Способ получения первичной культуры клеток почек новорожденных крольчат для репродукции вирусов

Авторы патента:

Фазлиахметов Равиль Галиахметович (RU)

Низамов Рамзи Низамович (RU)

Иванов Аркадий Васильевич (RU)

Хазиев Ленар Ринатович (RU)

Плотникова Эдие Миначетдиновна (RU)

Глаголева Ирина Сергеевна (RU)

C12N5/00 - Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них (размножение растений из тканевых культур A01H 4/00)

A61K35/23 - почки

Владельцы патента RU 2520868:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ предусматривает эвтаназию крольчат путем обезглавливания, удаление лапок, хвостов, снятие шкурок, вскрытие брюшной полости на уровне поясничных позвонков, извлечение почек, снятие капсулы органа, измельчение на кусочки величиной 1-3 мм. В качестве доноров первичный культуры клеток используют новорожденных крольчат 1-2-дневного возраста. Кусочки ткани отмывают от остатков крови солевым раствором Хенкса, подвергают дезагрегации в 0,25%-ном растворе трипсина путем предварительной инкубации кусочков при 37°C в течение 30-40 минут, клетки осаждают центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10 минут, супернатант сливают, а осадок ресуспендируют в ростовой среде, состоящей из среды Игла MEM, 0,5%-ного раствора лактальбумина (1:1) с рН 7,0-7,2 с 10% сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота или плодов коров, доводят концентрацию клеток до 5-7·10⁵ клеток/см³, затем добавляют антибиотик ципрофлоксацин по 100 Ед/мл. При этом определяют чувствительность первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных крольчат к респираторно-кишечным вирусам КРС, парвовирусам, герпесвирусам и парагриппу-3 путем установления титров вирусов в lg ТДЦ 50/мл. Способ позволяет повысить чувствительность к вирусам животных, улучшить биологическую активность культивируемых клеток и повысить выход вирусного материала. 3 табл., 3 пр.

Изобретение относится к биотехнологии при культивировании клеток животных. Первичные культуры клеток почек кроликов, используемые в качестве культивируемых субстратов, хотя и считаются достаточно эффективными объектами, однако они дорогостоящие, а существующие технологии их получения - несовершенны. Использование первичных культур клеток обусловлено более высокой чувствительностью их к вирусам по сравнению с перевиваемыми линиями клеток.

Известны способы получения первичной культуры клеток из легких (Опарин В.Н., Курносов А.Н. Получения и использование первичных культур клеток из постнатальных легких поросят //Актуальные вопросы вет. вирусологии. - Владимир. - 1976. - 4.1. - С.65-67), надпочечников (Сидоренко О.С., Божок Г.А., Легач Е.И. и др. - Получение первичной культуры клеток надпочечников новорожденных поросят // Трансплантология. - 2011. - №1. - С.248-251) и почек (Методы культивирования клеток / Под ред. Г.П. Пинаева. - Л., 1988. - 320 с.) поросят.

Общими для этих способов получения первичной культуры клеток являются следующие недостатки:

1. Использование в качестве доноров первичных культур клеток весьма дорогостоящих животных-поросят.

2. Поскольку для получения клеток используются целые органы, изначально первичная культура является неоднородной по своему клеточному составу и содержит клетки коры и мозгового слоя почек. К 3-м суткам культивирования монослой состоит, в основном, из фибробластоподобных клеток, а округлые гранулярные клетки (являющиеся скорее всего гормонопродуцирующими) из первичной культуры исчезают. Это может быть связано с тем, что дифференцированные гормонопродуцирующие клетки не способны к пролиферации и имеют ограниченное время существования. В то же время интенсивно пролиферирующие фибробласты приводят к быстрому истощению среды, конкурируя за питательные вещества с остальными типами клеток.

Наиболее близким по техническому решению и качественным параметрам является «Способ получения первичной культуры клеток почек кроликов 25-35-дневного возраста». Б. Митов, Р. Бостанджиева, и др. Проучване върху получаването на клетъчни култури от заешки бъбреци и чувствителността им към вирусни агенти по някой животни. // Ветеринарна медицина. - 2008. - София. - XII. - №1-2. - С.15-20, который взят нами в качестве прототипа предлагаемого изобретения.

Хотя данный способ считается самым лучшим для наработки вирусной биомассы, однако ему присущ ряд недостатков:

1. С увеличением возраста кроликов до 35 дней, степень покрытия клетками поверхности стекла или пластика за 14 дней составляет лишь 25-75%.

