Способ определения свободнорадикальной активности твердых материалов
Владельцы патента RU 2535950:
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (RU)
Способ определения величины свободнорадикальной активности твердых материалов относится к области экологического тестирования, контроля качества строительных и др. материалов и может быть использован для определения негативного воздействия твердых материалов на живые организмы. Способ включает выбор и подготовку исследуемых образцов, отбор заданных объемов растворов компонентов тестовой системы, помещение в кювету исследуемых образцов и компонентов тестовой системы, регистрацию хемилюминесценции с последующей количественной оценкой ее величины с учетом фонового сигнала хемилюминесценции. При этом берут массу навески образца исследуемого материала, соответствующую величине удельной поверхности 0,20±0,05 м2/г, а в случае, когда не представляется возможным определить величину удельной поверхности исследуемого образца, берут навеску 0,010±0,005 г. Помещают навеску образца исследуемого материала в кювету и последовательно добавляют компоненты тестовой системы: 0,01М раствор люминола в 0,5М растворе NaOH и раствор пероксида водорода 20-30% концентрации до заполнения рабочего объема кюветы, соблюдая соотношение люминол:пероксид водорода равным 2:5. И затем регистрируют значения хемилюминесценции в течение 125 минут и подсчитывают суммарную величину хемилюминесценции. Достигаемый при этом технический результат заключается в выявлении свободнорадикальной активности твердых материалов методом регистрации хемилюминесценции с помощью системы химических реагентов без использования биологических субстратов в тестовой системе. 3 табл., 3 пр.
Изобретение относится к области экологического тестирования, контроля качества строительных и др. материалов и может быть использовано для определения величины свободнорадикальной активности твердых материалов в качестве диагностики их негативного воздействия на живые организмы.
Известен способ определения общей токсичности твердых материалов с помощью люминесцентного бактериального теста и измерительного прибора серии «Биотокс», основанный на определении изменения интенсивности биологической хемилюминесценции генно-инженерного штамма при воздействии токсичных веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. [Методика определения токсичности химических веществ, полимеров, материалов и изделий с помощью биотеста «Эколюм». Методические рекомендации №01.018-07; http://bestpravo.ru/rossijskoje/ot-zakony/a2w.htm]
Критерием токсического действия является изменение интенсивности хемилюминесценции биологического тест-объекта в исследуемой пробе по сравнению с таковой для пробы с раствором, не содержащим токсических веществ, или эталонной пробой. Уменьшение интенсивности хемилюминесценции пропорционально токсическому эффекту.
Известно, что регистрируемые значения ХЛ клеток в присутствии люминола - ценный показатель функционального состояния фагоцитов крови и тканей, их способности производить при необходимости активные формы кислорода, т.е. выполнять свою защитную функцию. Эта способность обычно усиливается при возникновении в организме очагов воспаления (например, после инфаркта миокарда) и в ряде других случаев. Наоборот, при длительном недостатке кислорода, связанным с общим ослаблением организма, активность фагоцитов и ХЛ-ответы снижаются. [Владимиров Ю.А. Активированная хемилюминесценция и биолюминесценция как инструмент в медико-биологических исследованиях.]
Известен способ измерения собственной хемилюминесценции различных биологических субстратов (плазмы, сыворотки или суспензии эритроцитов, нейтрофилов) после добавления к этим объектам солей двухвалентного железа и пероксида водорода [Владимиров Ю.А. Хемилюминесценция как метод обнаружения и исследования свободных радикалов в биологических системах.]. Для проведения измерения отбирают заданный объем соответствующего субстрата (плазмы, сыворотки или суспензии эритроцитов, нейтрофилов), помещают в термостатированную кювету; добавляют люминол и фосфатный буфер для поддержания pH~7,4. В течение заданного времени регистрируют фоновые значения ХЛ. Затем добавляют раствор, содержащий ионы двухвалентного железа в качестве инициатора ХЛ, и регистрируют значения ХЛ.
Недостатки известных способов, в том числе и прототипа, состоят в том, что они решают задачу определения свободнорадикальной активности только с использованием биологических субстратов в качестве тестовой системы.
Задача предлагаемого изобретения - возможность создания способа определения свободнорадикальной активности широкого спектра твердых материалов методом регистрации хемилюминесценции без использования биологических субстратов в тестовой системе.
