Способ получения иммуногенной композиции на основе гибридного белка pesat6-dbd и декстрана, рекомбинантная плазмида pesat6-dbd, штамм escherichia coli, химерный белок esat6-dbd и их применение
Владельцы патента RU 2520737:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) (RU)
Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмиду pESAT6-DBD, состоящую из искусственного бактериального оперона химерного белка, включающего промоторную область раннего промотора бактериофага Т5, гена химерного белка, состоящего из последовательности белкового антигена ESAT6 из Mycobacterium tuberculosis, слитого с последовательностью декстрансвязывающего домена (DBD) декстрансукразы Leuconostoc citreum KM20 и терминатора транскрипции; бактериального оперона бета-лактамазы и бактериального участка инициации репликации типа ColEl. Изобретение также включает штамм Escherichia coli - продуцент химерного белка ESAT6-DBD, а также способ иммобилизации, концентрирования и очистки полученного белка на декстране. Кроме того, изобретение относится к самому рекомбинантному белку ESAT6-DBD и иммуногенной композиции, содержащей его, направленной на индукцию иммунитета против туберкулезной инфекции. Изобретение позволяет получать штамм-продуцент, обеспечивающий высокий уровень продукции устойчивых иммуногенных белков, которые могут быть получены, иммобилизованы и очищены в одну стадию, а также получать эффективные иммуногенные композиции против туберкулеза. 5 н.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 5 пр.
Область техники, к которой относится изобретение и преимущественная область использования изобретения
Изобретение относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для получения рекомбинантного (химерного) белка ESAT6-DBD и иммуногенной композиции, содержащей его, направленной на индукцию иммунитета против туберкулезной инфекции. Изобретение позволяет получать штамм-продуцент, обеспечивающий высокий уровень продукции устойчивых иммуногенных белков, которые могут быть получены, иммобилизованы и очищены в одну стадию, а также получать эффективные иммуногенные композиции против туберкулеза.
Описание аналогов изобретения
Туберкулез (ТБ) остается одной из самых опасных и распространенных инфекционных болезней. По данным ВОЗ в мире регистрируется около 9 млн. новых случаев и около 2 млн смертей в год. В разных регионах России заболеваемость ТБ составляет от 35 до 100 случаев на 100 тыс. населения и остается относительно стабильной в течение последних лет. При этом Россия остается в числе стран с высоким уровнем заболеваемости (в несколько раз выше, чем в Западной Европе и Северной Америке), поэтому создание новых средств борьбы с ТБ - приоритетная задача российской биомедицинской науки.
Mycobacterium tuberculosis - это внутриклеточный патоген, и основная роль в адаптивном иммунитете к ТБ принадлежит клеточным, а не гуморальным факторам защиты. Разные группы антигенов микобактерий, например белки теплового шока, липропротеины, секреторные белки, ферменты, изучены достаточно хорошо. По мнению многих авторов основными мишенями (иммунодоминатными антигенами) протективного иммунитета являются секреторные белки, присутствующие в культуральном фильтрате М. tuberculosis. Среди них наиболее полно охарактеризованы близкородственные белки комплекса Ag85 (Ag85A, В и С), ESAT-6 (Early Secret Antigen Target) и CFP-10 (Culture-Filtrate Protein).
Известно изобретение US 2011/0206713 A1, которое описывает иммуногенную композицию или лекарственные средства, состоящие из одного антигена ESAT-6, Ag85A, Ag85B, ТВ10.4 Mycobacterium tuberculosis; сочетания различных химерных белков на основе этих антигенов; использование гибридных (fusion) белков в разных сочетаниях с вакциной BCG.
В патенте US 2011/0027349 A1 на изобретение описывается состав иммуногенной композиции, предназначенной для борьбы с латентными формами инфекции и предупреждения развития активного ТБ на основе белков семейства ESX1 и ESAT6.
