Способ получения 4-гидроксиацетофенон-4-о-бета-d-глюкопиранозида (пицеина) из растительного сырья

Изобретение относится к способу получения редкого фенологликозида - 4-гидроксиацетофенон-4-O-β-D-глюкопиранозида (пицеина), обладающего антидиабетической, цитотоксической и антиоксидантной активностями, из стеблей толокнянки обыкновенной путем экстрагирования растительного материала. Способ заключается в предварительном проведении ультразвуковой экстракции измельченного растительного материала 50% этиловым спиртом в соотношении сырье : экстрагент 1:(7-10) в течение 30-40 мин, дальнейшем экстрагировании трижды растительного материала тем же экстрагентом в соотношении сырье : экстрагент 1:(17-19) при температуре 80-90°C в течение 1-1.5 ч, концентрировании объединенных извлечений и последовательной жидкофазной экстракции этилацетатом и н-бутанолом в соотношении 1:0.3 и 1:0.4, пятикратно и трехкратно соответственно. Полученный продукт перекристаллизовывают из этилацетата, очищают хроматографически на оксиде алюминия и перекристаллизовывают из метанола. Изобретение позволяет упростить способ получения высокочистого образца пицеина, а также повысить выход целевого продукта. 5 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к области биоорганической химии и касается способа получения редкого фенологликозида-4-гидроксиацетофенон-4-O-β-D-глюкопиранозида (пицеина).

Установлено, что пицеин обладает способностью к стимуляции адипогенеза в 3T3/L1 клетках, что в свою очередь позволяет рассматривать его в качестве перспективного антидиабетического средства [1]; также известны сведения о наличии у пицеина цитотоксической [2] и антиоксидантной активности [3].

Известны следующие способы выделения пицеина:

- из коры Salix hulteni (семейство Salicaceae) с применением экстракции сырья метанолом, жидкофазной экстракцией гексаном, хлороформом и бутанолом, колоночной хроматографией бутанольной фракции на силикагеле и многократной хроматографией на Сефадексе LH-20; выход-0.08% [2];

- из коры Populus ussuriensis (семейство Salicaceae) с применением экстракции сырья метанолом, жидкофазной экстракцией гексаном, хлористым метиленом и этилацетатом, колоночной многократной хроматографией этилацетатной фракции на Сефадексе LH-20; выход -6.12·10^-3% [3];

- из травы Phagnalon rupestre (семейство Asteraceae) с применением экстракции сырья гексаном, дихлорэтаном, этилацетатом и бутанолом, колоночной хроматографией бутанольной фракции на Сефадексе LH-20, силикагеле, препаративной ВЭЖХ на силикагеле RP-18; выход - 7.72·10^-4% [4];

- из травы Veronica bellidioides (семейство Scrophulariaceae) с применением экстракции сырья метанолом, колоночной хроматографией спиртового экстракта на силикагеле и колонках с сорбентом Lobar; выход - 0.16% [5];

- из травы Verbascum dudleyanum (семейство Scrophulariaceae) с применением экстракции сырья метанолом, жидкофазной экстракцией хлороформом и бутанолом, колоночной хроматографией бутанольной фракции на полиамиде и препаративной ВЭЖХ на силикагеле С-18; выход - 3.02·10^-3% [6];

- из травы Cephalaria stellipilis (семейство Dipsacaceae) с применением экстракции сырья метанолом, жидкофазной экстракцией бутанолом, препаративной ВЭЖХ бутанольной фракции на силикагеле С-18, колоночной хроматографией на силикагеле; выход - 1.56·10^-3% [7];

- из травы Brassica rapa L. (семейство Brassicaceae) с применением экстракции сырья метанолом, жидкофазной экстракцией гексаном, этилацетатом и бутанолом, колоночной хроматографией бутанольной фракции на Сефадексе LH-20, Diaion НР-20, препаративной ТСХ на силикагеле, препаративной ВЭЖХ на силикагеле С-18; выход - 3.96·10^-5% [8];

- из корней Rhodiola crenulata (семейство Crassulaceae) с применением экстракции сырья 80% этанолом, жидкофазной экстракцией этилацетатом, фильтрованием на макропористой смоле D-101, высокоскоростной противоточной хроматографией; выход - 5.10·10^-4% [9];

Недостатками известных методов является длительность технологического процесса, низкий выход целевого продукта, а также использование в качестве сырьевых источников растительных видов, не характерных для флоры Российской Федерации. В качестве альтернативного источника получения пицеина предлагаются стебли толокнянки обыкновенной, обладающей обширным ареалом распространения на территории России. Более того, следует отметить, что стебли данного растительного вида, несмотря на высокую концентрацию пицеина (до 7%), не используются при заготовке официнального растительного сырья - листьев толокнянки. Создание технологии комплексной переработки биомассы толокнянки позволит более полно использовать ресурсы данного растительного вида.

