Флуоресцентно-меченый олигонуклеотидный зонд ms8 flip-r для идентификации возбудителя гистоплазмоза histoplasma capsulatum

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен олигонуклеотидный зонд MS8 Flip-R для флуоресцентной детекции возбудителя гистоплазмоза Histoplasma capsulatum методом полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными праймерами HcMs8s, HcMs8as3, имеющий следующую структуру: MS8 Flip-R 5'(ROX)-GGCCTGACCAGTATAACCAAGGCC-(BHQ2) 3', где ROX - флуоресцентный краситель карбокси-Х-родамин, BHQ2 - гаситель флуоресценции "Black Hole 2". Изобретение может быть использовано в медицине для выявления генетического материала возбудителя гистоплазмоза - H. capsulatum в пробах, для диагностики в здравоохранении и для научных исследований, поскольку позволяет в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать ДНК H.

capsulatum в пробах чистых культур и биологическом материале. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала возбудителя гистоплазмоза Histoplasma capsulatum в пробах как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований.

Гистоплазмоз - инфекционное заболевание, вызываемое диморфными грибами, относящимися к роду Н. capsulatum. В эндемичных областях условия окружающей среды представлены умеренным климатом с постоянной влажностью. Ареалами существования Н. capsulatum в естественных условиях служат многие азиатские страны, такие как Индонезия, Тайланд, Индия. Высокоэндемичные очаги Histoplasma capsulatum var. capsulatum - возбудителя классического (американского) гистоплазмоза, расположены вдоль реки Миссисипи (США), в Латинской Америке (Венесуэла, Эквадор, Бразилия, Парагвай, Уругвай, Аргентина). Histoplasma capsulatum var. duboisii - вариант африканского гистоплазмоза, эндемичен для тропических районов Африки. Еще один представитель рода Histoplasma, Histoplasma capsulatum var. farciminosum, вызывает эпизоотический лимфангоит у лошадей, ослов, мулов и в патологии людей какого-либо существенного значения не имеет. Ареал распространения включает средиземноморские страны, Северную Африку и государства Азии (Индия, Пакистан, Япония).

Возбудителя гистоплазмоза относят к агентам II группы патогенности, все работы с ними строго регламентированы СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». Манипуляции с данными грибами могут проводиться только в специализированных учреждениях, квалифицированными специалистами, имеющими опыт работы с возбудителями особо опасных инфекций.

Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления ДНК данных микромицетов и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.

Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителя гистоплазмоза.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для каждого типа возбудителей. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микромицетов.

При детекции продуктов амплификации использование специальных флуоресцентных меток позволяет отказаться от стадии электрофореза, что не только сокращает время проведения анализа, но и снижает риск перекрестной контаминации продуктами ПЦР и, соответственно, уменьшает число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе реакции амплификации, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории силами одного сотрудника. Этот подход позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм. Существует несколько флуоресцентных технологий, различающихся по способам генерации репортерной флуоресценции. В данной заявке используются зонды с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярных маяков» (molecular beacons).

Наиболее близким аналогом являются олигонуклеотидные зонды, разработанные для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени J. Martagon-Villamil с соавторами в 2003 году. Авторы используют 2 зонда с резонансным переносом энергии (LightCycler assay). Принцип метода основан на переносе энергии с одного флуорофора, находящегося на 3′-конце первого зонда, ко второму флуорофору, находящемуся на 5′- конце второго зонда. Излучение детектируется при одновременном связывании обоих зондов с ДНК-матрицей. В качестве ДНК-мишеней для выявления возбудителя гистоплазмоза были выбраны спейсерные области рибосомальных генов [Identification of Histoplasma capsulatum from culture extracts by real-time PCR / Martagon-Villamil J., Shrestha N., Sholtis M., et al. // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol.41, №3, - p.1295-1298].

S.J. Buitrago с соавторами в 2009 году предложили использование двух гибридизационных зондов для одновременного обнаружения ДНК Н. capsulatum и Paracoccidioides brasiïiensis методом ПЦР в режиме реального времени (патент №ЕР 2339026). В качестве ДНК-мишеней авторы выбрали спейсерные области рибосомальных генов. Однако, данные фрагменты генома, как правило, являются высококонсервативными у близкородственных микромицетов, что может приводить к ложноположительным результатам при проведении анализа.

