Тест-полоска для высокочувствительного иммунохроматографического анализа

Авторы патента:

G01N33/53 - иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого (препараты для терапевтических целей, содержащие антигены или антитела,A61K; гептены вообще, см. соответствующие рубрики в классе C07; пептиды, например протеины, вообще C07K)

Владельцы патента RU 2523393:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН Российской академии наук (ИНБИ РАН) (RU)

Изобретение относится к иммунологии, аналитической биохимии и диагностике и представляет собой тест-полоску для высокочувствительного иммунохроматографического анализа. В основе метода лежит контакт мембранной тест-полоски с анализируемой жидкой пробой и инициируемое этим контактом движение по мембранам тест-полоски реагентов, которые содержатся в пробе или нанесены на мембрану и в ходе взаимодействий в порах мембраны или на ее поверхности формируют иммунные комплексы. Интенсивность окраски метки, связавшейся в аналитической зоне, детектируется визуально. Предложенная система предназначена для иммунохроматографического определения в жидких пробах антител или антигенов. Отличительной особенностью предлагаемого способа проведения иммунохроматографического анализа является то, что мультимембранный композит тест-полоски содержит дополнительную мембрану с нанесенным на нее веществом, медленно растворяющимся в воде, например бычьим сывороточным альбумином (БСА), которая прикрепляется к тест-полоске сразу за мембраной с нанесенным коллоидным конъюгатом. Фронт жидкой пробы, преодолевая мембрану с коллоидным золотом, конъюгированным с реагентом для связывания аналита, останавливается, попадая на мембрану с БСА, до тех пор, пока БСА не растворится. В течение этого времени проба инкубируется с коллоидным конъюгатом, что приближает реакцию связывания аналита к положению равновесия и, таким образом, приводит к снижению предела обнаружения анализа. 2 ил., 1 пр.

Иммунохимический анализ может быть реализован в различных форматах. Однако, поскольку для массовых обследований первоочередное значение имеют скорость и производительность тестирования, в данной ситуации несомненными преимуществами обладает иммунохроматографический анализ, для которого все необходимые реагенты предварительно нанесены на мембранные компоненты тест-полоски и ее контакт с тестируемой пробой непосредственно инициирует движение фронта жидкости по мембранам, протекание специфических реакций и формирование иммунных комплексов, которые благодаря включению в их состав окрашенного маркера могут детектироваться визуально или с помощью оптического детектора (Рис.1). Проба, потенциально содержащая анализируемое соединение (аналит), под действием капиллярных сил перемещается вдоль тест-полоски. При этом она вначале взаимодействует с окрашенными частицами (коллоидное золото или иной маркер), на поверхности которых адсорбирован компонент, предназначенный для связывания с аналитом. Затем фронт жидкости преодолевает аналитическую (тестовую) зону, которая представляет собой участок мембраны со вторым компонентом для связывания аналита. Степень связывания маркера в тестовой зоне и, соответственно, интенсивность окрашивания мембраны определяются концентрацией аналита в пробе (Raphael С. Wong l Harley Y. Tse (Editors) Lateral Flow Immunoassay. Springer, New York, 2009.).

Основное преимущество иммунохроматографии заключается в скорости (время анализа 10-15 мин) и методической простоте анализа (анализ инициируется контактом тест-полоски с пробой и не требует от оператора никаких дополнительных действий). Однако, в силу того, что реакции проходят в проточном режиме, равновесие между иммунореагентами зачастую не достигается и значительная часть аналита не успевает связаться с коллоидным носителем, как следствие, предел обнаружения понижается. Для решения данной проблемы используется прединкубация пробы с коллоидным конъюгатом, которая может быть реализована несколькими способами: либо коллоидный конъюгат смешивается с пробой в отдельной емкости, инкубируется и затем наносится на тест-полоску, либо используется особая конструкция кассеты, в которую упаковывается тест-полоска, предусматривающая возможность предварительного смешения реагентов и дополнительных манипуляций для приведения реагентов в контакт с рабочей мембраной теста. Второй способ используется, например, в тест-системе ImmunoCAP™ Rapid (Phadia АВ) для серодиагностики аллергии на пыльцу растений (http://www.phadia.com/Global/A%20Document%20Library/Allergy/Promotion%20Material/IC%20Rapid/ImmunoCAP_Rapid_Test_Procedure_US.pdf). Данная тест-система снабжена специальной кассетой с двумя емкостями, в одной из которых смешивается проба с коллоидным конъюгатом и инкубируется в течение 5 мин, а во вторую емкость по истечении 5 мин добавляется смывающий раствор, который протекает через зону со смешанными конъюгатом и пробой и вместе с ними протекает дальше через рабочую мембрану.

