Способ определения замещенных 2-метоксигидроксибензола в биологическом материале

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и ветеринарных лабо-раторий. Биологический материал, содержащий замещенное 2-метоксигидроксбензола, дважды (каждый раз в течение 30 минут) настаивают с этилацетатом при перемешивании, отдельные извлечения отделяют от твердых частиц биологического материала, объединяют, этилацетат испаряют в токе воздуха при 18-22°C, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, обезвоживают, упаривают в токе воздуха при 18-22°C, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане, экстрагируют буферным раствором с pH 12-13, водно-щелочное извлечение отделяют, подкисляют до pH 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают в токе воздуха при 18-22°C, а затем - в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в соотношении 20:5:1 по объему, хроматографируют в макроколонке с силикагелем КСС №3 80/120 мкм с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 20:5:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют вначале в токе воздуха при температуре 18-22°C, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в дихлорметане, обрабатывают в течение 20 минут N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамидом в условиях нагревания при температуре 60°C и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой (5%-фенил)-метилполисилоксан, используя масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°C, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°C до 290°C со скоростью 20°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°C, температура квадруполя - 150°C, температура источника ионов - 230°C, температура интерфейса детектора - 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество замещенного 2-метоксигидроксибензола по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного. Достигается повышение чувствительности анализа. 4 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения замещенных 2-метоксигидроксибензола в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и ветеринарных лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола, относящегося к группе замещенных 2-метоксигидроксибензола, в биологическом материале (крови) путем двукратного по 30 минут настаивания с этилацетатом, отделения этилацетатных извлечений, их объединения, упаривания объединенного извлечения вначале в токе воздуха, а затем в токе азота до полного испарения растворителя, растворения остатка в смеси растворителей ацетон-вода, взятых в соотношении 5:5 по объему, хроматографирования в макроколонке с сорбентом Силасорб C-18 с использованием подвижной фазы ацетон - вода в соотношении 5:5 по объему, объединения фракций элюата, содержащих 2-метокси-4-аллилгидроксибензол, разбавления буферным раствором с pH 2-3, неоднократного экстрагирования этилацетатом, объединения отдельных экстрактов, упаривания вначале в токе воздуха, затем в токе азота до полного испарения растворителя, растворения остатка в гексане с последующим хроматографированием методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом «Силасорб 600» с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 15:5:1 по объему (Сухомлинова Е.А., Шорманов В.К. Определение эвгенола в биологических жидкостях // Фармация. - 2008. - Т. 57, №1. - С. 7-9).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью.

Известен способ определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола, относящегося к группе замещенных 2-метоксигидроксибензола, в биологическом материале, который заключается в том, что биологический объект двукратно по 30 минут обрабатывают этилацетатом, этилацетатные извлечения объединяют, обезвоживают, этилацетат испаряют вначале в токе воздуха при температуре 18-22°C, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане, экстрагируют буферным раствором с pH 12-13, водно-щелочное извлечение отделяют, подкисляют до pH 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают при 18-22°C в токе воздуха, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в соотношении 40:5:1 по объему, хроматографируют в макроколонке с силикагелем L 40/100µ с использованием подвижной фазы гексан - диоксан-пропанол-2 в соотношении 40:5:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до незначительного объема, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, содержащей полиэтиленгликоль и силоксан в массовом отношении 95:5, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1 мл в минуту, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 50°C (задержка на 1 минуту), температура программируется от 50°C до 150°C со скоростью 50°C в минуту, от 150°C до 290°C со скоростью 20°C в минуту с выдержкой при конечной температуре 8 минут, температура инжектора составляет 280°C, температура интерфейса - 260°C, температура квадруполя - 150°C, температура источника ионов - 230°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-метокси-4-аллилгидроксибензола по площади хроматографического пика (патент RU 2395081, МПК G01N 33/15; G01N 33/50; G01N 30/00 / Способ определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в биологическом материале / Шорманов В.К., Сухомлинова Е.А., Елизарова М.К., Сипливая Л.Е., Сипливый Г.В.; заявители и патентообладатели: В.К. Шорманов, Е.А. Сухомлинова, М.К. Елизарова. - №2008138004; Заяв. 23.09.2008; Опуб.20.07.2010 // Изобретения (Заявки и патенты). - 2010. - №20. - 9 с.).

