Ген звездчатки stellaria media, кодирующий антимикробный пептид sm-amp-x

Авторы патента:

Истомина Екатерина Александровна (RU)

Коростылева Татьяна Викторовна (RU)

Одинцова Татьяна Игоревна (RU)

Славохотова Анна Александровна (RU)

Рогожин Евгений Александрович (RU)

C12N15/29 - гены, кодирующие растительные белки, например тауматин

Владельцы патента RU 2531505:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук (RU)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к гену звездчатки Stellaria media, кодирующему антимикробный пептид звездчатки Stellaria media Sm-AMP-Х, обладающему последовательностью SEQ ID №1. Изобретение решает задачу пополнения ассортимента защитных генов растений для использования в биотехнологии при создании новых форм растений, устойчивых к факторам внешней среды, с помощью методов генной инженерии. 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии растений, конкретно к защитным генам растений, кодирующим антимикробные пептиды (АМР), и может быть использовано для создания сельскохозяйственных культур, устойчивых к патогенам.

В настоящее время более 1 миллиарда человек на Земле недоедают [FAO, 2009. The state of food security in the world 2009. Electronic Publishing Policy and Support Branch Communication Division FAO. http://www.fao.org/docrep/012/i0876e/i0876e00.htm (accessed 23 April 2010)]. При этом население Земли продолжает расти. По прогнозам, к 2050 году оно увеличится на 2-2.5 миллиарда человек [UN Population Council, 2003. Demographic 2000-2050 according to the 2002 revision of the United Nations population projections. Popul. Dev. Rev. 29, 139-145]. Предполагаемое изменение климата и сокращение запасов воды усугубляет проблему обеспечения продовольствием растущее население Земного шара. Все это требует разработки новых сельскохозяйственных систем и технологий для повышения урожайности и качества сельскохозяйственной продукции. Борьба с патогенами и вредителями сельскохозяйственных культур является важнейшей составной частью современного земледелия. Однако в существующем виде практика ведения сельского хозяйства приводит к значительным потерям плодородного слоя почвы и ее чрезмерным загрязнением химическими средствами защиты растений (пестицидами и фунгицидами), что ухудшает экологическую обстановку и губительно для здоровья человека.

Внедрение достижений генетической инженерии, которая позволяет встраивать чужеродные гены, обусловливающие ценные сельскохозяйственные признаки, в геномы культурных растений способно решить многие из указанных проблем. В настоящее время созданы и успешно используются трансгенные растения, обладающие устойчивостью к герибицидам, что позволяет облегчить и усовершенствовать технологию обработки сельскохозяйственных земель и замедляет эрозию почвы, а также растения, устойчивые к насекомым-вредителям, что существенно сокращает объемы используемых для обработки пестицидов. Устойчивость к насекомым-вредителям обеспечивается генами энтомотоксинов бактерии Bacillus thuringiensis [Andrews R.E., Faust R.M., Wabiko H., Raymond K.C., Bulla L.A. The biotechnology of Bacillus thuringiensis. // Crit. Rev. Biotech. 1987. Vol. 6. P. 163-232; Vaeck M., Reynaerts A., Höfte H., Jansens S., De Beuckeleer M., Dean C., Zabeau M., Van Montagu M., Leemans J. Transgenic plants protected from insect attack. // Nature 1987. Vol. 328. P. 33-37]. Генетически модифицированные сельскохозяйственные культуры, устойчивые к гербицидам и насекомым-вредителям, успешно выращиваются в Соединенных Штатах Америки, Бразилии, Аргентине, Индии, Канаде, Китае, Парагвае и Южной Африке на площадях, достигающих 134 млн. га [James C. 2009. Global status of commercialized Biotech/GM crops. ISAAA Brief 41. Executive Summary. http://www.isaaa.org/resources/publications/briefs/41/executive summary/default.asp (accessed 23 April 2010]. Использование культур, устойчивых к гербицидам (преимущественно глифосату) и растительноядным насекомым, во многих случаях приводит к увеличению их урожайности [Munkvold G.P., Hellmich R.L., Rice L.G. Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and non-transgenic hybrids. Plant Dis. 1999. Vol. 81. P. 556-565].

В то время как используя методы генетической инженерии, уже удалось достичь значительных успехов в создании и внедрении в практику сортов, устойчивых к гербицидам и насекомым-вредителям, а на стадии испытаний находятся генетически модифицированные растения, которые обладают улучшенными пищевыми качествами или повышенной урожайностью, устойчивы к засухе или другим видам абиотического стресса, на рынке до сих пор не представлены культуры, устойчивые к грибным и бактериальным заболеваниям [Park J.R., McFarlane I., Phipps R.H., Ceddia G. The role of transgenic crops in sustainable development. Plant Biotechnology Journal 2011.Vol. 9. P. 2-21].

