Симметричные диимины на основе камфоры - ингибиторы репродукции вируса гриппа (штамм a/california/07/09 (h1n1)pdm09)

Изобретение относится к новым симметричным дииминам на основе камфоры общей формулы 1a-f, которые являются ингибиторами репродукции вируса гриппа (штамм A/California/07/09 (H1N1) pdm09). В общей формуле 1a-f.

Соединения наряду с выраженной противовирусной активностью в отношении указанного вируса гриппа обладают низкой токсичностью. Химиотерапевтический индекс например соединений (1a-d) превышает таковой у известных препаратов сравнения в три и более раз. 1 табл., 8 пр.

 

Изобретение относится к медицине и фармацевтике, конкретно к биологически активным веществам, симметричным дииминам на основе камфоры формулы 1a-f, которые могут использоваться в качестве ингибиторов репродукции вируса гриппа (штамм A/California/07/09 (H1N1)pdm09).

Разработка новых лекарственных средств лечения и профилактики вирусных инфекций - одна из актуальных задач современной фармакологии и медицинской химии, поскольку глобализация, мобильность населения и характер передачи вирусных инфекций способствуют их активному распространению по всему миру. Эпидемия «птичьего» гриппа H5N1 (1997-2006) и затем пандемия гриппа 2009 г., вызванная вирусом свиного происхождения A(H1N1)pdm09, сделали настоятельно необходимой ревизию состояния проблемы с разработкой противовирусных препаратов [Киселев О.И. Химиопрепараты и химиотерапия гриппа. Санкт-Петербург, Росток, 2012].

Как показала практика, наиболее перспективным источником для разработки противовирусных лекарственных средств являются природные соединения [Advances in Antiviral Drug Design. Vol.5. Ed. by E. De Clercq. Publ. by Elsever, 2007]. Среди разрешенных в последние десятилетия для клинического использования в США новых лекарств около половины - это природные вещества и их химически модифицированные производные. Противовирусные средства для лечения гриппа представляют собой крайне ограниченную группу лекарственных препаратов, а для большинства из них известна лекарственная резистентность. Создание противовирусных препаратов - это ближайшая перспектива развития медицинской науки в области создания средств лечения и профилактики вирусных инфекций [Еропкин М.Ю., Зарубаев В.В. Современное состояние разработок новых антивирусных препаратов против гриппа и ОРВИ // Фармацевтический бюллетень - 2012. №1. - С 68].

Благодаря особенностям организации генома (отсутствие механизма коррекции ошибок репликации) и короткому жизненному циклу вирус гриппа обладает высокой скоростью мутаций. Как результат, антигенная структура вируса в высокой степени подвержена изменениям в результате селективного давления иммунной системы организма-хозяина. Кроме того, применение химиопрепаратов воспринимается вирусом как фактор селекции, в результате чего также происходит формирование устойчивых штаммов. Эти два процесса приводят к появлению вариантов вирусов, способных избегать как активности нейтрализующих антител, и тем самым ускользать от иммунного ответа организма, так и преодолевать действие химиопрепаратов, исходно направленных на определенный этап репродукции вируса. Сложность проблемы состоит в том, что каждый тип вируса имеет свой механизм приспособления к химическому препарату [Ison M.G. Antivirals and resistance: influenza virus // Current Opinion in Virology. - 2011. - V.1. P. 563-573]. Известно, что ингибировать репродукцию вируса гриппа можно на разных стадиях его жизненного цикла.