Известно изобретение (патент US8293250 В2), которое описывает иммуногенную композицию для профилактики и лечения заболеваний, вызванных микобактериями (М. tuberculosis, М. Bovis, М. africanum, М. microti). В основе иммуногенных композиций лежат гибридные (fusion) белки, в том числе ESAT6.
Изобретение ЕР 1200466 А2 предполагает создание вакцинных композиций для профилактики туберкулеза на основе белков семейства, к которому принадлежит ESAT6.
Целью приведенных изобретений является создание иммуногенных композиций на основе белков микобактерий, включая ESAT6. Во всех изобретениях не описан способ получения белков, так как это не является предметом патента.
Известно изобретение US 6174700, которое описывает способ очистки полипептидов, несущих в своем составе карбогидратсвязывающий домен. В качестве карбогидратсвязывающего домена описывается целлюлозосвязывающий домен.
Недостатком изобретения является то, что метод очистки белков, приведенный в качестве примера не может быть применен для фармацевтического применения вследствие загрязнения конечного продукта эндотоксинами E. coli и сложности удаления карбогидратсвязывающего домена из белковой молекулы.
Найден патент (WO 2009/143413), который описывает использование гибридного белка pneumolysin и микобактериальных белков ESAT6, mtb или Ag85, конъюгированных с полисахаридами, в том числе декстраном. Однако в найденном патенте не используются карбогидратсвязывающие домены, специфически взаимодействующие с полисахаридом, а препараты, полученные описанным в изобретении способом, относятся к классическим конъюгированным вакцинам.
Известны патенты, в которых описывается использование декстрансвязывающего домена из микроорганизма Leuconostoc mesenteroides в качестве домена, взаимодействующего с декстраном. В патенте RU 2428477 приводится описание химерной белковой конструкции ДСД-сп-β-ГАЛ, содержащей декстрансвязывающий домен из микроорганизма Leuconostoc mesenteroides, который генно-инженерным путем объединен через глицин-сериновый спейсер с термостабильной бета-галактозидазой из термофильного микроорганизма Thermoanaerobacter ethanolicus. Однако в патенте не приводится способ очистки рекомбинантного белка с использованием декстрана в качестве сорбента, а приводимый в патенте пример по определению декстрансвязывающих свойств у химерного белка можно использовать только для очистки термостабильных рекомбинантных белков. Использовать этот метод для получения иммуногенных компонентов медицинских иммунобиологических препаратов невозможно по причине термолабильности антигенов.
Описание прототипа изобретения
Прототипом заявленного изобретения является патент RU 2422525, в котором излагается способ получения рекомбинантного белка ESAT6-CBD, состоящего из антигенного домена - белка ESAT6, и целлюлозосвязывающего домена - CBD. Описана рекомбинантная плазмида pESAT6-CBD, состоящая из искусственного бактериального оперона химерного белка, включающего промоторную область раннего промотора бактериофага Т5, ген химерного белка и терминатор транскрипции; бактериального оперона бета-лактамазы и бактериального участка инициации репликации типа ColE1. Изобретение также включает штамм Escherichia coli - продуценты химерного белка ESAT6-CBD, а также способ иммобилизации, концентрирования и очистки полученного белка на целлюлозе. Кроме того, изобретение относится к самому рекомбинантному белку ESAT6-CBD и иммуногенной композиции, содержащей его, направленной на индукцию иммунитета против туберкулезной инфекции. Изобретение позволяет получать штамм-продуцент, обеспечивающий высокий уровень продукции устойчивых иммуногенных белков, которые могут быть получены, иммобилизованы и очищены в одну стадию, а также получать эффективные иммуногенные композиции против туберкулеза.
Недостатком данного изобретения является низкая биодеградируемость целлюлозы, что ограничивает область применения иммуногенной композиции «рекомбинантный белок ESAT6-CBD - целлюлоза».
