Вакцина против гриппа и способ ее получения
Владельцы патента RU 2523614:
Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Группа изобретений относится к медицинской биотехнологии, в частности к способу получения вакцины против вируса гриппа и вакцине, полученной указанным способом. Способ получения вакцины против вируса гриппа включает стадии получения вирусного концентрата из вируссодержащей жидкости, осветления, очистки, концентрирования, инактивации, расщепления концентрата вируса гриппа, ультрафильтрации, разведения полученного концентрата и стерилизующей фильтрации моновакцины. Стадии расщепления концентрата вируса гриппа проводят аминокислотными анионными детергентами в присутствии натрия хлорида 0,3 - 2,0 М, стадии расщепления, ультрафильтрации и последующего разведения проводят в присутствии стабилизаторов нейтральных и/или основных аминокислот.
Применение способа по настоящему изобретению позволяет расщепить вирус гриппа с максимальным сохранением нативных свойств вирусных антигенов: гемагглютинина, матриксного белка, нейраминидазы, а также стабилизировать полуфабрикаты вакцины в процессе их получения на стадиях расщепления, ультрацентрифугирования, ультрафильтрации и стерилизующей фильтрации. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 7 ил., 10 табл., 7 пр.
Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к способу получения вакцины против вируса гриппа.
Грипп является глобальной инфекцией, которая в период эпидемий может поражать от 10 до 20% населения планеты, и практически единственной, способной вызывать пандемии в современном мире (1).
Вирус гриппа состоит из поверхностных и внутренних белков. К поверхностным белкам относятся гликопротеины гемагглютинин (HA), нейраминидаза (NA) и частично-поверхностный матриксный М2-белок, который пронизывая липидную мембрану, выходит в минорном количестве из внутренней части вириона гриппа. Внутренние белки вируса гриппа представлены в основном матриксным M1-белком и нуклеопротеином (NP-белком).
Поверхностные антигены вириона гриппа гетерогенны и изменчивы. С этими белками связана ежегодная сезонная эпидемичность и пандемичность гриппа. Причем в большей степени это касается гемагглютинина, который наряду с нейраминидазой определяет подтип вируса гриппа (H1N1, H2N2, H3N2 и т.д.). Из-за постоянного антигенного дрейфа, происходит некоторое, но не полное изменение антигенной специфичности гемагглютинина, позволяющее этому белку «ускользать» от части антител, образовавшихся к прежде циркулировавшему штамму вируса гриппа. Такие изменения наблюдаются практически каждый год, и в связи с этим Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) выявляет определенные варианты вируса и рекомендует такие варианты для приготовления гриппозных вакцин на следующий эпидсезон. Тем не менее люди, переболевшие гриппом в предыдущем эпидсезоне, сохраняют определенный уровень иммунитета и к новым дрейфовым вариантам вируса гриппа того же серотипа (2).
Внутренние белки гриппа - M1-белок и NP-белок напротив, постоянны (консервативны) по своей структуре и определяют тип вируса (A, B и C). Консервативность внутренних белков гриппа связана с низкой мутационной антигенной изменчивостью при естественном пассировании вируса в популяциях человека и животных. Внутренние белки разных типов вируса гриппа человека имеют между собой большое антигенное сходство, где перекрестность составляет 92-94% (3). Это свойство ученые используют при разработке новых гриппозных вакцин с широким спектром антигенной активности.
Активная иммунизация является наиболее эффективным медицинским средством защиты от гриппозной инфекции (1).
При вакцинации цельновирионными и расщепленными (сплит-) вакцинами человек иммунизируется всем комплексом антигенов, входящих в вирион гриппа - изменчивыми поверхностными штаммоспецифическими антигенами (HA и NA), частично поверхностным консервативным белком М-2 и внутренними консервативными антигенами, в основном представленными белками М-1 и NP. Накоплено достаточно фактов, свидетельствующих о длительном сохранении частичной устойчивости к гриппу, в том числе связанной с перекрестным иммунитетом, при вакцинации расщепленными и цельновирионными вакцинами (4). Следовательно, эти вакцины защищают не только от ежегодных мутаций, но частично и от всех возможных разновидностей гриппа, поскольку внутренние антигены подвержены незначительным изменениям.
Расщепленные вакцины избавлены от самого главного недостатка цельновирионных вакцин - наличия токсинов, а также очищены от липидных компонентов вируса, с которыми связаны основные побочные реакции. Таким образом, по уровню побочных реакций сплит-вакцины аналогичны субъединичным вакцинам, а по иммунологической эффективности - цельновирионным, поскольку содержат полноценный набор формирующих иммунитет антигенов вируса гриппа.
Состав вакцины против вируса гриппа и ее качественные характеристики зависят от технологии получения, в первую очередь - от используемого для расщепления вириона детергента и добавляемого в препарат стабилизатора.
Физико-химические свойства детергента определяют характер действия его на вирусные белки и, в конечном счете, отражаются на эффективности, т.е. иммуногенной активности гриппозной вакцины.
Ионные детергенты высокоэффективны для солюбилизации вируса гриппа. Они обладают, как правило, высокой критической концентрацией мицеллообразования (ККМ) и образуют небольшие мицеллы (1000 D). Чем выше ККМ, тем легче детергент удаляется ультрафильтрацией или гель-фильтрацией. Ионные детергенты обеспечивают более высокий выход интересуемых вирусных антигенов, однако до некоторой степени сильнее денатурируют белок.
Неионные детергенты считаются мягкими и малоденатурирующими белок. Позволяют солюбилизировать вирусы без потерь каких-либо структурных особенностей антигенов и сохраняют максимальную нативность и активность белков. Однако неионные детергенты обеспечивают более низкий выход выделяемых антигенов и многие из них трудно удаляются на последующих стадиях технологического цикла.
Технология получения вакцины против вируса гриппа должна обеспечивать не только соответствие препарата требованиям ВОЗ, но и стабильность качественных показателей во время хранения. Сохранение требуемых параметров препарата обеспечивается внесением в конечную форму вакцины определенных стабилизаторов. Стабилизирующие агенты позволяют продлить срок годности гриппозной вакцины и обеспечить большую стабильность показателей при хранении и транспортировке. Используемые стабилизаторы при этом должны обладать определенными качественными характеристиками: помимо главного - обеспечения стабильности,они должны быть безопасными, то есть не должны нести антигенности и не вносить новой биологической активности.
Известно, что при вакцинации гриппозной вакциной иммунный ответ выше, когда антигены в препарате находятся в нативном состоянии, и, в частности, белок матрикса М-1 сохраняет молекулярную массу 20 кДа и более. Молекулярная масса полноразмерного белка матрикса составляет ~26 (5), ~28 кДа (6).
Известен способ получения антигенов для вакцины против вируса гриппа (7), где для расщепления вирионов вирусов гриппа применяется неионный детергент β-октилглюкозид. Используемый в изобретении детергент практически не образует мицелл в водных растворах и легко отделяется от антигенов вируса гриппа после расщепления вирионов. В описании изобретения не представлено данных по количественному содержанию внутренних белков вируса. Кроме того, известно, что β-октилглюкозид на основе производных углеводов не полностью отделяет липиды от белков. А также известно, что октилгликозид, известный также под названием n-октил-β-D-гликопиранозид используется для получения вакцин, содержащих выделенные из интактных нативных вирионов в суспензии лишь очищенные основные антигенные компонеты ГА и НА (8). Использование октилгликозида позволяет получить основные субъединицы вириона, в виде мицеллярного раствора в детергенте, где они включены в мицеллы детергента и отделены от липидов вирусной мембраны. Но его основным преимуществом является именно способность селективной солюбилизации только поверхностных гликопротеинов при комнатной температуре (9).
Заявлены инактивированные тривалентные сплит-вакцины против вируса гриппа (10, 11, 12), включающие поверхностные и внутренние белки вируса гриппа. В заявленных вакцинах содержание гемагглютинина на вирусный штамм составляет от 0,1 до 29 мкг/мл, матричного белка - от 1 до 20 мкг/мл. При этом в изобретениях (10), (11) в качестве детергента используют: дезоксихолат натрия, Твин, Тритон или их комбинации. В изобретении (12) возможно использование любого известного детергента: полисорбата 80 (Твин 80), Тритона Х-100, дезоксихолата, саркозил и т.д. Однако в готовом препарате матриксный белок имеет молекулярную массу менее 20 кДа.
