Способ оценки детоксикационной активности черноземов в агроценозах
Владельцы патента RU 2525677:
Государственное научное учреждение Сибирский научно-исследовательский институт земледелия и химизации сельского хозяйства, Россельхозакадемии (RU)
Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает отбор проб почвы, внесение в почву метсульфурон метила (МСМ) в заданном количестве с последующей инкубацией и определением удельной метаболической активности (УМА) сапрофитного комплекса почвы при помощи мультисубстратного тестирования (МСТ) и учета числа КОЕ (колониеобразующих единиц) на разбавленной агаризованной среде. Уровень детоксикационной активности оценивают по относительной величине повышения УМА сапрофитного микробного сообщества почвы при внесении МСМ в сравнении с показателями почвы без его внесения (показатель Кд). 4 табл., 1 пр.
Изобретение относится к сельскому хозяйству, почвенной микробиологии, экологии, а именно определению самоочищающей способности почвы.
Детоксикационная (самоочищающая) активность почвы - способность почвы к разложению, инактивации токсикантов естественного и антропогенного происхождения, обусловленная, прежде всего, ее биологическими свойствами.
Методические подходы к решению проблемы можно подразделить на прямое определение токсиканта в почве при помощи физико-химических анализов и косвенное - при помощи различных биотестов.
Первая группа методов, как известно, требует достаточно дорогостоящего оборудования. Во второй возникает сложная проблема выбора индикаторного показателя из их обширного списка. К настоящему времени ясно, что не существует единого критерия для оценки экотоксилогических последствий тех или иных агротехнологий, вследствие чего возникает необходимость применения комплекса показателей, отражающих различные стороны функционирования микробного сообщества почвы. Традиционный подход к проблеме предусматривает определение числа тех или иных групп микроорганизмов. Попытка применения показателей активности (дыхание, нитрификация, ферментативная активность и др.) часто дает противоречивые результаты. Это вполне понятно, так как последние отражают отдельные стороны функционирования микробной системы почвы. В этих условиях возрастает актуальность исследований, связанных с поиском более или менее интегрального показателя для оценки способности почвы к детоксикации пестицидов. Заявленный способ предусматривает в качестве такового количественную меру отклика активности и числа КОЕ (колониеобразующих единиц) микробного сообщества почвы при внесении действующего вещества ряда гербицидов, характеризующихся высокой остаточной устойчивостью, которая особенно заметна в почвах с нейтральной и щелочной реакцией среды, в частности в черноземах.
Известен способ оценки остаточных количеств гербицидов с малой дозой действующего вещества (Спиридонов Ю.Я., Шестаков В.Г., Ларина Г.Е. Как ослабить остаточное действие сульфонилмочевинных гербицидов// Защита и карантин растений, 2006, № 2, с. 59-60), к которым относятся гербициды на основе метилсульфурон метила (МСМ),в почве при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), которая предусматривает экстракцию соединения из пробы почвы, пропускание экстракта через хроматографические колонки под высоким давлением и определение искомого соединения при помощи детекторов.
Недостатком известного способа с точки зрения достижения технического результата заявляемого изобретения является низкая эффективность, обусловленная тем, что чувствительность ВЭЖХ при определении остаточных количеств гербицидов с малой дозой действующего вещества, к которым относятся гербициды на основе МСМ, до 30 раз ниже в сравнении с биотестом на высших растениях, и также для осуществления способа требуется специальное дорогостоящее лабораторное оборудование и квалифицированный персонал.
Также известен способ оценки остаточных количеств гербицидов с малой дозой действующего вещества (Колупаев М.В., Матвеев Ю.М., Спиридонов Ю.Я., Шестаков В.Г. Способ определения хлорсульфурона в почве по показателям фитотоксичности // Агрохимия, 1993, №6, с.82-86), к которым относятся гербициды на основе МСМ, в почве, предусматривающий посев семян тест-растения на испытуемый образец почвы и выращивание посевов в камерах с контролируемыми условиями температуры освещенности.
Недостатком известного способа с точки зрения достижения технического результата заявленного изобретения является продолжительность анализа (30 дней), трудоемкость (проведение вегетационного опыта), и также для осуществления способа необходима специальная камера с регулируемыми условиями освещенности и температуры (лаборатория искусственного климата).
Известен также способ оценки самоочищающей способности почвы (Ананьева Н.Д. Микробиологические аспекты самоочищения и устойчивость почв. - М.: Наука, 2003. - 223 с.), предусматривающий внесение в испытуемый образец глюкозы, учет изменения дыхательной активности микробного сообщества в сравнении с почвой без внесения глюкозы и расчет величины микробного метаболитического коэффициента.