2. С увеличением пассажа субкультивирования наблюдается понижение чувствительности к вирусам, а к 11-у пассажу культура становится нечувствительной к ним.

3. Культура клеток почек до 6 пассажа более чувствительна к вирусу миксоматоза кроликов, чем культура после 6 пассажа и даже постоянная линия RK-13

4. Выращивание крольчат до 28-35-дневного возраста предполагает дополнительные экономические затраты на уход и содержание животных, что ведет к удорожанию себестоимости продукции.

Цель предлагаемого изобретения - повышение эффективности способа на всех этапах технологической цепи получения первичной культуры клеток почек новорожденных кроликов, репродукции вирусов и наработки вирусной массы.

Поставленная цель решается за счет существенного снижения возраста новорожденных крольчат, используемых в качестве доноров первичной культуры клеток, что ведет к значительному удешевлению себестоимости продукции с одновременным повышением чувствительности культур клеток к вирусам и выходу вирусной биомассы.

Способ получения первичной культуры клеток почек новорожденных крольчат для репродукции вирусов, включающий эвтаназию крольчат путем обезглавливания, удаление лапок, хвостов, снятие шкурок, вскрытие брюшной полости на уровне поясничных позвонков, извлечение почек, снятие капсулы органа, измельчение на кусочки величиной 1-3 мм, отличающийся с тем, что в качестве доноров первичный культуры клеток используют новорожденных крольчат 1-2-дневного возраста, кусочки ткани отмывают от остатков крови солевым раствором Хенкса, подвергают дезагрегации в 0,25%-ном растворе трипсина путем предварительной инкубации кусочков при 37°С в течение 30-40 минут, клетки осаждают центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10 минут, супернатант сливают, а осадок ресуспендируют в ростовой среде, состоящей из среды Игла MEM, 0,5%-ного раствора лактальбумина (1:1) с pH 7,0-7,2 с 10% сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота или плодов коров, доводят концентрацию клеток до 5-7·10⁵ клеток/см³, затем добавляют антибиотик ципрофлоксацин по 100 Ед/мл. Определяют чувствительность первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных крольчат к респираторно-кишечным вирусам КРС, парвовирусам, герпесвирусам и парагриппу-3 путем установления титров вирусов в lg ТДЦ 50/мл.

Существенным отличием способа получения первичной культуры клеток почек новорожденных кроликов для репродукции вирусов является то, что используют унифицированную технологию ее получения, позволяющую не только значительно уменьшить возраст используемых доноров первичной культуры клеток до 1-2 дней жизни, тем самым снизить себестоимость продукции, улучшить биологическую активность культивируемых клеток и повысить выход вирусного материала, используемого для производства лечебно-профилактических вирусных препаратов, что иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Зависимость степени и времени образования монослоя первичной культуры клеток почек кроликов от возраста доноров.

Для изучения степени и времени образования монослоя клеток почек новорожденных крольчат были использованы первичные культуры клеток, полученные предлагаемым и известным способами на 1, 2, 20, 25, 28, 30 и 35 дни после рождения крольчат.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1
Способы	Первичная культура клеток	Возраст доноров (дни)	Получена первичная культура	Монослой
степень (%)	время (дни)
Предлагаемый	ПК-1	1	+	97	8
	ПК-1	2	+	97	8
	ПК-2	1	+	100	10
ПК-2	2	+	100	10
Известный	ЗБ-8	20	-	25	6
	ЗБ-10	25	-	37	8
	ЗБ-5	28	+	75	14
	ЗБ-3	30	+	95	14
ЗБ-6	35	+	100	14

Из данных таблицы видно, что при использовании доноров предлагаемым способом, первичная культура была получена во всех случаях, в то время как при использовании известного способа она получена только на 28-35 сутки. Степень образования монослоя при предлагаемом способе составляет 97-100% за 8-10 суток, в то время как при использовании известного способа она достигает этого уровня только за 14 сут культивирования.

Пример 2. Определение зависимости эффективности культивирования почечных клеток новорожденных крольчат от числа пассажей.

Для определения зависимости культивирования клеток от числа пассажей, первичные культуры клеток подвергали 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 59-кратному пассированию их на питательных средах с последующим определением времени и степени образования монослоя клеток почек новорожденных крольчат от смены пассажей.