Под твердыми материалами подразумеваются лекарственные препараты, продукты питания, почвы, донные отложения, твердые аэрозольные частицы, строительные материалы, минералы и т.д.
Технический результат - выявление свободнорадикальной активности твердых материалов методом регистрации хемилюминесценции с помощью системы химических реагентов без использования биологических субстратов в тестовой системе.
В результате протекания свободнорадикального распада пероксида водорода под действием исследуемого образца в присутствии люминола регистрируется хемилюминесценция, величина которой является показателем интенсивности протекающей реакции, т.е. уменьшение интенсивности хемилюминесценции соответствует снижению токсической активности.
В основу предлагаемого изобретения положены экспериментальные данные о способности образцов крокодилита и хризотил-асбеста в системе, содержащей пероксид водорода и люминол, вызывать радикальный распад пероксида водорода [Тарасенко Е.А. «Изучение способности минералов, содержащих на поверхности ионы Fe2+ и Fe3+ стимулировать хемилюминесценцию» - 2010. - стр. 138-140. Материалы III Всероссийской школы-семинара «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы».].
Предлагаемый способ включает в себя выбор и подготовку исследуемых образцов, отбор заданных объемов растворов компонентов тестовой системы, помещение в кювету исследуемых образцов и компонентов тестовой системы, регистрацию хемилюминесценции с последующей количественной оценкой ее величины с учетом фонового сигнала хемилюминесценции. Но, в отличие от прототипа, содержит следующие новые признаки: в качестве исследуемого материала используют образцы твердого материала, масса навески которых соответствует величине удельной поверхности 0,20±0,05 м2/г, в случае когда не представляется возможным определить величину удельной поверхности исследуемого образца, берут навеску 0,010±0,005 г, после помещения ее в кювету последовательно добавляют 0,01М раствор люминола в 0,5М растворе NaOH и раствор пероксида водорода 20-30% концентрации до заполнения рабочего объема кюветы, соблюдая соотношение люминол:пероксид водорода в исследуемой системе - 2:5, регистрируют значения хемилюминесценции в течение 125 минут и определяют свободнорадикальную активность твердого материала с учетом данных регистрации фонового значения хемилюминесценции путем подсчета суммарной величины ХЛ.
Предлагаемое изобретение соответствует условиям «новизна» и «изобретательский уровень», так как совокупность признаков изобретения не известна из уровня техники и явным образом из уровня техники не следует влияние новых отличительных признаков на заявленный технический результат.
Соответствие условию «промышленная применимость» подтверждают приведенные ниже примеры.
Пример 1. Определение свободнорадикальной активности волокнистых минералов с известной канцерогенностью
Для исследования брали образцы волокнистых минералов с доказанной канцерогенной активностью - крокидолит и хризотил-асбест. Массу навесок образцов в граммах подбирали таким образом, чтобы она соответствовала величине удельной поверхности, равной 0,20 м2/г±0,05.
Готовили стандартные растворы тестовой системы - растворы люминола 0,01 М (в щелочной среде - 0,5 М NaOH) и пероксида водорода 20-30% концентрации. Соотношение люминол:пероксид водорода в исследуемой системе - 2:5. Навеску образца помещали в кювету, последовательно добавляли 0,01М раствор люминола в 0,5М растворе NaOH и раствор пероксида водорода 20-30% концентрации до заполнения рабочего объема кюветы. Проводили регистрацию кинетики ХЛ в течение 125 минут. По окончании измерений обработку данных проводили в программе Excel 2007. Подсчитывали суммарную величину ХЛ.
В ходе исследований были получены следующие данные:
| № п/п | Материал | Суммарная величина ХЛ, ОЕ | По данным СанПиН 2.2.3.757-99 |
| 1 | Крокидолит | 218350±24972 | III класс опасности, фиброгенное действие, канцероген |
| 2 | Хризотил | 66916±10547 | III класс опасности, фиброгенное действие, канцероген |
Полученные данные согласуются с данными о канцерогенности, представленными в СанПиН 2.2.3.757-99 [Работа с асбестом и асбестосодержащими материалами СанПиН 2.2.3.757-99].