Задачей изобретения является упрощение способа получения высокочистого образца пицеина через уменьшение количества хроматографических этапов, а также повышение выхода целевого продукта.

Технический результат изобретения (получение пицеина) достигается за счет использования нового растительного сырья (стебли толокнянки обыкновенной - Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng., семейство Ericaceae) и комбинации экстракционно-хроматографических методов.

Для достижения указанного технического результата измельченный растительный материал (стебли толокнянки обыкновенной) заливают 50% этанолом в соотношении сырье:экстрагент 1:(7-10) и подвергают смесь ультразвуковой обработке частотой 50 кГц в течение 30-40 мин. Далее к смеси приливают 50% этанол до соотношения сырье:экстрагент 1:(17-19) и экстрагируют при температуре 80-90°C в течение 1-1.5 ч. Извлечение фильтруют в сборник. Экстракцию повторяют в тех же условиях еще два раза. Спиртовые извлечения объединяют и концентрируют до 1/40 от первоначального объема. Водный остаток подвергают жидкофазной экстракции этилацетатом в соотношении 1:0.3 пятикратно, органическое извлечение отбрасывают. Водный остаток после экстракции этилацетатом подвергают жидкофазной экстракции н-бутанолом в соотношении 1:0.4 трехкратно, органическое извлечение объединяют и концентрируют в вакууме до полного удаления органического растворителя. Сухой остаток растворяют в этилацетате при нагревании в соотношении 1:2 (об./об.), отфильтровывают и оставляют при 0-2°C в течение 24-38 ч. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают, промывают на фильтре ледяным 95% этанолом до бесцветных промывных вод. Полученный кристаллический осадок высушивают в сушильном шкафу (полупродукт). Полупродукт растворяют в горячей воде в соотношении 1:50, раствор отфильтровывают и после охлаждения до температуры 20-25°C наносят на колонку, заполненную оксидом алюминия (III) 0-й степени активности в соотношении полупродукт:сорбент 1:50. Колонку элюируют водой в объеме, равном 10 объемам сорбента. Элюат концентрируют в вакууме досуха, сухой остаток растворяют в минимальном объеме метанола при нагревании и оставляют при 0-2°C в течение 24-38 ч. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают, промывают на фильтре ледяным метанолом и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Выход готового продукта (пицеина) составляет 0.35-0.41% от массы растительного сырья.

Выявленные отличительные признаки позволяют сделать вывод о соответствии предлагаемого технологического решения критерию "новизна".

Предложенный способ позволяет получить субстанцию 4-гидроксиацетофенон-4-O-β-D-глюкопиранозида (далее - пицеин) в виде мелкоигольчатого бесцветного порошка, горького вкуса, без запаха, нерастворимого в гексане и петролейном эфире, умеренно растворимого в 40% этаноле и воде, хорошо растворимого в метаноле и этаноле. Потеря массы при высушивании - 2-4%.

