Набор синтетичеcких олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности сушеницы болотной (filaginella uliginosa (l.) opiz)

Авторы патента:

G01N33/68 - с использованием протеинов, пептидов или аминокислот

C12Q1/68 - использующие нуклеиновые кислоты

Владельцы патента RU 2535063:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" (RU)

Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики и фармакогнозии и предназначено для выявления видовой принадлежности сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz). Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для ПЦР с фрагментом ITS2 ядерной ДНК, включающий прямой и обратный праймеры и разрушаемый зонд. Набор обладает высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет быстро и достоверно провести идентификацию лекарственного растения. 1 ил., 1 пр.

Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики и фармакогнозии. Использование набора синтетических олигонуклеотидов позволяет достоверно идентифицировать видовую принадлежность лекарственного растения - сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz). Изобретение может быть использовано для выявления видовой принадлежности данного растения; в ходе проведения скрининга растительного сырья, для контроля на соответствие состава, декларированного производителем.

Среди большого количества методов генодиагностики с целью идентификации присутствия ДНК интересующего вида растений в образце в качестве основы нашего изобретения был принят формат ПЦР с детекцией в режиме реального времени на основе разрушаемого зонда. ПЦР в реальном времени имеет преимущество перед обычными ПЦР-системами идентификации - отсутствие необходимости последующего анализа, что минимизирует риск контаминации в лаборатории. Характерна также повышенная чувствительность и отсутствие ложноположительного результата при неспецифичном отжиге праймеров. Кроме того, следует отметить обеспеченность практически всех молекулярно-генетических диагностических лабораторий оборудованием, необходимым для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени, и широкое использование метода в клинической диагностике и органами госконтроля. При проведении анализа методов детекции продукта полимеразной цепной реакции выбран метод на основе разрушаемого зонда, так как он относится к специфичным методам детекции, возможно свободное использование без нарушения авторских и смежных прав (первоначально система разрушаемого зонда предложена в 1991 году, при этом все патенты на настоящий момент закончили свое действие).

Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка праймеров и разрушаемых зондов на основе данных видоспецифичных нуклеотидных последовательностей ядерной ДНК растений. В качестве видоспецифичных участков нами используется ITS2 фрагмент ядерной ДНК (internal transcribed spacer 2), обладающий большой копийностью в геноме [Alvarez, I. & Wendel, J. F. (2003) Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference // Mol. Phylogenet. Evol. 29, 417-434] и используемый в проектировании системы ДНК-баркодинга. В этом регионе показана высокая вариабельность и потенциальная применимость в качестве маркерного участка [Stoeckle, М. (2003) Use of DNA barcodes to identify flowering plants // Bioscience 53, 2-3].

Прототип - рассмотрим идентификацию лекарственных растений с использованием фрагмента ITS2, амплифицированного специфичными праймерами [Chiou SJ, Yen JH, Fang CL, Chen HL, Lin TY Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers//Planta Med. 2007, Oct; 73(13): 1421-6. Epub 2007 Oct 1]. В прототипе используются специфичные наборы праймеров BEL-1/BEL-3 и BEL-2/BEL-3 для амплификации ITS2 участка рДНК 55 лекарственных растений.

Принципиальные отличия прототипа от заявленного изобретения следующие: идентифицируется лекарственное растение с нуклеотидными последовательностями специфичных праймеров, отличных от заявленных. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности лекарственного растения - сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz), включающий проведение полимеразной цепной реакции с фрагментом ITS2 ядерной ДНК, для идентификации данного растения используют специфичные прямой, обратный праймеры и разрушаемый зонд.

Работа над созданием праймеров строится следующим образом. 1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей различных видов растений либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности растений выбирается участок генома, встречающийся у всех видов.

2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения или вручную подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции (2 праймера и зонд). На данном этапе работа заключается в создании выравнивания многих последовательностей и выборе участка последовательности, где присутствуют отличия для создания прямого, обратного праймеров и зонда. Выравнивание геномных последовательностей означает сравнение последовательностей многих видов друг с другом, поиск гомологичных для растений участков.

3) Изготовление праймеров и зонда производится на автоматических синтезаторах.

4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей.

Анализ нуклеотидного полиморфизма последовательности ITS2 на основании данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и секвенированных de novo последовательностей видов, не размещенных в генбанке, позволяет применить данные последовательности в качестве основы для создания праймеров. Для детекции накопления продукта ПЦР в ходе реакции используют технологию с разрушаемым зондом (Holland Р М, Abramson R D, Watson R, Gelfand D H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase.//Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 August 15; 88(16): 7276-7280).

В качестве флуоресцентной метки используют, например, FAM, в качестве гасителя - BHQ1 (возможны другие комбинации флуорофоров и гасителей и это не является предметом охраны авторских прав).

Аналогичные наборы, реакционные смеси, праймеры для амплификации и выявления видовой принадлежности сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz) не известны.

Ход работы с применением набора синтетических олигонуклеотидов для амплификации состоит из следующих шагов.

