Мутантная формиатдегидрогеназа (варианты)

Авторы патента:

Алексеева Анастасия Александровна (RU)

C12N15/52 - гены, кодирующие ферменты или проферменты

Владельцы патента RU 2522819:

Общество с ограниченной ответственностью "Инновации и высокие технологии МГУ" (RU)

Изобретение относится к области генной и белковой инженерии и представляет собой три новые мутантные формы растительной формиатдегидрогеназы, обладающие улучшенными свойствами по сравнению с белком дикого типа. В первом из предложенных мутантных белков природный остаток фенилаланина в положении, соответствующем положению 290 в последовательности формиатдегидрогеназы из сои Glycine max, заменен на остаток аспарагина. Во второй мутантной форме фермента этот же природный остаток фенилаланина 290 заменен на остаток аспарагиновой кислоты, а в третьей - на остаток серина. Изобретение позволяет получить улучшенные варианты формиатдегидрогеназы с повышенной термостабильностью. 3 н.п. ф-лы, 3 табл., 5 пр.

Изобретение относится к области генной и белковой инженерии и может быть использовано в процессах синтеза оптически активных соединений или физиологически активных веществ, детекции формиата, а также для получения стрессоустойчивых растений.

Получены три новые мутантные формы растительной формиатдегидрогеназы (ФДГ), обладающие улучшенными свойствами по сравнению с белком дикого типа. В первом из предложенных мутантных белков природный остаток фенилаланина в положении, соответствующем положению 290 в последовательности формиатдегидрогеназы из сои Glycine max, заменен на остаток аспарагина. Во второй мутантной форме фермента этот же природный остаток фенилаланина 290 заменен на остаток аспарагиновой кислоты, а в третьей - на остаток серина. Данные замены могут быть использованы в комбинации с другими мутациями, обеспечивающими приобретение формиатдегидрогеназами новых или улучшенных свойств.

Данное изобретение относится к новому белку, в частности к мутантным формиатдегидрогеназам из растений, которые обладают улучшенными свойствами по сравнению с соответствующим ферментом дикого типа, к ДНК, кодирующей мутантные формы формиатдегидрогеназы, к применению данных ферментов в системах синтеза оптически активных соединений или физиологически активных веществ, для детекции формиата, а также для получения стрессоустойчивых растений.

NAD⁺-зависимая формиатдегидрогеназа катализирует окисление формиата до углекислого газа при сопряженном восстановлении NAD⁺ до NADH.

ФДГ обладает высокой специфичностью к формиату, поэтому этот фермент успешно применяют для определения формиата в сложных смесях.

Реакция окисления формиат-иона является необратимой, продуктом является углекислый газ, который можно легко вывести из сферы реакции. Также ФДГ обладает широким рН-оптимумом активности. Поэтому формиатдегидрогеназа может быть эффективно использована для регенерации NADH в процессах синтеза оптически активных соединений с использованием дегидрогеназ. В качестве примера можно привести промышленный процесс получения терт-L-лейцина из триметилпирувата с использованием лейциндегидрогеназы с системой регенерации NADH на основе формиатдегидрогеназы из дрожжей Candida boidinii (Bommarius A.S., Schwarm M., Stingl K., Kottenhahn M., Huthmacher K. and Drauz K., Synthesis and Use of Enantiomerically Pure tert. - Leucine, Tetrahedron Asymmetry 1995, v.6, pp.2851-2888).

В настоящее время часто применяют способ, в котором процесс синтеза и регенерацию осуществляют непосредственно к бактериальной клетке. Так, ген ФДГ из дрожжей Candida boidini был экспрессирован в E.coli и использован в процессах синтеза ксилитола из ксилозы и S-1-(2-хлорфенил) этанола из о-хлорацетофенона (Mädje К., Schmölzer К., Nidetzky В., Kratzer R. Host cell and expression engineering for development of an E.coli ketoreductase catalyst: Enhancement of formate dehydrogenase activity for regeneration of NADH. Microb Cell Fact. 2012, v.11, pp.11-17).

Формиатдегидрогеназа найдена в бактериях, дрожжах, микроскопических грибах, а также растениях. Впервые формиатдегидрогеназная активность в растениях была обнаружена в 1921 г. (Thunberg Т. Sur la presence de certains ferments oxydants dans les grains de phaseolus vulgaris. Arch. int. Physiol., 1921, v.18, pp.601-606). В растениях ФДГ - это фермент стресса, синтез которого резко возрастает при таких стрессовых воздействиях, как засуха, повышенная доза ультрафиолета, резкие скачки температуры, нехватка кислорода и т.п. (Hourton-Cabassa С., Ambard-Bretteville F., Moreau F., Davy de V., Remy R., and Francs-Small С.С. Stress Induction of Mitochondrial Formate Dehydrogenase in Potato Leaves. Plant Physiol, 1998, v.116, pp.627-635; Suzuki K., Itai R., Suzuki K., Nakanishi H., Nishizawa N.K., Yoshimura E., and Mori S. Formate dehydrogenase, an enzyme of anaerobic metabolism, is induced by iron deficiency in barley roots. Plant Physiol, 1998, v.116, pp.725-732; Thompson P., Bowshеr C.G., and Tobin A.K. Heterogeneity of mitochondrial protein biogenesis during primary leaf development in barley. Plant Physiol, 1998, v.118, p.1089-1099; Andreadеli A., Flemetakis R., Axarli I., Dimou M., Udvardi M.K., Katinakis P., and Labrou N.E. Cloning and characterization of Lotus japonicus formate dehydrogenase: a possible correlation with hypoxia. Biochim. Biophys. Acta, 2009, v.1794, pp.976-984; David P., des Francs-Small C.C., Sevignac M., Thareau V., Macadre C., Langin Т., and Geffroy V. Three highly similar formate dehydrogenase genes located in the vicinity of the B4 resistance gene cluster are differentially expressed under biotic and abiotic stresses in Phaseolus vulgaris. Theor. Appl Genet., 2010, v.121, pp.87-103). Подробный обзор по физиологической роли, получению и свойствам ФДГ из растений был опубликован в 2011 году (Алексеева А.А., Савин С.С., Тишков В.И. NAD⁺-зависимая формиатдегидрогеназа растений. Acta Naturae, 2011, т.3, №4(11), с.40-56).