Задача изобретения и способ ее решения
Задачей изобретения является разработка способа получения антигенного белкового компонента вакцины с высоким уровнем экспрессии и стабильности этих компонентов в бактериальной системе, эффективная система их очистки. Для решения этой задачи используется декстрансвязывающий домен из микроорганизма Leuconostoc citreum для получения стабильной в течение продолжительного времени (не менее года) иммуногенной композиции путем объединения последовательности, кодирующей DBD, с последовательностью микобактериального белка (антигена) и иммобилизации полученного в экспрессионной системе Е. coli химерного антигена на молекуле полисахарида декстран, который применяется в качестве адъюванта.
При использовании этого подхода был получен двухкомпонентный рекомбинантный белок. Последовательность гена М. tuberculosis ESAT6 кодирует полноразмерный белок, который формирует первый белковый домен, определяющий функциональные иммунологические свойства комплексной молекулы. Далее следует соединяющая (спейсерная) аминокислотная последовательность из нескольких чередующихся остатков глицина и серина (Gly-Ser). Второй белковый домен кодируется последовательностью гена декстрансукразы Leuconostoc citreum KM20, он определяет способность продукта взаимодействовать с декстрановым сорбентом. Белковые продукты нарабатываются в непатогенных лабораторных штаммах Escherichia coli. Иммобилизованный на декстране антиген представляет собой суспензию сорбента с адсорбированным на нем белке. Декстрановый носитель выступает в роли адъюванта при иммунизации, так как обеспечивает укрупнение и полимеризацию антигена. Отличительной особенностью декстрана в качестве адъюванта является его биодеградируемость. Антигены в свободном состоянии представляют собой растворы с определенной ионной силой, свободные от примесей липополисахаридов и ДНК штамма-продуцента.
Очистка конечных продуктов от высокотоксичных для организма липополисахаридов, балластных белков, ДНК и РНК штаммов-продуцентов является важной проблемой.
Использование декстрансвязывающего домена декстрансукразы Leuconostoc citreum определяется тем, что он обеспечивает большую стабильность рекомбинантных белков, чем описанный в литературе последовательности из микроорганизмов Leuconostoc mesenteroides и Streptococcus sobrinus (S. Suwannarangsee, С. Moulis, G. Potocki-Veronese, P. Monsan, M. Remaud-Simeon, and W. Chulalaksananukul, "Search for a dextransucrase minimal motif involved in dextran binding.,» FEBS letters, vol. 581, no. 24, pp.4675-80, Oct. 2007.).
Таким образом, заявляемая группа изобретений позволяет создавать штамм Е. coli, обеспечивающий высокий уровень продукции рекомбинантного белка, содержащего белок M. tuberculosis ESAT6; получить простую и эффективную схему очистки рекомбинантного белка, специфически и эффективно индуцирующего иммунный ответ на антиген микобактерий, в том числе синтез ИФН-гамма, необходимый для противотуберкулезной защиты; создать иммуногенную композицию на основе рекомбинантных белка на декстрановом носителе (биодеградируемый адъювант).
Указанный результат достигается за счет синтеза рекомбинантного белка ESAT6-DBD в клетках рекомбинантного штамма Е. coli M15 [pREP4, pESAT6-DBD], несущего рекомбинантную плазмиду pESAT6-DBD. Также за счет создания комплексного препарата ESAT6-DBD-декстран, в котором рекомбинантный белок ESAT6-DBD (концентрация 3,5 мг/мл) иммобилизован на декстране (концентрация декстрана 500 50 мг/мл) и ресуспендирован в 1x PBS буфере рН 7,2-7,4.
Сущность изобретения
Создана рекомбинантная плазмида pESAT6-DBD (3753 п.н., последовательность №1), кодирующая бифункциональный рекомбинантный белок ESAT6-DBD (последовательность №2), обладающий способностью самопроизвольно связываться с декстрансодержащим сорбентом. Плазмида pESAT6-DBD содержит следующие существенные для ее функционирования структурные элементы:
- искусственный бактериальный оперон рекомбинантного белка pESAT6-sp-DBD2, включающий: промоторную область бактериофага Т5 (7-87 п.н.), ген рекомбинантного белка ESAT6-sp-DBD2 (117-852 п.н), нетранслируемую область терминации транскрипции (892-986 п.н.);
- бактериальный оперон бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампицилину (2688-3548 п.н.);
- бактериальный участок инициации репликации типа ColE1 (2466-2477 п.н.), обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах Е. coli.
