Способ количественного определения d-антигена полиовирусов 1-3 типов

Авторы патента:

Иванова Ольга Евгеньевна (RU)

Козлов Виталий Григорьевич (RU)

Иванов Александр Петрович (RU)

Киктенко Александр Васильевич (RU)

G01N33/53 - иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого (препараты для терапевтических целей, содержащие антигены или антитела,A61K; гептены вообще, см. соответствующие рубрики в классе C07; пептиды, например протеины, вообще C07K)

Владельцы патента RU 2535058:

Козлов Виталий Григорьевич (RU)

Изобретение относится к медицине и касается способа количественного определения D-антигена полиовирусов 1-3 типов иммуноферментным анализом (ИФА). В качестве иммуносорбента используют поливалентный (к трем типам полиовируса) аффинно очищенный иммуноглобулин класса Y (IgY), полученный из яичных желтков куриц, иммунизированных полиовирусами, а в качестве детекторных антител - аффинно очищенный препарат IgG кролика против каждого из трех полиовирусов. Изобретение обеспечивает более низкий неспецифический фон и, соответственно, более высокую достоверность результата анализа. 1 н.п. ф-лы, 3 пр., 1 табл.

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии, вакцинологии и вирусологии и предназначено для лабораторной идентификации D-антигена полиовирусов 1-3 типов в инфицированных культурах клеток и в препаратах инактивированной полиовирусной вакцины. Изобретение касается получения поливалентного препарата (к полиовирусам 1-3 типов) антител класса Y (IgY), выделяемых из желтков яиц иммунизированных куриц, и его применению в качестве иммуносорбента в комбинации с иммуноглобулинами класса G (IgG) кролика против типов полиовируса 1, 2 и 3 в качестве детекторных антител раздельно для количественного определения D-антигена полиовирусов 1, 2 и 3 типов в иммуноферментном анализе (ИФА).

Изобретение может быть использовано в производстве инактивированных полиовирусных вакцин (из диких и аттенурованных штаммов полиовирусов) для контроля содержания D-антигена - основного показателя качества вакцины как профилактического препарата, вызывающего защитный иммунитет (иммуногенность вакцины).

Уровень техники

Заключительный этап глобальной ликвидации полиомиелита предусматривает прежде всего изменения в стратегии вакцинации, а именно: синхронизацию работы по прекращению плановой иммунизации с помощью пероральной аттенуированной полиовирусной вакцины (ОПВ) и разработку более безопасных процессов изготовления инактивированных полиовирусных вакцин (ИПВ) и приемлемых стратегий их использования (Исполнительный комитет ВОЗ, 10 января 2008 г.). Многолетний опыт применения ИПВ и ОПВ показал, что ОПВ эффективна в популяциях, где циркулируют дикие полиовирусы, то есть на первых этапах борьбы с полиомиелитом, когда центральным моментом является создание коллективного иммунитета. В странах и регионах, где циркуляция диких полиовирусов прекращена (среди них - Российская Федерация), применение только ОПВ нерационально и небезопасно (вакциноассоциированный полиомиелит, возникновение штаммов-ревертантов); в таких условиях комбинация ИПВ/ОПВ становится стратегией выбора. В дальнейшем целесообразен переход исключительно на ИПВ, то есть на заключительном этапе выполнения программы ликвидации полиомиелита и в последующем периоде времени (контроль данного заболевания) ИПВ будет основным средством профилактики полиомиелита.

Создание любого варианта ИПВ (на основе диких, аттенуированных или рекомбинантных штаммов полиовирусов) неизбежно связано с разработкой метода количественного определения D-антигена (выражается в D-антигенных единицах, DU/ДАГ ЕД) - основного показателя потенциальной способности вакцины вызывать защитный иммунитет у вакцинированных лиц. Ведущие производители коммерческих ИПВ (например, Sanofi Pasteur, Франция; GlaxoSmithKline, Великобритания) для определения D-антигена используют различные варианты ИФА собственной разработки. Эти системы ИФА основаны на использовании специфических (против полиовирусов) поликлональных антител млекопитающих, в частности, от кроликов (http://www.faqs.org/patents/app/20100040647). Однако известно, что использование антител млекопитающих (кроликов) для систем ИФА сопряжено с рядом негативных моментов, прежде всего, с возможностью неспецифических взаимодействий данных антител в другими компонентами ИФА (детекторными антителами, ферментным конъюгатом), что выражается в получении ложноположительных результатов анализа (Schade R., Calzado E.G., Sarmiento R. et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine// ATLA. - 2005. - Vol.33. - P. 129-154). Раскрытие изобретения Задача, решаемая изобретением, заключается в конструировании комбинированной системы ИФА для количественного определения D-антигена в препаратах ИПВ: в качестве иммуносорбента используется поливалентный (против трех типов полиовируса) препарат высокоактивных специфических антител класса Y (IgY), полученный авторами изобретения из яичных желтков иммунизированных куриц, функционально соответствующих антителам млекопитающих, а в качестве вторичных (детекторных) антител - моновалентные препараты иммуноглобулина класса G (IgG) кроликов раздельно против типов полиовируса 1, 2 и 3.