Многие из генов, кодирующих данные ферменты, были клонированы и секвенированы, поэтому их можно получать с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Последовательность кДНК, кодирующую формиатдегидрогеназу, встраивают в генно-инженерный вектор (плазмида, фаг и т.д.), который используют для трансформации микроорганизмов, например бактерий E.coli. Полученный рекомбинантный штамм используют для экспрессии желаемого ферментного продукта.

Для растительных формиатдегидрогеназ характерны низкие значения констант Михаэлиса по сравнению с ферментами из других источников. Одной из наиболее перспективных для практического применения формиатдегидрогеназ из растений является формиатдегидрогеназа из сои Glycine max (SoyFDH). Этот фермент был получен в активной и растворимой форме и он имеет самые низкие значения констант Михаэлиса по сравнению со всеми изученными формиатегидрогеназами на настоящий момент (Садыхов Э.Г., Серов А.Е., Ясный И.Е., Войнова Н.С., Алексеева А.А., Петров А.С., Тишков В.И. NAD⁺-зависимые формиатдегидрогеназы из Arabidopsis thaliana и сои: экспрессия в клетках E.coli и кинетические свойства рекомбинантных ферментов. Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия, 2006, т.47, N1, c.31-34).

Основными недостатками известных природных и рекомбинантных формиатдегидрогеназ из растений дикого типа является невысокая температурная стабильность этих ферментов. Таким образом, для успешного применения формиатдегидрогеназы из сои на практике необходимо повысить стабильность этого фермента. Одним из подходов для решения поставленной задачи является мутагенез аминокислотных остатков целевого белка.

Для бактериальных и дрожжевых ферментов в литературе описано много примеров успешного улучшения свойств методами белковой инженерии. Для повышения термостабильности формиатдегидрогеназы из бактерий Pseudomonas sp.101 (PseFDH) были использованы подходы, основанные на гидрофобизации α-спиралей (замены остатков Ser в α-спиралях на Ala) (Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V., and Tishkov V.I. Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the еnzyme thermal stability by hydrophobization of alpha-helices. FEBS Lett., 1999, v.445, pp.183-188), и снятия конформационных напряжений в полипептидной цепи (замены объемных Asn и Tyr на Gly) (Serov A.E. and Tishkov V.I. Role of Pro residues in stability of prokaryotic and euacaryotic formate dehydrogenases. Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия, 2002, v.43, pp.345-349; Serov A.E., Odintzeva E.R., Uporov I.V., and Tishkov V.I. Use of Ramachandran plot for increasing thermal stability of bacterial formate dehydrogenase. Biochemistry (Mosc.), 2005, v.70, pp.804-808). Поиск положений для мутагенеза был основан на данных рентгеноструктурного анализа и сравнении аминокислотных последовательностей ФДГ из разных источников. В результате единичной замены эффект стабилизации был небольшим - от 10 до 50%, но практически во всех случаях - аддитивным (Tishkov, V.I., Popov, V.O. Protein engineering of formate dehydrogenase. Biomolеcular Engineering 2006, v.23, N2-3, p.89-110. Мутации, повышающие операционную и температурную стабильность, были объединены в мутанте PseFDH GAV. В результате такого объединения сродство к NAD⁺ увеличилось в 2 раза, а температурная стабильность - в 2,5 раза, а операционная - более, чем в 1000 раз по сравнению с PseFDH дикого типа. Получение мутантных PseFDH с улучшенной термостабильностью позволило ввести в процесс очистки рекомбинантного фермента стадию термообработки. Нагревание бесклеточного экстракта при 60°С в течение 20-30 мин приводит к повышению чистоты препарата PseFDH GAV с 50 до 80-85% без потери ферментативной активности (Tishkov V.I. and Popov V.O. Protein engineering of formate dehydrogenase. Biomol. Eng., 2006, v.23, pp.89-110).

Также в литературе имеются данные по увеличению стабильности ФДГ из дрожжей С. boidini. В работе (Slusarczyk Н., Felber S., Kula M.R., and Pohl M. Novel mutants of formate dehydrogenase from Candida boidinii. US Patent Application Publication, 2003, US 2003/0157664) получен химически более стабильный мутант CboFDH SM с заменой Cys23Ser, который был гораздо устойчивее фермента дикого типа в растворах 150 мМ H₂O₂ и 50 мкМ CuSO₄, однако его термостабилытость уменьшилась в 6,7 раз (уменьшение Т_m на 5°С). Для компенсации потери стабильности использовали метод направленной эволюции. Были найдены 4 мутации, дающие наибольший эффект стабилизации (Glu151Asp, Arg178Ser, Lys306Arg, Thr315Asn), которые повысили термостабильность мутанта CboFDH_SM в 36 раз (увеличение Т_m на 10°С), а по сравнению с ферментом дикого типа - в 5,7 раз.

Техническая задача, решаемая посредством предлагаемого технического решения, состоит в получении мутантных форм формиатдегидрогеназы из сои Glycine max с улучшенными свойствами по сравнению с ферментом дикого типа.