Штамм-продуцент рекомбинантного белка ESAT6-DBD получают трансформацией клеток Е. coli штамма M15 [pREP4] плазмидой pESAT6-DBD. Штамм обеспечивает продукцию рекомбинантного белка ESAT6-DBD после проведения процедуры индукции изопропил-β-D-тио-галактопиранозидом (ИПТГ) до 25-30% от тотального белка клетки.
Штамм Е. coli M15 [pREP4], несущий плазмиду pESAT6-DBD - продуцент бифункционального рекомбинантного белка ESAT6-DBD - характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, неподвижные, грамотрицательные. При рассеве на чашке с 2,0% агаризованной средой LB рост в виде отдельных колоний, иногда в R-форме с неровными краями. Хорошо растет на плотных и жидких питательных средах (LB-бульон, LB-агар, МПА, МПБ).
Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут при температуре от +4°С до +42°С, при оптимуме рН=6,8-7,5. Штамм разлагает глюкозу, маннит с образованием кислоты, не разлагают сахарозу, арабинозу, галактозу, сбраживает мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу. Существенным при использовании данного штамма является чувствительность к налидиксовой кислоте (25 мг/мл), стрептомицину (20 мг/мл) и рифампицину (25 мг/мл). Проявляет устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pESAT6-DBD и к канамицину (до 50 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pREP4.
По созданию комплексного препарата рекомбинантного белка и декстрана 500 технический результат достигается за счет создания двухкомпонентного рекомбинантного белка, состоящего из белка ESAT6 М. tuberculosis и гена декстрансукразы Leuconostoc citreum KM20. А также за счет получения комплексного препарата (иммунологической композиции), в которой рекомбинантный белок (Ag-DBD) иммобилизован на декстране (Ag-DBD-декстран).
Рекомбинантный белок ESAT6-DBD имеет в своем составе домен, определяющий его способность связываться с декстраном, что позволяет проводить в одну стадию концентрирование, очистку и иммобилизацию белкового продукта на декстране. Иммобилизация на декстране обеспечивается за счет присутствия в рекомбинантном белке декстрансвязывающего домена декстрансукразы из микроорганизма Leuconostoc citreum KM20.
Поскольку в Е. coli отсутствуют белки, связывающиеся с декстраном, то синтезируемый в клетках Е. coli, трансформированных плазмидой pESAT6-DBD, рекомбинантный белок ESAT6-DBD является единственным белком штамма-продуцента, прочно связывающимся с декстраном. Это обеспечивает возможность одностадийного получения высокоочищенного препарата белка, иммобилизованного на сорбенте. На фиг.1 приведена схема плазмиды pESAT6-DBD.
Сравнение стабильности рекомбинантных микобактериальных белков, слитых с декстрансвязывающими доменами из L. mesenteroides и L. citreum выявили, что белки, слитые с декстрансвязывающим доменом из L. mesenteroides являются нестабильными и склонны к деградации при хранении свыше полугода, что не позволяет использовать вышеупомянутый домен для очистки этих рекомбинантных белков. Использование DBD L. citreum в качестве субъединицы, которая связывается с декстраном, позволяет получать более стабильные иммуногенные композиции.
Была исследована иммуногенность комплексного препарата ESAT6-DBD - декстран на мышах линии C57b1/6. Животных иммунизировали под кожу спины 2-кратно с 2-недельным интервалом иммуногенным (рекомбинантный белок ESAT6-DBD на декстране) и контрольным препаратом (физиологический раствор). Через 5 недель был исследован пролиферативный ответ Т-клеток и количество Т-клеток, продуцирующих ИФН-гамма. Был выявлен прирост ИФН-гамма-положительных Т-клеток и усиление пролиферации в присутствии соответствующего антигена в культуре клеток по сравнению с контрольными животными.