Известна расщепленная гриппозная вакцина (13), в состав которой может дополнительно добавляться фракция матричного белка в количестве не менее 3-10 мкг. Для расщепления вируса гриппа используется смесь эфира и полисорбата 80, а для получения корфракции содержащей М-белок - неионный детергент Нонидент Р40 или Тритон X100, или некоторые катионные детергенты, такие как гексадил триметиламмония бромид. Однако известно, что использование эфира приводит к потере ферментативной активности нейраминидазы. Кроме того, при осаждении коровой фракции теряется нативность антигена и образуется агрегированная форма М-белка. Технология трудоемкая и дорогая.
Известен стабилизирующий состав для лиофилизации вакцинного штамма вируса гриппа, включающий яичный альбумин и углевод или аминокислоту, или их комбинации (14). При стабилизации вируса гриппа в качестве углевода используют глюкозу и/или лактозу, в качестве аминокислоты - глицин. Известно, что альбумин несет новую биологическую активность и возможность контаминации препарата (15). Использование в качестве стабилизаторов углеводов связано с риском возникновения побочных реакций (гипергликемии или глюкозурии) и изменения иммуногенности антигенов вакцины из-за гликозилирования их во время хранения.
В изобретении (16) аминокислоты - аргинин моногидрохлорид и мононатрийгидрат глутаминовой кислоты входят в состав стабилизирующих веществ - сахарозы и желатина гидролизата, используемых для стабилизации конечной лекарственной формы - жидкой вакцины против вируса гриппа. Известно, что желатин обладает свойством антигенности и вероятностью контаминации вирусами (17).
В международной заявке на изобретение (18) с целью увеличения выхода антигена вируса гриппа в яйца птиц вводят аминокислоты. Для получения сплит-вакцины используют неионные детергенты, в том числе Тритон, Твин-80, лаурет-9. Конечная форма вакцины может содержать неионные детергенты и производные желчной кислоты, в том числе, дезоксихолат натрия. При этом в известном способе на стадии размножения вируса гриппа в развивающихся куриных эмбрионах аминокислоты применяются в качестве питательных веществ. На стадии очистки и концентрации вируса гриппа аминокислоты удаляются из вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) и отсутствуют в полученном вирусном концентрате и готовом препарате.
Согласно технологии (19) рассматривается процесс стабилизации вакцины против гриппа аминокислотами аргинином и его кислотно-аддитивной соли (гидрохлорид аланина) или фенилаланином, или комбинацией фенилаланина с изолейцином или лейцином или валином на конечной стадии производства (в процессе лиофилизации).
В заявке на изобретение (20) описан способ получения сплит-вакцины, содержащей вирусные оболочечные белки, белок матрикса и нуклеопротеины. Представленная технология получения гриппозной вакцины (по примеру 1) выбрана в качестве прототипа. В процессе расщепления вирионов используются различные детергенты неионные, ионные ПАВ и др. В качестве конкретного примера используемых детергентов приводятся такие ПАВ, как производные желчных кислот, N, N-бис (3DGluconoamidopropyl) deoxycholamide, натрий дезоксихолата-NADOC, октоксинолы (Triton (ТМ) серии), полиоксиэтиленовые эфиры, полиокси-этиленсорбитана моноолеат (Tween 80 (ТМ)), и polyoxythylene простые или сложные эфиры, а также N-лаурилсаркозина натриевая соль, СТАВ (бромид цетилтриметиламмония) или Cetavlon. Как наиболее предпочтительные заявлены натрий дезоксихолата-NADOC и саркозил. Допускается использование комбинаций детергентов.
Согласно технологической схеме примера 1 для удаления примесей предусмотрена длительная 10-кратная диафильтрация цельного вируса. Согласно п.0138 соотношение детергента к белку не менее 5:1, что представляет собой жесткое воздействие на выделяемые антигены и, как правило, приводит к разрушению М-белка до низкомолекулярных фрагментов, а также инактивации выделяемой нейраминидазы. Согласно п.0139, на стадии расщепления предпочтительно используется детергент в высокой конечной концентрации до 2%. Необходимо заметить, что подобная концентрация может вызвать денатурацию/инактивацию выделяемых антигенов вакцины.
Также недостатком метода расщепления упомянутыми детергентами является проведение процесса расщепления в течение достаточно длительного периода времени, согласно п.0040 расщепление проводят при инкубации в течение ночи при комнатной температуре.
По заявке (21) готовую вакцину против вируса гриппа стабилизируют белковым гидролизатом и/или аминокислотами, и/или их комбинациями в конечной концентрации 0,01-4,0%. Представленная технология стабилизации выбрана в качестве наиболее близкого аналога по стабилизаторам. Изобретение предусматривает использование аминокислот из группы альфа-аминокислот: аланин, аспарагиновая кислота, глицин, лейцин, лизин, гистидин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, валин или комбинация любых двух или более из названных аминокислот. Процесс стабилизации предусмотрен на конечной стадии технологического цикла производства вакцин, в частности жидких, подходящих для парентерального интраназального или перорального, а также для внутримышечного применения и рассматривает влияние указанных веществ на стабилизацию ферментативной активности лишь одного поверхностного антигена вируса - нейраминидазы. В описании изобретения влияние стабилизаторов на сохранение нативности гемагглютинина и матриксного белка не представлено. Кроме того, основные потери иммунологической активности вирусных антигенов наблюдаются, в том числе и на предшествующих конечным стадиях производственного цикла, в частности при процессах расщепления, ультрацентрифугирования и ультрафильтрации.
В заключение следует отметить, что в известных вышеперечисленных способах при получении вакцины против вируса гриппа, использование детергентов приводит либо к селективной солюбилизации только поверхностных гликопротеинов, либо к потере нативности поверхностных и/или внутренних вирусных белков, либо к низкому выходу вирусных антигенов, а также к невозможности максимального удаления используемых детергентов.
Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в создании эффективной, стабильной при хранении сплит-вакцины против вируса гриппа за счет оптимизации технологического процесса.
Технический результат изобретения - разработан мягкий способ расщепления вируса гриппа с максимальным сохранением нативных свойств вирусных антигенов - гемагглютинина, матриксного белка, нейраминидазы, а также стабилизации полуфабрикатов вакцины в процессе их получения на стадиях расщепления, ультрацентрифугирования, ультрафильтрации и стерилизующей фильтрации. Технический результат заключается в получении сплит-вакцины против вируса гриппа содержащей в нативной форме гемагглютинин, нейраминидазу и матриксный белок, как низкомолекулярный, так и с молекулярной массой более 20 кДа, стабильной при хранении.
Сущность изобретения заключается в следующем. Предварительно осветленную вируссодержащую жидкость концентрируют, очищают и инактивируют любыми способами, разрешенными к применению.
Расщепление вируса гриппа проводят анионными аминокислотными детергентами, в присутствии натрия хлорида в концентрации 0,3-2,0 М и стабилизаторов при значении pH 7,6-9,0, где в качестве стабилизирующих веществ используют аминокислоты: основные - аргинин, гистидин, лизин или нейтральные - аланин, глицин, пролин, изолейцин, и/или их комбинации в конечной суммарной концентрации 0,1-0,5 М. Расщепленный концентрат вируса гриппа дополнительно стабилизируют твином 80 до конечной концентрации 0,005-0,1%.
Ультрафильтрацию концентрата вируса гриппа осуществляют с использованием фосфатно-буферного раствора (ФБР), содержащего, по крайней мере, одну из вышеперечисленных аминокислот и/или их комбинаций в конечной концентрации 0,05-0,3 М.
Разведение полученного концентрата полуфабриката вакцины гриппа проводят ФБР, содержащим в качестве стабилизаторов, по крайней мере, одну из вышеперечисленных аминокислот и/или их комбинаций в конечной концентрации, обеспечивающей осмолярность 240-600 мОсм/кг.