Технический результат, получаемый при реализации предлагаемого технического решения, состоит в улучшении свойств полученной мутантной формы формиатдегидрогеназы из сои Glycine max по отношению к свойствам фермента дикого типа.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать рекомбинантную растительную формиатдегидрогеназу, в которой в качестве основы использована аминокислотная последовательность формиатдегидрогеназы из сои Glycine max дикого типа. Полная последовательность кДНК этого фермента (код доступа в базе GeneBank ВТ094321.1) содержит в начале нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид, необходимый для транспорта белка-предшественника формиатдегидрогеназы из цитоплазмы в митохондрии клеток растений. После попадания про-белка внутрь митохондрии этот пептид отщепляется с образованием активной формиатдегидрогеназы. В связи с отсутствием в бактериях митохондрии, вышеописанная посттрансляционная модификация белка-предшественника формиатдегидрогеназы невозможна. Поэтому для экспрессии в клетках Е.соli из последовательности кДНК формиатдегидрогеназы сои была удалена последовательность, кодирующая сигнальный пептид (31 аминокислотный остаток). В результате синтезируется активный рекомбинантный фермент дикого типа без дополнительной стадии посттрансляционной модификации (Алексеева А.А, Савин С.С., Тишков В.И. NAD⁺-зaвиcимaя формиатдегидрогеназа растений. Acta Naturae, 2011, т.3, №4(11), с.40-56).

В дальнейшем получение и преимущества полученной мутантной формиатдегидрогеназы будут рассмотрены с использованием примеров получения и реализации этого фермента.

Пример 1.

Получение мутантной формиатдегидрогеназы, в которой остаток Phe290 заменен на остаток Asn.

Направленный мутагенез проводили с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве матрицы для проведения направленного мутагенеза использовали плазмиду pSoyFDH. Плазмида pSoyFDH получена из коммерчески доступной плазмиды рЕТ21а (Novagen, США), в которую по сайтам рестрикции NdeI и EcoRI встроена кДНК формиатдегидрогеназы сои Glycine max без участка, кодирующего сигнальный пептид.

Для введения мутации Phe290Asn в ген формиатдегидрогеназы с использованием ПЦР применяли универсальные праймеры Т7 for и Т7 rev:

T7For 5' - TAATACGACTCACTATAGGG - 3'

T7 rev 5' - GCTAGTTATTGCTCAGCGG - 3',

а также прямой и обратный праймеры, несущие требуемую замену в триплете, кодирующем в гене soyfdh остаток Asn в положении 290:

SoyF290Nfor 5' - TGATGTTTGG AAC CCACAGCCAGCTCCAAA - 3'

SoyF290Nrev 5' - GGCTGTGG GTT CCAAACATCACCACTATAACCT -3'

Полужирным шрифтом с подчеркиванием выделены нуклеотидные замены, обеспечивающие мутацию Phe290Asn.

Реакцию ПЦР проводили в тонкостенной пластиковой пробирке объемом 0,5 мл («SSI», США). Для предотвращения испарения реакционной смеси и ее конденсации на крышке в пробирку добавляли 30 мкл минерального масла. Пробирку прогревали 5 мин при 95°С и затем проводили реакцию ПЦР по следующей программе: 1-я стадия - 95°С, 60 с; 2-стадия - 56°С, 60 с и 3-я стадия - 72°С, 2 мин, всего 25-35 циклов. После этого реакционную смесь выдерживали еще 10 мин при 72°С. Температуру на второй стадии выбирали на 3-5°С ниже Т_m температуры плавления дуплексов, образуемых праймерами.

Реакционная смесь для проведения ПЦР имела следующий состав (таблица 1):

Таблица 1
Условия проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР)
	10-кратный буфер для PFU Turbo ДНК-полимеразы (Fermentas, Литва)
2,5 мкл

	смесь dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), концентрация 2,5 мМ
2 мкл	смесь dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), концентрация 2,5 мМ

1 мкл	ДНК-матрица, концентрация ~10 нг/мкл
2 мкл	праймер 1, концентрация 10 нмоль/мл (Синтол, Россия)
2 мкл	праймер 2, концентрация 10 нмоль/мл (Синтол/Россия)
	PFU Turbo ДНК-полимераза (2,5 Ед/мкл) (Fermentas, Литва)
0,5 мкл	PFU Turbo ДНК-полимераза (2,5 Ед/мкл) (Fermentas, Литва)

	деионизованная вода, очищенная с использованием системы MilliQ (Millipore, США)
до 25 мкл

На первом этапе проводили две полимеразные цепные реакции с использованием следующих пар праймеров: 1) T7For+SoyF290Nrev и 2) SoyF290Nfor+T7Rev. В качестве матрицы использовали плазмиду pSoyFDH. Полученные продукты ПЦР, фрагмент 1 и фрагмент 2, очищали с использованием препаративного электрофореза в агарозном геле с применением предназначенных для этого наборов, например GeneJet Gel Extraction Kit (Fermentas, Литва). Затем проводили третью, объединяющую ПЦР с праймерами T7For и T7Rev, где в качестве ДПК-матрицы использовали полученные ранее фрагменты 1 и 2.

Продукт третьей ПЦР очищали аналогично фрагментам 1 и 2 и обрабатывали эндонуклеазами рестрикции KpnI и EcoRI в течение двух часов при 37°С, затем инкубировали рестрикционную смесь для инактивации рестриктаз в течение 20 минут при 65°С (использовали рестриктазы и буферные растворы фирмы Fermentas (Литва)). Затем полученные фрагменты ДНК очищали от коротких фрагментов препаративным электрофорезом в агарозном геле с последующей экстракцией нужной полосы из агарозы с использованием специального набора, например, GeneJet Gel Extraction Kit (Fermentas, Литва), и лигировали с фрагментом исходной плазмиды pSoyFDH, из которой расщеплением по тем же сайтам рестрикции KpnI и EcoRI был удален фрагмент гена soyfdh из G.max дикого типа.

Полученной после лигирования реакционной смесью трансформировали клетки Е.coli TG1 (генотип supE hsdΔ5 thi Δ(lасproAB) F'[traD36 proAB⁺ lacI^q lacZΔM15]) и выращивали в течение ночи при 37°С на твердой агаризованной среде LВ, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл (плазмида pSoyFDH содержит ген устойчивости к ампициллину).