Решение задачи обеспечивается установленной изобретением возможностью получения из яичных желтков куриц, иммунизированных полиовирусами (или препаратами коммерческих ИПВ), специфических антител (IgY). Предлагаемый метод сокращает срок получения антител за счет более короткого цикла иммунизации при одновременном увеличении выхода антител за счет того, что кладка яиц каждым продуцентом происходит ежедневно или через день в течение 3-4 месяцев, а содержание антител в одном желтке соответствует количеству антител в 25-30 мл специфической сыворотки, получаемой в результате кровопускания у иммунизированного кролика. Несмотря на принципиальное сходство двух аналогов (IgG млекопитающих и IgY птиц, чьи биохимические характеристики хорошо изучены), IgY обладает рядом преимуществ, особенно ценных для его использования в диагностических целях в качестве иммунных реагентов: 1) высокая иммунореактивность птиц по отношению к чужеродным белкам инфекционного происхождения (вирусных, бактериальных, паразитарных), а также к белкам токсинов и ядов; 2) низкая перекрестная реактивность с белками млекопитающих за счет большой филогенетической дистанции между птицами и млекопитающими: неспособность IgY активировать систему комплемента млекопитающих, неспособность связываться с ревматоидным фактором, Fc-рецепторами, что обеспечивает низкий уровень неспецифических реакций. Таким образом, варианты ИФА на основе специфических антител птиц представляют собой новый и перспективный класс диагностических систем, в частности, для определения вирусных антигенов, включая D-антигены полиовирусов. Осуществление изобретения

Изобретение заключается в том, что IgY получают из желтка яиц иммунизированных куриц 5-6 месячного возраста. Куриц иммунизируют вируссодержащими культуральными жидкостями (ВЮК), полученными в результате заражения аутентичных перевиваемых клеток НЕр-2-С (клетки эпителиальной карциномы человека) прототипными штаммами аттенуированных полиовирусов (штаммы Сэбина) 3-х серотипов (1 тип -LSc2ab; 2 тип - Р 712 Ch 2ab; 3 тип - Leon 12ai b), либо коммерческой ИПВ (из диких полиовирусов 3-х типов) производства Sanofi Pasteur, Франция, сконцентрированной в 10 раз. IgY выделяют из желтка яиц последовательно высаливанием с помощью сульфата натрия (Е.М. Akita, S. Nakai. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E.coli strain. J. Immunol. Methods. 1993, 160: 207-214) и аффинной хроматографией. IgG кроликов (селективные детекторные антитела) получают стандартным методом:

раздельной иммунизацией кроликов вышеуказанными штаммами Сэбина (ВКЖ) с последующей аффинной хроматографией (на колонке с Protein A процедура не представлена). Уровень нейтрализующей активности и специфичность IgY и IgG определяют в реакции нейтрализации (РН), проводимой микрометодом в перевиваемых клетках НЕр-2-С (Руководство по лабораторным исследованиям полиомиелита. 4-е издание. ВОЗ. Женева. 2005).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами

Примеры

Пример 1. Получение IgY против трех типов полиовируса

1. Иммунизация куриц

Используют несущихся куриц породы Леггорн 5-6 месячного возраста. Иммуногены представляют собой вируссодержащие культуральные жидкости (ВКЖ), полученные в результате заражения перевиваемых клеток RD и НЕр-2-С, либо коммерческую ИПВ (из диких полиовирусов 3-х типов) производства Sanofi Pasteur, Франция, сконцентрированную в 10 раз. Цикл иммунизации включает трехкратное введение иммуногена (по 1,0 мл в 4 точки пекторальных мышц) с интервалами в 1 месяц. Сбор яиц начинают через 2-4 недели после завершения полного цикла иммунизации. Яйца хранят до 2-х месяцев при 4°С; желтки хранят неопределенно долгое время при - 20°С.

2. Выделение IgY из желтков методом высаливания сульфатом натрия FNa^SOA

2.1. Прибавляют к одному куриному желтку (средний объем 15-20 мл) 9 объемов охлажденной воды для инъекций (ФС 42-2620-97).

2.2. Гомогенизируют смесь осторожным перемешиванием и выдерживают раствор 18 часов при 4°С.

2.3. Отделяют раствор, содержащий IgY, от преципитата фильтрованием через фильтровальную бумагу Whatman с высокой скоростью фильтрации.

2.4. Разбавляют фильтрат водой для инъекций до объема 175 мл.

2.5. Помещают емкость с раствором на роторную мешалку с подогревом до 40°С и медленно добавляют 33,5 г Na₂SO₄ (хч) при постоянном перемешивании.

2.6. Продолжают перемешивание в течение 15 мин. после полного растворения.