Таблица 2
Результаты субкультивирования первичной культуры клеток, почек кроликов, полученных предлагаемым и известным способами
Способ	Культуры клеток	Возраст доноров (дни)	Пассаж	Время(дни) образования монослоя	Степень(%)образования монослоя
Предлагаемый	ПК-1	1	59	9	100%
ПК-2	2	30	9	100%
Известный	ЗБ-6	35	52	14	100%
Известный	ЗБ-1	28	5	14	97%
ЗБ-8	20	3	14	25%

Из данных таблицы видно, что время, затраченное на образование монослоя при культивировании первичных культур в предлагаемом способе, меньше, чем в известном. Также как и степень образовавшегося монослоя значительно выше в предлагаемом способе.

Пример 3. Определение чувствительности первичной культуры клеток почек новорожденных крольчат к некоторым вирусам.

Для определения чувствительности первичных культур клеток почек новорожденных крольчат к вирусам, ростовые среды с указанными культурами клеток заражали паравирусом крупного рогатого скота, герпесвирусом типа-1 (ИРТ) - вакцинный штамм ТК-А (ВИЭВ)-В2 и вирусом парагриппа-3 («штамм ПТК-43-86»).

Результаты титрования чувствительности первично-трипсинизированный культуры почек новорожденных кроликов к использованным вирусам представлены в таблице 3.

Таблица 3
Чувствительность первичной культуры клеток почек новорожденных крольчат к некоторым вирусам
Вирус	Первичная культура клеток	Наличие ЦПД	lg ТЦД50/мл
		24 ч	48 ч	72 ч	1 пассаж	2 пассаж	3 пассаж
Герпесвирус типа I (вирус ИРТ)	ПК	+	+	+	1,5	4,0	4,25
ПГ-3	ПК	-	-	-	0,5	0,7	0
Парвовирус КРС типа I	ПК	-	-	-	-	-	-

Из данных таблицы видно, что использованные клетки нечувствительны к парвовирусу, о чем свидетельствовало отсутствие специфического цитопатического действия (ЦПД) в течение трех последовательных пассажей.

Первичная культура клеток почек новорожденных кроликов поддерживала репликацию вируса парагриппа-3 КРС на протяжении двух пассажей. Однако в последующих пассажах на этой системе репродукция вируса ПГ-3 не была регистрирована.

Герпесвирус типа I легко культивировался в монослое, его цитопатогенное действие отмечалось на 48-96 ч после заражения и характеризовалось специфическим ЦПД. С каждым последующим пассажем на клеточном монослое титр вируса возрастал и на третьем пассаже соответствовал lg ТЦД50/мл=4,25±0,1.

Кроме того, при данной плотности посева клеток (5-7·10⁵ клеток см³) образовался монослой через 8-9 дней с сывороткой крови взрослого КРС, а с сывороткой крови плодов коров через 6-7 дней после посева. Клетки, выращенные на среде Игла MEM в присутствии 0,5% раствора лактоальбумина (1:1) с 10% сывороткой крови, полученные по предлагаемому способу, более жизнеспособны; падение индекса пролиферации происходит медленнее, чем при выращивании на среде Игла MEM.

Отличительные признаки и полезной эффективность предлагаемого способа получения первичной культуры клеток новорожденных крольчат для репродукции вирусов сводится к следующему:

а) преимущества предлагаемого способа получения первичной культуры клеток новорожденных крольчат дают возможность ускорить технологической процесс в 17 раз, что ведет к снижению себестоимости продукции;

б) использование комбинированной питательной (ростовой) среды на основе среды Игла и 0,5%-ного раствора лактальбумина (1:1) позволяет сэкономить дорогостоящую и труднодоступную фетальную сыворотку и сыворотку крови КРС, что также позволяет значительно снизить себестоимость конечного продукта;

в) существенное увеличение выхода вирусного материала при использовании предлагаемой культуры клеток обеспечивает значительное ускорение технологического процесса производства вирусных биопрепаратов.