Наибольший интерес в направлении создания таких культур представляют гены антимикробных пептидов растений. Антимикробные пептиды являются важнейшими компонентами иммунной системы растений. Они обладают широким спектром антимикробного действия, не вызывают появления устойчивых форм, и их гены могут быть непосредственно встроены в геном чувствительных к патогенам растений. Дикорастущие сорные растения, которые обладают повышенной устойчивостью к патогенам, являются перспективными донорами генов новых высокоактивных антимикробных пептидов.

Stellaria media - мокрица, или звездчатка средняя, является широко распространенным сорным растением. Звездчатка средняя относится к семейству Гвоздичные Caryophyllaceae, классу двудольные Dicotyledones (Liliopsida), отделу покрытосеменные (цветковые) Magnoliophyta (Angiospermae). В ряде стран она используется в качестве листовой овощной культуры, поэтому применение генов этого растения для улучшения свойств сельскохозяйственных культур, в частности, генов антимикробных пептидов для повышения устойчивости к фитопатогенам, представляется безопасным для здоровья человека и сельскохозяйственных животных.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента защитных генов растений для использования в биотехнологии при создании новых форм растений, устойчивых к факторам внешней среды, с помощью методов генетической инженерии.

Поставленная задача решается с помощью гена звездчатки Stellaria media, кодирующего антимикробный пептид звездчатки Stellaria media sm-amp-x, обладающего последовательностью SEQ ID №1. Антимикробный пептид звездчатки Stellaria media sm-amp-x проявляет антифунгальную активность в тестах in vitro против Aspergillus niger, Fusarium solani и Fusarium oxysporum в микромолярных концентрациях (Таблица 1). Это означает, что ген звездчатки sm-amp-x можно использовать для повышения устойчивости растений к патогенам c использованием методов генетической инженерии.

Гомологичных ДНК и кДНК к заявленной нуклеотидной последовательности ранее известно не было.

Таблица 1.

Антифунгальное действие пептида Sm-AMP-X, кодируемого нуклеотидной последовательностью sm-amp-x и выделенного из Stellaria media L., на конидии грибов через 24 часа после заражения.

Гриб	IC₅₀, мкМ*
Aspergillus niger	4,0
Fusarium solani	7,2
Fusarium oxysporum	5,4
*IC₅₀ соответствует концентрации пептида, при которой достигается 50%-ное ингибирование прорастания спор гриба.

Нуклеотидная последовательность sm-amp-x (SEQ ID №1) соответствует кодирующей части кДНК (мРНК), полученной из проростков звездчатки Stellaria media.

Нуклеотидная последовательность sm-amp-x кодирует белок-предшественник защитного пептида Sm-AMP-X длиной 478 аминокислотных остатков (SEQ ID №2), состоящий из N-концевого сигнального пептида длиной 20 аминокислотных остатков, 11 предположительно пептидных доменов, зрелого пептидного домена из 33 остатков и C-концевого продомена длиной 19 остатков.

Техническим результатом изобретения является модульная структура гена, кодирующего защитный пептид Sm-AMP-X.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1.

Установление структуры кДНК звездчатки Stellaria media, кодирующей новый антимикробный пептид Sm-Amp-X.

Аминокислотная последовательность пептида Sm-Amp-X:

ValAspProAspValArgAlaTyrCysLysHisGlnCysMetSerThrArgGlyAspGlnAlaArgLysIle CysGluSerValCysMetArgGlnAsp.

Тотальную РНК выделяют из 5-дневных проростков с помощью набора реагентов Trizol RNA Prep 100 (Изоген, Россия) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. 2 мкг тотальной РНК используют в качестве матрицы для синтеза кДНК с помощью набора Mint (Евроген, Россия).

Определение структуры кДНК проводят в несколько этапов: определение 3'-концевой части кДНК, определение 5'-концевой части кДНК, получение кодирующей части гена. Для двуступенчатой ПЦР с целью определения 3'-концевой части кДНК на основе известной аминокислотной последовательности пептида Sm-AMP-X были сконструированы и синтезированы праймеры 4CDir1 и 4C Dir2 (Таблица 2).

Таблица 2.

Последовательности праймеров.