2.7. Переносят раствор в центрифужный стакан и центрифугируют при 10 000 g в течение 20 мин при 25°С.

2.8. Удаляют надосадочную жидкость.

2.9. Подсушивают хорошо видимый осадок при комнатной температуре.

2.10. Растворяют осадок в 20 мл стандартного фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,2-7,4 при 25°С.

2.11. Медленно добавляют в раствор 2,8 г Na₂S0₄ (хч).

2.12. Выдерживают раствор 15 мин при 25°С после полного исчезновения осадка.

2.13. Центрифугируют раствор при 12 000 в течение 10 мин при 25°С.

2.14. Удаляют надосадочную жидкость.

2.15. Подсушивают осадок при комнатной температуре.

2.16. Растворяют осадок в 5,0 мл ФСБ.

2.17. Переносят осадок в диализный мешок (диаметр 1,0 см).

2.18. Проводят диализ против 2 Л ФСБ при 4°С.

2.19. Стерилизуют полученный препарат IgY фильтрацией через фильтр Millipore (0,45 ммк).

2.20. Сохраняют стерильный препарат IgY при 4°С (несколько месяцев) или при - 20°С (неопределенно долго).

Среднее содержание белка в препаратах составляет 5-10 мг/мл (определение по поглощению при 280 нм).

3. Очистка IgY на аффинной колонке HiTrap (Amersham) согласно инструкции от производителя Объем колонки: 5 мл Вместимость колонки: 100 мг IgY

Скорость элюции: 5 мл/мин (максимальная скорость: 20 мл/мин) Связывающий буфер: 20 мМ фосфат натрия +0,5 М K₂SO₄, рН 7,5 Буфер для элюции: 20 мМ фосфат натрия, рН 7,5 Очищающий буфер: 20 мМ фосфат натрия, рН 7,5 с 30% изопропанола Перед использованием указанные буферы стерилизуют через фильтр 0,45 ммк.

К препарату IgY (после высаливания из куриного желтка) добавляют К₂SО₄до концентрации 0,5 М, рН доводят до 7,5. Перед нанесением на колонку полученный препарат стерилизуют через фильтр 0,45 ммк. Процедура очистки IgY (проводят при комнатной температуре)

3.1. Промывают колонку минимум 5 объемами каждого из указанных буферов (последовательно): связывающим, для элюции и очищающим.

3.2. Уравновешивают колонку 5 объемами связывающего буфера.

3.3. Наносят образец.

3.4. Промывают колонку минимум 10 объемами связывающего буфера (или до полного отсутствия белка в элюате).

3.5. Элюируют IgY 10 объемами буфера для элюции.

3.6. Определяют содержание белка в аффинно очищенном препарате IgY (по поглощению при 280 нм), стерилизуют через фильтр 0,45 ммк, хранят при +4-8°С до 1 года. Для неопределенно длительного хранения добавляют глицерин (до 50%) и хранят при -20°С.

Пример 2. Определение специфической активности IgY и IgG в РН.

Основным показателем качества антител является их специфическая активность, выраженная в титрах антител. Определение специфической активности IgY и IgG проводят в функциональном тесте - реакции нейтрализации, осуществляемой микрометодом с использованием в качестве индикаторных систем перевиваемых клеток НЕр-2-С. Титр IgY или IgG измеряют по результатам подавления цитопатического эффекта (ЦПЭ), развивающегося в индикаторных клетках под действием испытуемого вируса. Титр IgY или IgG эквивалентен величине его разведения, способного нейтрализовать 100 (32-320) тканевых цитотоксических доз (ТЦД₅₀) гомологичного вируса.

Специфическую активность IgY или IgG определяют следующим образом.

1. В среде Игла MEM (ТУ 9385-012-01895045-2007) готовят разведение IgY или IgG 1:8.

2. Инактивируют IgG (IgY не подлежит инактивации) в разведении 1:8 в течение 30 мин при 56°С.

3. Готовят последовательные двукратные разведения инактивированного IgG или IgY до 1:32 768.

4. Вносят по 0,025 мл каждого последовательного разведения IgY или IgG, начиная от 1:8, в каждые 4 лунки 96-луночной панели для микротитрования («Costar» или его аналог).

6. Добавляют в каждую лунку с разведениями IgY или IgG по 0,025 мл разведения гомологичного вируса, содержащего 100 (32-320) ТЦД₅₀ (рабочая концентрация вируса)ю

7. Помещают панель с содержимым на 3 часа в СС>2-инкубатор с 5% С02 при 36°С.

8. Готовят суспензию индикаторных клеток НЕр-2-С.

9. Удаляют из флакона с полностью сформированным монослоем клеток питательную среду Игла MEM.

10. Однократно промывают монослой клеток раствором Эрла (ТУ 9385-005-01895045-20011).