Способ иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. 1.1 кг стеблей толокнянки обыкновенной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 1-2 мм. 1 кг измельченного сырья загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 8 л 50% этанола. Полученную смесь перемешивают, вносят стержневой ультразвуковой процессор и обрабатывают смесь ультразвуком мощностью 50 кГц в импульсном режиме в течение 35 мин. После этого ультразвуковой процессор удаляют и загружают в аппарат еще 10 л 50% этанола. Экстрагируют при температуре 80-85°C и периодическом перемешивании в течение 1.2 ч. Извлечение фильтруют в сборник. Экстракцию повторяют в тех же условиях еще два раза. Спиртовые извлечения объединяют и концентрируют до 1/40 от первоначального объема. Водный остаток подвергают жидкофазной экстракции этилацетатом в соотношении 1:0.3 пятикратно, органическое извлечение отбрасывают. Водный остаток после экстракции этилацетатом подвергают жидкофазной экстракции н-бутанолом в соотношении 1:0.4 трехкратно, органическое извлечение объединяют и концентрируют в вакууме до полного удаления органического растворителя. Сухой остаток растворяют в этилацетате при нагревании в соотношении 1:2 (об./об.), отфильтровывают и оставляют при 0-2°C в течение 32 ч. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают, промывают на фильтре ледяным 95% этанолом до бесцветных промывных вод. Полученный кристаллический осадок высушивают в сушильном шкафу (полупродукт). Полупродукт растворяют в горячей воде в соотношении 1:50, раствор отфильтровывают и после охлаждения до температуры 20-25°C наносят на колонку, заполненную оксидом алюминия (III) 0-й степени активности в соотношении полупродукт:сорбент 1:50. Колонку элюируют водой в объеме, равном 10 объемам сорбента. Элюат концентрируют в вакууме досуха, сухой остаток растворяют в минимальном объеме метанола при нагревании и оставляют при 0-2°C в течение 32 ч. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают, промывают на фильтре ледяным метанолом и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Получают 4.33 г готового продукта (пицеина), что составляет 0.39% от массы исходного сырья.

Пример 2. 1.1 кг стеблей толокнянки обыкновенной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 1-2 мм. 1 кг измельченного сырья загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 10 л 50% этанола. Полученную смесь перемешивают, вносят стержневой ультразвуковой процессор и обрабатывают смесь ультразвуком мощностью 50 кГц в импульсном режиме в течение 40 мин. После этого ультразвуковой процессор удаляют и загружают в аппарат еще 9 л 50% этанола. Экстрагируют при температуре 85-90°C и периодическом перемешивании в течение 1.5 ч. Извлечение фильтруют в сборник. Экстракцию повторяют в тех же условиях еще два раза. Спиртовые извлечения объединяют и концентрируют до 1/40 от первоначального объема. Водный остаток подвергают жидкофазной экстракции этилацетатом в соотношении 1:0.3 пятикратно, органическое извлечение отбрасывают. Водный остаток после экстракции этилацетатом подвергают жидкофазной экстракции н-бутанолом в соотношении 1:0.4 трехкратно, органическое извлечение объединяют и концентрируют в вакууме до полного удаления органического растворителя. Сухой остаток растворяют в этилацетате при нагревании в соотношении 1:2 (об./об.), отфильтровывают и оставляют при 0-2°C в течение 38 ч. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают, промывают на фильтре ледяным 95% этанолом до бесцветных промывных вод. Полученный кристаллический осадок высушивают в сушильном шкафу (полупродукт). Полупродукт растворяют в горячей воде в соотношении 1:50, раствор отфильтровывают и после охлаждения до температуры 20-25°C наносят на колонку, заполненную оксидом алюминия (III) 0-й степени активности в соотношении полупродукт:сорбент 1:50. Колонку элюируют водой в объеме, равном 10 объемам сорбента. Элюат концентрируют в вакууме досуха, сухой остаток растворяют в минимальном объеме метанола при нагревании и оставляют при 0-2°C в течение 38 ч. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают, промывают на фильтре ледяным метанолом и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Получают 4.49 г готового продукта (пицеина), что составляет 0.41% от массы исходного сырья.

Пример 3. 1.1 кг стеблей толокнянки обыкновенной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 1-2 мм. 1 кг измельченного сырья загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 7 л 50% этанола. Полученную смесь перемешивают, вносят стержневой ультразвуковой процессор и обрабатывают смесь ультразвуком мощностью 50 кГц в импульсном режиме в течение 30 мин. После этого ультразвуковой процессор удаляют и загружают в аппарат еще 10 л 50% этанола. Экстрагируют при температуре 80-85°C и периодическом перемешивании в течение 1 ч. Извлечение фильтруют в сборник. Экстракцию повторяют в тех же условиях еще два раза. Спиртовые извлечения объединяют и концентрируют до 1/40 от первоначального объема. Водный остаток подвергают жидкофазной экстракции этилацетатом в соотношении 1:0.3 пятикратно, органическое извлечение отбрасывают. Водный остаток после экстракции этилацетатом подвергают жидкофазной экстракции н-бутанолом в соотношении 1:0.4 трехкратно, органическое извлечение объединяют и концентрируют в вакууме до полного удаления органического растворителя. Сухой остаток растворяют в этилацетате при нагревании в соотношении 1:2 (об./об.), отфильтровывают и оставляют при 0-2°C в течение 24 ч. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают, промывают на фильтре ледяным 95% этанолом до бесцветных промывных вод. Полученный кристаллический осадок высушивают в сушильном шкафу (полупродукт). Полупродукт растворяют в горячей воде в соотношении 1:50, раствор отфильтровывают и после охлаждения до температуры 20-25°C наносят на колонку, заполненную оксидом алюминия (III) 0-й степени активности в соотношении полупродукт:сорбент 1:50. Колонку элюируют водой в объеме, равном 10 объемам сорбента. Элюат концентрируют в вакууме досуха, сухой остаток растворяют в минимальном объеме метанола при нагревании и оставляют при 0-2°C в течение 24 ч. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают, промывают на фильтре ледяным метанолом и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Получают 3.88 г готового продукта (пицеина), что составляет 0.35% от массы исходного сырья.

