло 0,17. В результате гистопатологической диагностики с использованием иссеченных тканей наблюдалась инвазивная гиперплазия и у собаки 7 была диагностирована мастоцитома, соответствующая умеренно дифференцированному типу (Patnaik II тип). Собака 7 снова была обследована 10 марта 2008 и снова подвергалась серодиагностике. В результате поглощение при 450 нм составляло 0,07. В это же время не подтвердилось ни метастазирование, ни рецидив. Следовательно, в случае собаки 7, можно сказать, что результаты серодиагностики были ниже, чем при хирургическом вмешательстве, поскольку опухоль могла быть полностью удалена.

(2)-5 Диагностика рецидивов

Собака 8 (хаски) подвергалась радикальному хирургическому вмешательству 8 мая 2007, по поводу аденокарциномы молочной железы. В результате серодиагностики, проведенной в это время, поглощение при 450 нм составляло 0,05. В результате патологической диагностики с использованием иссеченной ткани сильно атипичные эпителиальные клетки росли, преимущественно образуя трубчатую структуру. Следовательно, у собаки 8 была диагностирована аденокарцинома из первичной молочной железы. В это же время наличие большого количества злокачественных клеток в лимфатических протоках уже было подтверждено, указывая на высокий риск метастазирования или рецидива в лимфатические узлы или отдаленные участки. 28 июня 2007 (примерно полтора месяца после операции) был подтвержден рецидив в этом же месте. Результат серодиагностики в это время составил 0,09, и, следовательно, было подтверждено повышенное значение. В случае собаки 8 было обнаружено, что вследствие неполной резекции опухоли или ее рецидива результаты диагностики были выше в конце июня, чем в начале мая.

(2)-6 Диагностика метастазирования

Собака 9 (шотландский терьер) перенесла многочисленные метастазирования и рецидивы, в том числе опухоли молочной железы в феврале 2003, внутриротовой злокачественной меланомы в августе 2003, злокачественной меланомы губы в январе 2005 и внутриротовой меланомы 13 апреля 2005. Все эти опухоли были удалены хирургическим путем. Собака 9 повторно поступила 17 декабря 2006 для последующего врачебного осмотра после рецидива внутриротовой меланомы в апреле 2005 и ей была проведена серодиагностика. В результате поглощение при 450 нм составляло 0,09. Полгода спустя пациент 9 снова поступил в больницу 20 июня 2007 по поводу шейной и лимфоидной гиперплазии и подколенной лимфоидной гиперплазии. В случае лимфомы лимфатические узлы системно увеличиваются. У собаки 9 были увеличены лимфатические узлы только в двух местах. Следовательно, у собаки 9 клинически диагностировали с большой вероятностью лимфому вследствие метастазирования. Диагностика была проведена с помощью этой методики. Также установлено, что поглощение при 450 нм было повышено до 0,10, указывающее на то, что лимфома была вызвана метастазированием предыдущей опухоли.

Собака 10 (шиба-ину) подвергалась хирургическому удалению опухоли 11 марта 2006 по поводу внутриротовой злокачественной меланомы правой губы. У собаки 10 в анамнезе лечение противоопухолевым средством (циклофосфамидом) с 10 июня 2006 по 26 сентября 2006, и она находилась под воздействием лекарственной терапии BIREMO S, с органическим германием в качестве основного ингредиента, с 23 мая 2006. Серодиагностика была проведена 20 марта 2007, после удаления опухоли считалось, что она является результатом метастазирования предыдущей опухоли, так что поглощение при 450 нм составляло почти 0,03, указывая почти на отсутствие обнаружения. Патологическая диагностика была проведена в отношении ткани, оперативно удаленной в это время, так что заболевание было диагностировано как метастазирующая злокачественная меланома. Однако метастазы появились снова 27 июня 2007, через 3 месяца после хирургической операции по поводу метастазирующей меланомы. Опухоль развивалась с правой части шеи 20 марта 2007, далее развитие опухоли произошло на стороне, противоположной этой части 27 июня 2007. Опухоли формировали черные образования, аналогичные таковым предыдущих наблюдений. Размер опухоли составил 3,1×3,2×0,8 см, и опухоли были клинически диагностированы как метастазирующие опухоли. В результате серодиагностики в это время было подтверждено, что поглощение при 450 нм повысилось до 0,23, что дает возможность предположить, что эти опухоли являлись результатом метастазирования предыдущих опухолей.