11. Вносят во флакон с монослоем клеток НЕр-2-С подогретую до 36°С смесь из эквивалентных объемов раствора Версена (ТУ 9385-008-01895045-2007) и трипсина (ТУ 9385-01895045-2007) в количествах, достаточных для покрытия монослоя клеток.

12. Удаляют растворы после 15-30 сек. контакта с клетками.

13. Помещают флакон в термостат при 36°С.

14. Выдерживают флаконы в термостате до отслоения клеток от поверхности флакона.

15. Ресуспендируют отделившиеся клетки в 10,0 мл среды роста, состоящей из 95% среды Игла MEM и 5% сыворотки крови плодов коровы ("Gibco", кат. №10106-169, США).

16. Разводят 0,1 мл суспензии клеток в ростовой среде до 1:10.

17. Подсчитывают в приготовленном разведении концентрацию жизнеспособных клеток с помощью счетной камеры Горяева.

18. Готовят в среде роста разведение, содержащее 1-2х10⁴ соответствующих индикаторных клеток в 0,1 мл (рабочая концентрация клеток).

19. Вносят в каждую лунку со смесью IgY или IgG и вируса по 0,1 мл суспензии клеток в рабочей концентрации.

20. Панель заклеивают стерильной адгезивной пленкой, накрывают крышкой и помещают на 5-7 дней в СО₂ -инкубатор с 5% СO₂ при 36°С.

21. Ежедневно с помощью инвертированного микроскопа определяют наличие и степень проявления ЦПЭ вируса в клетках. При каждом измерении активности IgY или IgG предусмотрены следующие виды контролей, проводимые одновременно с основным опытом: контроль рабочей концентрации гомологичного вируса, контроль токсичности IgY или IgG, контроль качества индикаторных клеток.

Контроль рабочей концентрации гомологичного вируса

1. Вносят по 0,025 мл разведения, содержащего рабочую концентрацию гомологичного вируса, и три последующие десятикратные разведения в две лунки панели.

2. Добавляют в те же лунки 0,025 мл среды Игла MEM.

3. Помещают панель с содержимым на 3 часа в СО₂ - инкубатор с 5% СO₂ при 36°С.

4. Добавляют в те же лунки по 0,1 суспензии индикаторных клеток в рабочей концентрации.

5. Помещают панель с содержимым на 5-7 дней в СО₂ - инкубатор с 5% СО₂ при 36°С.

Последующие этапы контроля соответствуют пп.20-21 раздела, который касается определения специфической активности IgY или IgG.

Контроль цитотоксичности IgY или IgG

1. Вносят по 0,025 мл каждого последовательного двукратного разведения IgY или IgG от 1:8 до 1: 512 в 4 лунки панели.

2. Добавляют в те же лунки по 0,025 мл среды Игла MEM.

3. Добавляют в те же лунки по 0,1 мл суспензии индикаторных клеток в рабочей концентрации.

Последующие этапы контроля соответствуют пп.20-21 раздела, который касается определения специфической активности IgY или IgG. Контроль качества индикаторных клеток

1. Вносят по 0,05 мл среды Игла MEM в 10 лунок панели.

2. Добавляют в каждую лунку по 0,1 мл суспензии клеток в рабочей концентрации.

Титр нейтрализующих антител определяют по последнему разведению IgY или IgG, которое нейтрализует 100 (32-320) ТЦД5о гомологичного вируса (отсутствие ЦПЭ в индикаторных клетках), либо по формуле Кербера (Руководство по лабораторным исследованиям полиомиелита. 4-е издание. ВОЗ. Женева. 2005). Препараты IgY или IgG с титрами нейтрализующих антител ≥1:1024 пригодны для конструирования систем ИФА для определения D-антигена полиовирусов.

Пример 3. ИФА для определения D-антигена полиовирусов в препаратах ИПВ

Используется непрямой вариант ИФА. 1. Иммунопанель с высокой сорбционной емкостью (Costar, кат.№9018) сенсибилизируют аффинно очищенным IgY к трем полиовирусам: в лунки панели вносят по 0,1 мл раствора IgY в концентрации 20 мкг/мл в карбонат-гидрокарбонатном буфере рН 9,6 (Sigma, кат.№С3041-100 CAP), панель накрывают крышкой и инкубируют 18 час. при (+) 4-8°С или 3 час. при (+) 37°С.

2. Содержимое лунок вытряхивают, панель постукивают по нескольким слоям фильтровальной бумаги (в положении вверх дном) для удаления остатков иммуносорбента (IgY). Лунки промывают 3 раза фосфатно-солевым буфером (ФСБ) рН 7,2 (Sigma, кат.№Р4417-100ТАВ) с 0,05% Tween-20 (Sigma, кат. №PI 379-100ml) - ФСБ-Т, внося раствор до края лунок и сразу же удаляя его. Вносят в лунки по 0,2 мл 1% раствора фетальной сыворотки теленка (Gibco или аналог) в ФСБ (ФСБ-ФС), панель накрывают крышкой и инкубируют 1 час при комнатной температуре. Это процедура блокирования свободных сайтов лунок панели индифферентным белком.