Пример 2. Определение свободнорадикальной активности твердых материалов, не обладающих канцерогенной активностью [Пылев Л.Н., Васильева Л.А., Стадникова Н.М., Смирнова О.В., Зубакова Л.Е., Везенцев А.И., Гудкова Е.А., Бахтин А.И. Характеристика биологических свойств волокон хризотил-асбеста, обработанных кислотой//Гигиена и санитария.- 2006.- №4.- С. 70 -73]
Брали навески лизардита, сивола и целлюлозы, масса которых соответствовала величине удельной поверхности, равной 20 м2/г±0,05.
Готовили стандартные растворы для тестовой системы - растворы люминола 0,01 М (в щелочной среде - 0,5 М NaOH) и пероксида водорода 20-30% концентрации. Соотношение люминол.пероксид водорода в исследуемой системе - 2:5. Навеску образца помещали в кювету, последовательно добавляли 0,01М раствор люминола в 0,5М растворе NaOH и раствор пероксида водорода 20-30% концентрации до заполнения рабочего объема кюветы. Регистрацию кинетики ХЛ проводили в течение 125 минут. По окончании измерений данные обрабатывали в программе Excel 2007. Подсчитывали суммарную ХЛ.
| №п/п | Материал | Суммарная величина ХЛ, ОЕ |
| 1 | Лизардит | 13662±3120 |
| 2 | Сивол | 980±21 |
| 3 | Целлюлоза | 588±61 |
Пример 3. Определение свободнорадикальной активности материала на основе минеральной ваты «IZOVOL»
Для исследования брали теплоизоляционный материал «IZOVOL». Данный материал широко применяется в гражданском и промышленном строительстве в качестве теплоизоляционного материала; обладает хорошими звукоизоляционными качествами. Материал негигроскопичен и долговечен. Образец взят из строительного объекта, находящегося в эксплуатации.
Поскольку не представляется возможным определить величину удельной поверхности исследуемого образца, массу навески брали 0,01±0,005 грамм. Готовили стандартные растворы для тестовой системы - растворы люминола 0,01 М (в щелочной среде - 0,5 М NaOH) и пероксида водорода 20-30% концентрации. Соотношение люминол:пероксид водорода в исследуемой системе - 2:5. Навеску образца помещали в кювету, последовательно добавляли 0,01М раствор люминола в 0,5М растворе NaOH и раствор пероксида водорода 20-30% концентрации до заполнения рабочего объема кюветы. Регистрацию кинетики ХЛ проводили в течение 125 минут. По окончании измерений данные обрабатывали в программе Excel 2007. Подсчитывали суммарную ХЛ.
| №п/п | Материал | Суммарная величина ХЛ, ОЕ |
| 1 | IZOVOL | 2923±141 |
Таким образом, показано, что предложенный способ позволяет определить величину свободнорадикальной активности твердых материалов методом регистрации хемилюминесценции с помощью системы химических реагентов без использования биологических субстратов в тестовой системе.
Способ может быть использован для экспресс-тестирования свободнорадикальной активности твердых материалов и определения величины свободнорадикальной активности твердых материалов с целью диагностики их негативного воздействия на живые организмы.
Способ определения величины свободнорадикальной активности твердых материалов, включающий выбор и подготовку исследуемых образцов, отбор заданных объемов растворов компонентов тестовой системы, помещение в кювету исследуемых образцов и компонентов тестовой системы, регистрацию хемилюминесценции с последующей количественной оценкой ее величины с учетом фонового сигнала хемилюминесценции, отличающийся тем, что берут массу навески образца исследуемого материала, соответствующую величине удельной поверхности 0,20±0,05 м2/г, а в случае, когда не представляется возможным определить величину удельной поверхности исследуемого образца, берут навеску 0,010±0,005 г, помещают навеску образца исследуемого материала в кювету и последовательно добавляют компоненты тестовой системы: 0,01М раствор люминола в 0,5М растворе NaOH и раствор пероксида водорода 20-30% концентрации до заполнения рабочего объема кюветы, соблюдая соотношение люминол:пероксид водорода равным 2:5, регистрируют значения хемилюминесценции в течение 125 минут и подсчитывают суммарную величину хемилюминесценции.