В настоящей заявке предлагается альтернативный способ обеспечения прединкубации реагентов, для обеспечения которого не требуется ни использования специальных кассет, ни дополнительных манипуляционных стадий. Данный способ предполагает использование дополнительной стекловолоконной мембраны, которая находится в мультимембранном композите тест-полоски сразу после мембраны с нанесенным коллоидным конъюгатом и перед рабочей мембраной. На данную дополнительную мембрану наносится концентрированный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) (>10% по массе) и затем высушивается. Когда жидкая проба последовательно диффундирует через мембраны тест-полоски, она сначала попадает на подложку с коллоидным конъюгатом, инициируя реакцию аналита с иммобилизованным на поверхности коллоидных частиц компонентом для связывания данного аналита, затем фронт жидкости попадает на мембрану с высушенным БСА и замедляется, так как БСА забивает поры мембраны. В то время пока фронт жидкости медленно растворяет высушенный БСА происходит инкубация пробы с конъюгатом, после растворения БСА и освобождения пор мембраны жидкость продолжает течение и инициирует последующие стадии иммунохроматографического анализа.

Предложенный подход был реализован заявителями в системе для серодиагностики туберкулеза с использованием антигена 38 кДа (Ag78, antigen 5, PhoS, Rv0934) M tuberculosis. Ниже представлено описание способа получения тест-полосок и проведения иммунохроматографического анализа, а также полученные результаты.

Пример

Для формирования тест-системы использовали набор мембран «mdi Easypack» фирмы «Advanced Microdevices» (Индия), включающий рабочую мембрану CNPC-SN12 L2-P25 (размер пор 15 мкм), мембрану под конъюгат PT-R5, мембрану для нанесения образца GFB-R4, адсорбирующую мембрану АР 045, для нанесения БСА использовалась мембрана PT-R5.

На мембраны были нанесены следующие реагенты:

1. Белок А из Staphylococcus aureus, производства ООО «Имтек» (Россия).

2. Конъюгат коллоидного золота со средним диаметром частиц 30 нм и рекомбинантного антигена 38 кДа М. tuberculosis (Rv0934), фирмы «Arista Biologicals Inc.» (США), кат. № AGMTB-0220.

3. Моноклональные антитела НТМ81 против рекомбинантного антигена 38 кДа М. tuberculosis, Центр молекулярной диагностики и терапии, Москва (Россия).

Для формирования аналитической зоны использовали белок А, контрольной зоны - Моноклональные антитела НТМ81 против рекомбинантного антигена 38 кДа М. tuberculosis. На 1 см полосы наносили 2 мкл раствора белка А (10,0 мг/мл в 50 мМ фосфатном буфере, pH 7,4) и 2 мкл раствора антител (0,5 мг/мл в том же буфере). Конъюгат коллоидного золота с антигеном наносили в разведении, соответствующем D₅₂₀=3,0, в объеме 8 мкл на 1 см полосы. Раствор БСА наносили из концентрации 10% по массе в объеме 6 мкл на 1 см полосы на мембрану длиной 5 мм. Для нанесения реагентов использовали диспенсер «IsoFlow» фирмы «Imagene Technology» (США). После нанесения реагентов мембраны высушивали не менее 24 ч в помещении с контролируемыми температурой и влажностью. Листы мембран с нанесенными иммунореагентами нарезали на индивидуальные тест-полоски шириной 3,5 мм.