3. Блокирующий раствор удаляют, лунки промывают 3 раза ФСБ-Т, как описано выше. Вносят по 0,1 мл исследуемого препарата ИПВ в разведениях, начиная, например, с 1:8, в ФСБ-ФС с 0,05% Tween-20 (ИФА-буфер), по 2 лунки на разведение. Параллельно разведениям ИПВ вносят по 0,1 мл ИФА-буфера - негативный контроль. Панель накрывают крышкой и инкубируют 2 час. при (+) 37°С или 18 час.при (+) 4-8°С. Это фаза связывания определяемого D-антигена с иммуносорбентом.

4. Содержимое лунок удаляют, лунки промывают 5 раз ФСБ-Т, как описано выше. Вносят в лунки по 0,1 мл детекторных антител - IgG кролика к соответствующему типу полиовируса с титром гомологичных антител в РН не ниже 1:1024 в разведении, подобранном шахматным тированием, в ИФА-буфере. Панель накрывают крышкой и инкубируют 1 час при (+) 37°С. Это фаза детекции определяемого D-антигена, связанного с иммуносорбентом.

5. Содержимое лунок удаляют, лунки промывают 6 раз ФСБ-Т, как описано выше. Вносят в лунки по 0,1 мл пероксидазного конъюгата против IgG кролика (Sigma) в ИФА-буфере в рабочем разведении, которое подбирается титрованием в отдельном опыте. Панель накрывают крышкой и инкубируют 1 час при (+) 37°С.Это фаза выявления комплекса иммуносрбент+определяемый D-антиген+детекторные антитела.

6. Содержимое лунок удаляют, лунки промывают 6 раз ФСБ-Т, как описано выше. Вносят в лунки по 0,1 мл готового субстрат-индикаторного раствора -тетраметилбензидина (ТМБ, Sigma, кат.№Т0440-100 ml). Панель инкубируют в темноте 20 мин. при комнатной температуре.

7. Вносят в лунки по 0,05 мл 2М раствора серной кислоты (остановка ферментной реакции).

8. Результат немедленно учитывают в ИФА-ридере (любая доступная модель) при длине волны 450 им. Результат считается положительным при отношении оптической плотности лунок с определяемым D-антигеном (его наивысшее разведение) к оптической плотности контрольных лунок (ИФА-буфер)≥2,1 (P/N). Количество D-антигена в исследуемом образце ИПВ вычисляют по отношению к референс-образцу ИПВ (с известным количеством D-антигена), который титруется в ИФА параллельно исследуемому образцу, используя метод "параллельных линий" (PLA) -точный подсчет. Концентрацию D-антигена выражают в D-антигенных единицах на 1 мл (DU/ml, ДАТ ЕД/мл).

В таблице 1 представлены результаты определения D-антигена полиовируса 1 типа: параллельное титрование в ИФА экспериментальной серии ИПВ на основе штамма Сэбин 1 (Р 712 Ch 2ab) и коммерческой ИПВ (из диких штаммов полиовируса) производства Sanofi Pasteur, Франция, с известной концентрацией D-антигена 1 типа - 80 ДАГ ЕД/мл. В качестве иммуносорбента использован желточный IgY, полученный в результате иммунизации куриц аттенуированными штаммами полиовирусов Сэбин 1-3 типов, в качестве детекторных антител - IgG кролика с РН-титром против штамма Сэбин 1≥:1:1024.

Из таблицы 1 следует, что, согласно критерию положительности результата (P/N≥2,1), титр D-антигена 1 типа в ИПВ (Сэбин 1) равен 1: 16384, титр D-антигена 1 типа в составе ИПВ (Sanofi) равен 1: 256, то есть концентрация D-антигена в составе ИПВ (Сэбин 1) равна примерно 5120 ДАГ ЕД/мл.

Таблица 1.
Антиген	Разведения антигена
1:16	1:64	1:256	1:1024	1:4096	1:16384
ИПВ(Сэбин 1)	3,761*	3,42	2,535	1,345	0,591	0,328
ИПВ (Sanofi)	2,332	0,932	0,380	0,238	0,225	0,219
Контроль (ИФА-буфер)	0,141	0,131	0,148	0,133	0,140	0,139
Среднее значение=0,139

* - оптическая плотность при 450 нм

Преимущества изобретения заключаются в использовании в качестве иммуносорбента для количественного определения D-антигена полиовирусов в ИФА аффинно очищенных поливалентных препаратов IgY (против трех полиовирусов) из яичных желтков иммунизированных куриц, которые обладают высокой специфической активностью по отношению к определяемому антигену и низкой перекрестной реактивностью с белками млекопитающих за счет большой филогенетической дистанции между птицами и млекопитающим, и селективных детекторных IgG кролика (против каждого из трех полиовирусов), в результате чего такая комбинация в системах ИФА для определения антигенов (в частности, D-антигена полиовирусов) обеспечивает более низкий неспецифический фон и соответственно более высокую достоверность результата анализа.