После стадии расщепления, при необходимости, проводят дополнительную стадию - ультрацентрифугирование. Процесс осуществляют с использованием ФБР, содержащего, по крайней мере, одну из вышеперечисленных аминокислот и/или их комбинаций в конечной концентрации 0,1-0,5 М.
Вируссодержащая жидкость может быть получена культивированием вируса гриппа в куриных эмбрионах, или на культуре клеток.
В качестве культуры тканей для культивирования вируса можно использовать клетки почки собаки, такие как MDCK, MDCK - подобные клетки, клетки почки обезьяны, такие как клетки AGMK, включая клетки Vero, или любой другой тип клеток млекопитающих, подходящий для продуцирования вируса гриппа с целью получения вакцины.
Согласно данному изобретению вакцина может содержать разнообразные штаммы вирусов гриппа, типичные как для гриппа человека, так и гриппа птиц, свиней и др. животных.
Заявленный способ позволяет получить расщепленную вакцину против вируса гриппа стабильную при хранении, содержащую в нативной форме гемагглютинин, нейраминидазу и матриксный белок с молекулярной массой более 20 кДа. Выход по гемагглютинину составляет не менее 85%.
Полученная вакцина может содержать адъювант.
В заявляемом способе получения вакцины против вируса гриппа для расщепления вирусного концентрата используют только мягкие анионные аминокислотные детергенты.
Стадию расщепления вируса гриппа осуществляют в присутствии натрия хлорида 0,3-2,0 М и стабилизаторов - аминокислот при значении pH 7,6-9,0 в конечной суммарной концентрации 0,1-0,5 М.
Выделение очищенных антигенов вируса гриппа проводят в присутствии стабилизаторов - аминокислот: основных - аргинина, гистидина, лизина или нейтральных - аланина, глицина, пролина, изолейцина, и/или их комбинации, содержащихся в буферных растворах, используемых для ультрацентрифугирования, ультрафильтрации в конечной концентрации 0,05-0,3 М.
Конечный состав вакцины включает по крайней мере одну из вышеперечисленных аминокислот и/или их комбинаций в концентрации, обеспечивающих осмолярность препарата в пределах 240-600 мОсм/кг.
Совокупность отличительных признаков заявленного способа позволяет получить следующие преимущества.
Расщепление вируса гриппа проводится анионными аминокислотными детергентами: лаурилсаркозинатом натрия, Amilite ACS-12, Amilite GCS-12, Amisoft-CS-22, которые высокоэффективны в отношении солюбилизации вируса гриппа. Указанные анионные аминокислотные детергенты содержат в своем составе аминокислоты и жирные кислоты, которые оказывают синергетический эффект на процесс расщепления и стабилизируют вирусные белки гриппа при солюбилизации вируса (табл.1).
Использование аминокислот на наиболее критических стадиях процесса получения гриппозной вакцины - расщепления вирусного концентрата детергентом, выделения антигенов вируса гриппа методами ультрацентрифугирования, ультрафильтрации и последующем внесении их на стадии стерилизующей фильтрации моновакцины способствует сохранению нативности и иммунологической активности гемагглютинина, иммунологической и ферментативной активности нейраминидазы (табл.2, рис.1: Влияние и диаграмма стабилизации аминокислотами полуфабриката на стадии расщепления; табл.3, рис.2: Влияние и диаграмма стабилизации аминокислотами полуфабриката на стадии ультрацентрифугирования; табл.4, рис.3: Влияние и диаграмма стабилизации аминокислот на содержание наиболее иммунологически активных полимерных форм поверхностных антигенов до и после стадии стерилизующей фильтрации) и позволяет получать матриксный белок, в виде мономерной и/или димерной фракций, с молекулярной массой более 20 кДа в процентном соотношении более 8,0% от общего вирусного белка; (рис.4: Электрофорез вируса гриппа типа A/California 07/09 (H1N1), табл.5: Количественный анализ содержания вирусных белков при стабилизации полуфабриката вакцины типа A/California 07/09 (H1N1) различными аминокислотами; рис.5: Электрофорез вируса гриппа типа B, табл.6: Количественный анализ содержания вирусных белков при стабилизации полуфабриката вакцины типа B/NIB-58 различными аминокислотами).
Расщепление вириона гриппа в присутствии натрия хлорида 0,3 - 2,0 М и аминокислот-стабилизаторов при значении pH, равной 7,6-9,0, позволяет снизить концентрацию детергента на стадии расщепления вирусного концентрата.
Кроме того, внесение аминокислот при ультрафильтрации (и в случае проведения при ультрацентрифугировании) способствует более эффективному удалению детергентов в 2-4 раза, с 80 мкг/мл до 20-40 мкг/мл в конечной моновакцине. Увеличение ионной силы до 0,3-2,0 М увеличивает солюбилизацию вируса гриппа.
Совокупность концентраций используемых комбинаций вспомогательных веществ обеспечивают осмолярность заявленной вакцины 240-600 мОсм/кг, высокие критерии иммуногенности и стабильность качественных характеристик препарата в процессе производства и во время хранения (табл.7, 8).
Предложенный способ осуществляется следующим образом:
1. Осветление на проточной центрифуге и предварительная фильтрация вируссодержащей жидкости, полученной культивированием вируса гриппа в куриных эмбрионах или культуре клеток.
2. Очистка микрофильтрацией, концентрирование ультрафильтрацией осветленной вируссодержащей жидкости в тангенциальном потоке и диафильтрация концентрата вируса гриппа.
3. Концентрирование и очистка концентрата вируса гриппа в градиенте плотности сахарозы.
4. Разведение концентрата вируса гриппа и инактивация разведенной взвеси любыми способами, разрешенными к применению.
5. Расщепление разведенной взвеси инактивированного вируса гриппа детергентами, выбранными из группы мягких анионных - лаурилсаркозинатом натрия, Amilite ACS-12 Sodium N-Cocoyl-L-Alaninate, Amilite GCS-12 Sodium N-Cocoyl Glycinate, Amisoft-CS-22 Sodium N-Cocoyl Glytamat в различных концентрациях с добавлением, по крайней мере, одной из аминокислот - основных - аргинин, гистидин, лизин или нейтральных - аланин, глицин, пролин, изолейцин, и/или их комбинации.
6. Удаление детергента ультрафильтрацией с последующей стабилизацией концентрата вируса гриппа вышеперечисленными аминокислотами основными и/или нейтральными и/или их комбинациями.
До стадии ультрафильтрации, дополнительно, может быть проведена стадия ультрацентрифугирования с использованием ФБР, содержащего аминокислоты.
7. Разведение полученного концентрата вируса гриппа ФБР, содержащим в качестве стабилизаторов вышеперечисленные аминокислоты и/или их комбинации до требуемой активности по гемагглютинину и осмолярности 240-600 мОсм/кг.
8. Стерилизующая фильтрация моновакцины.
Пример 1.
Предварительно осветленную, очищенную методом микрофильтрации вируссодержащую жидкость (штамм вируса гриппа типа B/Wisconsin) концентрируют, очищают и инактивируют. 300 мл инактивированной разведенной взвеси вируса гриппа добавляют в приготовленный и подогретый до температуры 25°C раствор из ФБР (pH 7,8) и 2,5 М NaCl (pH 8,0), с конечной молярностью по NaCl, равной 0,5 М. Тщательно перемешивают и добавляют без вспенивания 10% раствор лаурилсаркозината натрия для получения конечной концентрации детергента в растворе 0,6%. Инкубируют полученный раствор в течение 1 ч при температуре 25°C. Добавляют 10% раствор твин-80 до конечной концентрации 0,1% и 10% раствор аргинина (pH 8,0) до конечной концентрации 1,5%.
Удаляют детергент ультрафильтрацией, для чего полученные 4-5 л раствора концентрата вируса гриппа концентрируют на ультрафильтрационной установке с размером пор 30 кДа до 800-1000 мл, с последующей диафильтрацией против 15-20 л ФБР с pH 7,1, содержащего твин-80 в конечной концентрации 0,005%, натрия хлорида - 0,15 М, аргинина - 1%. По окончании процесса диафильтрации стабилизируют полученный концентрат вируса гриппа 15% раствором аргинина (pH=8,0) до конечной концентрации аминокислоты в растворе 2,4%.