Целью настоящего изобретения является разработка олигонуклеотидного зонда для флуоресцентной детекции результатов анализа методом полимеразной цепной реакции при идентификации H. capsulatum в режиме реального времени.

Цель достигается конструированием специфичного олигонуклеотида, имеющего структуру «шпильки» с флуорофором и гасителем флуоресценции на концах и обладающего комплементарностью к продукту реакции амплификации с праймерами HcMs8s/HcMs8as3 (патент №2464318):

MS8 Flip-R5/(ROX)-GGCCTGACCAGTATAACCAAGGCC-(BHQ2)3/

Где ROX - карбокси-Х-родамин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого сотавляет 580 нм, а длина волны флуоресценции - 605 нм. BHQ2 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 550-650 нм.

Характеристика олигонуклеотидного зонда и ДНК-мишени для его гибридизации.

Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information), был подобран олигонуклеотид, обладающий активностью гибридизационного зонда по типу «молекулярного маяка» к фрагменту генома возбудителя гистоплазмоза, фланкированному праймерами HcMs8s-HcMs8as3. Данный зонд обеспечивает флуоресцентную детекцию продуктов амплификации фрагмента гена MS8 (mold-specific MS8 protein) (GenBank NCBI, AY049031), кодирующего белок H. capsulatum, экспрессия которого происходит в мицелиальной фазе. Протеин ms8 участвует в образовании клеточной стенки гиф, придавая ей гидрофильность и гибкость.

В качестве положительного контроля эксперименты проводили на штаммах H.capsulatum var. capsulatum 6650, 6651, 6652, H. capsulatum var. duboisii 630, 638, H. capsulatum var. farciminosum 12-89, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микромицета в концентрациях от 1×106 клеток/мл до 1×101 клеток/мл. Подсчет клеток дрожжевой фазы проводили в камере Горяева. Апробация флуоресцентного зонда была осуществлена на наборе штаммов возбудителя гистоплазмоза коллекционного центра МЖК ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.

Чувствительность реакции амплификации с флуоресцентно-меченым зондом MS8 Flip-R оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений чистых культур возбудителя гистоплазмоза, и составила- 1×102-1×104 клеток/мл.

Для обнаружения возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР в режиме реального времени оценена возможность использования сконструированного олигонуклеотидного зонда для анализа биологического материала (кровь, суспензия органов, искусственно контаминированные клетками Н. capsulation). Показано, что использование разработанного зонда при постановке реакции амплификации позволяет выявлять ДНК возбудителей гистоплазмоза с чувствительностью 1×104 кл/мл.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика конструирования флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда MS8 Flip-R для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР с флуоресцентной детекцией.

На основе анализа in silico нуклеотидной последовательности фрагмента гена MS8 возбудителя гистоплазмоза, фланкированной праймерами HcMs8s/HcMs8as3 и имеющей длину 361 п.н., сконструирован гибридизационный зонд размером 24 п.н. (таблица 1).

Полученный олигонуклеотид был проанализирован с помощью компьютерной программы Vector NTI Express v.1.1.2 (Life Technologies, США) на предмет образования вторичных структур с праймерами HcMs8s/HcMs8as3, а также с использованием ресурса BLAST на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) для установления гомологии между ним и нуклеотидными последовательностями близкородственных возбудителей особо опасных микозов и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа, гомологии выявлено не было.

Пример 2. Детекция специфических фрагментов ДНК с помощью разработанного зонда MS8 Flip-R для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР в режиме реального времени.

В состав реакционных смесей, помимо анализируемой ДНК, входили комплементарные специфическому фрагменту ДНК Н. capsulatum олигонуклеотидные зонды, меченые флуорофором ROX и гасителем флуоресценции (BHQ2), а также праймеры HcMs8s/HcMs8as3, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Taq-F-ДНК-полимераза. Праймеры и зонд для внутреннего контроля использовали при проверке тест-систем на специфичность и при анализе способов выделения ДНК. В качестве отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили такой же объем дистиллированной воды.

