Способ удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины

Изобретение относится к области медицины. Способ предусматривает отделение подвижных сперматозоидов от спермоплазмы и сопутствующих клеток путем центрифугирования и последующей инкубации в специальных средах с целью забора супернатанта, содержащего «отмытые» сперматозоиды для проведения оплодотворения. Применение способа позволяет удалить ВИЧ из эякулята и свести к минимуму риск инфицирования здоровой супруги. Способ применяется для удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины перед проведением вспомогательных репродуктивных технологий. 2 пр.

 

Настоящее изобретение касается способа удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины перед проведением вспомогательных репродуктивных технологий.

Выделяют три основные составляющие спермы - сперматозоиды, спермоплазму и сопутствующие ядерные клетки. Из спермы ВИЧ-инфицированных мужчин был выделен вирус, а встроенная ДНК ВИЧ обнаруживалась в сопутствующих клетках и даже в неподвижных сперматозоидах. На основании результатов известных исследований был сделан вывод, что жизнеспособные подвижные сперматозоиды, как правило, не несут в себе ВИЧ (Weigel, 1999; Pena, 2003; Gilling-Smith, 2003). Подвижные жизнеспособные сперматозоиды можно выделить из эякулята стандартизованными методами. После отделения сперматозоидов от спермоплазмы и сопутствующих клеток их промывают дважды жидкой питательной средой, а затем помещают в свежую питательную среду и инкубируют в течение 20-60 минут. За это время подвижные сперматозоиды всплывают на поверхность среды, верхний слой которой (супернатант) забирают для проведения оплодотворения. Для того чтобы убедиться в отсутствии вирусных частиц в супернатанте, его проверяют на наличие нуклеиновой кислоты ВИЧ, используя высокочувствительные методы обнаружения ВИЧ (Weigel, 2001; Gilling-Smith, 2003). Поскольку теоретически не исключено, что после обработки спермы в супернатанте может содержаться ВИЧ, важно, чтобы способ удаления ВИЧ был настолько эффективен, чтобы концентрация вируса снижалась до неопределяемых значений.

Для удаления ВИЧ из спермы известен способ, включающий процедуру центрифугирования и инкубации (Semprini А.Е, Levi-Setti P., Bozzo М., et al. Insemination of HIV-negative women with processed semen of HIV-positive partners. Lancet 1992; 340:1317-1319). Однако данный метод не гарантирует полного удаления ВИЧ из спермы.

Задача изобретения - исключение заражения женщины ВИЧ-инфекцией за счет полного удаления вируса иммунодефицита человека.

Указанная задача решается с помощью способа удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины, включающего отделение подвижных сперматозоидов от спермоплазмы и сопутствующих клеток путем центрифугирования и последующей инкубации в специальных средах с целью забора супернатанта, содержащего «отмытые» сперматозоиды, в котором согласно изобретению каждый этап обработки эякулята проводится в новой стерильной пробирке, цетрифугирование проводится при 300 g в растворах Sil-Select Plus в течение 20 минут, затем осадок, содержащий сперматозоиды, аспирируется пипеткой, не задевая стенок пробирки, и инкубируется в растворе среды FertiCult Flushing medium в течение 80-90 минут.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Привести семенную жидкость и все необходимые для процедуры принадлежности к температуре 37°C.

2. Поместить 2,5 мл 40% раствора Sil-Select Plus в стерильную центрифужную пробирку (верхний слой).

3. Поместить 2,5 мл 80% раствора Sil-Select Plus под верхний слой.

4. Поместить 2,5 мл спермы на верхний слой.

5. Центрифугировать 20 минут при 300 g.

6. Удалить супернатант до осадка.

7. Осадок аккуратно аспирировать пипеткой (не задевая стенок пробирки), поместить в другую стерильную пробирку, а затем добавить 3 мл среды для промывки спермы FertiCult Flushing medium и ресуспендировать осадок.

8. Центрифугировать 10 минут при 300 g.

9. Удалить супернатант до осадка.

10. Осадок аккуратно аспирировать пипеткой (не задевая стенок пробирки), поместить в другую стерильную пробирку, а затем добавить 3 мл среды для промывки спермы FertiCult Flushing medium и ресуспендировать осадок.

11. Центрифугировать 10 минут при 300 g.

12. Удалить супернатант до осадка.

13. Осадок аккуратно аспирировать пипеткой (не задевая стенок пробирки) и затем поместить в другую стерильную пробирку.

14. Осадок, содержащий сперматозоиды, аккуратно покрыть 2 мл среды FertiCult Flushing medium, и пробирку поместить в инкубатор под углом 45° на 80-90 минут для того, чтобы позволить наиболее подвижным сперматозоидам передвинуться в среду. Затем 0,7 мл аспирировать.