Физико-химические свойства пицеина

Выделенное соединение согласно данным физико-химического анализа является 4-O-β-D-глюкопиранозидом 4-гидроксиацетофенона (пицеин) (рис.1). Основные свойства пицеина приведены ниже.

УФ-спектр (MeOH, λ_max, нм): 216, 265. Брутто-формула: C₁₄H₁₈O₇. HR-ESI-MC-спектр (m/z): 321 [M+Na]⁺. ЕI⁺-МС-спектр (m/z): 298 [М+Н]⁺, 136 [М-глюкоза]⁺, 121 [М-глюкоза-СН³]⁺ (100%), 93 [М-глюкоза-CH₃-CO]⁺, 65 [M-глюкоза-CH₃-2×CO]⁺ (рис.1). ¹Н-ЯМР спектр (500 МГц; δ, м.д., J/Гц): 2.63 (3Н, с, Н-8), 3.29-3.82 (4Н, м, Н-3', Н-4') 3.85 (1Н, дд, J=2.1, 12.2, Н-6'), 4.04 (1Н, дд, J=6, 12.2, Н-6'), 4.81 (1Н, д, J=7.4, Н-1'), 7.15 (2Н, д, J=9.2, Н-3, Н-5), 8.03 (2Н, д, J=9.2, Н-2, С-6). ¹³С-ЯМР спектр (125 МГц; δ, м.д.): остаток n-гидроксиацетофенона-27.4 (CH₃, С-8), 119.2 (CH, C-3, C-5), 121.7 (CH, C-2, 2, C-6), 132.9 (C, C-1), 162.8 (C, C-4), 202.3 (C, C-7); остаток β-D-глюкопиранозы-62.3 (CH₂, C-6'), 72.0 (CH, C-4'), 75.3 (CH, C-2'), 78.2 (CH, C-C-5'), 78.8 (CH, C-3'), 102.5 (CH, C-1').

Постадийный контроль технологического процесса получения субстанции пицеина с применением метода ВЭЖХ подтверждает правильность выбранной схемы выделения. Так, в спиртовом извлечении из стеблей A. uva-ursi присутствует ряд соединений, идентифицированных по данным хроматографического анализа как арбутин, галловая кислота, пицеин, 1,6-ди-О-галлоил-глюкоза, (+)-катехин, 3,4,6-три-О-галлоил-глюкоза, (-)-эпикатехин, (+)-галлокатехингаллат, корилагин, хебулаговая кислота и 1,2,3,4,6-пента-О-галлоил-глюкоза (рис.2). Содержание доминирующего компонента - пицеина, в сырье составляет 6.4-7.2%. Применение предварительной жидкофазной экстракции водного остатка спиртового извлечения позволяет удалить большинство примесных компонентов, представителей групп галлотаннинов, эллаготаннинов и катехинов.

В составе бутанольной фракции содержание целевого продукта составляет 45-52% (рис.3). После перекристаллизации бутанольной фракции из этилацетата в полупродукте наблюдается присутствие примеси 1,6-ди-О-галлоил-глюкозы, составляющей 8-12% от массы продукта (рис.4). Хроматографическая очистка полупродукта на колонке с оксидом алюминия (III) приводит к практически полному удалению 1,6-ди-О-галлоил-глюкозы и повышает содержание пицеина в субстанции до 98.5-99.4% (рис.5).