Техническим результатом, достигаемым при осуществлении изобретения, является получение штамма-продуцента, обеспечивающего высокий уровень продукции устойчивого иммуногенного белка, который может быть получен, иммобилизован и очищен в одну стадию. Нековалентное взаимодействие декстрансвязывающего домена с декстраном обеспечивает постоянный, но медленный выход антигена из комплекса с субстратом за счет естественной диссоциации, тем самым обеспечивая пролонгированное взаимодействие компонентов вакцины с иммунной системой организма (депонирование), достаточное для индукции сильного и продолжительного иммунного ответа. Тем самым достигается получение эффективной иммуногенной композиции против туберкулеза, стабильной в течение продолжительного времени.
Изобретение проиллюстрировано следующими примерами, приведенными ниже. Генно-инженерные и микробиологические манипуляции, амплификацию и секвенирование ДНК проводили по стандартным методикам (T.Parish, N.G.Stoker. Mycobacterium tuberculosis protocols., Humana Press Inc., 2001, Methods in molecular Medicine, 54; Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д.Гловера, Пер. с англ., Москва, Мир, 1988; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988, Vol.239, No. 4839, pp.487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNAsequencing with chain-terminating inhibitors (DNA polymerase/nucleotide sequences/bacteriophage 4Х174). Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, Vol.74, No.12, pp.5463-5467).
Пример 1. Получение экспрессионной генетической конструкции pESAT6-DBD
а) Получение фрагмента гена белка sp-DBD с последующим его клонированном в вектор pQE6.
Фрагмент гена белка sp-DBD, содержащий Gly-Ser спейсер (последовательность №3) и последовательность декстрансвязывающего домена DBD из Leuconostoc citreum KM20 (последовательность №4), получали синтетическим путем в фирме Евроген. Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок sp-DBD, была спланирована с использованием оптимальных кодонов для экспрессии в Е. coli с учетом отсутствия выраженной вторичной структуры мРНК.
Для клонирования гена белка sp-DBD плазмидный вектор pQE6 и синтезированную в фирме Евроген плазмиду pAT-sp-DBD гидролизовали эндонуклеазами рестрикции NcoI и Kpn2I при 37°С в буфере, содержащем 33 мМ Трис-ацетата (рН 7,9 при 37°С), 10 мМ ацетата магния, 66 мМ ацетата калия и 0,1 мг/мл BSA в течение 1 ч. В 1,2% агарозном геле проводили разделение продуктов рестрикции. Выделенный из агарозного геля фрагмент вектора pQE6 (размером 3016 п.н.) объединяли с фрагментом плазмиды pAT-sp-DBD (464 п.н.). Далее фрагменты дотировали при 25°С в буфере, содержащем 40 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, 0,5 мМ АТФ (рН 7,8 при 37°С) с помощью ДНК лигазы бактериофага Т4 в течение 1 ч. Продукты реакции переосаждали при -20°С 96% этиловым спиртом с добавлением ацетата аммония в течение 1,5 ч. После переосаждения смесь растворяли в деионизированной воде. Методом электропорации полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма M15 [pREP4] (NalS, StrS, rifS, lac-, ara-, gal-, mtl-, F-, recA+, uvr+). После трансформации клоны отбирали на агаризованной среде LB, содержащей антибиотики ампициллин (50 мг/мл) и канамицин (25 мг/мл). Плазмидную ДНК из колоний выделяли методом щелочного лизиса; анализировали методом рестрикционного картирования эндонуклеазами рестрикции BglI, BglII, BspMII и NcoI. Отбирали клоны плазмидной ДНК psp-DBD (3480 п.н.), содержащие в своем составе последовательность гена белка sp-DBD. Первичную структуру полученных генно-инженерных конструкций подтверждали секвенированием.
б) Получение фрагмента гена белка ESAT6 с последующим его клонированном в плазмиду psp-DBD.