Выросшие колонии инокулировали в 6-8 мл среды 2YT, содержащей 150 мкг/мл ампициллина, и растили при 37°С в течение 8-10 часов при аэрировании. Плазмидную ДНК выделяли из полученной культуры клеток с использованием предназначенного для этого набора, например GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва). Для контроля введения требуемых мутаций проводили секвенирование плазмидной ДНК в Центре коллективного пользования «Геном» (Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН). В результате из 5 выделенных плазмид все 5 содержали только требуемую замену Phe290Asn. Таким образом, была получена плазмида pSoyFDH_F290N, которая обеспечивала получение повой формиатдегидрогеназы SoyFDH Phe290Asn с заменой Phe290Asn.

Для получения мутантного фермента клетки E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus (генотип E.coli В F^- ompT hsdS(rB^- mB^-) dcm⁺ Tet^r gal λDE3)pLysS endA Hte [argU proL Cam^r]) трансформировали плазмидой pSoyFDFI_F290N, высевали на чашки Петри с агаризованной средой, содержащей анпициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (25 мкг/мл) и проводили их культивирование (см. ниже).

Пример 2.

Получение мутантной растительной формиатдегидрогеназы, и которой остаток Phe290 заменен на остаток Asp.

Данный пример идентичен примеру 1 за исключением того, что к качестве прямого и обратного праймеров, обеспечивающих введение замены Phe290Asp, использовали следующие дезоксирибоолигопуклеотиды:

Soy_F290Dfor 5' - TGATGTTTGG GAC CCACAGCCAGCTCCAAA - 3'

Soy_F290Drev 5' - GCTGTGG GTC CCAAACATCACCACTATAACCT - 3'

Полужирным шрифтом с подчеркиванием выделены нуклеотидные замены, обеспечивающие мутацию Phe290Asp.

Плазмида pSoyFDH с нуклеотидными заменами, обеспечивающими в гене фермента мутацию Phe290Asp, получила название pSoyFDH_F290D.

Для получения мутантного фермента клетки E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus (генотип Е.coli В F^- ompT hsdS(rB^- mВ^-) dcm⁺ Tet^r gal λ(DE3)pLysS endA Hte [argU proL Cam^r]) трансформировали плазмидой pSoyFDH_F290D, высевали на чашки Петри с агаризованной средой, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (25 мкг/мл) и проводили их культивирование (см. ниже).

Пример 3.

Получение мутантной растительной формиатдегидрогеназы, в которой остаток Phe290 заменен на остаток Ser.

Данный пример идентичен примеру 1 за исключением того, что в качестве прямого и обратного праймеров, обеспечивающих введение замены Phe290Ser, использовали следующие дезоксирибоолигонуклеотиды:

Soy_F290SFor 5' - GATGTTTGG TCC CCACAGCCAGCTCCAAA - 3'

Soy_F290SRev 5' - GCTGTGG GGA CCAAACATCACCACTATAACCT - 3'

Полужирным шрифтом с подчеркиванием выделены нуклеотидные замены, обеспечивающие мутацию Phe290Ser.

Плазмида pSoyFDH с нуклеотидными заменами, обеспечивающими в гене фермента мутацию Phe290Ser, получила название pSoyFDH_F290S.

Для получения мутантного фермента клетки E.coli BL 21 (DE3) pLysS Codon Plus (генотип E.coli В F^- ompT hsdS(rB^- mB^-) dcm⁺ Tet^r gal λ(DE3)pLysS endA Hte [argU proL Cam^r]) трансформировали плазмидой pSoyFDH_F290S, высевали на чашки Петри с агаризованной средой, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (25 мкг/мл) и проводили их культивирование (см. ниже).

Пример 4.

Изучение температурной стабильности мутантных форм формиатдегидрогеназы SoyFDH с заменами F290N, F290D, F290S и фермента дикого типа.

Для точной оценки эффекта изменения температурной стабильности за счет введенных замен мутантный фермент SoyFDH Phe290Asn и формиатдегидрогеназу дикого типа выделяли в высокоочищенном состоянии и определяли зависимость остаточной активности от времени инкубации при 56°С.

Методика получения высокоочищенных препаратов была одинакова как для мутантных SoyFDH Phe290Asn, SoyFDH Phe290Asp, SoyFDH Phe290Ser, так и для фермента дикого типа.

Экспрессию SoyFDH дикого типа и ее мутантов проводили к клетках E.coli BL21 (DE3) CodonPlus/pFysS. Для приготовления посевного материала с чашки отбирали единичную колонию и культивировали в течение 7-9 ч при 30°С и 180 об/мин до достижения величины поглощения на длине волны 600 нм А₆₀₀≈0,6-0,8 в 5 мл среды 2YT (дрожжевой экстракт 10 г/л, бактотриптон 16 г/л, хлорид натрия 5 г/л, рН 7.0) в присутствии 150 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл хлорамфеникола. Затем содержимое пробирок переносили в конические качалочные колбы с отбойниками объемом 1 л, содержащими 200 мл среды 2YT и 150 мкг/мл ампициллина и клетки культивировали при 30°С и 80-90 об/мин до достижения величины поглощения на 600 нм, А₆₀₀=0,6-0,8. Далее проводили индукцию клеток, добавляя в среду для культивирования раствор лактозы (300 г/л) до конечной концентрации индуктора 20 г/л. После индукции температуру культивирования снижали до 20°С и клетки культивировали в течение 17 ч при 120 об/мин. Полученную биомассу осаждали на центрифуге Beckman J-21 (США) при 7500 об/мин в течение 20 мин при 4°С и после удаления культуральной жидкости клетки ресуспендировали в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рH 8,0 в соотношении 1:4 (масс.). Полученную суспензию замораживали и хранили при -20°С.