Способ получения первичной культуры клеток почек новорожденных крольчат для репродукции вирусов, включающий эвтаназию крольчат путем обезглавливания, удаление лапок, хвостов, снятие шкурок, вскрытие брюшной полости на уровне поясничных позвонков, извлечение почек, снятие капсулы органа, измельчение на кусочки величиной 1-3 мм, отличающийся с тем, что в качестве доноров первичный культуры клеток используют новорожденных крольчат 1-2-дневного возраста, кусочки ткани отмывают от остатков крови солевым раствором Хенкса, подвергают дезагрегации в 0,25%-ном растворе трипсина путем предварительной инкубации кусочков при 37°C в течение 30-40 минут, клетки осаждают центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10 минут, супернатант сливают, а осадок ресуспендируют в ростовой среде, состоящей из среды Игла MEM, 0,5%-ного раствора лактальбумина (1:1) с рН 7,0-7,2 с 10% сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота или плодов коров, доводят концентрацию клеток до 5-7·10⁵ клеток/см³, затем добавляют антибиотик ципрофлоксацин по 100 Ед/мл, определяют чувствительность первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных крольчат к респираторно-кишечным вирусам КРС, парвовирусам, герпесвирусам и парагриппу-3 путем установления титров вирусов в lg ТДЦ 50/мл.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения полипептида в культуре клеток млекопитающего (варианты) и среду для культивирования клеток млекопитающего.

Способ стимуляции цитотоксического иммунного ответа против клеток опухолевой линии аденокарциномы молочной железы, экспрессирующих специфические антигены, с помощью дендритных клеток, трансфецированных полиэпитопной днк-конструкцией // 2520091

Изобретение относится к иммунологии, медицине и биотехнологии. Предложен способ стимуляции специфического противоопухолевого иммунного ответа против клеток рака молочной железы с помощью дендритных клеток, трансфецированных полиэпитопной ДНК-конструкцией.

Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, способ его получения (варианты) и применения // 2519326

Предложенная группа изобретений относится к области медицины и ветеринарии. Предложен биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, содержащий носитель, по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую гены, кодирующие VEGF и/или SDF-1, и клетки, обеспечивающие репаративную регенерацию.

Способ получения антитела или его фрагмента с подпиткой (варианты) // 2518289

Изобретение относится к области получения рекомбинантных белков и касается способов их получения. Представлены способы получения антител, включающие: культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или его фрагмент, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток; подпитку клеток млекопитающего добавлением обогащенного гидролизатом раствора и обогащенного раствора базальной среды к культуре клеток, где обогащенный гидролизатом раствор содержит гидролизат продуктов растительного происхождения и 75-300 г/мл гидролизата дрожжей.

Антитела, специфично связывающиеся с рецепторами эпидермального фактора роста // 2518239

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителам, которые специфично связываются с рецепторами эпидермального фактора роста (EGFR), а также к ДНК, которые кодируют вариабельные области тяжелой цепи указанных антител, ДНК, которые кодируют вариабельные области легкой цепи указанных антител.

Способ культивирования мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга // 2517112

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, а также медицины. Предложен способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга.

Штамм диплоидных клеток легкого плода крупного рогатого скота для репродукции вирусов // 2515915

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и вирусологии и касается штамма диплоидных клеток легкого плода крупного рогатого скота. Охарактеризованный штамм выделен из легкого плода коровы и депонирован в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им.

Способ культивирования эксплантов атеросклеротических бляшек ex vivo // 2515371

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в кардиологии для исследования формирования и разрыва бляшек в контролируемых лабораторных условиях, наблюдения за жизнедеятельностью различных клеток в бляшке в заданных условиях и проведения сравнения ех vivo и in vivo.

Мутеины липокалина слезной жидкости, обладающие аффинностью к с-мет рецепторной тирозинкиназе человека и способы их получения // 2515063

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к мутеинам липокалина слезной жидкости человека, и может быть использовано в медицине. Мутеин липокалина слезной жидкости человека (hTLc) имеет обнаруживаемую аффинность связывания с рецепторной тирозинкиназой Met (c-Met) человека, или ее доменом, или фрагментом c-Met человека.

Способ получения лимфоцитов из тонкого кишечника мыши // 2514653

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к генной инженерии, и касается выделения жизнеспособных клеток из такого биологического материала, как стенка тонкого кишечника мыши.

Средство, обладающее антилитогенным действием, антилитал // 2484834

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству, обладающему антилитогенным действием. .

Органопрепарат // 2405548

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности, в частности к препарату для лечения пиелонефрита и гломерулонефрита. .