Разводят концентрат вируса гриппа раствором ФБР с pH=7,1, содержащим 0,3% NaCl, 1% гистидин, 0,1% твин-80, и общей осмолярностью раствора 330-400 мМ. Проводят стерилизующую фильтрацию моновакцины.
Пример 2.
Предварительно осветленную, очищенную методом микрофильтрации вируссодержащую жидкость (штамм вируса гриппа типа A/California/07/2009 (H1N1)) концентрируют, очищают и инактивируют. 400 мл инактивированной разведенной взвеси вируса гриппа добавляют в приготовленный и подогретый до температуры 37°C раствор из ФБР (pH 7,8) и 2,5 М NaCl (pH 7,8), с конечной молярностью по NaCl, равной 2,0М. Тщательно перемешивают без вспенивания и добавляют 10% раствор лаурилсаркозината натрия для получения конечной концентрации детергента в растворе 0,4%. Инкубируют полученный раствор в течение 1 ч при температуре 37°C. Добавляют 10% раствора твин-80 до конечной концентрации 0,1% и 10% раствора глицина (pH 7,8) до конечной концентрации 1,5%.
Удаляют детергент ультрафильтрацией, для чего полученные 4-5 л раствора концентрата вируса гриппа концентрируют на ультрафильтрационной установке с размером пор 30 кДа до 800-1000 мл, с последующей диафильтрацией против 15-20 л ФБР с pH 7,2, содержащего твин-80 в конечной концентрации 0,0025%, натрия хлорида - 0,15 М (0,87%). По окончании процесса диафильтрации стабилизируют полученный концентрат вируса гриппа комбинацией аминокислот в виде 10% раствора аргинин/глицин (pH 7,8) до конечной концентрации аминокислот в растворе 1,2%.
Разводят концентрат вируса гриппа раствором ФБР, содержащим 0,3% NaCl, 0,16 М глицина, 0,07 М аргинина, 0,1% твин-80, с pH 72 и общей осмолярностью раствора 330-400 мМ. Проводят стерилизующую фильтрацию моновакцины.
Пример 3.
Предварительно осветленную, очищенную методом микрофильтрации вируссодержащую жидкость (штамм вируса гриппа A/California/07/2009 (H1N1)), концентрируют, очищают и инактивируют.400 мл инактивированной разведенной взвеси вируса гриппа добавляют в приготовленный и подогретый до температуры 35°C раствор из ФБР (pH 8,0) и 2,5 М NaCl (pH 7,8), с конечной молярностью по NaCl, равной 1,0 М. Тщательно перемешивают без вспенивания и добавляют 10% раствор лаурилсаркозината натрия для получения конечной концентрации детергента в растворе 0,2%. Инкубируют полученный раствор в течение 1 ч при температуре 35°C. Добавляют 10% раствора твин-80 до конечной концентрации 0,5% и 10% раствор аланина (pH 7,8) до конечной концентрации 1,5%.
Проводят процесс ультрацентрифугирования на проточной ультрацентрифуге CP40Y при скорости ротора 16 тыс. об/мин в течение 2 ч при температуре 18-20°C. Весь объем ротора предварительно заполняют ФБР, содержащим лаурилсаркозинат натрия в конечной концентрации 0,1%, твин-80 - 0,05%, натрия хлорид - 0,5 М, аланин - 1%.
Удаляют детергент ультрафильтрацией, для чего полученные 4-5 л раствора концентрата вируса гриппа концентрируют на ультрафильтрационной установке с размером пор 30 кДа до 800-1000 мл, с последующей диафильтрацией против 15-20 л ФБР с pH 7,2, содержащего твин-80 в конечной концентрации 0,0025%, натрия хлорида - 0,25 М (1,45%). По окончании процесса диафильтрации стабилизируют полученный концентрат вируса гриппа комбинацией аминокислот в виде 10% раствора аргинин/глицин (pH 7,6) до конечной концентрации аминокислот в растворе 1%.
Разводят концентрат вируса гриппа раствором ФБР с рН 7,2, содержащим 0,3% NaCl, 0,1% твин-80, 1% аланина и общей осмолярностью раствора 330-400 мМ. Проводят стерилизующую фильтрацию моновакцины.
Пример 4.
Предварительно осветленную, очищенную методом микрофильтрации вируссодержащую аллантоисную жидкость (штамм вируса гриппа типа A/NIB-64 (H3N2)) концентрируют, очищают и инактивируют. 300 мл инактивированной разведенной взвеси вируса гриппа добавляют в приготовленный и подогретый до температуры 37°C раствор из ФБР (pH 8,0) и 2,5 М NaCl (pH 7,8), с конечной молярностью по NaCl, равной 1,5 М. Тщательно перемешивают без вспенивания и добавляют 10% раствор Amilite ACS-12 для получения конечной концентрации детергента в растворе 0,4%. Инкубируют полученный раствор в течение 1 ч при температуре 37°C. Добавляют 10% раствора твин-80 до конечной концентрации 0,1% и 10% раствор глицина (pH 7,5) до конечной концентрации 1%.
Удаляют детергент ультрафильтрацией, для чего полученные 4-5 л раствора концентрата вируса гриппа концентрируют на ультрафильтрационной установке с размером пор 30 кДа до 800-1000 мл, с последующей диафильтрацией против 15-20 л ФБР с pH 7,2, содержащего твин-80 в конечной концентрации 0,0025%, натрия хлорида - 0,3 М (1,75%). По окончании процесса диафильтрации стабилизируют полученный концентрат вируса гриппа 10% раствором аланина (pH 8,6) до конечной концентрации аминокислоты в растворе 1,2%.
В данном примере проведение ультрацентрифугирования, как дополнительной стадии очистки, не требовалось, в связи с высокой степенью расщепления, 99,969% от общего количества, до частиц размером от 12 до 34 нм, о чем свидетельствует сравнительная характеристика размеров частиц исходного концентрата вируса гриппа и полуфабриката после расщепления, полученная с использованием лазерного анализатора размеров наночастиц SALD-7101 (рис.6, табл.9: Кривая распределения и количественный анализ размеров частиц исходного концентрата вируса гриппа типа A/NIB-64 (H3N2), рис.7, табл.10: Кривая распределения и количественный анализ размеров частиц полуфабриката вируса гриппа типа A/NIB-64 (H3N2) после расщепления).
Разводят концентрат вируса гриппа раствором ФБР с pH 7,2, содержащим 0,3% NaCl, 0,1% твин-80, 1% лизина и общей осмолярностью раствора 330-400 мМ. Проводят стерилизующую фильтрацию моновакцины.
Пример 5.
Предварительно осветленную, очищенную методом микрофильтрации вируссодержащую жидкость (штамм вируса гриппа типа A/NIB-64 (H3N2)) концентрируют, очищают и инактивируют. 300 мл инактивированной разведенной взвеси вируса гриппа добавляют в приготовленный и подогретый до температуры 37°C раствор из ФБР (pH 8,0) и 2,5 М NaCl (pH 7,8), с конечной молярностью по NaCl, равной 0,5 М. Тщательно перемешивают без вспенивания и добавляют 10% раствор Amilite GCS-11 для получения конечной концентрации детергента в растворе 0,2%. Инкубируют полученный раствор в течение 1 ч при температуре 37°C. Добавляют 10% раствора твин-80 до конечной концентрации 0,1% и и 10% раствор аланина (pH 8,2) до конечной концентрации 1%.
Удаляют детергент ультрафильтрацией, для чего полученные 4-5 л раствора концентрата вируса гриппа концентрируют на ультрафильтрационной установке с размером пор 30 кДа до 800-1000 мл, с последующей диафильтрацией против 15-20 л ФБР с pH 7,2, содержащего твин-80 в конечной концентрации 0,0025%, натрия хлорида - 0,3 М. По окончании процесса диафильтрации стабилизируют полученный концентрат вируса гриппа 10% раствором глицина (pH 7,2) до конечной концентрации аминокислоты в растворе 1%.
Разводят концентрат вируса гриппа раствором ФБР с pH 7,2, содержащим 0,3% NaCl, 0,1% твин-80, 1% глицина и общей осмолярностью раствора 330-400 мМ. Проводят стерилизующую фильтрацию моновакцины.