Для выделения мутантных SoyFDH Phe290Asn, SoyFDH Phe290Asp, SoyFDH Phe290Ser, и фермента дикого типа 20% суспензию клеток в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рH 8,0 подвергали двум циклам заморозки-разморозки, и затем клетки разрушали с использованием ультразвукового дезинтегратора «Branson Sonifier 250» (Германия) при постоянном охлаждении. Осадок удаляли центрифугированием на центрифуге «Eppendorf 5804 R»(11000 об/мин, 30 мин).

Для очистки использовали модифицированную методику, разработанную для получения рекомбинантной ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101 (Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V., and Tishkov V.I. Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of alpha-helices. FEES Lett., 1999, v.445, pp.183-188). Процедура очистки фермента включала высаживание балластных белков сульфатом аммония (45% от насыщения), осаждение целевого белка при концентрации сульфата аммония 85% от насыщения и его последующее перерастворение в растворе, содержащем 45%) сульфат аммония в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0 (буфера А). Полученный супернатант использовали для гидрофобной хроматографии на Phcnyl Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) в нисходящем градиенте 45-0% концентрации сульфата аммония в буфере А и обессоливание на колонке с Сефадекс G-25 в том же буфере. Контроль чистоты полученных препаратов осуществлялся с помощью аналитического электрофореза в 12%) полиакриламидном геле в присутствии 0,1% додецильсульфата натрия на приборе для электрофореза MiniProtcan II фирмы «BioRad».

Активность ФДГ определяли спектрофотометрически по накоплению NADH на длине волны 340 им (ε₃₄₀=6220 М^-1 см^-1) на спектрофотометре «Schimadzu UV 1800 PC» при 30°С в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,0. Концентрация формиата натрия и NAD⁺ в кювете составляла 0,6 М и 0,2 мг/мл соответственно.

Термостабильность фермента измеряли в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,0. Для каждого эксперимента готовили серию из пластиковых пробирок объемом 0,5 мл по 100 мкл раствора фермента (0,2 мг/мл) в каждой. Пробирки помещали в предварительно прогретый до необходимой температуры водный термостат (52-56°С, точность термостатирования ±0,1°С). В определенные моменты времени отбирали по одной пробирке и переносили в лед на 5 мин, после чего пробирку центрифугировали в течение 3 мин при 12000 об/мин на центрифуге «Eppendorf 5415D». Остаточную активность ФДГ измеряли, как описано выше. Константу скорости термоинактивации k_in определяли как тангенс угла наклона прямой из графика зависимости натурального логарифма величины остаточной активности от времени (полулогарифмические координаты ln(A/A₀)-t) методом линейной регрессии, используя программу «Origin Pro 8.5».

В качестве параметра, характеризующего термостабильность, использовали константу скорости процесса термоинактивации. Результаты представлены в таблице 2. Как следует из таблицы 2, введение мутаций Phe290Asn, Phe290Asp, Phe290Ser, повышает стабильность формиатдегидрогеназы из сои при температуре 56°С в 10, 42 и 3,6 раза соответственно.

Таблица 2
Константы скорости термоинактивации формиатдегидрогеназы из сои дикого типа SoyFDH, а также мутантных форм SoyFDH Phe290Asn, SoyFDH Phe290Asp и SoyFDPhe290Ser
	Температура
Форма фермента	56°С

	k_in, мин^-1	k_in(wt)/k_in(mut)


SoyFDH дикого типа	(12,8±0,2)*10^-2	1


SoyFDH Phe290Asn	(1,29±0,02)*10^-2	10


SoyFDH Phe290Asp	(0,30±0,01)*10^-2	42


SoyFDH Phe290Ser	(3,6±0,1)*10^-2	3,6

Пример 5.

Определение кинетических и каталитических параметров мутантных форм формиатдегидрогеназы из сои, содержащих аминокислотные замены Phe290Asn, Phe290Asp и Phe290Ser.

Константы Михаэлиса по NAD⁺ и формиату определяли из зависимостей активности фермента от концентрации (0,4-6 К_М) соответствующего субстрата. Концентрация второго субстрата была насыщающей (>30 К_М). Точную концентрацию исходного раствора NAD⁺ определяли спектрофотометрически на длине волны 260 нм (ε₂₆₀=17800 М^-1 см^-1). Раствор формиата натрия с заданной концентрацией готовили, растворяя нужное количество субстрата к 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рH 7,0. Объем раствора доводили в мерной колбе. Значения К_М были рассчитаны из экспериментальных кривых с применением метода нелинейной регрессии, используя программу Origin Pro 8.5.

Для нахождения каталитических констант готовили несколько проб исследуемого фермента с различной концентрацией. Для каждой пробы определяли значения максимальной скорости и концентрацию активных центров. Концентрацию активных центров определяли из зависимостей тушения собственной флуоресценции фермента в комплексе с NAD⁺ при добавлении азид-иона как описано в (Романова Е.Г., Алексеева А.А., Пометун Е.В., Тишков В.И. Определение концентрации активных центров и каталитической константы рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои Glycine max. Вестник Московского Университета, Сер. 2: Химия, 2010, т.51, №3, с.156-159). Измерения проводили в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рH 7,0 на спектрофлуориметре Cary Eclipse (“Varian” США). Далее строили график зависимости максимальной скорости от концентрации активных центров и значение каталитической константы определяли как тангенс угла наклона прямой методом линейной регрессии, используя программу Origin Pro 8.5.

Результаты для полученных мутантных форм SoyFDH Phe290Asn, SoyFDH Phe290Asp, SoyFDH Phe290Ser и белка дикого типа представлены в таблице 3. Как следует из таблицы 3, замена фенилаланина на аспарагин в 290 положении не влияет на К_М но NAD⁺ и каталитическую константу.