Недостатком известного способа с точки зрения достижения технического результата заявляемого изобретения является то, что в известном способе вывод об уровне детоксикационной активности почвы основывается на учете функционального отклика микробного сообщества при внесении только одного источника углерода (глюкозы), что снижает эффективность оценки детоксикационной активности почвы, также для осуществления способа требуется специальное лабораторное оборудование - газовый хроматограф.
Наиболее близким к заявленному изобретению по совокупности признаков является способ (патент РФ № 2335543, МПК C12Q 1/02 (2006.01), опубликован 10.10.2008), который предусматривает отбор проб почвы, получение суспензии почвенного микробного комплекса внесение суспензии в ячейки тест-планшета, содержащего набор тест-субстратов, минеральную среду и индикатор потребления субстратов, последующую инкубацию тест-планшетов в термостатируемой камере до появления окраски индикатора, фотометрическую регистрацию интенсивности окраски индикатора. Далее проводят математический анализ полученных спектров потребления субстратов. Принят за прототип.
Недостатком известного способа с точки зрения достижения технического результата заявляемого изобретения является то, что в известном способе не предусмотрен учет числа КОЕ в исходной почвенной вытяжке, что не позволяет оценить влияние микробной заселенности исходной вытяжки в формировании окраски индикатора, что снижает эффективность определения детоксикационной активности почвы.
Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение эффективности оценки детоксикационной активности черноземов путем разработки количественного критерия.
Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что в способе оценки функциональной активности почвенного микробного сообщества на основе мультисубстратного тестирования (МСТ), предусматривающего отбор проб, получение суспензии почвенного микробного комплекса, внесение суспензии в ячейки тест-планшета, содержащего набор тест-субстратов, минеральную среду, индикатор потребления субстратов, последующую инкубацию тест-планшетов в термостатируемой камере до появления окраски индикатора, фотометрическую регистрацию интенсивности окраски индикатора, в образец почвы вносят метсульфурон метил (МСМ) в дозе 10 мкг/100 г в.c. почвы, после инкубации в течение 10-15 суток определяют уровень метаболической активности микробного сообщества почвы по методу МСТ с использованием набора из 24 тест- субстратов (дульцит, инозит, маннит, сорбит, глицерин, мальтоза, лактоза, раффиноза, глюкоза, арабиноза, рамноза, ксилоза, галактоза, фруктоза, сахароза, крахмал, ацетат натрия, цитрат натрия, цитрат аммония, малат калия, тартрат калия-натрия, мочевина, карбоксиметилцеллюлоза, ТВИН-80) с добавлением в среду пептона, конечная концентрация субстрата в реакционной смеси - 0,2, пептона - 0,1%, проводят учет числа КОЕ на агаризованной среде, содержащей сухую питательную среду МПА (мясопептонный агар) - 0,3 г/л, пептон - 0,6, глюкоза - 0,1, рассчитывают величину удельной метаболической активности (УМА) микробного сообщества, представляющего собой отношение суммы баллов оценки метаболической активности по 24 субстратам к числу КОЕ, млн/г почвы, рассчитывают показатель Кд, показывающий прирост УМА в почве с пестицидом в % от показателя почвы без внесения МСМ и по предлагаемой шкале оценивают уровень детоксикационной активности почвы, причем активность считается низкой, если при внесении в образец почвы МСМ Кд превышает 200%, средней - при 100-200%, высокой - 20-100%, очень высокой - 0-20%.
Предлагаемый в заявке критерий детоксикационной активности почвы (Кд), полученный на основе одновременного учета оклика на внесение МСМ активности и числа КОЕ микробного сообщества в питательной среде близкого состава существенно повышает эффективность оценки детоксикационной активности почвы, так как отклик сообщества на воздействие токсиканта может заключаться как в изменении активности при постоянном числе КОЕ, так и в изменении числа КОЕ при стабильной активности.
Способ осуществляется следующим образом.