15. В случае достаточного количества и качества сперматозоидов раствор делится на 2 равные части. Первая часть доставляется в ПЦР - лабораторию сразу же после процедуры обработки для тестирования на наличие РНК ВИЧ, вторая часть немедленно подвергается криоконсервации. При получении отрицательного анализа на ВИЧ проводится искусственное оплодотворение.

Примеры конкретного осуществления.

Пример 1. Пациент А. В сперме методом ПЦР было определено 32500 копий РНК ВИЧ. Проводилось центрифугирование спермы в градиентных растворах Sil-Select Plus в течение 20 минут при скорости 300 g. После центрифугирования и забора супернатанта, в осадке, содержащем подвижные сперматозоиды, было обнаружено 1200 копий РНК ВИЧ. С учетом того, что на стенках остается небольшое количество супернатанта, содержащего ВИЧ, аспирация осадка проводилась пипеткой, не задевая стенок пробирки. Осадок переносился в другую стерильную пробирку. Затем к осадку добавляли среду для промывки FertiCult Flushing medium и проводили ресуспендирование. Промывку осадка проводили дважды при скорости 300 g в течение 10 минут. После окончания промывки, в осадке, содержащем подвижные сперматозоиды, обнаружено 150 копий РНК ВИЧ. Осадок аспирировался пипеткой (не задевая стенок пробирки) и затем помещался в другую стерильную пробирку.

В новой пробирке осадок, содержащий сперматозоиды, медленно покрывался 2 миллилитрами среды FertiCult Flushing medium, а затем пробирку помещали в инкубатор под углом 45° на 80 минут для того, чтобы позволить наиболее подвижным сперматозоидам передвинуться в среду. По окончании времени инкубации проводилась аспирация 0,7 мл. супернатанта. В аспирированном супернатанте было определено 34 миллиона сперматозоидов с прогрессивным движением, что является достаточным количеством для проведения вспомогательных репродуктивных технологий. Раствор был разделен на 2 равные части. Первая часть была доставлена в ПЦР - лабораторию сразу же после процедуры обработки для тестирования на наличие РНК ВИЧ, вторая часть немедленно подверглась криоконсервации. При тестировании супернатанта копии РНК ВИЧ были не найдены (заключение лаборатории - target not detected).

Пример 2. Пациент В. В сперме методом ПЦР было определено 53500 копий РНК ВИЧ. Проводилось центрифугирование спермы в градиентных растворах Sil-Select Plus в течение 20 минут при скорости 300 g. После центрифугирования и забора супернатанта, в осадке, содержащем подвижные сперматозоиды, было обнаружено 18000 копий РНК ВИЧ. С учетом того, что на стенках остается небольшое количество супернатанта содержащего ВИЧ, аспирация осадка проводилась пипеткой, не задевая стенок пробирки. Осадок переносился в другую стерильную пробирку. Затем к осадку добавляли среду для промывки FertiCult Flushing medium и проводили ресуспендирование. Промывку осадка проводили дважды при скорости 300 g в течение 10 минут. После окончания промывки в осадке, содержащем подвижные сперматозоиды, обнаружено 1100 копий РНК ВИЧ. Осадок аспирировался пипеткой (не задевая стенок пробирки) и затем помещался в другую стерильную пробирку.

В новой пробирке осадок, содержащий сперматозоиды, медленно покрывался 2 миллилитрами среды FertiCult Flushing medium, а затем пробирку помещали в инкубатор под углом 45° на 90 минут для того, чтобы позволить наиболее подвижным сперматозоидам передвинуться в среду. По окончании времени инкубации проводилась аспирация 0,7 мл супернатанта. В аспирированном супернатанте было определено 19 миллионов сперматозоидов с прогрессивным движением, что является достаточным количеством для проведения вспомогательных репродуктивных технологий. Раствор был разделен на 2 равные части. Первая часть была доставлена в ПЦР - лабораторию сразу же после процедуры обработки для тестирования на наличие РНК ВИЧ, вторая часть немедленно подверглась криоконсервации. При тестировании супернатанта копии РНК ВИЧ были не найдены (заключение лаборатории - target not detected).

Было проведено 52 процедуры очистки спермы от ВИЧ. Во всех случаях после очистки РНК вируса иммунодефицита человека не определялась. Поэтому указанный способ удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины можно считать эффективным и безопасным.