Как видно из таблицы 3, замена Phe290Asp привела к увеличению каталитической константы на 76% и, как следствие, к увеличению каталитической эффективности с NAD⁺ в 2 раза.

Замена Phe290Ser привела к увеличению каталитической константы на 41%, а также к уменьшению константы Михаэлиса по NAD⁺ на 46%. Также из таблицы 3 следует, что для фермента с заменой Phe290Ser происходит увеличение каталитической эффективности с NAD⁺ в 2,5 раза. Все три замены в 290 положении приводят к увеличению К_М по формиату.

Таблица 3
Кинетические параметры мутантных SoyFDH и фермента дикого типа (0,1 М натрий - фосфатный буфер, pH 7,0)
Форма фермента	К_м ^formate, мМ	$К_{м}^{N A D^{+}}$ , мкМ	k_cat, с^-1	k_cat/К_м ^formate, (мМ*с)^-1	$k_{c a t} / К_{м}^{N A D^{+}}$ (мкМ*с)^-1
SoyFDH дикого типа
SoyFDH дикого типа	1,5±0,1	13,3±0,8	2,9±0,1	1,93	0,22

SoyFDH Phe290Asn
SoyFDH Phe290Asn	4,5±0,3	14,0±1,0	2,8±0,1	0,62	0,2

SoyFDH Phe290Asp
SoyFDH Phe290Asp	5,0±0,2	12,8±0,8	5,1±0,3	1,02	0,4

SoyFDH
SoyFDH	4,1±0,3	9,1±0,7	4,1±0,2	1,0	0,5

Phe290Ser

1. Мутантная формиатдегидрогеназа с улучшенными свойствами, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности формиатдегидрогеназы из Glycine max дикого типа, в которой остаток фенилаланина в положении 290 заменен остатком аспарагина.

2. Мутантная формиатдегидрогеназа с улучшенными свойствами, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности формиатдегидрогеназы из Glycine max дикого типа, в которой остаток фенилаланина в положении 290 заменен остатком аспарагиновой кислоты.

3. Мутантная формиатдегидрогеназа с улучшенными свойствами, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности формиатдегидрогеназы из Glycine max дикого типа, в которой остаток фенилаланина в положении 290 заменен остатком серина.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Сконструированы рекомбинантные штаммы Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ac-1937 и Rhodococcus erythropolis HX7 p16-Ami ВКПМ Ac-1938, конститутивно продуцирующие фермент ациламидазу с ацилирующей активностью.

Способ идентификации улучшенных вариантов белка // 2520808

Изобретение относится к способу идентификации улучшенных вариантов белка. Способ включает тестирование множества вариантов белка с единичными заменами в первом тесте первого свойства и во втором тесте второго свойства.

Новые гидрогеназы, выделенные из thermococcus spp., гены, кодирующие эти гидрогеназы, и способы продуцирования водорода с использованием микроорганизмов, содержащих указанные гены // 2499831

Изобретение относится к биотехнологии. Представлены ферменты: гидрогеназа и дегидрогеназа, выделенные из Thermococcus onnurineus NA1 и имеющие последовательности, приведенные в описании, а также кодирующие их гены.

Полученная из микроорганизма протеаза усовершенствованного типа, обеспечивающая свертывание молока // 2495931

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии. Представлена протеаза, обладающая усовершенствованной молокосвертывающей активностью, содержащая аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 80% идентичую SEQ ID NO: 3, где указанная протеаза имеет, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из: (а) замены глутамина, соответствующего глутамину в положении 265 в SEQ ID NO:3, на кислую аминокислоту; и (b) замены глутамина, соответствующего глутамину в положении 266 в SEQ ID NO:3, на кислую аминокислоту.

Способ получения и экспрессии кодирующей последовательности изоформы 2 гена реналазы человека // 2482185

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии для получения представляющих практический интерес белков, являющихся продуктами молчащих генов или генов с низким уровнем экспрессии.

Новая гидрогеназа seq id no:5, очищенная из thermococcus onnurienus na1 с помощью моноokcида углерода, кодирующие ее гены, и способы получения водорода с использованием микроорганизма, имеющего указанные гены // 2460789

Изобретение относится к биотехнологии. .

Промотор для тканеспецифической экспрессии генов в герминальных тканях млекопитающих // 2459870

Изобретение относится к биотехнологии и касается промотора для тканеспецифической экспрессии генов в герминальных тканях млекопитающих. .

Плазмида 40ph, определяющая синтез щелочной фосфатазы cmap, штамм e.coli rosetta(de3)/40ph - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной щелочной фосфатазы cmap, и способ ее получения // 2447151

Изобретение относится к области биохимии. .

Гены и белки для биосинтеза лантибиотика 107891 // 2441915

Изобретение относится к выделению молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют ферменты, необходимые для пути биосинтеза лантибиотика 107891 и его гомологов. .

Микроорганизм, обладающий способностью к продукции путресцина в высокой концентрации, способ получения этого микроорганизма и способ продукции путресцина с использованием этого микроорганизма // 2433180

Тест-система для скрининга ингибиторов протеинкиназы gsk3β; человека // 2528059

Изобретение относится к области молекулярной биологии и касается тест-системы для скрининга ингибиторов протеинкиназы GSK3β. Охарактеризованное изобретение представляет собой генетическую конструкцию, представленную на рис.2, полученную на основе экспрессионного вектора pET32a, и включающую ген каталитического домена протеинкиназы GSK3β, клонированного по сайтам эндонуклеаз рестрикции EcoRI и HindIII, и ген субстрата - аминогликозидфосфотрансферазы aphVIII из Streptomyces rimosus, клонированный по сайту эндонуклеазы рестрикции XbaI, в котором модифицирован сайт фосфорилирования AphVIII Ser-146 (AVAEGS146VDLED→ ASAEGS146VDLSD). Тест-система позволяет проводить прескрининг in situ ингибиторов GSK3β - низкомолекулярных соединений различных химических классов, способных проникать в клетки E.coli и грамположительных бактерий и может быть использовано в фармацевтике и медицинской химии, в частности в разработке, создании и валидации новых биомишеней и тест-систем с целью поиска химических соединений-лидеров, которые могут являться потенциальными кандидатами в лекарства для лечения заболеваний человека. 5 ил., 3 табл., 3 пр.