В свежий образец почвы вносят метсульфурон метил в количестве 10 мкг/100 г в.c. почвы, что соответствует дозе гербицида магнум, превышающей рекомендованную в 5 раз. Повторность опыта не менее 3 сосудов. Почву инкубируют в течение 10-15 суток при температуре 23-25°С. После инкубации из каждого сосуда отбирают по 3 средних образца для проведения МСТ и посева на агаризованную среду. Анализ проводят следующим образом. Подготовку образца к анализу проводят по обычной схеме для посева на агаризованные среды. 2 г почвы растирают в 20 мл стерильного фосфатного буфера по Соренсену рН 6,5. Суспензию взбалтывают на лабораторной качалке течение 15 минут, подвергают центрифугированию в течение 20 мин при 4000 об/мин. Инокулят объемом 0,1 мл из разведения 1:10 вносят в 0,5 мл среды, содержащей минеральную основу среды Чапека, субстрат, пептон и индикатор (трихлортетразолий хлористый, ТТХ). Для этих целей можно использовать пробирки Эппендорфа с объемом 1,5 мл с крышкой. Конечная концентрация субстрата в реакционной смеси составляет 0,2%, пептона - 0,1%. Используют набор из 24 тест-субстратов: дульцит, инозит, маннит, сорбит, глицерин, мальтоза, лактоза, раффиноза, глюкоза, арабиноза, рамноза, ксилоза, галактоза, фруктоза, сахароза, крахмал, ацетат натрия, цитрат натрия, цитрат аммония, малат калия, тартрат калия-натрия, мочевина, карбоксиметилцеллюлоза, ТВИН-80.
Инкубацию проводят 40 ч при температуре 28°С. После инкубации содержимое пробирок раскапывают в плоскодонные иммунологические планшеты для оценки степени окрашенности культуральной жидкости. Мутность культуральной жидкости после инкубации не позволяет применение иммунологических счетчиков цветных реакций. Поэтому величину окрашенности оценивают следующим образом. Полученный планшет фотографируют при помощи цифровой фотокамеры и сравнивают с заранее заготовленной шкалой на ПК в режиме сравнения фотографий в 5-6-балльной шкале.
Учет КОЕ. Поскольку скорость развития окраски реакционной смеси зависит от исходного числа микробных клеток в посевном материале, необходима поправка на исходную неравнозначность посевного материала по микробной заселенности. Поэтому одновременно с постановкой МСТ проводят посев той же суспензии на агаризованную среду следующего состава (г/л): сухая питательная среда МПА - 0,3, пептон - 0,6, глюкоза - 0,1. Состав среды приближен к таковому органической основы реакционной смеси МСТ. Инкубацию чашек проводят в тех же условиях, что и пробирки МСТ. Учет проводят через 72 часа после посева.
Анализ проводят из 3 отдельных навесок каждого образца, с каждой навески засевают по 2-3 пробирки. При отсутствии достоверных различий между вариантами опыта числовые значения показателей усредняют, что существенно снижает вероятность случайных колебаний расчетных величин.
Расчет УМА микробного комплекса. По результатам анализа проводят вычисление удельной метаболической активности (УМА) микробного комплекса почвы по формуле: УМА=-Р1+Р2+…Р24/КОЕ (млн/г),
где Р балл оценки степени утилизации того или иного субстрата по окрашенности суспензии. (Сумма баллов оценки окрашенности суспензии по всем задействованным в опыте субстратам служит интегральной характеристикой микробиологической активности микробного сообщества почвы. Отнесение суммы к числу КОЕ является, по сути, поправкой на исходную неравноценность вариантов микробной заселенности.)
Далее вычисляют величину повышения этого показателя относительно контроля без внесения МСМ в процентах по формуле Кд=(УМАО-УМАК)*100/УМАК, где УМАО - удельная метаболическая активность в почве с МСМ, УМАК - то же в чистой почве. Далее по предложенной ниже шкале оценивают детоксикационную активность почвы (таблица 1).
| Таблица 1 | ||
| Шкала для оценки детоксикационной активности почвы | ||
| Кд (повышение УМА при внесении МСМ, % от чистой почвы) | Уровень детоксикационной активности | Критерий оценки (степень исчезновения остаточной фитотоксичности рекомендованной дозы МСМ за 45 суток), % |
| 1 | 2 | 3 |
| >200 | Низкий | 0-20 |
| 100-200 | Средний | 30-50 |
| 20-100 | Высокий | 50-80 |
| 0-20 | Очень высокий | 100 |
Калибровка градаций шкалы проведена при помощи биотеста, а именно, по исчезновению остаточной фитотоксичности МСМ, внесенного в почву в рекомендованной дозе, в течение 45 дней. В качестве тест-растения использовали редис.
Пример расчета предлагаемого критерия Кд приведен в табл. 2.
В исследовании были задействованы образцы чернозема выщелоченного Новосибирского Приобья, отобранные с сельскохозяйственных угодий с различным предшествующим использованием.