1. Способ количественного определения D-антигена полиовирусов 1-3 типов иммуноферментным анализом (ИФА), отличающийся тем, что в качестве иммуносорбента используют поливалентный (к трем типам полиовируса) аффинно очищенный иммуноглобулин класса Y (IgY), полученный из яичных желтков куриц, иммунизированных полиовирусами, а в качестве детекторных антител - аффинно очищенный препарат IgG кролика против каждого из трех полиовирусов.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки угрозы формирования гипоксии у беременных с обострением цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации.

Способ прогнозирования течения ишемического инсульта у больных сахарным диабетом // 2535039

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии, и может быть использовано для прогноза течения ишемического инсульта у больных сахарным диабетом.

Способ дифференциальной диагностики форм первичной плацентарной недостаточности // 2535011

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, и позволяет проводить морфологическую дифференциальную диагностику трофобластической, эндометриальной и смешанной формы первичной плацентарной недостаточности при самопроизвольном прерывании беременности в первом триместре.

Способ диагностики опухоли мозга у пациента // 2535000

Изобретение относится к области медицины, в частности к нейрохирургии, и касается способа диагностики опухоли мозга у пациентов. Сущность способа: в забранной крови определяют процентное количество CD25-лимфоцитов.

Способ дифференцированной иммуномодулирующей терапии хронического тонзиллита и/или гипертрофии небных миндалин у детей дошкольного возраста // 2533845

Изобретение относится к медицине, а именно к оториноларингологии и иммунологии, и может быть использовано для патогенетического лечения хронического тонзиллита и/или гипертрофии небных миндалин у детей дошкольного возраста с лимфопролиферативным синдромом.

Способ качественной дифференциальной экспресс-диагностики новообразований слизистой оболочки дна полости рта по содержанию биомаркеров в ротовой жидкости пациента // 2533241

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу качественной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований слизистой оболочки дна полости рта.

Способ выявления днк mycoplasma hominis из образцов крови // 2533238

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу выделения ДНК Mycoplasma hominis (М. hominis) для дальнейшего применения в диагностическом алгоритме.

Способ прогнозирования риска развития врожденных инфекций // 2532382

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ прогнозирования риска развития врожденных инфекций путем определения количества специфических антител классов Ig М и Ig G в биологическом материале, отличающееся тем, что в качестве биологического материала используют мазок со слизистой оболочки цервикального канала при первичном обследовании в сроке до 12-й недели гестации, одновременно в мазках определяют количество антител Ig М и Ig G к вирусу краснухи, цитомегаловирусу, парвовирусу B19V, токсоплазмам, вирусу простого герпеса 1 и 2 типов и величины авидности специфических Ig G к этим возбудителям, дополнительно в том же мазке определяют уровень секреторного неспецифического Ig A методом РИФ к антигенам цитомегаловируса, хламидий, микоплазм, и генетического материала этих микроорганизмов методом ПЦР и в зависимости от полученных результатов прогнозируют группы высокого, умеренного или низкого риска развития врожденных инфекций.

Способ количественного определения содержания фактора дифференцировки-прогностического биомаркера состояния сосудистой системы у человека в норме и патологии // 2532381

Изобретение относится к медицине. Способ включает последовательность этапов количественного определения содержания фактора дифференцировки клеток HLDF у пациента, страдающего заболеванием сердечно-сосудистой системы.

Способ прогнозирования рецидива рака вульвы // 2532342

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования рецидива рака вульвы. Для этого перед началом лечения определяют содержание в крови больших гранулярных лимфоцитов (БГЛ) и уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК).

Способ проведения иммунохроматографического анализа с диссоциирующей флуоресцентной меткой // 2535061

Изобретение относится к медицине и касается способа проведения иммунохроматографического анализа с диссоциирующей флуоресцентной меткой, в котором на мембранной тест-полоске формируют комплексы, в состав которых входят молекулы антигена или антигенов, специфичные к ним антитела и молекулы метки. При этом после проведения анализа метка экстрагируется из рабочей мембраны тест-полоски и флуоресцентный сигнал измеряется в объеме жидкости. Способ по изобретению обеспечивает оптимальные условия для флуоресценции метки, а так же устранение мешающего влияния мембраны, которая, будучи непрозрачной, уменьшает интенсивность как возбуждающего, так и испускаемого света. 1 ил., 1 пр.