Выше было указано, для удаления ВИЧ из спермы известен способ, включающий процедуру центрифугирования и инкубации. Как правило, инкубация при применении такого способа проводится 20-60 минут. Однако данный метод не гарантирует полного удаления ВИЧ из спермы. Это является причиной отказа в использования спермы мужчины в процедуре внутриматочной инсеминации или экстракорпорального оплодотворения с интрацитоплазматической инъекцией сперматозоида.

Такая ненадежность способа обусловлена недостаточным временем инкубации. Это связано с тем, что за 60-минутное время инкубации подвижные сперматозоиды всплывают на поверхность среды, но некоторое количество вируса иммунодефицита человека может не опуститься на дно пробирки и оставаться во взвеси. Необходимо отметить, что при проведении центрифугирования менее 20 минут и при скорости менее 300 g, в осадке отмечается низкая концентрация сперматозоидов, недостаточная для оплодотворения яйцеклеток. При проведении центрифугирования более 20 минут и при скорости более 300 g значительно возрастало количество копий РНК ВИЧ.

Таким образом, предлагаемый способ может быть использован для удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины перед проведением вспомогательных репродуктивных технологий.

Способ удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины, включающий отделение подвижных сперматозоидов от спермоплазмы и сопутствующих клеток путем центрифугирования и последующей инкубации в специальных средах с целью забора супернатанта, содержащего «отмытые» сперматозоиды, отличающийся тем, что каждый этап обработки эякулята проводится в новой стерильной пробирке, цетрифугирование проводится при 300 g в растворах Sil-Select Plus в течение 20 минут, затем осадок, содержащий сперматозоиды, аспирируется пипеткой, не задевая стенок пробирки, и инкубируется в растворе среды FertiCult Flushing medium в течение 80-90 минут.



 

Похожие патенты:

Изобретение касается набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации РНК вируса Хунин методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Изобретение касается набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченного зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации РНК вируса Мачупо методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Представленный способ получения бактериофага включает: засев бактериальной культуры штамма-хозяина в титре 108-109 КОЕ/мл в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивирование в течение 3-3,5 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина, затем на полученный газон культуры штамма-хозяина засевают маточный бактериофаг в титре 105-106 БОЕ/мл и культивируют в течение 13-15 часов при оптимальной температуре и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины. Предложен реассортантный вирус гриппа для производства вакцин.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается синтетических олигонуклеотидов-праймеров. Представленные праймеры фланкируют участки генов PB2, PB1, PA, NP, MP, NS низкопатогенных вирусов гриппа птиц и не дают перекрестных реакций с родственными видам.
Изобретение относится к области вирусологии и касается штамма вируса гриппа H10N7-cyбтипа. Охарактеризованный штамм вируса гриппа A/pochard/Siberia/249/08-МА H10N7-субтипа выделен из клоакального смыва красноголового нырка и адаптирован к линии BALB/c мышей.
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, вирусологии и биотехнологии и касается способа получения вакцины против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.
Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии. Способ оценки активности лечебно-профилактических препаратов против вируса натуральной оспы включает введение в организм модельных животных контрольной и испытуемой групп по заданной схеме суспензии исследуемого противовирусного препарата, интраназальное заражение их штаммом вируса натуральной оспы, инкубацию вируса в организме животных и определение концентрации вируса в легких животных с последующим вычислением оценочных показателей снижения концентрации вируса в легких.

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии. Штамм вируса иммунодефицита человека I-типа ИВ741 выделен на территории РФ от больного не получавшего АРВ-терапию.

Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека, принадлежащему к субтипу B, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии. Представленный штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ735 субтипа В депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им.
Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии. Способ оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов включает введение в организм модельных животных контрольной и испытуемой групп по заданной схеме суспензии исследуемого противовирусного препарата. Проводят интраназальное заражение их штаммом вируса оспы обезьян с последующей инкубацией вируса в организме животных. Определяют концентрацию вируса в легких животных с последующим вычислением оценочных показателей. В качестве модели животных используют обыкновенных степных разнополых сурков Marmota bobak 1-2-годовалого возраста. В качестве штамма вируса оспы обезьян используют штамм вируса оспы обезьян V79-1-005, депонированный в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером V-309. Заявленное изобретение позволяет более адекватно оценить активность лечебных противооспенных препаратов и вакцин. 2 пр., 3 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается вакцины против ящура типа А. Вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма вируса Aphtae epizooticae, сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, серотипа A, депонированного в коллекции ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером №2045/Киргизия/2007-ДЕПА №2045/Киргизия/2007-ДЕП, полученный в перевиваемой культуре клеток ВНК-21, представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура, адъюванты гидроокись алюминия с сапонином и поддерживающую среду в эффективных соотношениях. Вакцина обладает высокой иммуногенностью и способна обеспечить эффективную защиту от возбудителя инфекции ящура, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Ближнего и Дальнего Востока. 11 з.п. ф-лы, 14 табл., 1 ил, 4 пр.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. От племенной нетели выделен штамм вируса блютанга 14 серотипа, депонированный в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №3032. Штамм является новым, ранее неизвестным, выделенным на территории РФ. Изобретение может быть использовано в научно-исследовательских институтах и предприятиях биологической промышленности при конструировании биопрепаратов, в частности вакцин против блютанга 14 серотипа и контроля их иммуногенности, а также изготовления антигенов для диагностических наборов. 2 табл., 3 пр.
Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано при производстве живой холодоадаптированной аттенуированной вакцины против гриппа. Холодоадаптированный штамм вируса гриппа В/Виктория/2/63/87 обладает уникальными мутациями в генах, кодирующих белки PB2, PB1, PA, NP, M1, NS1, и предназначен для получения холодоадаптированных реассортантных штаммов-кандидатов для получения живой гриппозной сезонной вакцины. 2 табл., 5 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для идентификации вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов. Охарактеризованные праймеры комплементарны участкам вариабельного 2-го сегмента генома вируса блютанга нуклеотипа С (6, 14 и 21 серотипы) используются в ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации для идентификации вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов и имеют следующий состав (5'-3'): Прямой: GRAYATGRTGGATATWCCG Обратный: GGCTGCACRTCCAYYGARTC Представленное изобретение позволяет определить генетическую группу нуклеотипа C вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала с помощью ОТ-ПЦР в короткие сроки. 2 табл., 1 пр.
Представленное изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается способа обнаружения микроорганизма вида Vibrio parahaemolyticus. Способ включает посев исследуемого штамма на газон культуры, нанесение капли диагностического препарата фага в центр чашки, выдерживание при температуре 37°С в течение 20-24 часов и подтверждение его принадлежности к микроорганизмам вида V. parahaemolyticus по присутствию лизиса. При этом диагностический препарат фага готовят путем смешивания фагов ФК-44 и ФК-46, приготовленных на основе штамма Vibrio parahaemolyticus КМ-97, в соотношении 1:1 в титре n·108 БОЕ/мл. Представленное изобретение позволяет ускорить идентификацию штаммов V. parahaemolyticus и может быть использовано в лабораторной диагностике острых кишечных инфекций, вызываемых этим микроорганизмом.1 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики гриппа С. Представленный способ включает выявление РНК вируса в мазках из носоглотки человека и животных путем проведения этапов обратной транскрипции и амплификации в одной пробирке методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени со специфичными зондом (5'-TGCTCCTGAAACCAGGACAG-3') и праймерами (5'-GAAATATTGATTGCTGAGACAGA-3', 5'-CCCTCCTGTTATTGCTGAAATTA-3'). Охарактеризованное решение позволяет выявлять вирус гриппа С в клиническом материале. 1 ил., 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и биотехнологии. Штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32°С. Характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал гены, кодирующие поверхностные антигены вируса гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), от эпидемического родительского вируса и остальные шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки, от донора аттенуации. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» под номером 2724. Изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики заболеваемости сезонным гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из указанного штамма. 1 ил., 6 табл.,

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан реассортантный вирус гриппа. Вирус гриппа содержит 6 внутренних геномных сегментов от одного или нескольких вирусов-доноров и геномные сегменты, которые кодируют HA полипептид и NA полипептид. При этом, HA полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6. Описаны также иммуногенная композиция и вакцины, содержашие такой вирус, а также его применение для получения лекарственного средства. Изобретение может быть использовано в медицине. 7 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл.

Представлены наборы олигонуклеотидных зондов и праймеров, биологический микрочип и тест-система для идентификации и типирования вируса гриппа А и В. Охарактеризованная тест-система содержит: набор реагентов для выделения РНК вируса гриппа из биологического материала человека; набор реагентов для проведения ПЦР-амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией, с образованием флуоресцентно-меченных фрагментов генома вируса гриппа, содержащий описанные олигонуклеотиды-праймеры; набор реагентов для проведения гибридизации фрагментов ДНК, полученных после проведения амплификации на биочипе, содержащем элементы с иммобилизованными описанными олигонуклеотидными зондами; и при необходимости, отрицательный и положительный контрольные образцы. Представленные изобретения обеспечивают более доступный и простой метод анализа с высокой специфичностью и низкой стоимостью. 4 н.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 4 пр.
Наверх