Штамм гриба penicillium verruculosum b10 egii продуцент эндо-1.3/1.4-β-глюканазы, целлюлазы, β-глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата // 2532840

Изобретения касаются штамма гриба Penicillium verruculosum B10 EGII и способа получения кормового комплексного ферментного препарата. Представленный штамм является продуцентом эндо-1,3/1,4-β-глюканазы, целлюлазы, β-глюкозидазы и ксиланазы. Получен на основе штамма Penicillium verruculosum ВКМ F-3764D, путем трансформации его плазмидами pSTA10 и pPrCBHI-EGII. В плазмиде pPrCBHI-EGII нуклеотидная последовательность структурного гена эндо-1,3/1,4-β-глюканазы Penicillium verruculosum совмещена с нуклеотидными последовательностями промоторной области, сигнального пептида и терминатора гена cbhI целлобиогидролазы I Penicillium verruculosum. Способ получения препарата, содержащего эндо-1,3/1,4-β-глюканазу, целлюлазу, β-глюкозидазу и ксиланазу включает культивирование штамма гриба Penicillium verruculosum B10 EGII на оптимизированной питательной среде в ферментере и фильтрацию, ультрафильтрацию и лиофилизацию культуральной жидкости. Охарактеризованные изобретения могут быть использованы для получения кормового комплексного ферментного препарата, обогащенного эндоглюканазой. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 5 пр.

Мутантный микроорганизм, продуцирующий янтарную кислоту, способ его получения и способ получения янтарной кислоты (варианты). // 2537003

Группа изобретений относится к продуцирующему янтарную кислоту мутантному микроорганизму, который способен использовать одновременно сахарозу и глицерин в качестве источников углерода. Мутантный микроорганизм получают путем ослабления механизма опосредуемой сахарозой катаболитной репрессии глицерина путем удаления гена, кодирующего фруктозофосфотрансферазу, или путем введения гена, кодирующего глицеролкиназу. Мутантный микроорганизм выбирают из группы, состоящей из Mannheimia sp., Actinobacillus sp. и Anaerobiospirillum sp. Предложены также способ получения мутантного микроорганизма и варианты способа получения янтарной кислоты с использованием указанного микроорганизма. Группа изобретений обеспечивает получение янтарной кислоты с высоким выходом 1,54 моль/моль. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 5 пр.

Универсальные раковоспецифичные промоторы и их использование в противоопухолевой терапии // 2539764

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к опухолеспецифичным промоторам, и может быть использовано в противоопухолевой терапии. Сконструированы опухолеспецифичные промоторы широкого спектра действия, обеспечивающие экспрессию терапевтического гена внутри раковой клетки. Изобретение включает также экспрессионные кассеты, экспрессионные векторы, фармацевтические композиции, способы лечения раковых заболеваний и применения экспрессионных кассет и векторов. Промоторы настоящего изобретения обеспечивают высокий уровень экспрессии функционально связанного с ними терапевтического гена в раковых клетках различного генеза, при этом экспрессия в нормальных клетках отсутствует или находится на низком уровне. 5 н. и 24 з.п.ф-лы, 19 ил., 4 табл., 20 пр.

Улучшенные вакцины против bordetella pertussis на основе мутантных гликозилтрансфераз lps // 2542667

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Представлена клетка-хозяин Bordetella pertussis, Bordetella bronchiseptica или Bordetella parapertussis, которая используется в качестве адъюванта или для профилактики или лечения коклюша, имеющая сниженную активность эндогенной гликозилтрансферазы с по меньшей мере 98% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 по сравнению с активностью гликозилтрансферазы соответствующего родительского штамма, где сниженная активность достигается применением инактивирующего вектора, который вызывает инактивацию экспрессии последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, или приводит к сниженному уровню экспрессии последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, слиянием последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, со слабым или индуцибельным промотором. Раскрыт препарат, состоящий из LPS из указанной клетки-хозяина с увеличенной заменой гексозамином 1' или 4' фосфатных групп части LPS, относящейся к липиду А, по сравнению с препаратом LPS из соответствующего родительского штамма, и посредством чего LPS характеризуется получением по меньшей мере 8 ионов в ESI-MS спектре, где препарат используется в качестве адъюванта или для профилактики или лечения коклюша. Предложено применение указанных клетки-хозяина или препарата LPS для получения лекарственного средства для профилактики и/или лечения коклюша, или получения лекарственного средства для иммунизации млекопитающего, где клетка-хозяин или LPS используются в качестве адъюванта. Описана фармацевтическая композиция, используемая в качестве адъюванта или для профилактики или лечения инфекции Bordetella, содержащая указанную клетку-хозяина или указанный препарат LPS в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение позволяет получить фармацевтический препарат клеток Bordetella или LPS, обладающий повышенной иммуногенностью по сравнению с препаратом из соответствующего родительского штамма Bordetella. 9 н. и 3 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 1 пр.

Мутантная рекомбинантная l-аспарагиназа wolinella succinogenes (варианты) // 2545722

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой мутантные варианты рекомбинантной L-аспарагиназы, характеризующиеся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности L-аспарагиназы бактерий Wolinella succinogenes, в которой аминокислотный остаток лизина в положении 24 заменен на остаток серина либо аминокислотный остаток валина в положении 23 заменен на остаток глутамина, а аминокислотный остаток лизина в положении 24 заменен на остаток треонина. Изобретение позволяет получить варианты L-аспарагиназы с улучшенной устойчивостью к протеолизу под действием трипсина по сравнению с немодифицированным рекомбинантным белком и различным уровнем глутаминазной активности при полном сохранении аспарагиназной активности, что делает их привлекательными объектами для разработки на их основе новых противоопухолевых терапевтических препаратов. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 11 пр.