Способ характеризуется недостаточно высокими чувствительностью и селективностью определения.

Наиболее близким является способ определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола, относящегося к замещенным 2-метоксигидроксибензола, в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект двукратно по 30 минут обрабатывают этилацетатом, этилацетатные извлечения объединяют, этилацетат испаряют, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения объединяют, упаривают вначале в токе воздуха при температуре 18-22°C, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане, экстрагируют буферным раствором с pH 12-13, водно-щелочное извлечение отделяют, подкисляют до pH 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают в токе воздуха при 18-22°C, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан - диэтиловый эфир, взятых в соотношении 6:4 по объему, хроматографируют в макроколонке с силикагелем L 40/100µ с использованием подвижной фазы гексан - диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18 - 22°C, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой (5%-фенил)-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1 мл в минуту, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 50°C, температура программируется от 50°C до 200°C со скоростью 10°C в минуту, температура инжектора составляет 280°C, температура интерфейса - 260°C, температура квадруполя - 150°C, температура источника ионов - 230°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-метокси-4-аллилгидроксибензола по площади хроматографического пика (патент RU 2456597 Российская Федерация, МПК G01N 33/48; G01N 30/02 / Способ определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в биологическом материале / Шорманов В.К., Асташкина А.П., Елизарова М.К., Киричек А.В.; заявитель и патентообладатель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития. - №2011113156; Заяв. 05.04.2011; Опуб.20.07.2012 // Изобретения (Заявки и патенты). - 2012. - №20. - 11 с.).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью определения.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения.

Технический результат достигается тем, что биологический объект двукратно по 30 минут обрабатывают этилацетатом, этилацетатные извлечения объединяют, этилацетат испаряют, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения объединяют, упаривают вначале в токе воздуха при температуре 18-22°C, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане, экстрагируют буферным раствором с pH 12-13, водно-щелочное извлечение отделяют, подкисляют до pH 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают в токе воздуха при 18-22°C, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в соотношении 20:5:1 по объему, хроматографируют в макроколонке с силикагелем КСС №3 80/120 мкм с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 20:5:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в дихлорметане, обрабатывают в течение 20 минут N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамидом в условиях нагревания при температуре 60°С и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой (5%-фенил)-метилполисилоксан, используя масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°C, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°C до 290°C со скоростью 20°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°C, температура квадруполя - 150°C, температура источника ионов - 230°C, температура интерфейса детектора - 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество замещенного 2-метоксигидроксибензола по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

Способ осуществляется следующим образом: биологический материал, содержащий замещенное 2-метоксигидроксибензола, дважды (каждый раз в течение 30 минут) настаивают с этилацетатом при перемешивании, отдельные извлечения отделяют от твердых частиц биологического материала, объединяют, этилацетат испаряют в токе воздуха при 18-22°C, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, обезвоживают, упаривают в токе воздуха при 18-22°C, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане, экстрагируют буферным раствором с pH 12-13, водно-щелочное извлечение отделяют, подкисляют до pH 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают в токе воздуха при 18-22°C, а затем - в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в соотношении 20:5:1 по объему, хроматографируют в макроколонке с силикагелем КСС №3 80/120 мкм с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 20:5:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют вначале в токе воздуха при температуре 18-22°C, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в дихлорметане, обрабатывают в течение 20 минут N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамидом в условиях нагревания при температуре 60°C и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой (5%-фенил)-метилполисилоксан, используя масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°C, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°C до 290°C со скоростью 20°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°C, температура квадруполя - 150°C температура источника ионов - 230°C, температура интерфейса детектора - 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество замещенного 2-метоксигидроксибензола по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Определение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в ткани печени