Иммунохроматографический анализ проводили при комнатной температуре. Тест-полоску погружали в пробу на 1 мин в вертикальном положении, а затем извлекали и помещали на горизонтальную поверхность. Детекцию связывания коллоидного золота осуществляли через 10 мин визуально.

Мембрана с нанесенным БСА задерживала фронт диффундирующей жидкости примерно на 1 мин, в то время как без дополнительной мембраны фронт жидкости после попадания на мембрану с коллоидным конъюгатом достигал аналитической зоны за 10 с и вследствие меньшего времени взаимодействия реагентов интенсивность окраски аналитической зоны была существенно ниже (Рис.2): приблизительно в 6 раз, что позволяет детектировать (пропорционально - в 6 раз) меньшие концентрации антител.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Рис.1. Принцип иммунохроматографического анализа для серодиагностики. 1 - мембрана, адсорбирующая образец; 2 - частицы коллоидного золота; 3 - реагент для связывания антител: антивидовые антитела, белок A, белок G или др.; 4 - пластиковая основа; 5 - рабочая мембрана; 6 - конечная адсорбирующая мембрана; 7 - антиген, иммобилизованный в аналитической зоне; 8 - антивидовые антитела, иммобилизованные в контрольной зоне.

Рис.2. Тестирование сыворотки крови больного туберкулезом в стандартной комплектации тест-системы (А) и в комплектации с нанесенным раствором 10% БСА (Б) (Стрелкой указано положение аналитической зоны).

Тест-полоска для высокочувствительного иммунохроматографического анализа, представляющая собой мембрану, на которую наносят антиген или антигены и частицы коллоидного золота, конъюгированные с реагентом для связывания аналита, отличающаяся тем, что для замедления вымывания коллоидного золота, конъюгированного с реагентом для связывания аналита, и увеличения длительности взаимодействия пробы с реагентом для связывания аналита в систему дополнительно включена стекловолоконная мембрана с нанесенным на нее бычьим сывороточным альбумином, прикрепленная к тест-полоске сразу за мембраной с нанесенным коллоидным золотом, конъюгированным с реагентом для связывания аналита.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено однодоменное мини-антитело, специфически связывающее белок-рецептор эпидермального фактора роста HER2/ERBB2/neu человека, полученное при иммунизации двугорбого верблюда (Camelus bactrianus) препаратом опухолевых клеток SKBR3, и охарактеризованное аминокислотной последовательностью.

Комплексный способ определения циркулирующих опухолевых клеток в крови больных раком молочной железы // 2522923

Изобретение относится к диагностическим методам в медицине и может быть использовано в онкологии при адъювантной терапии опухолей, а также при длительном наблюдении за пациентами после оперативного удаления опухолей.

Способ оценки риска развития канцерогенеза шейки матки у женщин, инфицированных вирусами папилломы // 2522908

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, гинекологии, биофизике, и касается способа оценки риска развития папилломавирус-ассоциированного канцерогенеза шейки матки.

Способ выявления групп изоформ тканеспецифического транскрипционного фактора hnf4α в гепатоцеллюлярных карциномах человека // 2522859

Изобретение относится к медицине и касается способа выявления групп изоформ тканеспецифического транскрипционного фактора HNF4α в гепатоцеллюлярных карциномах человека.

Способ прогнозирования эффективности противовирусной терапии у взрослых больных хроническим гепатитом с с генотипом 1b // 2522500

Изобретение относится к области медицины, а именно к гепатологии, и может использоваться для прогнозирования эффективности противовирусной терапии у взрослых больных хроническим гепатитом C с генотипом 1b.

Способ прогнозирования обострения бронхиальной астмы и/или муковисцидоза при гриппе у детей // 2522276

Изобретение относится к области медицины, а именно к инфекционным болезням и пульмонологии, и может быть использовано для прогнозирования обострения бронхиальной астмы и муковисцидоза у детей при гриппе.

Способ диагностики нефротического синдрома с минимальными изменениями у детей // 2522238

Изобретение относится к медицине, а именно, к области биохимических исследований в нефрологии и может быть использовано для диагностики нефротического синдрома с минимальными изменениями (НСМИ).