Согласно данным ВЭЖХ предложенный способ получения позволяет получать высокочистый целевой продукт с содержанием пицеина более 98%.

Методика количественного анализа субстанции пицеина. Около 10 мг (точная навеска) субстанции помещают в колбу со шлифом вместимостью 10 мл, растворяют в 5 мл метанола и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. 1 мл полученного раствора фильтруют через кварцевый фильтр Millipore (ø 0.45 мкм) в хроматографическую виалу и используют для анализа методом микроколоночной ВЭЖХ-УФ. Условия ВЭЖХ-УФ: жидкостной хроматограф Милихром А-02 (Эконова); колонка ProntoSIL-120-5-С18 AQ (2×75 мм, ø 5 мкм; Metrohm AG); подвижная фаза: (4.1 М LiClO₄ в 0.1 М HClO₄):H₂O 5:95 (A), MeCN (В); градиентный режим В в А: 7-22% (0-7.6 мин), 22-25% (7.6-8.6 мин), 25-27% (8.6-12.0 мин), 27-100% (12-17 мин), 100-7% (17-20 мин); v 150 мкл/мин; Т_{колонки} 35°C; V_пробы 1 мкл; детектор при 266 нм.

Содержание пицеина в субстанции в процентах (X) вычисляют по формуле:

$$X=\frac{S_1\cdot K_1^v}{m_1}\cdot \frac{m_2}{S_2\cdot K_2^v}\cdot \frac{100}{100-W}\cdot \mathrm{100,}$$

где S₁ - площадь пика пицеина в исследуемом растворе; $$K_1^v$$ - коэффициент разбавления исследуемого раствора (10); m₁ - масса навески субстанции, г; S₂ - площадь пика пицеина в растворе РСО; $$K_2^v$$ - коэффициент разбавления раствора РСО пицеина (1); m₂ - масса навески пицеина, г; W - потеря в массе при высушивании субстанции, %.

Приготовление раствора РСО пицеина. Около 1 мг (точная навеска) пицеина переносят в пробирку Эппендорфа, приливают 1 мл метанола и перемешивают.

Метрологический анализ разработанной методики показал, что относительная ошибка определения пицеина хроматографическим методом не превышает 3%. Полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительных валидационных параметрах методик, что указывает на возможность их использования в практике фармакопейного анализа для определения показателей качества субстанции пицеина (см. табл. 1).

Таблица 1
Метрологические характеристики методики количественного анализа пицеина в субстанции*
$$\overline{x},\%$$	S2	Sx	$$\pm \Delta \overline{x},\%$$	Е, %
99.25	4.441	0.943	2.62	2.64
*n=5, Р=0.95, tPf=2.78

По данным проведенных исследований определены общие показатели качества субстанции пицеина, обобщенные в таблице 2. Для стандартизации субстанции было предложено определение внешнего вида, подлинности, потери в массе при высушивании, количественное определение содержания пицеина в субстанции и содержание посторонних примесей.

Рассчитать экономическую целесообразность предлагаемого способа в настоящее время не представляется возможным по причине отсутствия коммерчески доступных образцов сравнения пицеина, однако вышеуказанные преимущества в сочетании с простой схемой получения способствуют рациональному использованию лекарственного растительного сырья и определяют перспективность внедрения данного способа получения в химическую промышленность.

Таблица 2
Показатели качества субстанции пицеина
Показатель	Метод	Норма
Описание, внешние признаки	Визуальный, органолептический	Рассыпчатый негигроскопичный мелкоигольчатый порошок, цвет от белого до желтовато-белого, запах отсутствует
Подлинность: - УФ-спектр	Спектро-фотометрический	Ультрафиолетовый спектр 0.0005% раствора пицеина в 96% этаноле в области длин волн от 200 до 350 нм должен содержать максимумы поглощения при длинах волн 216±2 и 265±2 нм
- пицеин	- ВЭТСХ	На хроматограмме после проявления должна быть единственная зона синего цвета, совпадающая по подвижности с таковой РСО пицеина; присутствие других зон не допускается
Потеря в массе при высушивании	Гравиметрический	Не более 4%
Количественное определение: - содержание пицеина.	ВЭЖХ	Не менее 98%
Посторонние примеси	ВЭЖХ	На хроматограмме, полученной при количественном анализе субстанции, должен присутствовать единственный доминирующий пик с tR ~ 5.78-5.81 мин. Суммарная площадь других пиков не должна превышать 2%
Хранение		В защищенном от света месте при температуре 12-15°C

На рис.1 изображены структурная формула и схема ЕI⁺-МС-распада пицеина.