Способ определения генотипа человека по полиморфизму в гене матриксной металлопротеиназы ммр9-1562 с>т (rs3918242) // 2548811

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения генотипа человека по полиморфизму в гене матриксной металлопротеиназы ММР9-1562 C>Т (rs3918242). Способ основан на снятии кривых плавления с флуоресцентно-мечеными аллель-специфичными олигонуклеотидными пробами. В способе используют общую для всех аллелей пару праймеров, отличающиеся для каждого аллеля флуоресцентно-меченые аллель-специфичные олигонуклеотидные пробы и универсальный олигонуклеотид, меченый гасителем флуоресценции следующего нуклеотидного состава: MMP9-1562s CGAAACCAGCCTGGTCAACG; ММР9-1562а TCTGCCTCCCGGGTTCAAGC; ММР9-1562р1 GGCGCACGCCTATAA-FAM; ММР9-1562р2 GGCGCATGCCTATAA-HEX; ММР9-1562pq BHQ1-ACCAGCTACTCGGGAGGC-3'-(P), где FAM - означает флуоресцентный краситель FAM, HEX - означает флуоресцентный краситель HEX, BHQ1 - означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции. Отнесение образца к гомозиготе или гетерозиготе по данному аллелю оценивается по форме кривых плавления ДНК - по максимуму первой производной графиков флуоресценции. Изобретение позволяет повысить надежность и доступность генотипирования. 1 ил.

Новая ацетил-coa-карбоксилаза // 2551779

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлена нуклеиновая кислота, кодирующая белок, обладающий ацетил-СоА- карбоксилазной активностью, компенсирующей недостаток ацетил-СоА-карбоксилазной активности в дрожжах, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность: (a) кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2; (b) которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, комплементарной SEQ ID NO:1; (c) SEQ ID NO:1; и (d) которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок SEQ ID NO:2; где SEQ ID NO:1 и 2 раскрыты в описании. Также описаны: ацетил-СоА-карбоксилаза (SEQ ID NO:2), повышающая содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина; рекомбинантный вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту; и клетка, которая трансформирована указанным вектором, предназначенные для получения композиции жирных кислот, содержащей повышенный уровень арахидоновой кислоты. Предложен способ получения композиции жирных кислот, включающий культивирование указанной клетки и сбор композиции жирных кислот из культуры трансформированных клеток. Изобретение позволяет получить композицию жирных кислот в клетке-хозяине с повышенным содержанием арахидоновой кислоты. 9 н. и 2 з.п. ф-лы, 8 ил., 5 табл., 8 пр.

Микроорганизм, экспрессирующий ксилозоизомеразу // 2553537

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен трансформированный микроорганизм - дрожжи Saccharomyces для получения этанола, где упомянутый микроорганизм трансформирован нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилозоизомеразу, и указанный микроорганизм трансформирован нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилулокиназу, или указанный микроорганизм трансформирован промотором, способным повышать экспрессию эндогенной ксилулокиназы. Указанный микроорганизм способен к более высокой активности ксилозоизомеразы; более высокой скорости роста в среде для роста или на среде для роста, содержащей ксилозу; более быстрому метаболизму ксилозы; и/или более быстрой продукции этанола при выращивании в анаэробных условиях на ксилозе в качестве источника углерода, чем у эквивалентного микроорганизма перед трансформацией. Описаны инокулят и культуральная среда, содержащие указанные трансформированные дрожжи и ксилозу или источник ксилозы. Предложен способ получения указанного трансформированного микроорганизма, включающий стадию трансформации микроорганизма нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилозоизомеразу, и либо нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилулокиназу, либо промотором, способным повышать экспрессию эндогенной ксилулокиназы. Раскрыт способ ферментации, включающий культивирование указанного микроорганизма в культуральной среде, содержащей ксилозу или источник ксилозы. Представлен способ получения биотоплива, содержащего этанол, где указанный способ включает стадию культивирования микроорганизма по настоящему изобретению в культуральной среде, содержащей ксилозу или источник ксилозы. Описано применение дрожжей по настоящему изобретению для получения этанола. Изобретение позволяет получать этанол с помощью указанного трансформанта в большем количестве, по сравнению с эквивалентным микроорганизмом до трансформации, на среде, содержащей ксилозу. 7 н. и 4 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 7 пр.

Полипептид, обладающий активностью d-лактатдегидрогеназы, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и способ получения d-молочной кислоты // 2553563

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен полипептид D-лактатдегидрогеназы, который содержит полипептид с аминокислотной последовательностью, которая характеризуется идентичностью по последовательности на уровне не менее 80% с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2, раскрытые в описании, где указанный полипептид обладает D-лактатдегидрогеназной активностью. Также представлены полинуклеотиды, кодирующие указанные полипептиды D-лактатдегидрогеназы; конструкция ДНК для экспрессии полинуклеотида, кодирующего D-лактатдегидрогеназу, в которой связаны указанный полинуклеотид и промотор, способный осуществлять экспрессию полинуклеотида. Описан трансформант, в частности трансформированные дрожжи, для получения D-молочной кислоты, в который введен полинуклеотид или конструкция ДНК по настоящему изобретению. Предложен способ получения D-молочной кислоты, который включает стадию культивирования указанного трансформанта. Изобретение позволяет получать D-молочную кислоту на повышенном уровне при помощи трансформанта по настоящему изобретению по сравнению с уровнем D-молочной кислоты, полученным с использованием нетрансформированной родительской клетки. 9 н. и 6 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 13 пр.