Для 3'-области кДНК	4СDir1	5′- GTAGATCCAGA(T/C)GT(A/C/T/G)(A/C)G(A/C/T/G)GC-3′
4СDir2	5′-GCATA(T/C)TG(T/C)AA(A/G)CA(T/C)CA(A/G)TG(T/C)ATG-3′
Универсальный праймер	T7Cap	5′-GTAATACGACTCACTATGGGCAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT-3′
Для 5'-области кДНК	4СRev1	5ґ-ATCAAACCAAAGAGCTAACTTATAC-3ґ

3'-концевую область кДНК амплифицируют с помощью двуступенчатой ПЦР, для первого раунда амплификации используют универсальный праймер T7Cap и специфический праймер 4C Dir1, для второго раунда - универсальный праймер T7Cap и специфический праймер 4C Dir2. Амплифицированные фрагменты клонируют и секвенируют на автоматическом секвенаторе.

На основе установленных нуклеотидных последовательностей фрагментов кДНК был сконструирован и синтезирован праймер для амплификации 5'-областей кДНК sm-amp-x: 4Crev1 (Таблица 2). 5'-фрагмент кДНК амплифицируют с использованием универсального праймера T7Cap и специфического праймера 4Crev1. В результате получают полноразмерную кДНК sm-amp-x, кодирующую белок-предшественник пептида Sm-AMP-X.

Ген звездчатки Stellaria media, кодирующий антимикробный пептид звездчатки Stellaria media Sm-AMP-X, обладающий последовательностью SEQ ID №1.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к растению, обладающему повышенной устойчивостью к AHAS-ингибирующему гербициду, включающему, по крайней мере, одну Shiloh-8 IMI нуклеиновую кислоту, его части, растительной клетке и семени.

Биологический днк маркер для идентификации гена устойчивости к х вирусу картофеля // 2522828

Изобретение относится к области биохимии, в частности к биологическому ДНК маркеру, позволяющему идентифицировать ген Rx у культурного картофеля S. tuberosum и его гомологи у родственных дикорастущих видов рода Solanum sect.

Растения с измененным ростом и/или развитием и способ их создания // 2522480

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу увеличения биомассы или улучшения пролиферации клеток, развития листа и/или репродуктивного развития растения, содержащему увеличение в растении экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей Убиквитин-Специфичную Протеазу, а также к растению, части растения и семени растения, биомасса которых увеличена или пролиферация клеток, развитие листа и/или репродуктивное развитие которых улучшены указанным способом.

Гены и способы обеспечения устойчивости к фитофторозу пасленовых // 2511423

Изобретение относится к области биохимии, в частности к генам устойчивости Rpi для повышения устойчивости к фитофторозу пасленовых у растений семейства пасленовых, а также к белкам, способным опосредовать ответ против Р.infestans.

Гены пшеницы triticum kiharae, кодирующие антимикробные пептиды // 2483109

Изобретение относится к области биохимии. .

Растения, имеющие улучшенные характеристики роста, и способы их получения // 2463352

Изобретение относится к биохимии. .

Красный салат латук // 2460282

Изобретение относится к образующему кочан растению салата латука вида Lactuca sativa, имеющему красные листья по всему кочану, включая центральную часть кочана. .

Регулирующий высоту растений ген и его применения // 2458132

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве. .

Гены звездчатки stellaria media, кодирующие защитные пептиды // 2457251

Изобретение относится к области биотехнологии, к защитным генам растений, кодирующим биологически активные пептиды с антифунгальной активностью. .

Вариант аллергена группы i из роасеае, характеризующийся сниженной аллергенностью и сохраненной т-клеточной реактивностью (варианты), кодирующая его молекула днк и его применение // 2409589

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к получению вариантов аллергена группы I из Роасеае (зубровка душистая), и может быть использовано для специфической иммунотерапии (гипосенсибилизации) пациентов, имеющих аллергии на пыльцу растений, или для профилактической иммунотерапии аллергий на пыльцу.

Композиция для усиления экспрессии трансгена в эукариотических клетках и способ увеличения продукции целевого белка, кодируемого трансгеном // 2546249

Изобретение относится к области биохимии, в частности к композициям для интенсивной продукции целевого белка в эукариотических клетках, включающим ДНК-вектор со вставкой гена целевого белка и агонист клеточных рецепторов. Также изобретение относится к способам увеличения продукции целевого белка, кодируемого трансгеном, в эукариотических клетках с использованием вышеуказанных композиций. Изобретение позволяет эффективно увеличивать продукцию целевого белка в эукариотических клетках. 4 н. и 24 з.п. ф-лы, 4 ил., 7 табл., 10 пр.