Пример 6.
Предварительно осветленную, очищенную методом микрофильтрации вируссодержащую жидкость (штамм вируса гриппа типа A/NIB-64 (H3N2)) концентрируют, очищают и инактивируют. 300 мл инактивированной разведенной взвеси вируса гриппа добавляют в приготовленный и подогретый до температуры 37°C раствор из ФБР (pH 8,0) и 2,5 М NaCl (pH 7,8), с конечной молярностью по NaCl, равной 1,0 М. Тщательно перемешивают без вспенивания и добавляют 10% раствор Amisoft CS-22 для получения конечной концентрации детергента в растворе 0,4%. Инкубируют полученный раствор в течение 1 ч при температуре 37°C. Добавляют 10% раствора твин-80 до конечной концентрации 0,1% и 10% раствор аргинина (pH 7,8) до конечной концентрации 1,0%.
Удаляют детергент ультрафильтрацией, для чего полученные 4-5 л раствора концентрата вируса гриппа концентрируют на ультрафильтрационной установке с размером пор 30 кДа до 800-1000 мл, с последующей диафильтрацией против 15-20 л ФБР с pH 7,1, содержащего твин-80 в конечной концентрации 0,005%, натрия хлорида - 0,3 М. По окончании процесса диафильтрации стабилизируют полученный концентрат вируса гриппа 10% раствором комбинации аминокислот аргинин/глицин (pH 7,2) до конечной концентрации аминокислот в растворе 1,2%.
Разводят концентрат вируса гриппа раствором ФБР с pH 7,2, содержащим 0,3% NaCl, 0,1% твин-80, 0,16 М глицина, 0,07 М аргинина общей осмолярностью раствора 330-400 мМ. Проводят стерилизующую фильтрации моновакцины.
Пример 7. Изучение иммуногенных свойств вакцины
Иммуногенные свойства заявленной вакцины против гриппа были изучены путем оценки антигенной активности.
При определении антигенной активности исследовали образование антител в сыворотках крови животных. Опыты проводились на белых беспородных мышах массой тела 10-12 г. После двукратного с интервалом 7 суток внутрибрюшинного введения вакцины, сыворотки иммунизированных мышей исследовались в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с гомологичными антигенами вакцины.
Показатели антигенной активности заявленной вакцины и вакцины, полученной без использования стабилизаторов-аминокислот, приведены в таблице 7.
При сравнительной оценке антигенной активности двух вариантов вакцины, было выявлено, что гемагглютинирующий титр заявленной вакцины был не менее 1:80 к каждому из трех входящих в ее состав штаммов вирусов гриппа A и B.
Изучение стабильности антигенной активности во время хранения заявленного препарата и вакцины без стабилизаторов-аминокислот проводилось методом «ускоренного старения», показатели приведены в таблице 8.
Образцы заявленной вакцин и вакцины без стабилизаторов-аминокислот закладывали на ускоренное хранение при температуре 37°C и 22°C. Результаты исследования стабильности антигенной активности показали, что разработанный препарат имеет высокую стабильность, сохраняя показатели антигенной активности в течение срока хранения и более.
Список литературы
1. Смородинцев А.А. Грипп и его профилактика. Руководство для врачей. Л.: Медицина - 1984, 383 с.
2. Гендон Ю.З. Пандемия гриппа: предположения и факты // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. - №5. - С.109.
3. Tamura S, Tanimoto Т, Kurata Т. Mechanisms of broad cross-protection provided by influenza virus infection and their application to vaccines // Jpn J Infect Dis. - 2005. - Aug; 58(4). - P.195-207.
4. Кузнецов О.К., Степанова Л.А., Чурикова А.А. и др. Популяционный иммунитет к сезонному гриппу как основной фактор, ограничивающий глобальную эпидемию 2009-2010 годов // Эпидемиол. и вакцинопрофилакт. - 2010. - №4. - С.9 - 17.
5. Biotechnology and Bioengineering. - 2007. - Vol.96, №5, Apr.1.
6. Wu, W.W. Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleo-protein Complexes / W.W. Wu, L.L. Weaver, N. Pante // J. Vis. Exp.-2009.-Feb.9, (24).-P.1105
7. Патент РФ №2283139, опубл. 2006.09.10.
8. Е.С. Исаева и др. Гликопротеиды ортомиксовирусов. Изд. Наука, алма-Ата, 1988, стр.119-126.
9. T.Stegmann, et al. (1987) EMBO J.v.6, 2651-2659.
10. Заявка US 2007237788, опубл. 2007.10.11.
11. Патент СА 2438960, опубл. 2002.09.06.
12. Заявка ЕА 200801756, опубл. 2009.02.27.
13. Патент US 5741493, опубл. 1998.04.21.
14. Патент SU 1145029, опубл. 1985.03.15.
15. Lindsay R., Lester L.R., Catherina M.Crill et al. Should Adding Albumin to Parenteral Nutrient Solutions be considered an Unsafe Practice //American Journall of Health - System Pharmacy. - 2006, - Sep 1; 63(17). - P.1656-1661.
16. Заявка US 2006110406, опубл. 2006.05.25.
17. Медуницын H.B. Вакцинология. Изд. 2-е, перераб. и доп. - М.: Триада-X, 2004.
18. Заявка WO 2005113756, опубл. 2005.12.01.
19. Заявка РФ №2009137380, опубл. 2011.04.20.
20. Заявка US 2004028698, опубл. 2004.02.12.
21. Заявка US 4537769 (А), опубл. 1985.08.27.