Основой современной химиотерапии гриппа является использование нескольких классов соединений, действие которых направлено на подавление репликации вируса гриппа (см. рис.1). Это ингибиторы нейраминидазы - Озельтамивир (Тамифлю) [Jong M.D., Thanh Т.Т., Khanh Т.Н., Hien V.M., Smith G.J.D., Chau N.V., Cam B.V., Qui P.T., Ha D.Q., Malik Peiris J.S., Hien T.T., Farrar J. Oseltamivir Resistance during Treatment of Influenza A (H5N1) Infection // N. Engl. J. Med. -2005. - V 25. P.2667-72.] и Занамивир (Реленза) [Collins 1 P.J., Hairel L.F., Lin Y.P., Liu J., Russell R.J., Walker P.A., Skehel J.J., Martin S.R., Hay A.J. Gamblin S.J. Crystal structures of oseltamivir-resistant influenza virus пеш-aminidase mutants // Nature 2008. - V.453 - P.1258.], они действуют на этапе почкования вновь синтезированных вирионов гриппа из оболочки клетки, блокируя отщепление частиц вирусного потомства от поверхности клеток. Практика применения ингибиторов нейраминидазы в лечении гриппа показала, что высокая эффективность этой группы препаратов ограничена ранней стадией инфекции. Рибавирин - противовирусный препарат широкого спектра действия с высокой ингибирующей активностью в отношении ДНК- и преимущественно РНК-содержащих вирусов [Leyssen P., Clercq E.D., Neyts J. The Anti-Yellow Fever Virus Activity of Ribavirin Is Independent of Error-Prone Replication // Mol. Pharmacol. - 2006. - V.69. - P.1461]. Являясь аналогом нуклеозидов, рибаверин эффективен в субтоксических концентрациях и системное его применение вызывает побочные реакции, в частности анемию и тератогенный эффект при употреблении во время беременности. В России в клинической практике при терапии гриппа рибаверин не используется.

Наиболее известными практическому здравоохранению противовирусными препаратами прямого действия на репликацию вирусов гриппа являются римантадин (α-метил-1-адамантилметиламина гидрохлорид) и амантадин (1-аминоадамантан) [Davies, W.L.; Grunert, R.R.; Haff, R.F.; McGahen, J.W.; Neumayer, E.M.; Paulshock, M.; Watts, J.C.; Wood, T.R.; Hermann, E.C.; Hoffmann, С.E. Antiviral Activity of 1-Adamantanamine (Amantadine) // Science. - 1964. - V.144. - P.862]. Данные соединения блокируют белок M2 вируса гриппа, играющий роль ионного канала в вирусной мембране, препятствуя тем самым процессу расщепления гемагглютинина и слияния мембран вируса и лизосомальной вакуоли [Scholtissek С., Quack G., Klenk H.D., Webster R.G. // Antiviral Res. 1998. - V.37. - P.83-95]. Механизм действия этих препаратов изучен достаточно полно [Cady S.D., Schmidt-Rohr К., Wang J., Soto C.S., DeGrado W.F., Hong M.H. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers // Nature. 2010. - Vol.463. - P.689-692].

Адамантаны как класс каркасных соединений явились стартовой основой в конструировании большого класса противовирусных препаратов [Zoidis G., Kolocouris N., Naesens L., Clercq E.D. Design and synthesis of 1,2-annulated adamantane piperidines with anti-influenza virus activity // Bioorganic & Medicinal Chemistry - 2009. - N.17. P.1534]. Наиболее близкими к классическим адамантанам являются каркасные соединения - бананины-ингибиторы репликации коронавируса SARS [Tanner J.A., Zheng B.J., Zhou J., Watt R.M., Jiang J.Q., Wong K.L., Lin Y.P., Lu L.Y., He M.L., Kung H.F., Kesel A.J. The Adamantane-Derived Bananins Are Potent Inhibitors of the Helicase Activities and Replication of SARS Coronavirus // Chemistry & Biology, - 2005. - V.12. P.303]. Каркасные соединения остаются привлекательными в качестве основы для дизайна противовирусных препаратов. Так, дейтифорин - (2-(Г-аминоэтил)бицикло[2.2.1]гептан, является одним из наиболее интересных препаратов на основе природных бициклических каркасных соединений - борнанов [Патент РФ №2448692. Киселев О.И., Тандура С.Н., Деева Э.Г. Фармацевтические соли аминобицикло[2.2.1]гептанов как ингибиторы транскрипционного фактора NF-KB с противовирусной активностью и их применение]. При этом важно подчеркнуть, что данное соединение фактически имеет природное происхождение, а борнеол и изоборнеол широко известны в народной медицине как противовоспалительные средства.