Способ элюции патогена с иммобилизованной магнитной матрицы // 2535070

Изобретение относится к медицине, в частности к элюированию сконцентрированного на магнитной матрице патогена. Способ элюции осуществляется следующим образом: 0,1 мл 10% взвеси магнитно-иммунного сорбента (МИС) туляремийного, чумного или бруцеллезного инкубируют с микробными взвесями возбудителей туляремии, бруцеллеза или чумы в течение 30 мин, удаляют надосадок, далее МИС инкубируют с 0,5 мл элюирующего раствора в течение 10 мин, pH элюата возвращают к физиологическому значению, проводят постановку реакции непрямой гемагглютинации или реакции агглютинации латекса. Технический результат: способ позволяет качественно элюировать патоген с магнитной иммобилизованной матрицы для последующего исследования в серологических реакциях и сохранять функциональную активность антитела на магнитной матрице для повторного использования. 3 пр., 1 табл.

Способ качественной дифференциальной экспресс-диагностики новообразований слизистой оболочки губы по содержанию биомаркеров в ротовой жидкости пациента // 2535076

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской диагностике, и описывает способ качественной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований слизистой оболочки губы по содержанию биомаркеров в ротовой жидкости пациента. Способ включает забор ротовой жидкости у пациента, центрифугирование ротовой жидкости пациента при 3000 об/мин в течение 15 минут, разбавление ротовой жидкости физиологическим раствором в соотношении 1:100, повторное центрифугирование при 3000 об/мин в течение 15 минут, размещение готового для исследования материала ротовой жидкости пациента в кювету и выполнение стандартного метода иммуноферментного анализа на плашке на основе моноклональных антител. В качестве независимых биомаркеров выбирают матриксную металлопротеиназу 8/matrix metalloproteinase 8 (ММП 8/ММР 8) и матриксную металлопротеиназу 9/matrix metalloproteinase 9 (ММП 9/ММР 9). Способ характеризуется высокой точностью и чувствительностью дифференциальной экспресс-диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований слизистой оболочки губы, упрощением подготовки пациента для забора и хранения диагностического материала, возможностью получения результата в день обращения пациента, высокой вероятностью выявления доброкачественных и злокачественных новообразований в организме пациента как на ранних, так и на более поздних стадиях заболевания. Изобретение может быть использовано в дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных новообразований органов полости рта в условиях стоматологических, онкологических и хирургических лечебных заведений. 2 з.п. ф-лы, 6 пр.

Способ экспресс-диагностики острых кишечных инфекций // 2536243

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ экспресс-диагностики острых кишечных инфекций (ОКИ), включающий выявление маркеров-индикаторов этиологии ОКИ, с использованием иммунологического лабораторного исследования, отличается тем, что этиологию ОКИ устанавливают у детей ранней возрастной категории, предпочтительно у новорожденных, при этом определяют концентрацию в копрофильтрате цитокина - интерлейкина IL-10 и наличие хронической фетоплацентарной недостаточности (ХФПН), после чего рассчитывают вероятность (Р) бактериальной этиологии ОКИ, причем значение Р больше 50% свидетельствует о бактериальной этиологии ОКИ, а меньше 50% свидетельствует об отсутствии бактериальной этиологии ОКИ, и необходимости проведения второго этапа диагностики, на котором определяют концентрацию в копрофильтрате цитокина - интерлейкина IL-4, выявляют срок прикладывания к груди, а также вид вскармливания, при этом рассчитывают вероятность (Р) вирусной либо вирусно-бактериальной этиологии ОКИ, причем значение Р больше 50% свидетельствует о вирусной этиологии ОКИ, а меньше 50% свидетельствует о вирусно-бактериальной ОКИ. Изобретение обеспечивает повышение точности выявления этиологии острой кишечной инфекции и упрощение процедуры диагностирования. 2 табл.

Способ диагностики аллергических реакций // 2536291

Группа изобретений относится к способу обнаружения множественных цитокинов из отдельно взятых клеток и предназначено для создания набора иммунологических характеристик заболеваний. Для воплощения изобретения предусматривается наличие суспензии живых мононуклеарных клеток периферической крови индивида, нанесенной на пластичный планшет, который содержит по меньшей мере одну микролунку в матрице микролунок. При этом по меньшей мере одна микролунка в указанной матрице микролунок содержит одну клетку в объеме менее одного нанолитра. Матрицу микролунок приводят в контакт с субстратом, причем субстрат предварительно обрабатывают по меньшей мере двумя средствами для обнаружения и каждое средство для обнаружения связывается с секретированным цитокином указанной клетки. Измеряют уровень каждого указанного секретированного цитокина на указанном субстрате, при этом уровень соответствует количеству указанного секретированного цитокина указанной единичной клетки. Определяют скорость секреции каждого указанного секретированного цитокина из указанной клетки, определяя, таким образом, характеристики указанных секретированных цитокинов. Измеряют динамическое изменение указанных характеристик секретированных цитокинов. Использование группы изобретений обеспечивает создание иммунологических характеристик заболеваний. 2 н. и 39 з.п. ф-лы, 4 табл., 21 ил., 4 пр.