К 10 г ткани свежей трупной печени человека прибавляют 10 мг 2-метокси-4-аллилгидроксибензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°C. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл этилацетата и оставляют на 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Вытяжки объединяют, этилацетат испаряют в токе воздуха при 18-22°C, остаток трижды по 3 минуты обрабатывают порциями ацетона по 15 мл каждая при энергичном перемешивании, извлечения отделяют, объединяют, встряхивают с 7 г безводного сульфата натрия, фильтруют через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, сульфат натрия и фильтр дополнительно промывают 20 мл ацетона, фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают в токе воздуха при 18-22°C до объема 0,5-1,0 мл, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл гексана, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с pH 12-13 по 10 мл каждая. Отдельные водно-щелочные экстракты объединяют, подкисляют 24%-ным раствором хлороводородной кислоты до pH 2-3, насыщают сульфатом натрия и экстрагируют дважды порциями диэтилового эфира по 20 мл каждая. Эфирные извлечения объединяют, пропускают через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, фильтр дополнительно промывают 20 мл диэтилового эфира. Отдельные фильтраты объединяют, упаривают в токе воздуха при 18-22°C до объема 0,5-1,0 мл, а затем в токе азота до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в соотношении 20:5:1 по объему, и вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля КСС №3 80/120 мкм. Хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 20:5:1 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 5 по 11 включительно объединяют, упаривают при 18-22°C вначале в токе воздуха до объема 0,5-1 мл, а затем - в токе азота до полного испарения растворителя. Остаток растворяют в 10 мл дихлорметана (раствор А).

0,1 мл раствора А вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл, обрабатывают в течение 20 минут 0,016 мл дериватизирующего реагента, которым является N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамид, в условиях нагревания при 60°C, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят дихлорметаном до метки (раствор Б).

4 мкл раствора В вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой (5%-фенил)-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°C, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°C до 290°C со скоростью 20°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°C, температура квадруполя - 150°C, температура источника ионов - 230°C, температура интерфейса детектора - 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-метокси-4-аллилгидроксибензола по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 10,37 мин соответствует триметилсилильному производному 2-метокси-4-аллилгидроксибензола. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 45, 59, 73, 89, 103, 117, 163, 179, 206, 221, 236. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 206, интенсивность которой принимается за 100%.

2-метокси-4-аллилгидроксибензол в виде соответствующего триметилсилильного производного идентифицируют по сочетанию времени удерживания триметилсилильного производного в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание 2-метокси-4-аллилгидроксибензола, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 5,0 мл 0,125% раствора и 2,5, 4,0, 5,0, 10,0 мл 1,25% раствора 2-метокси-4-аллилгидроксибензола и доводят объем содержания каждой колбы до метки дихлорметаном.

0,1 мл каждого из растворов вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл, обрабатывают в течение 20 минут 0,016 мл N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамида в условиях нагревания при 60°C, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят дихлорметаном до метки.

4 мкл каждого из полученных растворов вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой (5%-фенил)-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°C, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°C до 290°C со скоростью 20°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°C, температура квадруполя - 150°C, температура источника ионов - 230°C, температура интерфейса детектора - 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-метокси-4-аллилгидроксибензола по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 1·10^-11-2·10^-7 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=5005133·C+7623,

где S - площадь хроматографического пика; C - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.

Результаты количественного определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в крови представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение 2-метокси-4-пропенилгидроксибензола в ткани печени