22. Spackman Е. A brief introduction to the avian influenza virus. // Methods Mol. Biol. - 2008; - 436: P.1-6.
| Таблица 1 | |||||||
| Сравнительная характеристика расщепления вируса гриппа различными группами детергентов | |||||||
| № | Наименование и концентрация раствора детергента | Гемагглютинин | М белок | Нейраминидаза | |||
| мкг/мл | выход, % (от исходного) | мкг/мл | выход, % (от исходного) | ЕД/мл | выход, % (от исходного) | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 1 | Исходный концентрат вируса гриппа | 870 | 100 | 503,3 | 100 | 288 | 100 |
| 2 | 10% AMISOFT® CS-22 Кокоилглутамат натрия и двунатриевый кокоилглутамат (до 0,4%) | 851 | 97,8 | 497 | 98,8 | 285 | 98,9 |
| 3 | 10% AMILITE® ACS-12 Sodium N-Cocoyl-L-Alaninate (до 0,4%) | 839 | 96,4 | 492 | 97,7 | 287 | 99,7 |
| 4 | 10% Amilite® GCS-11 Sodium N-Cocoyl Glyci-nate (до 0,4%) | 854 | 98,2 | 478 | 95 | 278 | 96,5 |
| 5 | 10% AMISOFT® LS-11 Sodium N-Lauroyl-L-Glutamate (до 0,4%) | 809 | 93 | 473 | 94 | 269 | 94 |
| 6 | 2,5%Amisoft® HS-11P Sodium N-Stearoyl-L-Glutamate (до 0,4%) | 826 | 94,9 | 473 | 94 | 272 | 94,4 |
| 7 | 10% раствор лаурилсар-козината натрия (до 0,4%) | 861 | 98,9 | 494 | 98,2 | 284 | 98,6 |
| 8 | 10% дезоксихолат натрия (до 0,4%) | 600 | 68,9 | 265 | 52,6 | 236 | 82 |
| 10 | 10% CAE (до 0,4%) | 683 | 78,5 | 277 | 55 | 144 | 50 |
| 11 | 10% Твин80(до 1%) | 478 | 54,9 | 312 | 62 | 131 | 45,5 |
| 12 | 10% Тритон X100 (до 1%) | 755 | 86,8 | 286 | 57 | 193 | 67 |
| 13 | 1% ТДТАБ (до 0,2%) | 771 | 88,6 | 299 | 59,4 | 224 | 77,8 |
| 14 | 1% СТАВ (до 0,4%) | 800 | 92 | 305 | 60,6 | 218 | 75,6 |
| 15 | 10% Октилглюкозид (до 2%) | 780 | 89,6 | 282 | 56 | 195 | 67,7 |
| Примечание: При расщеплении детергентами катионной и неионной группы наибольший выход гемагглютинина (НА) наблюдается при использовании СТАБ (92%), октилглюкозида (89,6%), ТДТАБ (88,6%), Тритона X100 (86,8%),. При контроле нейраминидазы (NA) наилучшие показатели выявлены при расщеплении дезоксихолатом натрия (82%), ТДТАВ (77,8%), СТАБ (75,6%). Однако необходимо заметить, что при использовании данных детергентов высокого выхода иммунологически активного М-белка не наблюдается. Тогда как, все используемые анионные детергенты показали выход по контролируемым показателям, в.т. по выходу полноразмерного иммунологически активного М-белка, выше проанализированных катионных и неионных. Наибольший выход гемагглютинина (НА) в данном случае наблюдается при использовании Лаурилсаркозината натрия (98,9%), Amilite® GCS-11 (98,2%), AMISOFT® CS-22 (97,8), AMILITE® ACS-12 (96,4%). Наибольший выход по нейраминидазе наблюдается при расщеплении AMILITE® ACS-12 (99,7%), AMISOFT® CS-22 (98,9%), Лаурилсаркозинатом натрия (98,6%), Amilite® GCS-11 (96,5%). Наибольший выход М-белка - AMILITE® ACS-12 (97,7%), Лаурилсаркозинат натрия (98,2%), AMISOFT® CS-22 (98,8%), Amilite® GCS-11. (95%). |
| Таблица 2 | |||||||
| Влияние стабилизации аминокислотами полуфабриката на стадии расщепления | |||||||
| № | Наименование и концентрация раствора детергента и аминокислоты | Гемагглютинин | М белок | Нейраминидаза | |||
| мкг/мл | выход, % (от исходного) | мкг/мл | выход, % (от исходного) | ЕД/мл | выход, % (от исходного) | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 1 | Исходный концентрат вируса гриппа | 870 | 100 | 503. | 100 | 288 | 100 |
| 2 | 10% раствор лаурил-саркозината натрия (до 1%) без стабилизаторов | 783 | 90 | 427 | 84,9 | 253 | 87,8 |
| 3 | 10% раствор лаурил-саркозината натрия (до 0,6%) +10% аргинин (до 1,5%) | 852 | 97,9 | 495 | 98,4 | 285 | 98,9 |
| 4 | 10% раствор лауроил-саркозината (до 0,4%) +10% глицин (до 1,5%) | 861 | 98,9 | 494 | 98,2 | 284 | 98,6 |
| 5 | 10% раствор лаурил-саркозината натрия (до 0,2%) +10% аланин (до 1,5%) | 860 | 98,8 | 498 | 99 | 287 | 99,7 |
| 6 | 10% AMISOFT® CS-22 (до 1%) без стабилизаторов | 791 | 90,9 | 430 | 85,5 | 259 | 89,9 |
| 7 | 10% AMISOFT® CS-22 (до 0,4%) +10% аргинин (до 1%) | 851 | 97,8 | 497 | 98,8 | 285 | 98,9 |
| 8 | 10% AMILITE® ACS-12 (до 1%) без стабилизаторов | 774 | 89 | 425 | 84,5 | 250 | 86,8 |
| 9 | 10% AMILITE® ACS-12 (до 0,4%) +10% глицин (до 1%) | 839 | 96,4 | 492 | 97,7 | 287 | 99,7 |
| 10 | 10% Amilite® GCS- И (до 0,8%) без стабилизаторов | 792 | 91 | 432 | 85,9 | 255 | 88,5 |
| 11 | 10% Amilite® GCS-11 (до 0,2%) +10% аланин (до 1%) | 854 | 98,2 | 478 | 95 | 278 | 96,5 |
| Примечание: Стабилизация концентрата вируса гриппа на стадии расщепления позволяет повысить выход полноразмерного М-белка, а также иммунологически активных поверхностных белков гемагглютинина и нейраминидазы. Кроме того, стабилизация обеспечивает снижение необходимой концентрации детергентов в зависимости от используемой в процессе аминокислоты. В частности, аминокислоты аланин и глицин усиливают синергетический эффект с жирными кислотами детергентов, что позволяет уменьшить необходимую для расщепления концентрацию детергента до 0,2-0,4% (пробы №№4, 5, 9, 11). |
| Таблица 3 | |||||||
| Влияние стабилизации аминокислотами полуфабриката на стадии ультрацентрифугирования | |||||||
| № | Наименование пробы | Гемагглютинин | М белок | Нейраминидаза | |||
| мкг/мл | выход, % (от исходного) | мкг/мл | выход, % (от исходного) | ЕД/мл | выход, % (от исходного) | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 1 | Исходная проба | 811 | 100 | 526 | 100 | 284 | 100 |
| 2 | Ультрацентрифугирование 1 ч без стабилизаторов | 752 | 92,7 | 475 | 90,3 | 259 | 91,2 |
| 3 | Ультрацентрифугирование 2 ч без стабилизаторов | 705 | 87 | 442 | 84 | 241 | 84,9 |
| 4 | Ультрацентрифугирование 2 ч + аргинин (до 1%) | 798 | 98,3 | 516 | 98 | 277 | 97,5 |
| 5 | Ультрацентрифугирование 2 ч, + гистидин (до 0,5%)и глицин (до 0,5%) | 799 | 98,5 | 502 | 95,4 | 274 | 96,4 |
| 6 | Ультрацентрифугирование 2 ч + аланин (до 1%) | 809 | 99,7 | 506 | 96,2 | 278 | 97,9 |
| 7 | Ультрацентрифугирование 2 ч + глицин (до 1%) | 801 | 98,7 | 512 | 97,3 | 277 | 97,5 |
| 8 | Ультрацентрифугирование 2 ч + аргинин (до 0,5%) и глицин (до 0,5%) | 796 | 98,1 | 514 | 97,7 | 279 | 98,2 |
| Примечание: Процесс ультрацентрифугирования приводит к постепенному снижению HA, M-белка и NA (пробы №2, №3). Добавление аминокислот в качестве стабилизаторов повышает ферментативную активность поверхностного антигена нейраминидазы вируса по сравнению с пробами без стабилизаторов. Кроме того, добавление вышеуказанных стабилизаторов повышает содержание иммунологически активного М-белка. |