На рис.2. изображена хроматограмма спиртового извлечения из стеблей А. uva-ursi, на которой числами обозначены соединения: 1 - арбутин, 2 - галловая кислота, 3 - пицеин, 4 - 1,6-ди-О-галлоил-глюкоза, 5 - (+)-катехин, 6 - 3,4,6-три-О-галлоил-глюкоза, 7 - (-)-эпикатехин, 8 - (+)-галлокатехингаллат, 9 - корилагин, 10 - хебулаговая кислота, 11 - 1,2,3,4,6-пента-О-галлоил-глюкоза.

На рис.3. изображена хроматограмма бутанольной фракции из стеблей А. uva-ursi, на которой обозначено положение пицеина (3).

На рис.4. изображена хроматограмма полупродукта, на которой обозначено положение пицеина (3).

На рис.5. изображена хроматограмма субстанции пицеина, на которой обозначено положение пицеина (3).

1. Morikawa Т., Imura К., Miyake S., Ninomiya K., Matsuda H., Yamachita C., A Muraoka O., Hayakawa Т., Yoshikawa M. Promoting the effect of chemical constituens from the flowers of Poacynum hendersonii on adipogenesis in 3T3/L1 cells // Journal of Natural Medicines. 2012. Vol. 66. P. 39-48.

2. Jeon S.H., Chun W., Choi Y.J., Kwon Y.S. Cytotoxic constituents from the bark of Salix hulteni II Archives of Pharmacal Research. 2008. Vol. 31. P. 978-982. - прототип.

3. Si C, Xu J., Kim J., Bae Y., Liu P., Liu Z. Antioxidant properties and structural analysis of phenolic glucosides from bark ofPopulus ussuriensis Kom. // Wood Science and Technology. 2011. Vol.45. P. 5-13. - Прототип.

4. Gongora L., Manez S., Giner R.M., Recio M.C., Gray A.I., Rios J.-L. Phenolic glycosides from Phagnalon rupestre II Phytochemistry. 2002. Vol.59. P. 857-860. - Прототип.

5. Taskova R., Handjieva N., Peev D., Popov S. Iridoid glucosides from three Veronica species // Phytochemistry. 1998. Vol.49. P. 1323-1327. - Прототип.

6. Tatli I.I., Schuhly W., Kunert O., Bedir E., Akdemir Z.S. Secondary metabolites from the aerial part of Verbascum dudleyanum and their biological activities // Chemistry of Natural Compounds. 2008. Vol.44. P. 292-295. - Прототип.

7. Kayce P., Kirmizigul S. Chemical constituents of two endemic Cephalaria and species // Records of Natural Products. 2010. Vol.4. P. 141-148. - Прототип.

8. Ninomiya M., Efdi M., Inuzuka Т., Koketsu M. Chalcone glycosides from aerial parts of Brassica rapa L. 'hidabeni', turnip // Phytochemistry Letters. 2010. Vol.3. P. 96-99. - Прототип.

9. Chen D., Fan J., Wang P., Zhu L., Peng Y., Du S. Isolation, identification and antioxidative capacity of water-soluble phenylpropanoid compounds from Rhodiola crenulata II Food Chemistry. 2012. Vol.134. P. 2126-2133. - Прототип.

Способ получения редкого фенологликозида - 4-гидроксиацетофенон-4-O-β-D-глюкопиранозида (пицеина) из стеблей толокнянки обыкновенной путем экстрагирования растительного материала, отличающийся тем, что предварительно проводят ультразвуковую экстракцию измельченного растительного материала 50% этиловым спиртом в соотношении сырье : экстрагент 1:(7-10) в течение 30-40 мин, далее растительный материал экстрагируют трижды тем же экстрагентом в соотношении сырье : экстрагент 1:(17-19) при температуре 80-90°C в течение 1-1.5 ч, объединенные извлечения концентрируют и последовательно подвергают жидкофазной экстракции этилацетатом и н-бутанолом в соотношении 1:0.3 и 1:0.4, пятикратно и трехкратно соответственно, полученный продукт перекристаллизовывают из этилацетата, очищают хроматографически на оксиде алюминия и перекристаллизовывают из метанола.