К 10 г ткани свежей трупной печени человека прибавляют 10 мг 2-метокси-4-пропенилгидроксибензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°C. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл этилацетата и оставляют на 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Вытяжки объединяют, этилацетат испаряют в токе воздуха при 18-22°C, остаток трижды по 3 минуты обрабатывают порциями ацетона по 15 мл каждая при энергичном перемешивании, извлечения отделяют, объединяют, встряхивают с 7 г безводного сульфата натрия, фильтруют через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, сульфат натрия и фильтр дополнительно промывают 20 мл ацетона, фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают в токе воздуха при 18-22°C до объема 0,5-1,0 мл, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл гексана, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с pH 12-13 по 10 мл каждая. Отдельные водно-щелочные экстракты объединяют, подкисляют 24%-ным раствором хлороводородной кислоты до pH 2-3, насыщают сульфатом натрия и экстрагируют дважды порциями диэтилового эфира по 20 мл каждая. Эфирные извлечения объединяют, пропускают через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, фильтр дополнительно промывают 20 мл диэтилового эфира. Отдельные фильтраты объединяют, упаривают в токе воздуха при 18-22°C до объема 0,5-1,0 мл, а затем в токе азота до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в соотношении 20:5:1 по объему, и вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля КСС №3 80/120 мкм. Хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 20:5:1 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 4 по 9 включительно объединяют, упаривают при 18-22°C вначале в токе воздуха до объема 0,5-1 мл, а затем - в токе азота до полного испарения растворителя. Остаток растворяют в 10 мл дихлорметана (раствор А).

0,1 мл раствора А вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл, обрабатывают в течение 20 минут 0,016 мл дериватизирующего реагента, которым является N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамид, в условиях нагревания при 60°C, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят дихлорметаном до метки (раствор Б).

4 мкл раствора В вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой (5%-фенил)-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°C, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°C до 290°C со скоростью 20°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°C, температура квадруполя - 150°C, температура источника ионов - 230°C, температура интерфейса детектора - 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-метокси-4-пропенилгидроксибензола по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 11,06 мин соответствует триметилсилильному производному 2-метокси-4-пропенилгидроксибензола. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 45, 59, 73, 89, 103, 115, 161, 179, 191, 206, 221, 236. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 206, интенсивность которой принимается за 100%.

2-метокси-4-пропенилгидроксибензол в виде соответствующего триметилсилильного производного идентифицируют по сочетанию времени удерживания триметилсилильного производного в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание 2-метокси-4-пропенилгидроксибензола, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,025, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 5,0 мл 0,125% раствора и 2,5, 4,0, 5,0, 10,0, 20,00 мл 1,25% раствора 2-метокси-4-пропенилгидроксибензола и доводят объем содержания каждой колбы до метки дихлорметаном.

0,1 мл каждого из растворов вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл, обрабатывают в течение 20 минут 0,016 мл N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамида в условиях нагревания при 60°C, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят дихлорметаном до метки.

4 мкл каждого из полученных растворов вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой (5%-фенил)-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°C, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°C до 290°C со скоростью 20°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°C, температура квадруполя - 150°C, температура источника ионов - 230°C, температура интерфейса детектора - 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-метокси-4-пропенилгидроксибензола по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 2,5·10^-11-4·10^-7 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=290141·C-4363,

где S - площадь хроматографического пика; C - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.

Результаты количественного определения 2-метокси-4-пропенилгидроксибензола в ткани печени представлены в таблице 2.

Пример 3

Определение 2-метоксигидроксибензола в ткани печени

К 10 г ткани свежей трупной печени человека прибавляют 10 мг 2-метоксигидроксибензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°C. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл этилацетата и оставляют на 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Вытяжки объединяют, этилацетат испаряют в токе воздуха при 18-22°C, остаток трижды по 3 минуты обрабатывают порциями ацетона по 15 мл каждая при энергичном перемешивании, извлечения отделяют, объединяют, встряхивают с 7 г безводного сульфата натрия, фильтруют через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, сульфат натрия и фильтр дополнительно промывают 20 мл ацетона, фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают в токе воздуха при 18-22°C до объема 0,5-1,0 мл, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл гексана, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с pH 12-13 по 10 мл каждая. Отдельные водно-щелочные экстракты объединяют, подкисляют 24%-ным раствором хлороводородной кислоты до pH 2-3, насыщают сульфатом натрия и экстрагируют дважды порциями диэтилового эфира по 20 мл каждая. Эфирные извлечения объединяют, пропускают через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, фильтр дополнительно промывают 20 мл диэтилового эфира. Отдельные фильтраты объединяют, упаривают в токе воздуха при 18-22°C до объема 0,5-1,0 мл, а затем в токе азота до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в соотношении 20:5:1 по объему, и вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля КСС №3 80/120 мкм. Хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 20:5:1 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 4 по 9 включительно объединяют, упаривают при 18-22°C вначале в токе воздуха до объема 0,5-1 мл, а затем - в токе азота до полного испарения растворителя. Остаток растворяют в 10 мл дихлорметана (раствор А).