Применение заявляемого способа позволило показать, что запахивание всей нетоварной части урожая пшеницы в течение 3 ротаций трехпольного зернопарового севооборота позволяет повысить детоксикационную способность почвы на одну градацию - от среднего до высокого уровня (таблица 2). Дальнейшее повышение биомассы поступающего в почву растительного опада путем замены чистого пара занятым и сидеральным не приводило к соответственному повышению способности чернозема к детоксикации МСМ. Следовательно, для обеспечения способности исследуемой почвы к детоксикации пестицидов в течение текущего после применения вегетационного периода достаточно всей нетоварной части урожая в севообороте.
| Таблица 2 | ||||||
| Детоксикационная активность чернозема выщелоченного Приобья при различных агротехнологиях | ||||||
| Агрофон | Уровень детоксикационной активности | Вариант | Сумма баллов при МСТ | Число КОЕ, млн/г | УМА | Кд (повышение УМА, % контроля) |
| Бессменные зерновые на протяжении 27 лет | низкий | Контроль | 5-15 | 10-15 | 0,5-1 | |
| МСМ | 35-40 | 10-20 | 2-3,5 | 250-300 | ||
| Удаление соломы с поля + чистый пар | средний | Контроль | 10-20 | 10-16 | 1-1,3 | |
| МСМ | 55-63 | 18-20 | 3-3,2 | 150-180 | ||
| Оставление соломы на поле + чистый пар | высокий | Контроль | 25-40 | 21-23 | 1,2-1,7 | |
| МСМ | 45-55 | 20-25 | 2,1-2,3 | 30-90 | ||
| Оставление соломы на поле + занятый пар | высокий | Контроль | 30-35 | 22-24 | 1,4-1,5 | |
| МСМ | 55-60 | 22-24 | 2-2,5 | 70-80 | ||
| Оставление соломы на поле + сидеральный пар | высокий | Контроль | 35-40 | 21-22 | 1,7-1,8 | |
| МСМ | 55-65 | 20-23 | 2,7-2,8 | 55-65 | ||
| Залежь многолетняя | очень высокий | Контроль | 80-10 | 25-30 | 3,2-3,3 | |
| МСМ | 90-110 | 25-30 | 3,6-3,7 | 10-15 | ||
| Примечание. В указанные интервалы входят не менее 75% экспериментальных значений при n=21.* Контроль - почва без внесения МСМ. |
Предлагаемый в изобретении способ оценки детоксикационной активности черноземов прост в исполнении, не требует специального лабораторного оборудования и может быть использован в малобюджетных лабораториях.
Примеры применения предлагаемого способа приведены в табл. 3 и 4.Детоксикационная активность почвы как функция ее живой фазы достаточно динамична. Однако экспериментально проверить это положение крайне сложно, из-за отсутствия доступного информативного способа. Использование в заявленном изобретении МСМ в качестве тест- системы для оценки детоксикационной активности почвы (ДАП) обусловлено тем, что поведение этого соединения в почве достаточно хорошо изучено (Boldt T.S., Jacobsen C.S. Different toxic effects of the sulfonylurea herbicides metsulfuron methyl, chlorsulfuron and thifensulfuron methyl on fluorescent Pseudomonas isolated from an agricultural soil// FEMS Microbiol. Lett. 1998. №161. P.29-35/ Norhayati Mohd Tahir et al. Adsorbtion of chlorimuron - ethyl and metsulfuronmethyl on selected Selangor agriculturalsoils// Malasian J. Analyt Sci. 2008. V.12. №2. P.341-347. Ye Q. et al. Causes of phytotoxicity of metsulfuron methyl bound residues is soil// Environ. Pollut. 2003. V.126. №3. P.417-423. Yun L. Y. et al. Fungal degradation of metsulfuron methyl in pure vultures and soil// Chemosphere. 2005. V.60. №4. P.460-466), установлено, что МСМ в дозах, рекомендуемых для применения в агробиоценозе, обычно вызывает повышение метаболической активности микроорганизмов, также показано, что длительная остаточная токсичность в почве отмечается именно в условиях недостатка влаги, нейтральной реакции среды и обогащении среды растительными остатками. То есть неблагоприятные с точки зрения агроэкологии свойства МСМ являются полезными для использования МСМ в качестве индикатора самоочищающей способности почвы. Как показано в таблицах 3 и 4, применение заявленного способа позволило проследить зависимость детоксикационной активности чернозема Приобья от ряда факторов. В частности, показано, что внесение минеральных удобрений в почву вместо внесения пожнивных остатков способствовало повышению детокскикационной активности исследуемой почвы на одну градацию (варианты 1-3 в табл.3). То, что это явление связано с действием азотного удобрения, показано на другом опыте (вариант 4 в табл. 3).