Способ диагностики онкологических заболеваний и иммуноферментный набор для его осуществления // 2522231

Группа изобретений относится к области медицинской диагностики, иммунологии и онкологии, в частности к новым онкомаркерам и способам диагностики онкологических заболеваний.

Способ диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований костной системы // 2522223

Изобретение относится к области медицины, а именно онкологии и ортопедии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований костной системы.

Способ иммунологического анализа белка cxcl1 человека // 2521669

Изобретение относится к биохимии. Описан способ иммунологического анализа белка CXCL1 человека.

Способ прогнозирования наступления беременности у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в программе экстракорпорального оплодотворения // 2523401

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования наступления беременности у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в результате лечения методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Сущность способа заключается в том, что перед программой ЭКО у пациентки в лютеиновую фазу цикла проводят биопсию эндометрия и определяют относительное содержание CD95+макрофагов в лейкоцитарном инфильтрате эндометрия. При значении относительного содержания CD95+макрофагов, равном 48,8% или более, прогнозируют наступление беременности, а при значении менее 48,8% - отсутствие наступления беременности. Заявляемый способ расширяет арсенал прогностических средств, повышает точность, чувствительность и специфичность прогнозирования наступления беременности у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием перед проведением программы ЭКО. Использование способа позволит определять дальнейшую тактику ведения пациентки, своевременно назначить дополнительные лечебные мероприятия. 1 табл., 3 пр.,

Способ диагностики ревматоидного артирита по наличию антител к модифицированному цинтруллинированному виментину (anti-mcv) в ротовой жидкости // 2523413

Изобретение относится к медицине. Более подробно изобретение относится к диагностике ревматоидного артрита. Способ диагностики по настоящему изобретению заключается в определении содержания Anti-MCV в ротовой жидкости (в смешанной слюне), использовании для обработки полученных показателей Anti-MCV в ротовой жидкости математического выражения: F=0,17×Anti-MCV-0,2537, диагностировании при положительном значении F наличия ревматоидного артрита, при отрицательном значении функции F ревматоидный артрит сомнителен. Заявленное изобретение предлагает малоинвазивный и достоверный способ диагностики ревматоидного артрита.

Способ оценки нарушений клеточного иммунитета при воздействии фенола // 2523418

Изобретение относится к биологическим исследованиям и медицине и предназначено для идентификации неблагоприятного воздействия фенола, поступающего из среды обитания, на здоровье населения. Для оценки нарушений клеточного иммунитета при воздействии фенола производят отбор пробы крови и ее исследование с использованием опытного и контрольного образцов с предварительным введением в опытный образец токсиканта - фенола в концентрации, соответствующей его региональному фоновому уровню. В качестве критериальных показателей в способе используют индекс специфической чувствительности клеток для цитокина фактора некроза опухолей ФНО-α и индекс специфической чувствительности клеток для цитокина Интерлейкина-10 ИЛ-10, которые определяют следующим образом: опытную и контрольную пробы крови вносят во флакон со стерильной питательной средой ДМЕМ с гепарином и гентамицином в объемном соотношении 1:4 соответственно (в преимущественном варианте содержание в стерильной питательной среде ДМЕМ гепарина составляет 2,5 Ед/мл и гентамицина - 100 мкг/мл), осуществляют при 37°C в течение суток инкубацию этих проб, а затем центрифугирование в течение 3 минут при 1000 об/мин и в отобранном супернатанте опытной пробы определяют уровень фенол-индуцированной продукции цитокинов, а именно уровень ИПЦИЛ-10 фенол-индуцированной продукции цитокина ИЛ-10 и уровень ИПЦФНО-α фенол-индуцированной продукции цитокина - фактора некроза опухолей ФНО-α, а в отобранном супернатанте контрольной пробы определяют уровень спонтанной продукции цитокинов, а именно уровень СПЦИЛ-10 спонтанной продукции цитокина ИЛ-10 и уровень СПЦФНО-α спонтанной продукции цитокина ФНО-α, далее рассчитывают индекс ИСЧфно-α специфической чувствительности клеток для цитокина ФНО-α, а также рассчитывают индекс ИСЧИЛ-10 специфической чувствительности клеток для цитокина ИЛ-10 по следующим формулам: ИСЧФНО-α=(ИПЦФНО-α-СПЦФНО-α):СПЦФНО-α, ИСЧИЛ-10=(ИПЦИЛ-10-СПЦИЛ-10):СПЦИЛ-10, где ИПЦИЛ-10 - уровень фенол-индуцированной продукции цитокина ИЛ-10; ИПЦФНО-α - уровень фенол-индуцированной продукции цитокина ФНО-α; СПЦИЛ-10 - уровень спонтанной продукции цитокина ИЛ-10; СПЦФНО-α - уровень спонтанной продукции цитокина ФНО-α; и при выполнении одновременного условия ИСЧФНО-α более 10 и ИСЧИЛ-10 более 2 судят о нарушении клеточного иммунитета организма под воздействием фенола. Изобретение обеспечивает повышение достоверности установления оценки влияния фенола на нарушение клеточного иммунитета организма человека. 1 з.п. ф-лы, 8 табл.