Способ лечения хронической и острой почечной недостаточности с помощью фетальных стволовых и прогениторных клеток // 2373942

Изобретение относится к медицине, в частности к клеточной медицине и нефрологии, и касается лечения почечной недостаточности. .

Средство, нормализующее функции почек, и способ его получения // 2302868

Средство, нормализующее функцию почек, и способ его получения // 2220732

Изобретение относится к медицине, а именно к производству лекарственных средств из животного сырья. .

Способ получения материала для укрытия раневой поверхности почки // 2186572

Изобретение относится к области медицины, а именно к урологии и хирургии, и может быть использовано при органосохраняющих операциях на почке. .

Способ выделения цистеиновых катепсинов из экстрактов тканей // 2126684

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской биохимии, и может быть использовано для выделения цистеиновых катепсинов из экстрактов тканей. .

Способ восстановления утраченного зуба и способ изготовления восстановительного материала // 2521195

Группа изобретений относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использована для изготовления восстановительного материала, используемого для восстановления области утраченного зуба в полости рта. Для этого помещают на носитель первую клеточную массу, образованную клетками/клеткой из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, и вторую клеточную массу, образованную другой клеткой/другими клетками из мезенхимальных либо эпителиальных клеток. При этом одну из мезенхимальных либо эпителиальных клеток получают из зубного зачатка и указанные клеточные массы располагают в тесном контакте друг с другом без смешивания. Выращивают указанные клеточные массы с формированием целого восстанавливаемого зуба или его зачатка. Затем определяют ориентацию целого восстанавливаемого зуба или его зачатка, сформированного выращиванием, что позволяет внедрить целый восстанавливаемый зуб или его зачаток в области утраченного зуба таким образом, чтобы коронковая часть зуба была направлена внутрь полости рта, при этом зубной зачаток или зуб используют в качестве восстановительного материала для получения эквивалента утраченного зуба в области утраченного зуба. Группа изобретений позволяет восстановить область утраченного зуба путем внедрения восстанавливаемого зубного зачатка или восстанавливаемого целого зуба, изготавливаемого указанным способом. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 пр.

Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью при раке молочной железы // 2521506

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам генерации антиген-специфических клеток с цитотоксической активностью против клеток рака молочной железы, и может быть использовано в медицине. Способ включает выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови пациента, разделение клеток на прилипающую и неприлипающую фракции, добавление к прилипающей фракции МНК ростовых факторов, нагрузку дендритных клеток антигенами опухолевого лизата in vitro, стимуляцию созревания дендритных клеток в течение последующих суток. При этом к полученным незрелым ДК добавляют лизат аутологичных опухолевых клеток в дозе 100 мкг/мл, а еще через 48 часов в течение последующих 24 часов вносят рчФНО-альфа в дозе 25 нг/мл. Затем проводят совместное культивирование зрелых активированных лизатом дендритных клеток и неприлипающей фракции МНК в соотношении 1:10 в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-12 в дозе 10 нг/мл и рекомбинантного человеческого интерлейкина-18 в дозе 100 нг/мл. Изобретение позволяет повысить уровень цитотоксической и интерферон-продуцирующей активности антиген-активированных дендритных клеток при сокращении сроков их культивирования. 4 табл.

Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток // 2522001

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ увеличения экспрессии MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. Способ включает этапы культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, в среде, содержащей достаточное количество ингибитора циклин-зависимой киназы, чтобы вызвать увеличение экспрессии MAFA. При этом в качестве ингибитора циклин-зависимой киназы используют этил-(6-гидрокси-4-фенилбензо[4,5]фуро[2,3-b])пиридин-карбоксилат. Изобретение может быть использовано в медицине. 2 з.п. ф-лы, 10 ил., 7 табл., 9 пр.

Средство для лечения ишемических поражений тканей и способ его применения // 2522778

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к средству для лечения ишемических поражений тканей, представляющему собой смесь с соотношением 1÷0,5-3 из двух культур мезенхимальных стволовых клеток, одна из которых модифицирована генетической конструкцией на основе вирусного вектора, обеспечивающего гиперпродукцию фактора роста эндотелия сосудов, а другая модифицирована генетической конструкцией на основе вирусного вектора, обеспечивающего гиперпродукцию ангиопоэтина, а также способу лечения ишемических поражений тканей посредством обкалывания ишемезированной ткани, и может быть использовано в медицине. Изобретение позволяет достичь эффективной васкуляризации и репарации ишемизированной ткани. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.