Также при помощи предлагаемого способа удалось проследить динамику ДАП в зависимости от гидротермических условий вегетационного периода. Так, предлагаемая в изобретении шкала для оценки ДАП была разработана в 2008-2011 гг., когда показатели температуры и влажности вегетационного периода были в пределах среднемноголетних значений для Приобья.
| Таблица 3 | ||||
| Влияние минеральных удобрений на детоксикационную активность чернозема выщелоченного | ||||
| № | Агрофон | Удобренность | Кд | Уровень ДАП |
| 1 | Удаление соломы с поля | УО | 150-180 | Средний |
| N 120Р45 | 80-100 | Высокий | ||
| 2 | Оставление соломы на поле | УО | 30-90 | Высокий |
| N 120Р45 | 60-70 | Высокий | ||
| 3 | Сидеральный пар | УО | 55-65 | Высокий |
| N 120Р45 | 70-90 | Высокий | ||
| 4 | Бессменные зерновые | УО | 250-300 | Низкий |
| N90 | 100-150 | Средний |
В 2012 г. Наблюдалась сильнейшая засуха при высоких температурах воздуха, а в 2013 г. - переувлажнение при умеренных температурах. Образцы почвы для лабораторных исследований отбирали вовсе годы исследований в конце сентября после осенних дождей. Как видно из табл. 4, при острой засухе общий уровень ДАП в вариантах 1-3 был ниже многолетних значений, тогда как в условиях переувлажнения во всех вариантах уровень ДАП достиг градации «высокий» и не зависел от варианта опыта.
| Таблица 4 | ||||||
| Влияние гидротермических условий вегетационного периода на детоксикационную активность чернозема | ||||||
| Агрофон | Кд | Уровень детоксикационной активности | ||||
| Среднее многолетнее (2008-2011 г.) | При острой засухе (2012 г.) | При переувлажнении (2013 г.) |
Среднее многолетнее (2008-2011 г.) | При острой засухе (2012 г.) | При переувлажнении (2013 г.) | |
| Среднее многолетние | 150-180 | 250-300 | 50-70 | средний | низкий | высокий |
| Оставление соломы на поле | 30-90 | 100-150 | 80-100 | высокий | средний | высокий |
| Сидеральный пар | 70-80 | 80-140 | 60-70 | высокий | средний | высокий |
| Бессменные зерновые | 55-65 | 70-100 | 60-80 | высокий | высокий | высокий |
Таким образом, предлагаемый в изобретении способ позволяет отслеживать изменение ДАП при различных условиях конкретного вегетационного периода.
Способ оценки детоксикационной активности черноземов в агроценозах, предусматривающий отбор проб, получение суспензии почвенного микробного комплекса, внесение суспензии в ячейки тест-планшета, содержащего набор тест-субстратов, минеральную среду, индикатор потребления субстратов, последующую инкубацию тест-планшетов в термостатируемой камере до появления окраски индикатора, фотометрическую регистрацию интенсивности окраски индикатора, отличающийся тем, что в образец почвы вносят метсульфурон метил (МСМ) в дозе 10 мкг/100 г в.c. почвы, после инкубации в течение 10-15 суток определяют уровень метаболической активности микробного сообщества почвы по методу МСТ с использованием набора из 24 тест-субстратов (дульцит, инозит, маннит, сорбит, глицерин, мальтоза, лактоза, раффиноза, глюкоза, арабиноза, рамноза, ксилоза, галактоза, фруктоза, сахароза, крахмал, ацетат натрия, цитрат натрия, цитрат аммония, малат калия, тартрат калия-натрия, мочевина, карбоксиметилцеллюлоза, ТВИН-80) с добавлением в среду пептона, конечная концентрация субстрата в реакционной смеси - 0,2%, пептона - 0,1%, проводят учет числа КОЕ на агаризованной среде, содержащей сухую питательную среду МПА (мясопептонный агар) - 0,3 г/л, пептона - 0,6, глюкозу - 0,1, рассчитывают величину удельной метаболической активности (УМА) микробного сообщества, представляющего собой отношение суммы баллов оценки метаболической активности по 24 субстратам к числу КОЕ, млн/г почвы, рассчитывают показатель Кд, показывающий прирост УМА в почве с пестицидом в % от показателя почвы без внесения МСМ, и по предлагаемой шкале оценивают уровень детоксикационной активности почвы, причем активность считается низкой, если при внесении в образец почвы МСМ Кд превышает 200%, средней - при 100-200%, высокой - 20-100%, очень высокой - 0-20%.