(2)-7 Диагностика злокачественных опухолей с использованием полипептида, производного CAPRIN-1 человека

Используя полипептид (SEQ ID NO:2) CAPRIN-1 человека, полученный в примере 2, титр сывороточного IgG антитела собаки, взаимодействующего с этим полипептидом, измеряли способом, аналогичным используемому выше. В результате исследования с использованием сыворотки здоровой собаки поглощение почти не определялось при 450 нм, аналогично случаю, описанному выше.

Между тем собаке 11 (ши-тцу) проводили радикальное хирургическое вмешательство по поводу аденокарциномы молочной железы 21 июня 2007. В результате патологической диагностики с использованием удаленных тканей у собаки 11 диагностировали аденокарциному молочной железы умеренной злокачественности, в которой сильно атипичные и инвазивные ткани молочной железы претерпевали аденоидно-тубулярный-папиллярный рост, с формированием крупных и мелких образований помимо наличия довольно диффузной гиперплазии волокнистых соединительных тканей. Поглощение при 450 нм у собаки 11 составляло 0,26.

(3) Диагностика злокачественных опухолей у кошек

Далее, проводили диагностику у кошек со злокачественными опухолями и у здоровых кошек. Используя полипептид CAPRIN-1 собаки (использованный выше) и антитело против IgG кошки, измеряли титр сывороточного IgG антитела кошки, специфически взаимодействующего с этим полипептидом, способом, аналогичным описанному выше. В качестве вторичного антитела антитело против IgG кошки, модифицированное HRP (КОНЪЮГИРОВАННАЯ С ПЕРОКСИДАЗОЙ ФРАКЦИЯ IgG КОЗЫ К IgG КОШКИ (ЦЕЛАЯ МОЛЕКУЛА): CAPPEL RESERCH REAGENTS) разбавляли в 8000 раз блокирующим раствором, а затем использовали.

Пациент 1, кошка (беспородная), подверглась радикальному хирургическому вмешательству по поводу аденосаркомы молочной железы 8 мая 2007. Поглощение при 450 нм для пациента 1, кошки, составляло 0,21. Также, в случае пациента 2, кошки (гималайская), которая перенесла радикальное хирургическое вмешательство по поводу карциномы из эпителия протоков 17 октября 2006, поглощение при 450 нм составляло 0,18. С другой стороны, поглощение не определялось в случае здоровых кошек.

Также, используя полипептид (SEQ ID NO:2) CAPRIN-1 человека, полученный в примере 2, титр сывороточного IgG антитела кошки, взаимодействующего с этим полипептидом, был измерен способом, аналогичным описанному выше. В результате в случае здоровых кошек поглощение почти не определялось при 450 нм, когда полипептид был иммобилизован. Между тем пациенту 3, кошке (американская короткошерстная), было проведено радикальное хирургическое вмешательство по поводу аденокарциномы молочной железы 15 апреля 2008. В результате патологической диагностики с использованием удаленных тканей у пациента 3, кошки, была диагностирована высоко злокачественная аденокарцинома молочной железы, связанная с крупными и мелкими безжизненным тканями, в которых сильно атипичные и инвазивные ткани молочной железы претерпевали пластинчатый рост в крупные и мелкие образования. Также в случае пациента 3, кошки, поглощение при 450 нм составляло 0,12.

Следовательно, было показано, что диагностика злокачественных опухолей также возможна у кошек с помощью этой методики, аналогично собакам, поскольку значения были установлены для образцов, полученных у кошек со злокачественными опухолями, но не были установлены для образцов, полученных от здоровых кошек.

