Питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов
Владельцы патента RU 2528874:
Государственное научное учреждение Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ Татарский НИИАХП Россельхозакадемии) (RU)
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, фосфорит и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет увеличить скорость роста азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов. 1 табл., 12 пр.
Изобретение относится к области создания биопрепаратов на основе индивидуальных микроорганизмов и их сочетаний (консорциумов) и может быть использовано в микробиологии и сельском хозяйстве.
Известна питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая глюкозу, аспарагин, сульфат калия, кукурузный экстракт, хлорид кальция, фосфат натрия и воду [1]. Недостатком данной питательной среды является относительно низкая скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие на ней роста азотфиксирующих микроорганизмов, вследствие чего она малопригодна для выращивания их консорциума.
Известна питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, карбонат кальция, сахарозу и воду [2]. Недостатком данной питательной среды является относительно низкая скорость роста на ней азотфиксирующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие на ней роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, вследствие чего она также малопригодна для выращивания их консорциума.
Наиболее близким к заявляемому нами объекту по совокупности признаков и достигаемому техническому эффекту является питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу и воду (т.н. среда Берка), описанная в [3]. Недостатком данной питательной среды, которая в связи с указанным обстоятельством взята нами за прототип, также является сравнительно низкая скорость роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов, и, следовательно, их консорциума в целом.
Цель настоящего изобретения - увеличение скорости роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов на питательной среде при выращивании консорциума на их основе.
Поставленная цель достигается тем, что питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II) и воду, дополнительно содержит фосфорит при следующем соотношении компонентов (г/л):
| Дигидрофосфат калия | 0.60-0.70 |
| Гидрофосфат калия | 0.12-0.20 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.15-0.25 |
| Хлорид натрия | 0.15-0.25 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.02-0.06 |
| Молибдат натрия | 0.0005-0.0007 |
| Сульфат железа(II) | 0.002-0.004 |
| Сахароза | 18.0-22.0 |
| Фосфорит | 1.0-1.5 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
В результате использования данной питательной смеси скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов возрастает более чем в 15 раз, фосфатмобилизующих - почти на порядок по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [3].
До настоящего времени в литературе не была кем-либо описана питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая вышеуказанную совокупность ингредиентов вообще и фосфорит в частности. Это обстоятельство дает нам основание считать, что заявляемый нами объект соответствует первому критериальному признаку изобретения по патентному законодательству РФ - новизна. С другой стороны, сопоставление известных признаков питательной среды-прототипа [3] и отличительных признаков заявляемой нами питательной среды (а именно введение в нее фосфорита) не позволяют предсказать априори появления у нее новых по сравнению с прототипом свойств, а именно указанного выше резкого увеличения скорости роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов в рамках вышеуказанного консорциума (в обоих случаях - на порядок и более). Указанное обстоятельство дает нам право утверждать, что заявляемый объект явным образом не следует из известного в данной отрасли техники уровня; следовательно, налицо его соответствие второму критериальному признаку изобретения по патентному законодательству РФ - изобретательский уровень. Предлагаемая нами питательная среда достаточно без особого труда может быть создана в промышленном масштабе и ее применение для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов осуществимо без каких-либо проблем, в связи с чем есть все основания утверждать: заявляемому нами объекту присущ и третий установленный патентным законодательством РФ критериальный признак изобретения, а именно промышленная применимость.
Заявляемая на предмет изобретения питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов может быть проиллюстрирована нижеследующими примерами.