Технология получения костного мозга от доноров-трупов с бьющимся и не бьющимся сердцем // 2523563

Группа изобретений относится к области медицины и может быть использована для получения костного мозга (КМ) от доноров-трупов. Для этого пунктируют крылья подвздошных костей в передней и задней трети крыльев, устанавливая в каждое по два троакара. Сбор КМ выполняют методом простой аспирации, аспирации-промыванием или их комбинированием при разряжении 0,6 Атм при помощи устройства. Устройство для заготовки КМ включает одноразовую многоканальную закрытую систему, модуль аспирации-накопления и модуль перфузии. Группа изобретений также относится к способу оценки заготовленного костного мозга. Использование данного способа получения костного мозга (КМ) обеспечивает заготовку стерильного богатого жизнеспособными мультипотентными мезенхимальными стромальными и гемопоэтическими прогенеторными клетками КМ, при этом результат достигается за счет автоматизации миелоаспирации, путем заготовки биоматериала специальным разработанным устройством для сбора КМ. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 пр., 1 ил., 1табл.

Способ лечения респираторного дистресс-синдрома новорожденных, находящихся на ивл // 2523573

Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии, и может быть использовано для лечения респираторного дистресс-синдрома у новорожденных детей, находящихся на искусственной вентиляции легких (ИВЛ). Для этого на фоне медикаментозной терапии дополнительно определяют уровень глютатионпероксидазы (GSH-Px-3) и, если ее значение менее 2,41 мкмоль/л, в комплекс лечения включают препарат «Селеназа» из расчета 10 мкг/кг/сут, 1 раз/день внутривенно струйно медленно, в течение 10 дней. Способ позволяет повысить выживаемость при снижении числа осложнений и сокращении сроков лечения за счет снижения тяжести течения оксидативного стресса и повышения антиоксидантной защиты организма.1 табл.,3 пр.

Набор реагентов для одновременного или раздельного иммунногистохимического выявления рецепторов эстрогена, прогестерона и her2 при диагностике рака молочной железы // 2523899

Изобретение относится к медицине, в частности к области лабораторной диагностики рака молочной железы, и описывает набор реагентов для иммунногистохимической диагностики рака молочной железы, который позволяет одновременно или раздельно выявлять рецепторы эстрогена, прогестерона и HER2-рецепторы. Набор реагентов включает в себя раствор для обеспечения биодоступности антигена, блокирующий раствор пероксидазы хрена, белковый блокирующий раствор, промывочный раствор, раствор первичных антител HER2-рецепторам, раствор первичных антител к рецепторам эстрогена, раствор первичных антител к рецепторам прогестерона, раствор антивидовых вторичных антител к первичным антителам, раствор стрептавидин-пероксидазы хрена, диаминбензидин, субстратный раствор, отрицательный контрольный образец, три положительных контрольных образца рака молочной железы для определения HER2, рецепторов эстрогена, рецепторов прогестерона. Набор реагентов по данному изобретению обладает повышенной чувствительностью и специфичностью. Изобретение может быть использовано в медицинских лабораториях и научно-исследовательских институтах. 3 пр., 4 табл.