(4) Диагностика злокачественных опухолей у людей

Используя полипептид (SEQ ID NO:2) CAPRIN-1 человека, полученный в примере 2, и антитело против IgG человека, измеряли титр сывороточного IgG антитела у здорового человека, которое специфически взаимодействует с этим полипептидом. Иммобилизацию полученного полипептида проводили путем добавления раствора рекомбинантного белка, разбавленного до 100 мкг/мл фосфатно-буферным солевым раствором, в 96-луночные планшеты Immobilizer Amino Plates (Nunc) по 100 мкл/лунку, а затем оставляя планшеты стоять в течение ночи при 4°C. Блокирование проводили следующим образом. Четыре грамма Block Ace powder (DS PHARMA BIOMEDICAL Co., Ltd.) растворяли в 100 мл очищенной воды, а затем этот раствор разбавляли в 4 раза очищенной водой. Затем этот раствор (здесь и далее блокирующий раствор) добавляли по 100 мкл/лунку, а затем встряхивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Сыворотку, разбавленную в 1000 раз блокирующим раствором, добавляли по 100 мкл/лунку, а затем встряхивали при комнатной температуре в течение 3 часов для взаимодействия. После промывания 3 раза с использованием фосфатно-буферного солевого раствора (здесь и далее, PBS-T), содержащего 0,05% Tween20 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), антитело против IgG человека, модифицированное HRP (HRP-Goat Anti-Human IgG (H+L) Conjugate: Zymed Laboratories), разбавленное в 10000 раз блокирующим раствором, добавляли по 100 мкл/лунку, а затем встряхивали при комнатной температуре в течение 1 часа для взаимодействия. После 3 промываний PBS-T, HRP субстрат TMB (1-стадийный Turbo TMB (тетраметилбензидин), PIERCE) добавляли по 100 мкл/лунку, а затем проводили фермент-субстратную реакцию при комнатной температуре в течение 30 минут. После этого 0,5 M раствор серной кислоты (Sigma Aldrich Japan) добавляли по 100 мкл/лунку для остановки реакции, а затем измеряли поглощение при 450 нм, используя микропланшетный ридер. Антиген овальбумин, доведенный до 50 мкг/мл фосфатно-буферным солевым раствором, иммобилизировали, а затем использовали в качестве положительного контроля. В результате поглощение при 450 нм составляло до 0,45 в среднем как результат для 7 здоровых пациентов в случае антигена овальбумина, но отсутствие поглощения (0) было установлено в случае указанного выше полипептида.

Способом, аналогичным указанному выше, 17 образцов сыворотки (приобретенных у ProMedDx) от пациентов со злокачественной опухолью груди дополнительно подвергали измерению титра сывороточного IgG антитела, специфически взаимодействующего с антигенным белком злокачественной опухоли, полученным от человека (аминокислотная последовательность SEQ ID NO:3). В результате поглощение при 450 нм составляло до 0,48 в случае указанного выше полипептида, в среднем, как результат для 17 пациентов с раком груди.

Также, используя полипептид (SEQ ID NO:8) CAPRIN-1 собаки, полученный в примере 2, и антитело против IgG человека, измеряли титр сывороточного IgG антитела человека, специфически взаимодействующего с этим полипептидом, способом, аналогичным указанному выше. В результате, тогда как среднее результатов для 7 здоровых пациентов составило 0,04, среднее результатов для 17 пациентов с раком груди составило 0,55.

Исходя из указанных выше результатов, было показано, что злокачественная опухоль у людей также может быть обнаружена с помощью этой методики.

Пример 5

Диагностика злокачественной опухоли путем измерения антигенного полипептида

Используя поликлональное антитело против пептида, производного CAPRIN-1 (SEQ ID NO:43), полученного в примере 3 (1), и каждое моноклональное антитело против белка CAPRIN-1, полученного в примере 3 (2), в сочетании, сам антигенный полипептид, содержащийся в образцах (сыворотка, полученная из живого организма со злокачественной опухолью), который давал положительную реакцию при диагностике злокачественных опухолей с использованием полипептида CAPRIN-1 в примере 4 (1)-(3), был обнаружен с помощью сэндвич ELISA. Поликлональное антитело использовали в качестве первичного антитела, и каждое моноклональное антитело использовали в качестве вторичного антитела. Измеряли уровень сывороточного белка, специфически взаимодействующего с каждым из указанных выше антител.