Задачей изобретения является расширение ассортимента ингибиторов репродукции вируса гриппа.

Задача решается новыми соединениями формулы la-f:

обладающими свойствами ингибиторов репродукции вируса гриппа.

Исследования биологической активности соединений 1a-f, проведенные в отношении вируса гриппа (штамм A/California/07/09 (H1N1)pdm09), показали их высокую эффективность как ингибиторов репродукции этого вируса. В результате исследований выявлено, что соединения 1a, b и 1d наиболее активно влияют на репродукцию вируса гриппа, что подтверждается приведенными ниже данными (Пример 8). Камфора является бициклическим терпеноидом с жестким типом остова, доступным как в правовращающих, так и в левовращающих энантиомерах.

Полученные количественные показатели ингибирования подтверждают высокую степень подавления репликации вируса гриппа в культуре клеток MDCK соединениями 1a-f, превышающую тот же показатель у эталонов сравнения - амантадина и римантадина в 5 и более раз. Использование в качестве препаратов сравнения адамантановых производных обусловлено наличием жестких структурных фрагментов как в полученных нами соединениях, так и в указанных препаратах. Наиболее активными являются симметричные диимины, имеющие алифатический линкер. Следует отметить, что длина алифатической цепочки в первую очередь влияет на токсичность соединений. Так, наименее токсичным является соединение 1d, имеющее в своем остове -C₁₂H₂₄- линкер.

Заявляемые соединения получают следующим образом:

В качестве исходных соединений для синтеза целевых веществ используют (+)-(1R)-камфору и диамины различного строения. Способ взаимодействия камфоры с 1,2-диаминэтаном, приводящий к образованию диастереометрически чистого диимина, в результате восстановления которого получают стереоселективный экзо-экзо диамин, в литературе описан [Caselli, A., Giovenzanna, G.В., Palmisano, G., Sisti, М., Pilati, Т.Synthesis of C₂-syrnmetrical diamine based on (1R)-(+)-camphor and application to oxidative aryl coupling of naphthols // Tetrahedron:Asymmetry - 2003 - V.14 - P.1451-1454]. В результате взаимодействия камфоры с алифатическими диаминами в одну стадию получают заявляемые диимины 1a-d. Реакции проводят в условиях азеотропной отгонки воды с использованием в качестве катализатора эфирата трехфтористого бора. Степень конверсии контролируют отбором проб и анализом по ГЖХ, ХМС. Соединения le,f получают при взаимодействии камфоры с ароматическими диаминами в среде тетраэтоксисилана, используемого в качестве дегидратирующего агента, как описано в методике [Love В.Е., Ren J. J. Synthesis of Sterically Hidered Imines // Org. Chem. - 1993 - V.58 - P.5556-5557]. Соединения 1a-f очищают колоночной хроматографией, все полученные вещества ранее в литературе не были описаны.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Получение N¹,N⁶-бис(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-илиден)гексан-1,6-диамина (1а)

К раствору 3 г (1R)-(+) камфоры (19.7 ммоль) в толуоле (30 мл) добавляют 1,6-диаминогексан (9.8 ммоль), 0.14 мл BF₃·Et₂O в 5 мл толуола. Реакцию ведут при постоянном кипении 28 ч, с помощью насадки Дина-Старка азеотропно удаляют воду. Контроль над реакцией осуществлялся по ГЖХ и ХМС. Реакционную смесь промывают насыщенным раствором NaCl, экстрагируют CH₂Cl₂, сушат Na₂SO₄, удаляют растворитель. Диимин 1a очищают методом колоночной хроматографии, элюент гексан/этилацетат (100:0→0:100)+метанол (1%), выделают с выходом 46%.

Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, δ, м. д): 0.70 s и 0.87 s (С⁸Н₃, С^8'Н₃ и С⁹Н₃, С^9'Н₃), 0.91 s (С¹⁰Н₃, С^10'Н₃), 1.13 ddd (H⁴ⁿ, H^4n', ²J 12.5, J_4n,5n 9.3, J_4n,5k 4.1 Гц), 1.24-1.32 м (2Н¹³, 2Н¹³, H⁵ⁿ, H^5'n), 1.50-1.57 м (2Н¹², 2Н^12'), 1.60 ddd (H^5k, H^5k', ²J 13.0, J_5k,4k 12.2, J_5k,_4m 4.1 Гц), 1.77 d (H²ⁿ, H^2'n, ²J 16.8 Гц), 1.75-1.83 м (H^4k, H^4'k), 1.87 dd (H³, H^3', J_3,2k=J₃,_4k=4.3 Гц), 2.27 ddd (H^2k, H^2'k, ²J 16.8, J_2k,3 4.3, J_2k,4k 3.2 Гц), 3.08-3.2 м (2H¹¹, 2H^11'). Спектр ЯМР ¹³C (CDCl₃), δ, м.д.: 180.99 s (C¹, С^1'), 35.211 (C², С^2'), 43.71 d (C³, С3^'), 27.371 (С⁴, С^4'), 32.09 t (С⁵, С^5'), 53.23 s (С⁶, С^6'), 46.66 s (С⁷, С^7'), 19.40 k и 18.83 k (С⁸, С^8' и С⁹, С^9'), 11.31 k (С¹⁰, С^10'), 52.191 (С¹¹, С^11'), 30.441 (С¹², С^12'), 27.311 (С¹³, С^13'). $${[\alpha ]}_D^{22}=18$$ (CHCl₃, с 1.0). Найдено: m/z 384.3499 [М]⁺ C₂6H₄₄N₂. Вычислено: M=384.3503.

Пример 2.

Получение N¹,N⁷-бис(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-илиден)гептан-1,7-диамина (1b).

К раствору 3 г (1R)-(+) камфоры (19.7 ммоль) в толуоле (30 мл) добавляют 1,7-диаминогептан (9.8 ммоль), 0.14 мл BF₃·Et₂O в 5 мл толуола. Реакцию проводят, как описано в примере 1, выдерживая реакционную смесь в течение 32 ч, выделяют соединение (1b) с выходом 65%.

Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, δ, м.д): 0.70 s и 0.87 s (C⁸H₃, C^8'H₃ и C⁹H₃, C^9'H₃), 0.91 s (C¹⁰H₃, C^10'H₃), 1.13 m (H⁴ⁿ, H^4n'), 1.18-1.32 м (2H¹³, 2H¹³, H⁵ⁿ, H^5'n, 2H¹⁴), 1.50-1.57 м (2H¹², 2H^12'), 1.60 м (H^5k, H^5k'), 1.77 d (H²ⁿ, H^2'n), 1.75-1.83 м (H^4k, H^4'k), 1.87 м (H³, H^3'), 2.27 м (H^2k, H^2'k), 3.08-3.2 м (2H¹¹, 2H^11'). Спектр ЯМР ¹³C (CDCl₃), δ, м.д.: 180.97 s (С¹, С^1'), 35.211 (С², С^2'), 43.73 d (С³, С^3'), 27.381 (С⁴, С^4'), 32.101 (С⁵, С^5'), 53.23 s (С⁶, С^6'), 46.67 s (С⁷, С^7'), 18.83 k (С⁸, С^8'), 19.40 k (С⁹, С^9'), 11.32 k (С¹⁰, С^10'), 52.26 t (С¹¹, С^11'), 30.391 (С¹², С^12'), 27.401 (С¹³, С^13'), 29.281 (С¹⁴). $${[\alpha ]}_D^{25}=20.7$$ (СНС1₃, c=0.66). Найдено: m/z 398.3656 [М]⁺ C₂₇H₄₆N₂. Вычислено: M=398.3653.