Пример:

1) Растительный материал перед проведением ПЦР с помощью заявляемого набора проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора Diamont DNA kit, в соответствии с инструкцией производителя; в ходе этой процедуры из растительного материала выделяется ДНК, которую в свою очередь используют для ПЦР.

2) Полимеразную цепную реакцию проводят на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, USA). Амплификация проводится по следующей программе: 1 цикл: 95°С - 3 мин; 40 циклов: 95°С - 10 сек, 58°С - 30 сек (на данной стадии производится сканирование уровня флуоресценции). Инкубационная смесь, конечным объемом 25 мкл, содержит: 14,1 мкл Н₂O; 2 мкл ДНК; 2,5 мкл 10Х буфер; 2,5 мкл 25 мМ MgC₁₂; по 1 мкл 10 мМ каждого праймера; 0,5 мкл зонда; 1,2 мкл 20 мМ dNTPs; 0,2 мкл Taq-полимеразы. Результат амплификации определяют по нарастанию уровня флуоресценции, рис.1.

Для выявления сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz) в качестве прямого праймера используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-СAACGGATATCTCGGCTCАС-3', в качестве обратного праймера используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-GTACGACTCAAGACGCACAA-3', в качестве разрушаемого зонда используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: (флуоресцентная метка)-5'-CCGTGAACC ATCGAGTTTTT-3'-(гаситель).

Гаситель располагается на 5'-конце, а флуоресцентная метка на 3'-конце разрушаемых зондов.

Разработан набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности лекарственного растения - сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz) методом полимеразной цепной реакцией с детекцией в режиме реального времени. Набор обладает высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет быстро и достоверно провести идентификацию рассмотренного лекарственного растения.

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz), включающий проведение полимеразной цепной реакции с фрагментом ITS2 ядерной ДНК, отличающийся тем, что для идентификации используют видоспецифичные участки для создания прямого, обратного праймеров и разрушаемого зонда, где в качестве прямого праймера - последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-CAACGGATATCTCGGCTCAC-3'; обратного праймера - последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-GTACGACTC AAGACGC АСАА-3'; разрушаемого зонда - последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: (флуоресцентная метка)-5'-CCGTGAACC ATCGAGTTTTT-3'-(гаситель).

Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики и фармакогнозии и предназначено для выявления видовой принадлежности аралии высокой (Aralia elata (Miq.) Seem.).

Способ определения биологического возраста трупа при повторной кровопотере // 2535044

Изобретение относится к судебной медицине, а именно к судебно-медицинской экспертизе, и предназначено для определения биологического возраста трупа при повторной кровопотере.

Способ определения биологического возраста трупа при длительной кровопотере // 2535042

Изобретение относится к судебной медицине, а именно к судебно-медицинской экспертизе, и предназначено для определения биологического возраста трупа при длительной кровопотере.

Способ прогнозирования течения ишемического инсульта у больных сахарным диабетом // 2535039

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии, и может быть использовано для прогноза течения ишемического инсульта у больных сахарным диабетом.

Способ прогнозирования уровня гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом 2 типа // 2533456

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования уровня гликированного гемоглобина y индивидуумов русской национальности, больных сахарным диабетом 2 типа.

Способ прогнозирования течения и эффективности терапии сахарного диабета 2 типа // 2533286

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования течения и эффективности терапии сахарного диабета 2-го типа у индивидуумов русской национальности.

Способы разделения и характеристики микроорганизмов с помощью идентификатора // 2533252

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к способу характеристики микроорганизмов. Сущность способа состоит в (a) получении тестируемого образца, о котором известно, что он содержит или может содержать микроорганизмы; (b) наслаивании тестируемого образца на плотностный буфер в контейнере, где указанный плотностный буфер обладает однородной плотностью от приблизительно 1,025 до приблизительно 1,120 г/мл; (c) добавлении идентификатора в указанный тестируемый образец и/или в указанный плотностный буфер; (d) центрифугировании указанного контейнера для разделения микроорганизмов от других компонентов указанного тестируемого образца и образовании осадка микроорганизмов; (e) спектроскопическом исследовании осадка и/или указанного одного или более чем одного идентификатора с получением измерений, которые характеризуют микроорганизмы, где указанные спектроскопические исследования проводят при нахождении указанного осадка в указанном контейнере; и (f) характеристике микроорганизмов в осадке на основании полученных измерений и/или присутствия или отсутствия указанного идентификатора или метаболизированной формы указанного идентификатора в осадке, где указанные микроорганизмы характеризуют по одной или более моделям классификации, выбранным из группы, состоящей из групп по Граму, клинических групп по Граму, терапевтических групп и функциональных групп.

Способ определения наследственной предрасположенности к развитию привычного невынашивания беременности // 2532367

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины и предназначено для определения генетической предрасположенности к привычному невынашиванию беременности (ПНБ).