Первичное антитело было иммобилизовано путем добавления поликлонального антитела, разбавленного до концентрации 5 мкг/мл фосфатно-буферным солевым раствором в 96-луночные планшеты Immobilizer Amino Plates (Nunc) по 100 мкл/лунку, а затем встряхивания планшетов при комнатной температуре в течение 2 часов. Блокирование проводили путем добавления 50 мМ раствора карбонат-натриевого буфера (pH 8,4) (здесь и далее блокирующий раствор), содержащего 0,5% BSA (бычий сывороточный альбумин, Sigma Aldrich Japan) по 100 мкл/лунку, а затем встряхивания при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого сыворотку, полученную от живого организма со злокачественной опухолью, разбавленную блокирующим раствором, добавляли по 100 мкл/лунку, а затем полученные в результате смеси встряхивали при комнатной температуре в течение 3 часов для взаимодействия. Степень разбавления в этот момент доводили 10-кратными (10-1000-раз) сериями разведений. После 3 промываний фосфатно-буферным солевым раствором (здесь и далее PBS-T), содержащим 0,05% Tween20 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), каждое моноклональное антитело в качестве вторичного антитела, разбавленного до концентрации 1 мкг/мл блокирующим раствором, добавляли по 100 мкл/лунку, а затем полученные в результате смеси встряхивали при комнатной температуре в течение 1 часа для взаимодействия. После 3 промываний с использованием PBS-T, антитело против IgG мыши (H+L), меченное HRP (Invitrogen Corporation), в качестве третичного антитела, разбавленного в 5000 раз блокирующим раствором, добавляли по 100 мкл на лунку, а затем оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. После 3 промываний лунок с использованием PBS-T раствор субстрата TMB (Thermo) добавляли по 100 мкл на лунку, а затем оставляли стоять в течение 15-30 минут для цветовой реакции. После развития цвета 1 н. серную кислоту добавляли по 100 мкл на лунку для остановки реакции, а затем измеряли поглощение при 450 нм, используя абсорбционный спектрометр.

В результате, в тех случаях когда моноклональные антитела #1-#10, взаимодействующие с поверхностями злокачественных клеток использовали в качестве вторичных антител, значения поглощения (уровни полипептида) 0,3 или выше, были установлены для всех образцов, полученных от собак со злокачественными опухолями и кошек со злокачественными опухолями, злокачественной меланомой и подобным, но поглощения не было обнаружено для здоровых собак и здоровых кошек. С другой стороны, в тех случаях, когда моноклональные антитела, взаимодействующие с самим белком CAPRIN-1, но не взаимодействующие с поверхностями злокачественных клеток, были использованы в качестве вторичных антител, уровни полипептида были установлены для всех образцов, но значения поглощения все были 0,05 или менее, которые были ниже, чем результаты для сочетаний антител, взаимодействующих с поверхностями злокачественных клеток.

Таким образом, злокачественная опухоль также может быть диагностирована с помощью этой методики, которая предусматривает обнаружение антигенных полипептидов с использованием антител против CAPRIN-1.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение является промышленно применимым для диагностики или обнаружения злокачественной опухоли.

Настоящее описание включает часть или все содержание, изложенное в описании и/или чертежах японской патентной заявки № 2008-202320, которая является приоритетным документом настоящей заявки. Также, все публикации, патенты и патентные заявки, процитированные в настоящем описании, включены в качестве ссылки в полном объеме.

Список последовательностей произвольный текст

SEQ ID NO:31-42: праймеры

1. Способ обнаружения злокачественной опухоли, включающий измерение экспрессии полипептида, обладающего способностью связываться посредством реакции антиген-антитело с антителом против белка CAPRIN-1, имеющего любую из аминокислотных последовательностей с четными номерами SEQ ID NO:2-30 списка последовательностей, в образце, полученном из живого организма,
в котором злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль по меньшей мере одного типа, выбранную из группы, состоящей из рака молочной железы, рака почек, опухоли головного мозга, рака пищевода, лейкоза, лимфомы, меланомы, сквамозно-клеточной карциномы тканей головы, шеи или пищевода, аденокарциномы матки, злокачественной смешанной опухоли, печеночно-клеточной карциномы, базальноклеточной карциномы, акантома-подобной опухоли десен, опухоли ротовой полости, перианальной аденокарциномы, опухоли анальной пазухи, апокринной аденокарциномы анальной пазухи, карциномы клеток сертоли, рака преддверия влагалища, сальной аденокарциномы, сальной эпителиомы, сальной аденомы, карциномы потовых желез, интраназальной аденокарциномы, назальной аденокарциномы, рака щитовидной железы, аденокарциномы бронхов, аденокарциномы, карциномы из эпителия протоков, аденокарциномы молочной железы, аденокарциномы молочной железы составного типа, сложной злокачественной опухоли молочной железы, внутрипротоковой сосочковой аденокарциномы, фибросаркомы, гемангиоперицитомы, остеосаркомы, хондросаркомы, саркомы мягких тканей, гистиоцитарной саркомы, миксосаркомы, недифференцированной саркомы, мастоцитомы, лейомиомы кожи, внутрибрюшинной лейомиомы, лейомиомы, хронического лимфоцитарного лейкоза, гастроинтестинальной лимфомы, кишечной лимфомы, мелкоклеточной-промежуточноклеточной лимфомы, опухоли мозгового слоя надпочечников, гранулезоклеточной опухоли и феохромоцитомы.