| Таблица 4 | |||||
| Влияние добавления аминокислот на содержание наиболее иммунологически активных полимерных форм поверхностных антигенов до и после стадии стерилизующей фильтрации | |||||
| № | Наименование пробы | Гемагглютинин (тримеры) | Нейраминидаза (тетрамеры) | ||
| % | выход, % (от исходного) | % | выход, % 1 (от исходного) | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| До стерилизующей фильтрации: | |||||
| 1 | Концентрат вируса | 3,7 | 100 | 7,9 | 100 |
| После стерилизующей фильтрации: | |||||
| 2 | Концентрат вируса без стабилизаторов | 3,2 | 86,5 | 6,5 | 82 |
| 3 | Концентрат вируса + аргинин (до 1%) | 3,5 | 94,5 | 7,6 | 96.2 |
| 4 | Концентрат вируса + аргинин (до 0,5%) и глицин (до 0,5%) | 3,5 | 94,5 | 7,7 | 97,5 |
| 5 | Концентрат вируса + аланин (до 1%) | 3,6 | 97,3 | 7,75 | 98,1 |
| 6 | Концентрат вируса + глицин (до 1%) | 3,55 | 96 | 7,8 | 98,7 |
| Примечание: Внесение стабилизаторов на стадии стерилизующей фильтрации обеспечивает снижение потерь иммунологически активных фракций антигенов - тетрамеров нейраминидазы и тримеров гемагглютинина (пробы №3, 4, 5, 6), обеспечивая тем самым увеличение иммунологической эффективности вакцины. |
| Таблица 5 | ||||||||
| Количественный анализ содержания вирусных белков при стабилизации полуфабриката вакцины типа A/California 07/09 (H1N1) различными аминокислотами | ||||||||
| Наименование образца | Содержание белков, % | |||||||
| М-белок низко-молекулярные фракции | М-белок с молекулярной массой более 20 кДа | NA/NP | НА (мономеры) | НА (димеры) | НА (гримеры) | Σ М | Σ HA | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| Исходный концентрат вируса гриппа A/California 07/09 (H1N1) (npo6a 2) | 7,3 (13,3 Да) | 18,4 | 18,1 | 15,9 | 23 | 10,2 | 25,7 | 49,1 |
| Полуфабрикат без стабилизации аминокислотами при 0,3 М NaCl (проба 3) | 27,3 (13 Да) | 2,4 | 5,4 | 33 | 3,3 | 14,2 | 29,7 | 50,5 |
| Полуфабрикат без стабилизации аминокислотами при 0,2 М NaCl (проба 4) | 31,7 (12,8 кДа) | 2,9 | 13,1 | 31,5 | 4 | 12,8 | 34,6 | 48,3 |
| Полуфабрикат без стабилизации аминокислотами при 0,15 М NaCl (проба 5) | 26,9 (11,4кДа) | 3,6 | 10,8 | 29 | 3,3 | 14,7 | 30,5 | 47 |
| Полуфабрикат при стабилизации глицином при 0,25 М NaCl (проба 6) | 15,6 (13кДа) | 18,4 | 14,8 | 32 | 4,1 | 16 | 34 | 52,1 |
| Примечание: Стабилизация полуфабриката вируса гриппа позволяет повысить выход полноразмерного М-белка, а также иммунологически активных поверхностных белков гемагглютинина и нейраминидазы. Результаты электрофореза свидетельствуют о получения полуфабриката, содержащего матриксный белок с молекулярной массой более 20 кДа в процентном соотношении 18% от общего вирусного белка. |
| Таблица 6 | |||||||||||||||||
| Количественный анализ содержания вирусных белков при стабилизации полуфабриката вакцины типа B/NIB-58 различными аминокислотами | |||||||||||||||||
| № про-бы | Содержание белков, % | NA (Димер+Тет-рамер)/NA(Mo-номер) | НА (Димер+Тример)/НА(Мо-номер) | ||||||||||||||
| М низко-молекул. | М-мономер | Не-иден-тифи-циро-ван-ный белок | М-димер | NA мономер | NP | НА мономер | NA димер | НА димер | НА тример | NA тет-ра-мер | Σ М (низко-молекул+мономер+димер) | Σ М (моно-мер+димер) | Σ NA | Σ НА | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 |
| 1 | 4,3 | 24,0 | 15,9 | 0 | 8,4 | 5,9 | 23,7 | 4,3 | 2,2 | 8,8 | 2,4 | 28,3 | 24,0 | 15,1 | 34,7 | 0,8 | 0,46 |
| 2 | 13,8 | 26,3 | 12,9 | 0 | 4,3 | 7,4 | 19,9 | 3,5 | 4,9 | 4,8 | 2,2 | 40,1 | 26,3 | 10,0 | 29,6 | 1,33 | 0,48 |
| 3 | 12,9 | 5,0 | 13,6 | 17,7 | 1,3 | 0,9 | 24,1 | 3,2 | 8,4 | 6,3 | 6,6 | 35,6 | 22,7 | 11,1 | 38,8 | 7,54 | 0,61 |
| 4 | 15,1 | 16,6 | 10,2 | 8,7 | 1,3 | 3,9 | 21,8 | 3,2 | 7,7 | 8,3 | 3,2 | 40,4 | 25,3 | 7,7 | 37,8 | 4,92 | 0,73 |
| 5 | 7,2 | 8,8 | 6Д | 22,5 | 3,0 | 0,8 | 24,6 | 3,3 | 7,8 | 8,3 | 7,5 | 38,5 | 31,3 | 13,8 | 40,7 | 3,6 | 0,65 |
| м, кДа | 13,1-13,7 | 21,4-24,6 | 27,6-48,6 | 50,9-52,8 | 55,6-58,1 | 58,9-59,6 | 74,8-81,0 | 115,1-123,5 | 166,1-182,4 | 192,7-198,8 | 220,0 | - | - | - | - | - | - |
| Примечание: Стабилизация полуфабриката вируса гриппа позволяет повысить выход полноразмерного М-белка, а также иммунологически активных поверхностных белков гемагглютинина и нейраминидазы. Результаты электрофореза свидетельствуют о получении соразмерного матриксного белка в виде мономерной и димерной фракций, с молекулярной массой более 20 кДа в процентном соотношении более 8,0% от общего вирусного белка. Наибольший выход мономерной фракции М-белка наблюдается при использовании в качестве стабилизатора комплекса аргинин/глицин при 0,25 М NaCl, наибольший выход димерной фракции М-белка наблюдается при стабилизации аланином при 0,3 М NaCl. |
| Таблица 7 | ||
| Антигенная активность вакцин против вируса гриппа (заявляемой вакцины и вакцины без стабилизаторов-аминокислот) при исследовании на лабораторных животных | ||
| Вакцина | Штамм вируса гриппа | Титр антител в РТГА (на 21 сут) |
| 1 | 2 | 3 |
| Вариант 1 | A/California 07/09,(H1N1), | 1:320 |
| Заявленная вакцина | A/NIB-64 (H3N2) | 1:640 |
| В/NIB-58 | 1:80 | |
| Вариант 2 | A/California 07/09 (H1N1), | 1:80 |
| Вакцина без стабилизаторов-аминокислот | A/NIB-64 (H3N2) | 1:320 |
| В/NIB-58 | 1:40 | |
| Физ. раствор | Менее 1:10 |
| Таблица 9 | |||||||||||
| Количественный анализ размеров частиц исходного концентрата вируса гриппа типа A/NIB-64 (H3N2) | |||||||||||
| Diam x(µ m) | Cum Q3(%) | Diff q3 (%) | Diam x(µ m) | Cum Q3(%) | Diff q3 (%) | Diam x(µ m) | Cum Q3(%) | Diff q3 (%) | |||
| 1 | 300.000 | 100 000 | 0.000 | 18 | 9.014 | 100 000 | 0.000 | 35 | 0.271 | 99.845 | 16.392 |
| 2 | 244.106 | 100 000 | 0.000 | 19 | 7.334 | 100 000 | 0.000 | 36 | 0.220 | 83.453 | 5.652 |
| 3 | 198.626 | 100 000 | 0.000 | 20 | 5.968 | 100 000 | 0.000 | 37 | 0.179 | 77.801 | 0.143 |
| 4 | 161.620 | 100 000 | 0.000 | 21 | 4.856 | 100 000 | 0.000 | 38 | 0.146 | 77.659 | 10.144 |
| 5 | 131.508 | 100 000 | 0.000 | 22 | 3.951 | 100 000 | 0.000 | 39 | 0.119 | 67.515 | 63.306 |
| 6 | 107.006 | 100 000 | 0.000 | 23 | 3.215 | 100 000 | 0.000 | 40 | 0.097 | 4.209 | 4.175 |
| 7 | 87.070 | 100 000 | 0.000 | 24 | 2.616 | 100 000 | 0.000 | 41 | 0.079 | 0.034 | 0.034 |
| 8 | 70.847 | 100 000 | 0.000 | 25 | 2.129 | 100 000 | 0.000 | 42 | 0.064 | 0.000 | 0.000 |
| 9 | 57.648 | 100 000 | 0.000 | 26 | 1.732 | 100 000 | 0.000 | 43 | 0.052 | 0.000 | 0.000 |