Фарнезен-синтаза // 2546877

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлены: выделенный из томата полинуклеотид, соответствующий SEQ ID NO:1, представленной в описании, или полинуклеотид, который имеет, по меньшей мере, 70% идентичность с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, или их фрагмент, которые кодируют полипептид с активностью фарнезен-синтазы, соответствующий SEQ ID NO:2, представленной в описании, или имеющий, по меньшей мере, 70% идентичность с аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:2, или их фрагмент. Описаны генетические конструкции, содержащие указанный полинуклеотид, где генетические конструкции представляют собой трансформационный вектор и экспрессионный вектор. Раскрыт трансформационный вектор, содержащий полинуклеотид, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим указанный полипептид. Описана клетка-хозяин для экспрессии фарнезен-синтазы, содержащая генетическую конструкцию, выбранную из указанных. Предложен способ получения альфа-фарнезена и/или бета-фарнезена, включающий стадии культивирования указанной клетки-хозяина с получением повышенной активности альфа-фарнезен-синтазы и/или активности бета-фарнезен-синтазы; и необязательно получения клетки с фарнезилдифосфатом; и выделения полученных альфа-фарнезена и/или бета-фарнезена. Раскрыт способ модулирования продуцирования растением альфа-фарнезена и бета-фарнезена, включающий повышение или уменьшение экспрессии указанной фарнезен-синтазы, где указанного повышения или уменьшения достигают с помощью генетической модификации для изменения экспрессии полинуклеотида, кодирующего указанный полипептид. Предложено применение полинуклеотида по настоящему изобретению для картирования молекулярного (ДНК) маркера, связанного с указанной нуклеотидной последовательностью. Изобретение позволяет получать альфа-фарнезен и бета-фарнезен в клетке-хозяине. 13 н. и 3 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 1 пр.

Белки, связанные с формой зерен и листьев риса, гены, кодирующие указанные белки, и их применения // 2553206

Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению гена, кодирующего белок, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO.2, для получения трансгенного риса с длинными, большими и многочисленными зернами и увеличенной урожайностью, увеличенным количеством зерен в метелке и скрученными листьями. Раскрыто применение трансгенной линии клеток риса и рекомбинантного вектора для получения трансгенного риса с длинными, большими и многочисленными зернами и увеличенной урожайностью, увеличенным количеством зерен в метелке и скрученными листьями. Изобретение позволяет эффективно получать трансгенный рис с длинными, большими и многочисленными зернами и увеличенной урожайностью, увеличенным количеством зерен в метелке и скрученными листьями. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 16 ил., 4 табл., 2 пр.

Белок-фактор транскрипции dst с доменом "цинковые пальцы" риса и его применение для регуляции устойчивости к засухе и к действию солей // 2558249

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способам получения растения с повышенной устойчивостью к засухе и действию солей по сравнению с диким видом растения путем снижения экспрессии/функции белка-фактора транскрипции у растения. Также изобретение относится к растению с повышенной устойчивостью к засухе и действию солей, полученное вышеуказанным способом. Изобретение позволяет эффективно получать растения с повышенной устойчивостью к засухе и действию солей по сравнению с диким видом растения. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 6 пр.

Варианты группы 5 аллергенов злаковых со сниженной аллергенностью вследствие мутагенеза остатков пролина // 2575606

Изобретение относится к области биохимии, в частности к гипоаллергенному полипептиду семейства злаковых. Также раскрыты молекула ДНК, кодирующая вышеуказанный гипоаллергенный полипептид, рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий указанную молекулу ДНК, и клетка-хозяин, трансформированная посредством указанной молекулы ДНК или указанным вектором, для получения вышеуказанного гипоаллергенного полипептида. Раскрыты способ получения указанного гипоаллергенного полипептида, применение указанного гапоаллергенного полипептида или указанной молекулы ДНК для получения лекарственного средства и фармацевтический препарат для профилактики или лечения аллергий типа 1, содержащий эффективное количество гипоаллергенного полипептида. Изобретение позволяет эффективно лечить аллергии типа 1. 8 н. и 6 з.п. ф-лы, 8 табл., 9 пр., 24 ил.