2. Способ по п.1, в котором измеряемый полипептид представляет собой белок CAPRIN-1, имеющий любую из аминокислотных последовательностей с четными номерами SEQ ID NO:2-30, или полипептид, который на 85% или более идентичен белку CAPRIN-1.

3. Способ по п.1, где живым организмом является человек, собака или кошка.

4. Способ по п.3, где живым организмом является собака, а измеряемый полипептид имеет аминокислотную последовательность любой последовательности с четным номером SEQ ID NO:2-30.

5. Способ по п.4, где живым организмом является собака, а измеряемый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14.

6. Способ по п.3, где живым организмом является человек, а измеряемый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или 4.

7. Способ по п.1, в котором экспрессию полипептида измеряют иммуноанализом антитела, которое может содержаться в образце и индуцируется in vivo против измеряемого полипептида.

8. Способ по п.1, в котором образцом является сыворотка, плазма крови, асцитная жидкость или плевральный выпот.

9. Способ по п.1, в котором экспрессию полипептида измеряют путем определения мРНК, кодирующей полипептид, который содержится в этом образце.

10. Способ по п.9, включающий исследование существующего количества мРНК в образце, используя полинуклеотид, который специфически гибридизируется с частичной последовательностью из 15 или более нуклеотидов в нуклеотидной последовательности мРНК.

11. Способ по п.10, в котором живым организмом является собака, а полинуклеотид представляет собой полинуклеотид, специфически гибридизирующийся с частичной последовательностью из 15 или более нуклеотидов в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5, 7, 9, 11 или 13.

12. Способ по п.10, в котором живым организмом является человек и полинуклеотид представляет собой полинуклеотид, специфически гибридизирующийся с последовательностью из 15 или более нуклеотидов в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 или 3.

13. Способ по п.9, в котором образец представляет собой ткань или клетку.

14. Способ по п.1, дополнительно включающий определение злокачественности опухоли на том основании, что чем выше злокачественность опухоли, тем выше уровень экспрессии указанного выше полипептида по сравнению с уровнем экспрессии контроля.

15. Способ по п.1, предусматривающий дополнительное обнаружение прогрессирования злокачественной опухоли на том основании, что степень злокачественной опухоли является прогрессирующей, если уровень экспрессии указанного полипептида выше уровня экспрессии контроля.

16. Агент для обнаружения злокачественной опухоли, содержащий антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, которое подвергается реакции антиген-антитело с полипептидом, где полипептид обладает реактивностью связывания посредством реакции антиген-антитело против белка CARPIN-1, имеющего одну из любых аминокислотных последовательностей с четным номером SEQ ID NO:2-30 в перечне последовательностей и продуцирующегося in vivo, где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, которое подвергается реакции антиген-антитело с полипептидом, представляет собой антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с поверхностью злокачественной клетки.

17. Агент для обнаружения злокачественной опухоли по п.16, где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, которое подвергается реакции антиген-антитело с полипептидом, обладает иммунологической реактивностью в отношении:
полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из 7 или более последовательных аминокислотных остатков в пределах области аминокислотных остатков 50-98 или аминокислотных остатков 233-305 в одной из аминокислотных последовательностей с четным номером SEQ ID NO:2-30, кроме последовательностей SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:18; или
полипептида, содержащего указанный полипептид.

18. Агент для обнаружения злокачественной опухоли по п.16, где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, которое подвергается реакции антиген-антитело с полипептидом, представляет собой антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с SEQ ID NO:43, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:44 и 45, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:44 и 46, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:44 и 47, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:44 и 48, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:49 и 50, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:51 и 52, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:53 и 54, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:55 и 56, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:57 и 58, или моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:59 и 60.