Пример 1
Приготавливают питательную среду для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.60 |
| Гидрофосфат калия | 0.12 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.15 |
| Хлорид натрия | 0.15 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.02 |
| Молибдат натрия | 0.0005 |
| Сульфат железа(II) | 0.002 |
| Сахароза | 18.0 |
| Фосфорит | 1.0 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Составляют консорциум азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов на основе коллекционных (депонированных) штаммов поименованных микроорганизмов (Pseudomonas brassicacearum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10388) и (Sphingobacterium multivorum. Регистрационный номер в ВКПМ В-10385), соответственно, с соотношением 1:1 по количеству КОЕ (колониеобразующих единиц). Для этого предварительно выращивают азотфиксирующие микроорганизмы на агаризованной среде Эшби, а фосфатмобилизующие - на агаризованной среде Муромцева, после чего обе эти культуры высеваются на питательную среду указанного выше состава. Выращивание ведут в течение того периода времени, в котором имеет место прирост их численности (5.0 сут), после чего этот процесс прекращают. Для определения численности микроорганизмов сразу же проводят посев консорциума на агаризованные питательные среды (среда Эшби в случае азотфиксирующих и среда Муромцева в случае фосфатмобилизирующих) и определяют среднюю скорость их роста в (млн·г-1·сут-1) как частное от деления числа микроорганизмов (в миллионах единиц) на массу питательной среды (в г) и время выращивания (в сут). Данные по скорости роста азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов для вышеуказанной питательной среды представлены в Таблице 1.
ПРИМЕР 2
Выполняют, как и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.64 |
| Гидрофосфат калия | 0.16 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.20 |
| Хлорид натрия | 0.20 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.05 |
| Молибдат натрия | 0.0006 |
| Сульфат железа(II) | 0.003 |
| Сахароза | 20.0 |
| Фосфорит | 1.2 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая представлены в Таблице 1.
Пример 3
Проводят таким же образом, как и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.70 |
| Гидрофосфат калия | 0.20 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.25 |
| Хлорид натрия | 0.25 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.06 |
| Молибдат натрия | 0.0007 |
| Сульфат железа(II) | 0.004 |
| Сахароза | 22.0 |
| Фосфорит | 1.5 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Данные по определению скорости роста поименовавнных выше микроорганизмов для указанного случая приведены в Таблице 1.
Пример 4 (сравнительный)
Осуществляют по типу примера 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов приготавливают питательную среду состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.64 |
| Гидрофосфат калия | 0.16 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.20 |
| Хлорид натрия | 0.20 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.05 |
| Молибдат натрия | 0.0005 |
| Сульфат железа(II) | 0.003 |
| Сахароза | 20.0 |
| Фосфорит | 0.8 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Показатели скорости роста вышеуказанных микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.
Пример 5 (сравнительный)
Выполняют подобно примеру 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.64 |
| Гидрофосфат калия | 0.16 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.20 |
| Хлорид натрия | 0.20 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.05 |
| Молибдат натрия | 0.0005 |
| Сульфат железа(II) | 0.003 |
| Сахароза | 20.0 |
| Фосфорит | 1.8 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Данные по определению скорости роста микроорганизмов для этого случая приведены в Таблице 1.
Пример 6 (сравнительный)
Выполняют по той же общей технологии, что и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.50 |
| Гидрофосфат калия | 0.09 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.10 |
| Хлорид натрия | 0.15 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.015 |
| Молибдат натрия | 0.0003 |
| Сульфат железа(II) | 0.001 |
| Сахароза | 14.0 |
| Фосфорит | 1.2 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Результаты по определению скорости роста микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.
Пример 7 (сравнительный)
Проводят, как и пример 1, но выращивание консорциума вышеуказанных микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.90 |
| Гидрофосфат калия | 0.30 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.30 |
| Хлорид натрия | 0.35 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.09 |
| Молибдат натрия | 0.0010 |
| Сульфат железа(II) | 0.006 |
| Сахароза | 28.0 |
| Фосфорит | 1.2 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Данные по скорости роста обоих этих микроорганизмов для указанного случая представлены в Таблице 1.
Пример 8 (сравнительный)
Осуществляют, как и пример 1, но для выращивания консорциума микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.50 |
| Гидрофосфат калия | 0.09 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.10 |
| Хлорид натрия | 0.15 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.015 |
| Молибдат натрия | 0.0003 |
| Сульфат железа(II) | 0.001 |
| Сахароза | 14.0 |
| Фосфорит | 1.8 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Значения скорости роста микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.
Пример 9 (сравнительный)
Осуществляют, применяя описанную в примере 1 общую схему, но выращивание консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.90 |
| Гидрофосфат калия | 0.30 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.30 |
| Хлорид натрия | 0.35 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.09 |
| Молибдат натрия | 0.0010 |
| Сульфат железа(II) | 0.006 |
| Сахароза | 28.0 |
| Фосфорит | 1.8 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Значения скорости роста микроорганизмов для рассматриваемого случая приведены в Таблице 1.