Растение, обладающее повышенной устойчивостью или чувствительностью к ингибитору 4-hppd // 2604793

Изобретение относится к области биохимии, в частности к агенту для придания растению устойчивости к ингибитору 4-HPPD, включающему ДНК, кодирующую белок, обладающий активностью, придающей растению устойчивость к ингибитору 4-HPPD. Изобретение также относится к растению, обладающему повышенной устойчивостью к ингибитору 4-HPPD, его клетке и материалу для размножения, а также способу его получения. Также раскрыт способ определения устойчивости или чувствительности к ингибитору 4-HPPD у растения. Изобретение позволяет эффективно получать растение, обладающее повышенной устойчивостью к ингибитору 4-HPPD. 9 н.п. ф-лы, 22 ил., 4 табл., 5 пр.

Растения, экспрессирующие ферменты, деградирующие клеточную стенку, и векторы экспрессии // 2606766

Изобретение относится к области биохимии, в частности к векторам для экспрессии белков в растениях. Представлены варианты трансгенного растения, предназначенного для экспрессии фермента, деградирующего клеточную стенку. Также представлены векторы для экспрессии в трансгенном растении указанного фермента, деградирующего клеточную стенку растения. Кроме того, изобретение относится к способу переработки растительной биомассы, где растительная биомасса содержит трансгенное растение по изобретению. Изобретение обеспечивает высокую ферментативную активность гидролитических ферментов, деградирующих клеточную стенку, в трансгенных растениях и может быть использовано в промышленных и сельскохозяйственных целях. 7 н. и 36 з.п. ф-лы, 73 ил., 6 табл., 22 пр.

Модификации аллергенов группы 6 poaceae (мятликовых), имеющих пониженную аллергенность благодаря мутагенезу пролиновых остатков // 2607373

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, конкретно к рекомбинантным модификациям аллергенов группы 6 Poaceae (мятликовых), и может быть использовано в медицине для предупреждения или терапевтического лечения аллергий типа 1, в инициирование которых вовлечены аллергены группы 6 мятликовых. Получают рекомбинантный аллерген Phl p 6, в котором пролины, которые соответствуют в линеаризованном виде пролинам в положениях 29, 30, 57 и 79 аминокислотной последовательности белка Phl p 6 дикого типа в соответствии с SEQ ID №:2, мутированы отдельно или в комбинации за счет точечных мутаций, выбранных из делеций и замен аминокислот. Настоящее изобретение позволяет получить рекомбинантным путем аллерген Phl p 6 с пониженной IgE реактивностью по сравнению с известными немутантными аллергенами и, в то же время, в значительной степени сохраненной реактивностью T-лимфоцитов. 11 н. и 1 з.п. ф-лы, 20 ил., 2 табл., 3 пр.

Биологический днк-маркер для определения примеси муки мягкой пшеницы в муке твердой пшеницы и продуктах ее переработки // 2615449

Изобретение относится к области биохимии, в частности к биологическому ДНК-маркеру для определения наличия примеси муки мягкой пшеницы в муке твердой пшеницы и продуктах ее переработки, а также к способу определения наличия примеси муки мягкой пшеницы в муке твердой пшеницы и продуктах ее переработки в исследуемых образцах с его использованием. Изобретение может быть использовано для оценки качества поступающего сырья на мукомольных комбинатах и макаронных фабриках, также для оценки качества продукции из муки твердой пшеницы на протяжении всей производственной цепи, в том числе санитарно-эпидемиологических экспертиз, сертификационных испытаний. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 1 пр.

Плазмидный вектор pet-ppsltp, штамм бактерии escherichia coli bl21(de3)star/ pet-ppsltp - продуцент пищевого аллергена гороха pis s 3 и способ получения указанного аллергена // 2618840

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению белков в Escherichia coli, и может быть использовано для получения рекомбинантного пищевого аллергена гороха посевного Pisum sativum. Конструируют плазмидный вектор pET-pPsLTP для экспрессии Pis s 3 в клетках Escherichia coli в составе гибридного белка His8-TrxL-Pis s 3. Трансформируют предложенным вектором родительский штамм Escherichia coli BL21(DE3)Star, получая штамм-продуцент гибридного белка His8-TrxL-Pis s 3. Затем проводят культивирование и последующий лизис клеток штамма-продуцента, аффинную очистку гибридного белка His8-TrxL-Pis s 3 на металлохелатном носителе, расщепление гибридного белка His8-TrxL-Pis s 3 бромцианом по остатку метионина, введенному между последовательностями аллергена Pis s 3 и тиоредоксина, повторную металлохелатную хроматографию и очистку целевого пептида с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Изобретение позволяет получить особо чистый пищевой аллерген Pis s 3, способный связывать специфические антитела. 3 н.п. ф-лы, 5 ил., 4 пр.