| 10 | 46.907 | 100 000 | 0.000 | 27 | 1.409 | 100 000 | 0.000 | 44 | 0.042 | 0.000 | 0.000 |
| 11 | 38.168 | 100 000 | 0.000 | 28 | 1.147 | 100 000 | 0.000 | 45 | 0.034 | 0.000 | 0.000 |
| 12 | 31.057 | 100 000 | 0.000 | 29 | 0.933 | 100 000 | 0.000 | 46 | 0.028 | 0.000 | 0.000 |
| 13 | 25.270 | 100 000 | 0.000 | 30 | 0.759 | 100 000 | 0.000 | 47 | 0.023 | 0.000 | 0.000 |
| 14 | 20.562 | 100 000 | 0.000 | 31 | 0.618 | 100 000 | 0.000 | 48 | 0.019 | 0.000 | 0.000 |
| 15 | 16.731 | 100 000 | 0.000 | 32 | 0.503 | 100 000 | 0.000 | 49 | 0.015 | 0.000 | 0.000 |
| 16 | 13.614 | 100 000 | 0.000 | 33 | 0.409 | 100 000 | 0.000 | 50 | 0.012 | 0.000 | 0.000 |
| 17 | 11.078 | 100 000 | 0.000 | 34 | 0.333 | 100 000 | 0.155 | 51 | 0.010 | 0.000 | 0.000 |
| Sampling Mode: manual | Refractive Index: 2.00-0.001 | ||||||||||
| Signal Accumulation Count: 1 | Interval (sec): _ Signal Averaging Count: 128 | ||||||||||
| Max of Absorbance Range: 0.200 | Min of Absorbance Range 0.010 | ||||||||||
| Ultrasonic Dispersion Tine (вес): _ | Walting Time After Ultrasonic Dlspersion(sec): _ | ||||||||||
| Range for Analysis: OFF | Starting Point: 1 S/B Sensor: Enable |
| Таблица 10 | |||||||||||
| Количественный анализ размеров частиц полуфабриката вируса гриппа типа A/NIB-64 (H3N2) после расщепления | |||||||||||
| Diam x(µ m) | Cum Q3(%) | Diff q3 (%) | Diam x(µ m) | Cum Q3(%) | Diff q3 (%) | Diam x(µ m) | Cum Q3(%) | Diff q3 (%) | |||
| 1 | 300.000 | 100 000 | 0.000 | 18 | 9.014 | 100 000 | 0.000 | 35 | 0.271 | 100.000 | 0.000 |
| 2 | 244.106 | 100 000 | 0.000 | 19 | 7.334 | 100 000 | 0.000 | 36 | 0.220 | 100.000 | 0.000 |
| 3 | 198.626 | 100 000 | 0.000 | 20 | 5.968 | 100 000 | 0.000 | 37 | 0.179 | 100.000 | 0.000 |
| 4 | 161.620 | 100 000 | 0.000 | 21 | 4.856 | 100 000 | 0.000 | 38 | 0.146 | 100.000 | 0.000 |
| 5 | 131.508 | 100 000 | 0.000 | 22 | 3.951 | 100 000 | 0.000 | 39 | 0.119 | 100.000 | 0.000 |
| 6 | 107.006 | 100 000 | 0.000 | 23 | 3.215 | 100 000 | 0.000 | 40 | 0.097 | 100.000 | 0.000 |
| 7 | 87.070 | 100 000 | 0.000 | 24 | 2.616 | 100 000 | 0.000 | 41 | 0.079 | 100.000 | 0.000 |
| 8 | 70.847 | 100 000 | 0.000 | 25 | 2.129 | 100 000 | 0.000 | 42 | 0.064 | 100.000 | 0.000 |
| 9 | 57.648 | 100 000 | 0.000 | 26 | 1.732 | 100 000 | 0.000 | 43 | 0.052 | 100.000 | 0.018 |
| 10 | 46.907 | 100 000 | 0.000 | 27 | 1.409 | 100 000 | 0.000 | 44 | 0.042 | 100.000 | 8.200 |
| 11 | 38.168 | 100 000 | 0.000 | 28 | 1.147 | 100 000 | 0.000 | 45 | 0.034 | 99.982 | 0.000 |
| 12 | 31.057 | 100 000 | 0.000 | 29 | 0.933 | 100 000 | 0.000 | 46 | 0.028 | 91.782 | 24.974 |
| 13 | 25.270 | 100 000 | 0.000 | 30 | 0.759 | 100 000 | 0.000 | 47 | 0.023 | 66.808 | 30.937 |
| 14 | 20.562 | 100 000 | 0.000 | 31 | 0.618 | 100 000 | 0.000 | 48 | 0.019 | 35.870 | 18.606 |
| 15 | 16.731 | 100 000 | 0.000 | 32 | 0.503 | 100 000 | 0.000 | 49 | 0.015 | 17.264 | 11.442 |
| 16 | 13.614 | 100 000 | 0.000 | 33 | 0.409 | 100 000 | 0.000 | 50 | 0.012 | 5.823 | 5.810 |
| 17 | 11.078 | 100 000 | 0.000 | 34 | 0.333 | 100 000 | 0.155 | 51 | 0.010 | 0.013 | 0.013 |
| Sampling Mode: manual | Refractive Index: 2.00-0.001 | ||||||||||
| Signal Accumulation Count: 1 | Interval (sec): _ Signal Averaging Count: 128 | ||||||||||
| Max of Absorbance Range: 0.200 | Min of Absorbance Range 0.010 | ||||||||||
| Ultrasonic Dispersion Tine (вес): _ | Walting Time After Ultrasonic Dlspersion(sec): _ | ||||||||||
| Range for Analysis: OFF | Starting Point: 1 S/B Sensor: Enable |
1. Способ получения вакцины против вируса гриппа, включающий получение вирусного концентрата из вируссодержащей жидкости, осветление, очистку, концентрирование, инактивацию, расщепление концентрата вируса гриппа, ультрафильтрацию, разведение полученного концентрата и стерилизующую фильтрацию моновакцины, отличающийся тем, что расщепление проводят аминокислотными анионными детергентами в присутствии натрия хлорида 0,3 - 2,0 М, стадии расщепления, ультрафильтрации и последующего разведения проводят в присутствии стабилизаторов нейтральных и/или основных аминокислот.
2. Способ по п.1, согласно которому после стадии расщепления, дополнительно, может быть проведено ультрацентрифугирование в присутствии стабилизаторов нейтральных и/или основных аминокислот.
3. Способ по п.1 или 2, где в качестве расщепляющего компонента используют аминокислотные анионные детергенты - лаурилсаркозинат натрия, Amilite ACS-12, Amilite GCS-12, Amisoft-CS-22 в концентрациях 0,2-1,0%.
4. Способ по п.1, где стабилизаторы - основные - аргинин, лизин, гистидин или нейтральные - аланин, глицин, пролин, изолейцин и/или их комбинации используют на стадии расщепления до конечной концентрации 0,1-0,5 М.
5. Способ по п.1 или 2, где расщепленный концентрат вируса гриппа дополнительно стабилизируют твином 80 до конечной концентрации 0,005-0,1%.
6. Способ по п.2, где стабилизаторы - основные - аргинин, лизин, гистидин или нейтральные - аланин, глицин, пролин, изолейцин и/или их комбинации используют на стадии ультрацентрифугирования до конечной концентрации 0,1-0,5 М.
7. Способ по п.1 или 2, где стабилизаторы - основные - аргинин, лизин, гистидин или нейтральные - аланин, глицин, пролин, изолейцин и/или их комбинации используют на стадии ультрафильтрации до конечной концентрации 0,05-0,3 М.
8. Способ по п.1 или 2, где концентрат вируса гриппа в процессе ультрафильтрации дополнительно стабилизируют твином 80 до конечной концентрации 0,0025-0,2%.
9. Способ по п.1 или 2, где конечный состав вакцины по стабилизаторам включает по крайней мере одну аминокислоту из группы: основных - аргинин, лизин, гистидин или нейтральных - аланин, глицин, пролин, изолейцин или их комбинации.
10. Способ по п.1 или 2, где комбинации натрия хлорида и аминокислот подбирают в концентрациях, обеспечивающих осмолярность конечной вакцины в пределах 240-600 мОсм/кг.
11. Способ по п.1 или 2, где концентрат вируссодержащей жидкости получен культивированием штамма вируса гриппа в куриных эмбрионах.
12. Способ по п.1 или 2, где концентрат вируссодержащей жидкости получен культивированием штамма вируса гриппа на культуре клеток.
13. Вакцина против вируса гриппа, полученная согласно пп.1-12, содержащая гемагглютинин, нейраминидазу и матриксный белок с молекулярной массой более 20 кДа, стабильная при хранении.
14. Вакцина по п.13, отличающаяся тем, что вакцина может содержать адъювант.