Пример 10 (по прототипу [3])
Выполняют по той же технологической схеме, что и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.64 |
| Гидрофосфат калия | 0.16 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.20 |
| Хлорид натрия | 0.20 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.05 |
| Молибдат натрия | 0.0005 |
| Сульфат железа(II) | 0.003 |
| Сахароза | 20.0 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Данные о скорости роста микроорганизмов для рассматриваемого случая см. в Таблице 1.
Пример 11 (по аналогу [1])
Осуществляют таким же образом, как и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:
| Сульфат калия | 0.20 |
| Хлорид кальция гексагидрат | 3.30 |
| Фосфат натрия додекагидрат | 3.80 |
| Кукурузный экстракт | 0.20 |
| Глюкоза | 10.0 |
| Аспарагин | 1.00 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Сведения о скорости роста микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.
Пример 12 (по аналогу [2])
Выполняют по той же технологической схеме, что и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.10 |
| Гидрофосфат калия | 0.20 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.20 |
| Хлорид натрия | 0.20 |
| Карбонат кальция | 5.00 |
| Сахароза | 20.0 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая также представлены в Таблице 1.
| Таблица 1 | |||
| № примера | Содержание фосфорита в питательной смеси, г/л | Средняя скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов (Pseudomonas brassicacearum), млн·г-1·сут-1 | Средняя скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов {Sphingobacterium multivorum), млн·г-1·сут-1 |
| 1 | 1.0 | 600/5 | 1750/5 |
| 2 | 1.2 | 620/5 | 1780/5 |
| 3 | 1.5 | 610/5 | 1730/5 |
| 4 (сравнительный) | 0.8 | 490/5 | 1520/5 |
| 5 (сравнительный) | 1.8 | 600/5 | 1690/5 |
| 6 (сравнительный) | 1.2 | 540/5 | 1650/5 |
| 7 (сравнительный) | 1.2 | 590/5 | 1700/5 |
| 8 (сравнительный) | 1.8 | 550/5 | 1620/5 |
| 9 (сравнительный) | 1.8 | 570/5 | 1660/5 |
| 10 (по прототипу) | - | 36/5 | 175/5 |
| 11 (по аналогу [1]) | - | 12/5 | 180/5 |
| 12 (по аналогу [2]) | - | 55/5 | 6/5 |
Как можно видеть из приведенных в Таблице 1 данных, применение заявляемой питательной среды, содержащей фосфорит в количестве (1.0-1.5) г/л, позволяет резко увеличить скорости роста азотфиксирующих (Pseudomonas brassicacearum) и фосфатмобилизующих (Sphingobacterium multivorum) микроорганизмов в рамках их консорциума по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [3] и сред-аналогов [1] и [2]. Заявляемые нами количества фосфорита в питательной смеси являются существенными: увеличение этого количества сверх указанного верхнего заявляемого значения (1.5 г/л) не приводит к дальнейшему возрастанию скорости роста как тех, так и других микроорганизмов и даже происходит некоторое ее снижение, при уменьшении же ниже указанного нижнего заявляемого значения (1.0 г/л) имеет место снижение скорости роста.
Аналогичные результаты были зафиксированы нами и на других культурах азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов (в частности, Azotobacter chroococcum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10387 и Achromobacter xylosoxidans, Регистрационный номер в ВКПМ В-10386).
ЛИТЕРАТУРА
[1] Основные микробиологические и биохимические методы исследования почвы (Методические рекомендации) / Под ред. Ю.М.Возняковской. - Л.: ВНИИСХМ, 1987. С.31.
[2] Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 3-е издание переработанное, под ред. Н.С.Егорова. М: Издательство Московского университета. 1995. - С.204.
[3] Патент РФ 2.177.466 (2001), МПК C05F 11/08, C12N 1/20 (прототип).
1. Питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит фосфорит при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.60-0.70 |
| Гидрофосфат калия | 0.12-0.20 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.15-0.25 |
| Хлорид натрия | 0.15-0.25 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.02-0.06 |
| Молибдат натрия | 0.0005-0.0007 |
| Сульфат железа(II) | 0.002-0.004 |
| Сахароза | 18.0-22.0 |
| Фосфорит | 1.0-1.5 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