Пример 3

Получение N¹,N⁸-бис(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-илиден)октан-18-диамина (1c).

К раствору 3 г (1R)-(+) камфоры (19.7 ммоль) в толуоле (30 мл) добавляют 1,8-диаминооктан (9.8 ммоль), 0.14 мл BF₃·Et₂O в 5 мл толуола. Реакцию проводят, как описано в примере 1, выдерживая реакционную смесь в течение 35 ч, выделяют соединение (1c) с выходом 67%.

Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, δ, м.д): 0.69 s и 0.86 s (С⁹Н₃, С^9'Н₃ и С⁸Н₃, С^8'Н₃), 0.91 s (С¹⁰Н₃, С^10'Н₃), 1.13 двд (H⁴ⁿ, H^4n', ²J 12.3, J_4n,5n 9.3, J_4n,5k 4.2 Гц), 1.19-1.30 м (2Н¹³, 2Н¹³, 2Н¹⁴, 2Н¹⁴), 1.29 ddd (Н^5н, Н^5н', ²J 13, J _5н,4н 9.3, J _5н,4k 4.4 Гц), 1.47-1.56 м (2Н¹², 2Н^12'), 1.59 ддд (H^5k, Н^{5к' 2}J 13.0, J_5k,4k 12.2, J_5k,4н 4.2 Гц),), 1.77 д (H²ⁿ, H^2'n, ²J 16.7 Гц), 1.74-1.82 м (Н^4к, Н^4'к), 1.86 дд (Н³, Н^3' J_3,2k=J_3,4k=4.4 Гц), 2.27 ддд (H^2k, H^2'k, ²J 16.7, J_2k,3 4.4, J_2k,4k 3.2 Гц), 3.12 дт (H^11a, H^11'a, ²J 12.1, J_11a,₁₂ 7.3 Гц), 3.16 д.т (H^llв, Н^11'в, ²J 12.1, J_11в,12 7.3 Гц) Спектр ЯМР ¹³C (CDCl₃), δ, м.д.: 180.00 s (С¹, С^1'), 35.191 (С², С^2'), 43.71 d (С³, С^3'), 27.35 t (С⁴, С^4'), 32.07 t (С⁵, С⁵), 53.23 s (С⁶, С^6'), 46.66 s (С⁷, С^7'), 19.38 k и 18.81 k (С⁸, С^8' и С⁹, С^9'), 11.29 k (С¹⁰, С^10'), 52.22 t (С¹¹, С^11'), 30.37 t (С¹², С^12'), 27.33 t (С¹³, С^13'), 29.32 т (С¹⁴, С^14'). $${[\alpha ]}_D^{25}=-32.0$$ (CHCl₃, c=0.92). Найдено: m/z 412.3813 [М]⁺ C₂₈H₄₈N₂. Вычислено: M=412.3812.

Пример 4.

Получение N¹,N¹²-бис(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-илиден)додекан-1,12-диамина (1d).

К раствору 3 г (1R)-(+) камфоры (19.7 ммоль) в толуоле (30 мл) добавляют 1,12-диаминододекана (9.8 ммоль), 0.14 мл BF₃·Et₂O в 5 мл толуола. Реакцию проводят, как описано в примере 1, выдерживая реакционную смесь в течение 48 ч, выделяют с выходом 41%.

Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, δ, м. д): 0.71 s и 0.88 s (C⁸H₃, C^8'H₃ и C⁹H₃, C^9'H₃), 0.92 s (C¹⁰H₃, C^10'H₃), 1.15 ddd (H⁴ⁿ, H^4n', ²J 12.2, J_4n,5n 9.3, J_4n,5k 4.2 Гц), 1.18-1.28 м (2H¹³, 2H^13', 2H¹⁴, 2Н^14' 2Н¹⁵, 2Н^15', 2Н¹⁶, 2Н^16'), 1.30 ddd (Н^5н, Н^5н', ²J 12.8, J_5k,4k 9.3, J_5h,_4k 4.3 Гц), 1.49-1.57 м (2Н¹², 2Н^12'), 1.61 ddd (H^5k, H^5k', ²J 12.8, J_5k,4k 12.2, J_5m,4Н 4.1 Гц), 1.78 d (H²ⁿ, H^2'n, ²J 16.8 Гц), 1.76-1.84 м (H^4k, H^4'k), 1.88 dd (H³, H^3', J_3,2k=J_3,4k=4.4 Гц), 2.28 ddd (H^2k, H^2'k, ²J 16.8, J_2k,3 4.3, J_2k,4k 3.2 Гц), 3.13 д.т (H^11a, H^{11'a 2}J 12.1, J_11a,12 7.3 Гц), 3.17 д.т (Н^11в, H^n'в, ²J 12.1, J_11в.12 7.3 Гц). Спектр ЯМР ¹³C (CDCl₃), δ, м.д.: 180.98 s (C¹, С^1'), 35.23 t (С², С^2'), 43.75 d (С³, C^3'), 27.401 (С⁴, С^4'), 32.11 t (С⁵, C^5'), 53.25 s (С⁶, С^6'), 46.68 s (С⁷, С^7'), 18.85 k (С⁸, С^8') 19.41 k (С⁹, С^9'), 11.33 k (С¹⁰, С^10'), 52.261 (С¹¹, С^11'), 30.421 (С¹², С^12'), 27.411 (С¹³, С^13'), 29.38 t (С¹⁴, С^14'), 29.46 t (С¹⁵, С^15'), 29.49 t (С¹⁶, С^16'). $${[\alpha ]}_D^{25}=-32.7$$ (CHCl₃, с=0.8). Найдено: m/z 468.4435 [М]⁺ C₃₂H₅₆N₂. Вычислено: M=468.4435.

Пример 5.

Получение N,N'-4,4'-метиленбис(N-(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-илиден)анилина (1e).

К 3 г (19.8 ммоль) камфоры добавляют 1.95 г (9.9 ммоль) 4,4'-метилендибензенамина и 0.1 мл конц. H₂SO₄, 4.1 мл (19.8 ммоль) Si(OEt)₄, кипятят 10 ч в атмосфере аргона. Удаляют остатки спирта, который образовывался из тетраэтоксисилана отгонкой на ротационном испарителе, добавляют насыщенный раствор NaHSO₃, экстрагируют эфиром. Органический слой сушат MgSO₄, удаляют растворитель. Далее в реакционную смесь добавляют 4 мл 1 М КОН и 20 мл EtOH. Перемешивают в течение 20 мин, затем отфильтровывают образовавшиеся силикаты, органический слой промывают насыщенным раствором NaCl, экстрагируют эфиром, сушат Na₂SO₄. Удаляют серный эфир, получают 3.8 г реакционной смеси. Колоночной хроматографией на 40 г SiO₂, элюент гексан/этилацетат (100:0→0:100)+метанол(1%) выделяют диимин (1e) с выходом 41%.

Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, δ, м.д): 0.83 s и 0.94 s (С⁸Н₃, С^8'Н₃ и С⁹Н₃, С^9'Н₃), 1.06 s (С¹⁰Н₃, С^10'Н₃), 1.17-1.25 м (H⁴ⁿ, Н^4'п) м 1.52-1.46 (H⁵ⁿ, H^5'n), м 1.70-1.77 (H²ⁿ, H^2'n, H^5k, H^5k') м 1.81-1.88 (H^4k, H^4k, Н³), м 2.15-2.22 (H^2k,H^2k'), s 3.87 (2Н¹⁷), м 6.63 (н^{13,15,13',15'}), м 7.04 (Н^12,16,12'16'). Спектр ЯМР ¹³C (CDCl₃), δ, м.д.: 184.43 s (C¹, С^1'), 36.141 (С², С^2'), 43.71 d (С³, С^3'), 27.341 (C⁴, С^4'), 31.971 (С⁵, С^5'), 53.81 s (С⁶, С^6'), 46.99 s (С⁷, С^7'), 18.93 k (С⁸, С^8') 19.45 k (С⁹, С^9'), 11.12 k (С¹⁰, С^10'), 150.01 s (С¹¹, С^11'), 119.37 d (С¹², С^12'), 129.24 d (С¹³, С^13'), 137.86 s(C¹⁴, С^14'), 129.24 d (С¹⁵, С^15'), 119.37 d (С¹⁶, С^16') 40.58 t (С¹⁷), $${[\alpha ]}_D^{30}=29$$ (CHCl₃, c=0.6). Т_пл=129-130°C. Найдено: m/z 466.3343 [М]⁺ C₃₃H₄₂N₂. Вычислено: M=466.3347

Пример 6.

Получение N-(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-илиден)-4-(4-(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-илиденамино)фенокси)анилина (1f).

К 3 г (19.8 ммоль) камфоры добавляют 1.95 г (9.9 ммоль) 4,4'-оксидибензенамина и 0.1 мл конц. H₂SO₄, 4.1 мл (19.8 ммоль) Si(OEt)₄, кипятят 10 ч в атмосфере аргона. Дальнейшую обработку реакции проводят, как описано в примере 5. Соединение (1f) выделяют с выходом 46%.

Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, δ, м.д): 0.83 s и 0.94 s (С⁸Н₃, С^8'Н₃ и С⁹Н₃, С^9'Н₃), 1.07 s (С¹⁰Н₃, С^10'Н₃), 1.19-1.26 м (H⁴ⁿ, H^4'n) м 1.53-1.46 (H⁵ⁿ, H^5'n), м 1.70-1.80 (H²ⁿ, H^2'n, H^5k, H^5k) м 1.81-1.92 (H^4k, H^4k, Н³), м 2.18-2.25 (H^2k, H^2k), м 6.68 (Н^{13,15,13',15'}), м 6.89 (Н^{12,16,12',16'}). Спектр ЯМР ¹³C (CDCl₃), δ, м.д.: 184.94 s (C¹, С^1'), 36.141 (С², С^2'), 43.70 d (С³, С^3'), 27.31 t (С⁴, С^4'), 31.93 t (С⁵, С^5'), 53.86 s (С⁶, С^6'), 46.98 s (С⁷, C'), 18.89 k (С⁸, С^8'), 19.43 k (С⁹, С^9'), 11.10 k (С¹⁰, С^10'), 147.29 s (С¹¹, С^11'), 120.53 d (С¹², С^12'), 118.98 d (С¹³, С^13'), 153.36 s (С¹⁴, С^14'), 118.98 d (С¹⁵, С^15'), 120.53 d (С¹⁶, С^16'). $${[\alpha ]}_D^{31}=\mathrm{30,3}$$ (CHCl₃, c=0.56). Т_плав=165С*. Найдено: m/z 468.3138 [M]⁺ $$C_{32}{H}_{40}{N}_2^{+}$$ . Вычислено: M=468.3135.

Пример 7.

Изучение токсичности препаратов.