Фрагмент гена белка ESAT6 из М. tuberculosis получали синтетическим путем в фирме Евроген. Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок ESAT6, была спланирована с использованием оптимальных кодонов для экспрессии в Е. coli с учетом отсутствия выраженной вторичной структуры мРНК.
Для клонирования гена белка ESAT6-sp-DBD плазмиду psp-DBD и синтезированную в фирме Евроген плазмиду pAT-ESAT6 гидролизовали эндонуклеазами рестрикции NcoI-BamHI и NcoI-BglII, соответственно, при 37°С в буфере, содержащем 33 мМ Трис-ацетата (рН 7,9 при 37°С), 10 мМ ацетата магния, 66 мМ ацетата калия и 0,1 мг/мл BSA в течение 1 ч. В 1,2% агарозном геле проводили разделение продуктов рестрикции. Выделенный из агарозного геля фрагмент вектора psp-DBD (размером 3469 п.н.) объединяли с фрагментом плазмиды pAT-ESAT6 (284 п.н.). Далее фрагменты лигировали при 25°С в буфере, содержащем 40 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, 0,5 мМ АТФ (рН 7,8 при 37°С) с помощью ДНК лигазы бактериофага Т4 в течение 1 ч. Продукты реакции переосаждали при -20°С 96% этиловым спиртом с добавлением ацетата аммония в течение 1,5 ч. После переосаждения смесь растворяли в деионизированной воде. Методом электропорации полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма M15 [pREP4] (NalS, StrS, rifS, lac-, ara-, gal-, mtl-, F-, recA+, uvr+). После трансформации клоны отбирали на агаризованной среде LB, содержащей антибиотики ампициллин (50 мг/мл) и канамицин (25 мг/мл). Плазмидную ДНК из колоний выделяли методом щелочного лизиса; анализировали методом рестрикционного картирования эндонуклеазами рестрикции BglI, BglII, BspMII и NcoI. Отбирали клоны плазмидной ДНК pESAT6-sp-DBD (3753 п.н.), содержащие в своем составе последовательность гена белка ESAT6-sp-DBD. Первичную структуру полученных конструкций подтверждали секвенированием.
Пример 2. Конструирование штамма Е. coli - продуцента антигена М. tuberculosis, соединенного с декстрансвязывающим доменом.
Для получения штамма Е. coli - продуцента рекомбинантного белка ESAT6-DBD, клетки штамма Е. coli M15 [pREP4] трансформировали плазмидой pESAT6-DBD. Трансформированные клетки выращивали в 3,5 мл среды LB с ампициллином и канамицином при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм (около 2,5 ч). В культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 ч. Для контроля продукции рекомбинантных белков в штамме Е. coli M15 [pREP4, pESAT6-DBD] применяли метод электрофореза по Лэммли в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Разделение белков проводили в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) в стандартной системе буферов (электродный буфер: 25 мМ Tris-HCl, 192 мМ глицин, 0,1% додецилсульфат натрия, рН 8,3; буфер для геля: 375 мМ Трис-HCl, рН 8,8). По окончании электрофореза гели окрашивали 0,15% раствором Кумасси G250 в 25% изопропаноле и 10% уксусной кислоте и отмывали в 10% уксусной кислоте.
При сравнении спектра белков в штаммах Е.coli M15 [pREP4] и Е. coli M15 [pREP4, pESAT6-DBD] обнаруживали появление дополнительной белковой полосы. Молекулярная масса дополнительной полосы 26,4 кДа, соответствовала расчетной для белка ESAT6-DBD. Уровень синтеза белков в E. coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка-стандарта Unstained Protein Molecular Weight Marker («Fermentas», Литва).