Амплификацию продолжительностью 45 циклов проводили в объеме 25 мкл с использованием «горячего старта».

Анализ продуктов ПЦР осуществляли в режиме реального времени на приборе «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия). Регистрацию результатов проводили в табличной и графической форме с помощью компьютерных программ. Результаты оценивали по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что определяется значением порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов (рис.1).

Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации в режиме реального времени с помощью разработанного флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза.

Чувствительность реакции амплификации с разработанным гибридизационным зондом MS8 Flip-R оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений клеток чистых культур возбудителя гистоплазмоза.

Обеззараживание исследуемых проб производили добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1%, прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С и инкубированием при комнатной температуре 24 ч. Выделение ДНК из чистых культур микромицетов осуществляли с помощью метода гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом (Sandhu G.S. et al., 1995). Постановку реакции ПЦР осуществляли как описано в примере 2. При тестировании коллекции грибных культур Н. capsulatum ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора с использованием разработанного флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда MS8 Flip-R продукт амплификации детектировался с ДНК всех штаммов возбудителя гистоплазмоза с чувствительностью 1×102-1×104 клеток/мл (рис.1). С другими видами близкородственных грибов и гетерологичных микроорганизмов в реакции ПЦР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат.

Таким образом, разработанный гибридизационный зонд может быть использован для идентификации возбудителя гистоплазмоза и позволяет в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать ДНК возбудителя гистоплазмоза в чистой культуре и биологическом материале.

Таблица 1
Характеристика сконструированного флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда для идентификации возбудителя гистоплазмоза H. capsulatum
Наименование зонда Последовательность праймеров Локализация флуоресцентный краситель/гаситель флуоресценции
MS8 Flip-R GGCCTGACCAGTATAACCAAGGCC ген MS8 (mold-specific MS8 protein) ROX/BHQ2

Олигонуклеотидный зонд MS8 Flip-R для флуоресцентной детекции возбудителя гистоплазмоза Histoplasma capsulatum методом полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными праймерами HcMs8s, HcMs8as3, имеющий следующую структуру: MS8 Flip-R 5'(ROX)-GGCCTGACCAGTATAACCAAGGCC-(BHQ2) 3',
где ROX - флуоресцентный краситель карбокси-Х-родамин, BHQ2 - гаситель флуоресценции "Black Hole 2".



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики гриппа С. Представленный способ включает выявление РНК вируса в мазках из носоглотки человека и животных путем проведения этапов обратной транскрипции и амплификации в одной пробирке методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени со специфичными зондом (5'-TGCTCCTGAAACCAGGACAG-3') и праймерами (5'-GAAATATTGATTGCTGAGACAGA-3', 5'-CCCTCCTGTTATTGCTGAAATTA-3').
Изобретение относится к области генетики безжировой массы тела и ожирения у животных и человека. Изобретение представляет собой комбинацию полинуклеотидов или экспрессируемых из них белков, которые дифференциально экспрессируются в животных, демонстрирующих безжировой фенотип, являющийся результатом одной или нескольких стимулирующих безжировой фенотип обработок, содержащих введение CLA, потребление диеты с высоким содержанием белка и увеличение физических упражнений.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для оценки риска развития рака шейки матки при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и носительстве вируса папилломы человека (ВПЧ) у женщин репродуктивного возраста.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, генной инженерии и медицины. Способ оценки цитолитической активности единичных эффекторных клеток, при этом определяя профиль секретированного продукта, используя матрицы микролунок, включает мониторинг лизиса инфицированных клеток-мишеней с помощью эффекторных клеток в микролунках, где микролунки содержат в среднем одну эффекторную клетку и по меньшей мере одну инфицированную клетку-мишень на микролунку; где мониторинг включает стадию детекции лизиса указанных инфицированных клеток-мишеней с помощью эффекторных клеток, используя флуоресцентный индикатор, при этом определяя профиль одного или более секретированных продуктов.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ идентификации кластера генов, кодирующих стафилококковые белки, являющиеся экзотоксинами.