Токсичность продуктов была изучена в отношении клеток MDCK. Клетки MDCK сеяли в 96-луночные планшеты и культивировали при 37°C в среде MEM с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота в атмосфере 5% CO₂ (в газопроточном инкубаторе Sanyo-175) до состояния монослоя. Из исследуемых препаратов готовили маточный раствор концентрации 10 мг/мл в диметилсульфоксиде, после чего готовили серию двукратных разведений препаратов в среде MEM от 1000 до 3,75 мкг/мл. Растворенные препараты вносили в лунки планшетов и инкубировали 2 суток при 37°C. По истечении этого срока клетки промывали 2 раза по 5 мин фосфатно-солевым буфером, и количество живых клеток оценивали при помощи микротетразолиевого теста (МТТ). С этой целью в лунки планшетов добавляли по 100 мкл раствора (5 мг/мл) 3-(4,5-диметилтиазолил-2)2,5-дифенилтетразолия бромида (ICN Biochemicals Inc., Aurora, Ohio) на физиологическом растворе. Клетки инкубировали при 37°C в атмосфере 5% СО₂ в течение 2 ч и промывали 5 мин фосфатно-солевым буфером. Осадок растворяли в 100 мкл на лунку ДМСО, после чего оптическую плотность в лунках планшетов измеряли на многофункциональном ридере Victor 1420 (Perkin Elmer, Finland) при длине волны 535 нм. По результатам теста для каждого продукта определяли 50% цитотоксическую дозу (CTD₅₀), т.е. концентрацию препарата, вызывающую гибель 50% клеток в культуре. Результаты приведены в таблице.

Пример 8.

Противовирусная активность препаратов.

Определение противовирусной активности препаратов проводили на клетках MDCK в 96-луночных планшетах для клеточных культур. Соединения растворяли в поддерживающей среде для клеток, вносили в лунки панелей с клеточным монослоем и инкубировали в течение 1 ч при 36°C в атмосфере 5% CO₂.

Из вируссодержащей жидкости (штамм A/California/07/09 (H1N1)pdm09) готовили серию десятикратных разведении от 10^-1 до 10^-7, добавляли в лунки с препаратами и инкубировали при 36°C в течение 48 ч в атмосфере 5% CO₂. По окончании срока инкубации 100 мкл культуральной жидкости смешивали с равным объемом 1% куриных эритроцитов в отдельных планшетах с круглым дном. Учет результатов проводили через 60 мин инкубации при 20°C. За титр вируса принимали величину, обратную десятичному логарифму наибольшего разведения исходного вируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации в лунке, и выражали в количестве 50% инфекционных доз (ID₅₀). Вирусингибирующее действие исследуемых соединений оценивали по снижению титра вируса в опыте по сравнению с контролем. На основании полученных данных рассчитывали 50% ингибирующую дозу ED₅₀, то есть концентрацию препарата, снижающую уровень вирусной репликации вдвое (на 0,3 lg ID₅₀), и химиотерапевтический индекс или индекс селективности (SI), представляющий собой отношение CTD₅₀ к ED₅₀.

В процессе исследования ингибирования репродукции вируса гриппа соединениями la-f и эталонами сравнения (амантадином и римантадином) были получены результаты, приведенные в таблице.

Таким образом, заявляемые соединения проявляют выраженную противовирусную активность наряду с низкой токсичностью. Химиотерапевтический индекс соединений (1a-d) превышает таковой у препаратов сравнения в три и более раз. Преимуществом перечисленных соединений является их активность в отношении римантадин-устойчивого штамма вируса гриппа A/California/07/09 (HlNl)pdm09, что свидетельствует о перспективности их применения для терапии современных эпидемически актуальных вирусов, подавляющее большинство которых устойчивы к римантадину.

Таблица.
Соединение	Формула	CTD50, мкг/мл	EC50, мкг/мл	SI
1a		517	5,8	89
1b		>500	9,1	55
1c		161	10,0	16
1d		1039	21,1	49
1e		>500	164	3
1f		>500	175	3
	Амантадин	42.9	9.7	4
	Римантадин	60	12	5

Симметричные диимины на основе камфоры формулы 1a-f,

проявляющие свойства ингибиторов репродукции вируса гриппа (штамм A/California/07/09 (H1N1)pdm09).