Для проверки растворимости синтезируемого белка биомассу выращенного штамма (Е. coli M15 [pREP4, pESAT6-DBD]) подвергали разрушению в 1% TES буфере (25 мМ Трис-HCl, 5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 5 мг/мл лизоцим) при соотношении биомасса-буфер 1:2 и гомогенизировали до однородной массы. После центрифугирования пробы разделяли на 2 фракции: растворимых клеточных белков (надосадочная жидкость) и нерастворимых (осадок). Обе фракции подвергали разрушению в лизирующем буфере (0,05 М Трис-HCl, рН 6.8, 0,5% Triton Х-100, 0,5 М NaCl, 0,25 М MgCl2, 5 мг/мл лизоцим, 10 мг/мл PMSF, 20 мг/мл ДНКаза) в соотношении 1:1; гомогенизировали до однородной массы; прогревали при +95°С 15 мин. Результаты контролировали с помощью электрофореза по Лэммли. Было показано, что рекомбинантный белок ESAT6-DBD синтезируется в клетках Е. coli как в растворимой фракции, так и виде телец-включений.
Пример 3. Получение рекомбинантного белка ESAT6-DBD в свободном состоянии и в виде белка, иммобилизованного на декстране.
Для получения рекомбинантного белка культуру штамма Е. coli M15 [pREP4, pESAT6-DBD] выращивали в 1000 мл среды LB с ампициллином и канамицином при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 100 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 ч. Клетки осаждали центрифугированием при 5500 об/мин в течение 15 мин.
Осадок ресуспендировали в лизирующем буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 0,25 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 0,15 мМ PMSF, 0,1% Тритон-Х100, 0,5 мг/мл лизоцима, 20 мг/мл ДНКазы; из расчета 1 г биомассы на 4 мл буфера. Дополнительно суспензию обрабатывали ультразвуком 3 раза по 20 с. После центрифугирования при 16000 об/мин в течение 30 мин фракция нерастворимых клеточных белков оставалась в осадке, растворимых - в надосадочной жидкости.
Осадок (нерастворимая фракция) суспендировали в лизирующем буфере (50 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 10 мМ ЭДТА, 0,002 объема β-меркаптанола) и добавляли равный (по массе) объем мочевины. После перемешивания выдерживали на водяной бане при +37°С до полного растворения мочевины. Центрифугировали при 12000 об./мин 30 мин и отбирали надосадочную жидкость. Для очистки рекомбинантного белка надосадочную жидкость переносили на колонку с Sephadex G200 (декстран со сшивками). Элюцию белков с декстрана проводили градиентным раствором (8-2 М) мочевины и 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0). Для удаления мочевины образцы диализовали против PBS буфера при 25°С в течение ночи.
Растворимую фракцию белков использовали для иммобилизации на декстране. К надосадочной жидкости добавляли раствор декстрана 500 с концентрацией 50 мг/мл в физиологическом растворе; инкубировали при 25°С 1 ч. В иммобилизованном на сорбенте состоянии белки представляют собой суспензию.
Концентрацию белков в свободной и иммобилизованной форме определяли по Бредфорду при длине волны 595 нм. Образцы подвергали лиофилизации. Таким образом, были получены следующие комплексные препараты (иммуногенные композиции) (антиген-DBD, антиген-DBD-декстран), степень чистоты которых составила не менее 95%.
Пример 4. Оценка стабильности очищенного рекомбинантного белка
Оценка стабильности рекомбинантных белков, полученного путем слияния последовательности микобактериального белка ESAT6 и DBD Leuconostoc citreum или DBD Leuconostoc mesenteroides, проводилась с помощью электрофореза в 12% ПААГ. Препараты химерных белков ESAT6-DBD Leuconostoc citreum и ESAT6-DBD Leuconostoc mesenteroides хранились при температуре 0-4°С в течение 6 и 12 месяцев с даты лиофилизации. Исследования выявили, что белок ESAT6-DBD Leuconostoc mesenteroides менее стабилен, чем ESAT6-DBD Leuconostoc citreum и после 6 месяцев хранения начинается его денатурация (см. фиг.2, где 1. Рекомбинантный белок ESAT6-DBD L. mesenteroides после 6 месяцев хранения; 2. Рекомбинантный белок ESAT6-DBD L. mesenteroides после 12 месяцев хранения; М - маркер молекулярных масс; 3. Рекомбинантный белок ESAT6-DBD L. citreum после 6 месяцев хранения; 4. Рекомбинантный белок ESAT6-DBD L. citreum после 12 месяцев хранения).