Способ оценки местного гуморального противохолерного иммунитета in vitro на модели экспериментальных животных // 2536707

Изобретение относится к медицине, в частности к вопросу изучения антиадгезивной активности противохолерных иммуноглобулинов и усиления ее для совершенствования специфической профилактики холеры. Для оценки местного гуморального противохолерного белых мышей иммунизируют 5×107 микробными клетками Vibrio cholerae 5879, через 10 дней выделяют общий пул противохолерных Ig из тонкокишечных промывных жидкостей. Дополнительно получают первичную культуру энтероцитов тонкой кишки от интактных мышей. Затем противохолерные Ig в двукратном разведении наносят в объеме 3 мл на монослой энтероцитов, сформированных в лунках культуральных панелей. В последние наносят живые холерные вибрионы штамма Vibrio cholerae 5879, 40 м.к. на 1 энтероцит и инкубируют в течение 3 часов. После панели трижды отмывают, фиксируют этанолом в течение 20 минут и окрашивают по Романовскому - Гимза. Оценку местного гуморального противохолерного иммунитета проводят под микроскопом по количеству вибрионов, окрашенных в темно-синий цвет и прикрепившихся к одному энтероциту. Способ позволяет оценить специфический местный гуморальный иммунитет и усилить антиадгезивную активность общего пула противохолерных иммуноглобулинов. 3 з.п. ф-лы, 2 пр., 2 табл.

Способ оценки нарушения микровязкости мембран эритроцитов периферической крови беременных на третьем триместре гестации, при обострении цитомегаловирусной инфекции // 2537119

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки устойчивости мембран эритроцитов периферической крови у беременных с цитомегаловирусной инфекцией на третьем триместре гестации. Способ характеризуется тем, что определяют титр антител к цитомегаловирусу, коэффициент эксимеризации в липидном бислое и в белок-липидном слое, оценивают микровязкость в мембранах эритроцитов и определяют активность аденозинтрифосфата в эритроцитах. При титре антител к цитомегаловирусу 1:1600, снижении активности аденозинтрифосфата до 0,40±0,008 мкмоль/мл, нарушении микровязкости в мембранах эритроцитов, снижении коэффициента эксимеризации в липидном бислое до 0,59±0,006 Fэ/Fм, а в белок-липидном слое до 0,70±0,004 Fэ/Fм оценивают угрозу устойчивости мембран эритроцитов.

Способ оценки ингибирующего действия цитомегаловирусной инфекции на активность карбоангидразы в эритроцитах периферической крови беременных // 2537180

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для оценки угрозы формирования гемической гипоксии у беременных при обострении цитомегаловирусной инфекции. Для этого при обострении у беременной цитомегаловирусной инфекции в периферической крови измеряют титр антител IgG к цитомегаловирусу и активность продуктов гистохимической реакции на карбоангидразу в эритроцитах, и при титре IgG 1:1600 и показателях активности реакции на карбоангидразу до 0,015±0,002 усл.ед. в 65,0±2,2% эритроцитов, снижении оксигемоглобина до 95,0±1,5% определяют угрозу формирования гемической гипоксии. Способ позволяет оценить угрозу формирования гемической гипоксии на доклиническом уровне. 2 ил.

Способ прогнозирования дискоординации родовой деятельности // 2537241

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству, предназначено для прогнозирования патологии в родах, в частности дискоординации родовой деятельности (дистоции шейки матки). Сущность способа: при доношенной беременности в начале I периода родов в сыворотке крови женщин иммуноферментным методом определяют содержание кортикотропин-рилизинг гормона, субстанции Р, нейрокининов А и В, интерлейкинов 6 и 8, релаксина и кортизола, и рассчитывают прогностическую вероятность П по формуле: П=(-0,0011229·CRH+(-0,15119·NA)+(-0,0071961·NB)+(-0,021071·IL6)+0,0032637·IL8+(-0,00085785·pF2α)+9,5773·REL+(-0,0098088·SP)+0,0058058·cort)·2,719. При уровне вероятности П больше 0,51 прогнозируют высокий риск развития дискоординации родовой деятельности и завершения родового процесса экстренным оперативным путем. Применение изобретения обеспечивает повышение точности прогнозирования дискоординации родовой деятельности, что позволит своевременно сформировать группу высокого риска, дифференцировать характер нарушения РД, тем самым выбрать адекватную тактику ведения пациентки. 2 пр.

Способ получения биотинилированного производного окисленного декстрана // 2537246

Изобретение относится к медицине, экспериментальной и клинической фармакологии. Суть способа: окисленный декстран растворяют в трис-ацетатном буферном растворе с рН 5,0-5,5, добавляют к полученному раствору гидразид биотина в соотношении к окисленному декстрану, равном 1:(20-25), после чего полученный раствор нагревают до 80-90°С и выдерживают в течение 30-60 минут. Технический результат: получение биотинилированного производного окисленного декстрана высокого качества, обеспечивающее повышение чувствительности его иммуноферментного анализа в сыворотке крови. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 4 пр.