Представленные решения касаются способа генерирования заквасочной культуры, заквасочной культуры и способа ферментации с использованием такой заквасочной культуры.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и вирусологии. Предложены праймеры, зонды и их наборы, для амплификации и обнаружения HPV типа 52 в исследуемом образце.

Изобретение относится к молекулярной биологии, генной инженерии, медицине и онкологии. Предложен способ детекции стволовых раковых клеток, основанный на инкубации образцов клеток с флуоресциентными красителями и последующей идентификации раковых клеток в ультрафиолетовом свете, где при инкубации образцов клеток, которая проводится с флуоресцентным красителем, ковалентно инкорпорированным во фрагменты двуцепочечной ДНК, обеспечивается интернализация экстраклеточных экзогенных фрагментов двуцепочечной ДНК во внутриклеточное пространство стволовых клеток, входящих в состав образцов клеток, путем проведения инкубации образцов клеток в растворе препарата фрагментированной двуцепочечной ДНК в соотношении 0.5-1 мкг ДНК на 1000000 клеток, находящихся в суспензии или на срезе ткани в течение 60-120 минут, а идентификацию раковых клеток в качестве стволовых осуществляют в ультрафиолетовом свете с длиной волны, соответствующей максимуму поглощения введенного в молекулы фрагментов двуцепочечной ДНК флуорохрома, причем, в качестве фрагментов двуцепочечной ДНК используют фрагменты ДНК Alu повтора человека, энзиматически меченые предшественником, содержащим ковалентно пришитый флуорохромный краситель, или меченые прямым химическим введением флуорохрома.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для идентификации вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов. Охарактеризованные праймеры комплементарны участкам вариабельного 2-го сегмента генома вируса блютанга нуклеотипа С (6, 14 и 21 серотипы) используются в ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации для идентификации вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов и имеют следующий состав (5'-3'): Прямой: GRAYATGRTGGATATWCCG Обратный: GGCTGCACRTCCAYYGARTC Представленное изобретение позволяет определить генетическую группу нуклеотипа C вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала с помощью ОТ-ПЦР в короткие сроки.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан набор праймеров для амплификации фрагментов гена CFTR.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора, включающего олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно меченный зонд для идентификации ДНК аденовируса серотипов 3, 4, 7, 14, 21 методом гибридизационно-флуоресцентной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Изобретение относится к паразитологии и касается способа видовой ДНК-дифференциации гельминтов - возбудителей церкариального дерматита человека. Дифференциацию четырех видов Trichobilharzia: Т.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способу молекулярно-генетического типирования штаммов Bordetella pertussis. Способ включает выделение ДНК из штаммов B.pertussis, проведение полимеразной цепной реакции с одновременным введением специфических праймеров PF-PR для получения ампликонов фрагмента промотора коклюшного токсина ptxP, рестрикции полученных ампликонов эндонуклеазами KpnI и MluI и электрофорезу продуктов рестрикции в агарозном геле.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для видоспецифичной экспресс-идентификации вируса Эбола-Заир методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченых зондов для видоспецифической экспресс-идентификации вируса Эбола-Судан методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров и способа их использования для выявления Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus в заквасочных культурах.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для генотипирования В.mallei. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для генотипирования В.mallei. .

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии, молекулярной эпидемиологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для генотипирования В.mallei. .

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к набору олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации Burkholderia mallei и дифференциации его от Burkholderia pseudomallei. Прямой и обратный праймеры имеют следующую структуру: 5′-GGCGTCAGGACTACAACGAGC-3′-Bm-ISfl-f и 5′-CACGGGCGACATCACGAACA-3′-Bm-ISfl-r. Флуоресцентно-меченый зонд имеет следующую структуру: Bm-ISfl-Pr 5′ (FAM)-GGGCGTGAAGCTCGTTGACCTGCCC-(BHQ1) 3′, где FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 490 нм, а BHQ1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 480-580 нм. Предложенное изобретение позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителя сапа и дифференцировать его от возбудителя мелиоидоза в пробах чистых культур и биологическом материале. 1 ил., 1 табл., 3 пр.
Наверх