L-фукоза α1→6 специфичный лектин // 2524425

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен L-фукоза α1→6-специфичный лектин, экстрагируемый из базидиального гриба или сумчатого гриба, характеризующийся пиковым значением молекулярной массы около 4500 m/z, определяемым при масс-спектрометрическом анализе MALDI-TOF. Новый L-фукоза α1→6-специфичный лектин обладает высоким сродством к L-фукоза α1→6 сахарной цепи, определяемым константой ассоциации 1,0×104 М-1 или более (при 25ºС), и имеет константу ассоциации 1,0×103 М-1 или менее (при 25ºС) с высокоманнозными сахарными цепями и/или гликолипидами, не содержащими L-фукоза α1→6 сахарную цепь. В одном варианте предложенный L-фукоза α1→6 специфичный лектин представляет собой белок или пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:2-6. L-фукоза α1→6-специфичный лектин используют для специфического обнаружения L-фукоза α1→6 сахарной цепи и эффективной очистки L-фукоза α1→6 сахарной цепи или сахарной цепи, не содержащей L-фукозу α1→6. 6 н. и 10 з.п. ф-лы, 38 ил., 8 табл., 4 пр.

Вирус диареи крупного рогатого скота с модифицированным белком erns // 2524426

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан химерный пестивирус, где указанный химерный пестивирус включает вирус диареи крупного рогатого скота, который не экспрессирует его гомологичный Erns белок. При этом указанный химерный пестивирус экспрессирует гетерологичный Erns белок, происходящий из другого пестивируса, или природный, синтетический или генетический вариант указанного гетерологичного Erns белка. Также описаны способы и наборы для лечения или предупреждения распространения инфекции, вызванной вирусом диареи крупного рогатого скота, а также способы и наборы для дифференцировки между вакцинированными животными и животными, инфицированными вирусом дикого типа. Изобретение может быть использовано в качестве иммуногенных композиций и вакцин в животноводстве. 12 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 табл., 5 пр.

Способ диагностики ранней стадии ревматоидного артрита // 2524616

Изобретение относится к медицине, а именно к ревматологии, и может быть использовано для диагностики ранней стадии ревматоидного артрита. Для этого производят забор у пациента одновременно образцов костного мозга и синовиальной оболочки, из которых готовят препараты для иммуногистохимического и иммуноцитохимического исследований. После чего определяют долю клеток, синтезирующих белок Mdm2, по формуле: А И M d m 2 = N M d m 2 ⋅ 100 N о б щ , где АИMdm2 - доля клеток, синтезирующих белок Mdm2, %; NMdm2 - количество клеток, синтезирующих белок Mdm2; Noбщ - общее число клеток в поле зрения. В случае, когда в образцах синовиальной оболочки АИMdm2=81,6-88,8%, а в образцах костного мозга АИMdm2=85,0-89,2%, у пациента диагностируют раннюю стадию ревматоидного артрита. Использование данного способа позволяет диагностировать заболевание на ранней стадии и назначить адекватную базисную терапию для лечения и замедления прогрессирования ревматоидного артрита. 3 пр., 1 табл., 1 ил.

Способ оценки чувствительности сосудистого эндотелия к напряжению сдвига // 2524632

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и может быть использовано для оценки чувствительности сосудистого эндотелия к напряжению сдвига. Способ заключается в следующем: до и после окклюзионной пробы определяют уровень нитритов и эндотелина в крови. Чувствительность сосудистого эндотелия к напряжению сдвига определяют по величине коэффициента index(e), который вычисляют по формуле. При величине коэффициента index(e) меньше или равной 0,5 чувствительность сосудистого эндотелия к напряжению сдвига оценивают сниженной, а при величине index(e) больше 0,5 - нормальной. Способ позволяет определить реальное соотношение продуцируемых сосудистым эндотелием вазоактивных факторов (нитритов и эндотелина) при изменении напряжения сдвига, что дает возможность оценить эффективность лечения больных сосудистой патологией непосредственно в процессе лечения. 3 пр.