Способ прогнозирования вероятности развития рестеноза после стентирования коронарных артерий // 2532340

Изобретение относится к области медицины. Сущность способа прогнозирования вероятности развития рестеноза с учетом локализации стента в правой коронарной артерии, огибающей артерии состоит в том, что на момент стентирования осуществляют забор крови пациента и регистрируют в физических величинах значения протромбинового индекса, коэффициента атерогенности, липопротеидов очень низкой плотности, липопротеидов высокой плотности, вычисляют величину стеноза S.

Способ прогнозирования характера течения репаративной регенерации после оперативного лечения механической травмы печени // 2531086

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической и экспериментальной абдоминальной хирургии и может быть использовано для оценки характера течения репаративной регенерации после оперативного лечения механической травмы печени.

Способ оценки фармакологических и токсикологических свойств веществ - радио-, токсикопротекторов и радио-, токсикосенсибилизаторов // 2534822

Изобретение относится к области радиобиологии и экспериментальной медицины. Способ оценки фармакологических и токсикологических свойств веществ заключается в том, что исследуемое вещество вносят в питательную среду личинок и мух Drosophila melanogaster, сочетающих в своем геноме гипоморфные мутации ss- и СG5017-генов.

Способ диагностики окислительного стресса измерением экспрессии кислородчувствительных генов (варианты) // 2534821

Группа изобретений относится к области медицины и молекулярной биологии. Способ предусматривает измерение экспрессии следующих кислородчувствительных генов: Pdk4, Nid2, Golph2, Actr1a, Api5, Mrp13, Scn7a, Асох3, Lamr1, Sv2b, Stmn2, Тrрс3, Crebzf, Herс1, Ssc1, Snrpb, Zfhx1b, sc125b, Rn.

Синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации вируса блютанга нуклеотипа а (4, 10, 11, 17, 20 и 24 серотипы) методом от-пцр // 2534358

Изобретение относится к биотехнологии, генетической инженерии и ветеринарной вирусологии. Предложены синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные участкам вариабельного 2-го сегмента генома вируса блютанга серотипов, входящих в состав нуклеотипа А (4, 10, 11, 17, 20 и 24 серотипы) для выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа А, имеющие следующий нуклеотидный состав (5′-3′): прямой TATTGGCATAGRCAGTGG; обратный GTAAGYGTAAGAGGCCA.

Способ прогнозирования эффективности лечения пациентов с неходжкинской лимфомой высокой степени злокачественности // 2533816

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ прогнозирования эффективности лечения пациентов с неходжкинскими злокачественными лимфомами высокой степени злокачественности.

Способ электрохимической идентификации целевых последовательностей нуклеотидов // 2532855

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ и устройство для электрохимической идентификации целевых последовательностей нуклеотидов. Способ включает получение биологического образца, который может содержать целевую последовательность нуклеотидов.

Устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени и способ определения целевой нуклеиновой кислоты с его использованием // 2532853

Группа изобретений относится к области молекулярно-диагностических исследований. Устройство для комплексного качественного или количественного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени используют в способе определения целевой нуклеиновой кислоты.

Флуоресцентно-меченый олигонуклеотидный зонд ms8 flip-r для идентификации возбудителя гистоплазмоза histoplasma capsulatum // 2532845

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен олигонуклеотидный зонд MS8 Flip-R для флуоресцентной детекции возбудителя гистоплазмоза Histoplasma capsulatum методом полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными праймерами HcMs8s, HcMs8as3, имеющий следующую структуру: MS8 Flip-R 5'(ROX)-GGCCTGACCAGTATAACCAAGGCC-(BHQ2) 3', где ROX - флуоресцентный краситель карбокси-Х-родамин, BHQ2 - гаситель флуоресценции "Black Hole 2".

Способ диагностики гриппа с // 2532843

Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики гриппа С. Представленный способ включает выявление РНК вируса в мазках из носоглотки человека и животных путем проведения этапов обратной транскрипции и амплификации в одной пробирке методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени со специфичными зондом (5'-TGCTCCTGAAACCAGGACAG-3') и праймерами (5'-GAAATATTGATTGCTGAGACAGA-3', 5'-CCCTCCTGTTATTGCTGAAATTA-3').

Профили эксспресии генов, ассоциированных с безжировым фенотипом // 2532837

Изобретение относится к области генетики безжировой массы тела и ожирения у животных и человека. Изобретение представляет собой комбинацию полинуклеотидов или экспрессируемых из них белков, которые дифференциально экспрессируются в животных, демонстрирующих безжировой фенотип, являющийся результатом одной или нескольких стимулирующих безжировой фенотип обработок, содержащих введение CLA, потребление диеты с высоким содержанием белка и увеличение физических упражнений.

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности свободноягодника колючего, элеутерококка (eleutherococcus senticocus (rupr. et maxim.) maxim.) // 2535064

Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики и фармакогнозии и предназначено для выявления видовой принадлежности свободноягодника колючего, элеутерококка (Eleutherococcus senticocus (Rupr. et Maxim.) Maxim.). Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для ПЦР с фрагментом ITS2 ядерной ДНК, включающий прямой и обратный праймеры и разрушаемый зонд. Набор обладает высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет быстро и достоверно провести идентификацию лекарственного растения. 1 ил., 1 пр.