Пример 5. Способ проверки иммуногенности комплексных препаратов антиген-DBD-декстран на мышах.
Самкам мышей инбредной линии С57В16 вводили подкожно с двухнедельным интервалом следующие препараты: 1) ESAT-6-DBD-декстран (10 мкг на мышь по содержанию ESAT-6); 2) DBD-декстран (10 мкг на мышь по содержанию DBD) - отрицательный контроль; 3) однократно вакцина BCG (106 КОЕ на мышь) - положительный контроль. Через 5 недель оценивали содержание в селезенках Т-лимфоцитов, продуцирующих ИФН-гамма в присутствии соответствующих антигенов в культуральной жидкости методом ELISPOT, с подсчетом клеток, реагирующих с антителами анти-ИФН-гамма, через 60 часов после начала культивирования. Результаты приведены в таблице:
| Таблица 1 | ||
| Иммуногенность рекомбинантного белка ESAT6-DBD | ||
| Вакцинация | Количество продуцентов ИФН-гамма на 1 млн. клеток селезенки | Количество продуцентов ИФН-гамма на 1 млн. клеток лимфатических |
| узлов | ||
| Без антигена в культуре | 27±1,2 | 30±1,3 |
| ЕЗАТ-6-DBD-декстран | 120±6,0 | 50±2,5 |
| BCG | 21,6±0,55 | 35,6±0,96 |
| DBD-декстран | 12±0,95 | 20±1,3 |
Результаты показывают, что вакцинация моноантигенами, связанными с декстраном через DBD-домен, приводит к специфической активации продуцентов ИФН-гамма. Вакцинация теми же антигенами, в тех же количествах, но без адсорбции на декстране, не вызывает иммунного ответа.
1. Рекомбинантная плазмида pESAT6-DBD, представленная нуклеотидной последовательностью №1, обеспечивающая экспрессию рекомбинантного белка ESAT6-DBD, состоящего из полноразмерного белка ESAT6 Mycobacterium tuberculosis, Gly-Ser спейсера, декстрансвязывающего домена декстрансукразы Leuconostoc citreum КМ20, размером 3753 п.н., состоящая из следующих структурных элементов: искусственный бактериальный оперон рекомбинантного белка ESAT6-DBD, включающий: промоторную область бактериофага Т5 (7-87 п.н.), ген рекомбинантного белка ESAT6-DBD (117-852 п.н.), нетранслируемую область терминации транскрипции (892-986 п.н.); бактериальный оперон бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину (2688-3548 п.н.); бактериальный участок инициации репликации типа ColEl (2466-2477 п.н.), обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах E. coli.
2. Рекомбинантный штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pESAT6-DBD], полученный трансформацией штамма Е. coli M15 [pREP4] плазмидой по п.1, продуцент белка ESAT6-DBD.
3. Способ получения иммобилизованного очищенного рекомбинантного белка ESAT6-DBD на декстране, включающий: выращивание клеток штамма Е. coli M15 [pREP4, pESAT6-DBD] по п.2; иммобилизацию белка ESAT6-DBD в составе клеточных экстрактов штамма Е. coli M15 [pREP4, pESAT6-DBD] на декстрановом сорбенте за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации с последующей отмывкой от несвязавшихся бактериальных белков, при этом происходит концентрирование целевого продукта и его очистка; выделение целевого продукта.
4. Рекомбинантный белок ESAT6-DBD с молекулярной массой 26,4 кДа, включающий полноразмерный белок ESAT6 с последовательностью №2, Gly-Ser спейсер с последовательностью №3, декстрансвязывающий домен декстрансукразы из L. citreum KM20 с последовательностью №4.
5. Иммуногенная композиция, содержащая белок по п.4 ESAT6-DBD, иммобилизованный на декстране, специфически активирующая Т-лимфоциты, синтезирующие ИФН-гамма при стимуляции антигенами микобактерий.