0,1 мл раствора А вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл, обрабатывают в течение 20 минут 0,016 мл дериватизирующего реагента, которым является N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамид, в условиях нагревания при 60°C, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят дихлорметаном до метки (раствор Б).

4 мкл раствора В вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой (5%-фенил)-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°C, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°C до 290°C со скоростью 20°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°C, температура квадруполя - 150°C, температура источника ионов - 230°C, температура интерфейса детектора - 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-метоксигидроксибензола по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 8,58 мин соответствует триметилсилильному производному 2-метоксигидроксибензола. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 41, 58, 73, 89, 121, 136, 151, 166, 167, 181, 196. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 166, интенсивность которой принимается за 100%.

2-метоксигидроксибензол в виде соответствующего триметилсилильного производного идентифицируют по сочетанию времени удерживания триметилсилильного производного в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание 2-метоксигидроксибензола, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 5,0 мл 0,125% раствора и 2,5, 4,0, 5,0, 10,0 мл 1,25% раствора 2-метоксигидроксибензола и доводят объем содержания каждой колбы до метки дихлорметаном.

0,1 мл каждого из растворов вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл, обрабатывают в течение 20 минут 0,016 мл N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамида в условиях нагревания при 60°C, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят дихлорметаном до метки.

4 мкл каждого из полученных растворов вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой (5%-фенил)-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°C, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°C до 290°C со скоростью 20°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°C, температура квадруполя - 150°C, температура источника ионов - 230°C, температура интерфейса детектора - 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-метоксигидроксибензола по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 1·10^-11-2·10^-7 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=4065703·C-14791,

где S - площадь хроматографического пика; C - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.

Результаты количественного определения 2-метоксигидроксибензола в ткани печени представлены в таблице 3.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 100 раз повышает чувствительность определения в хроматографируемой пробе и в 5 раз - в биологическом материале.

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 4.

Таблица 1
Результаты определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в ткани печени (n=5; P=0,95)
№	Внесено 2-метокси-4-аллилгидроксибензола, мг в 10 г печени	Найдено	Метрологические характеристики, %
площадь пика на хроматограмме, усл.ед.	мг в хроматографируемой пробе	мг в пересчете на навеску, внесенную в биоматериал	% от внесенной в биоматериал навески
1	10,0	84354124	16,852·10-6	8,426	84,26	$$\overline{x}=84,54$$
2	10,0	82612338	16,504·10-6	8,252	82,52	S=3,59
3	10,0	89479381	17,876·10-6	8,938	89,38	$$S_{\overline{x}}=1,60$$
4	10,0	86566393	17,294·10-6	8,647	86,47	$$\Delta \overline{x}=4,46$$
5	10,0	80184849	16,019·10-6	8,005	80,05	$$\overline{\epsilon }=5,28$$

Таблица 2
Результаты определения 2-метокси-4-пропенилгидроксибензола в ткани печени (n=5; P=0,95)
№	Внесено 2-метокси-4-пропенил-гидрокси-бензола, мг в 10 г печени	Найдено	Метрологические характеристики, %
площадь пика на хроматограмме, усл. ед.	мг в хроматографируемой пробе	мг в пересчете на навеску, внесенную в биоматериал	% от внесенной в биоматериал навески
1	10,0	5075426	17,508·10-6	8,754	87,54	$$\overline{x}=85,24$$
2	10,0	5172333	17,842·10-6	8,921	89,21	S=3,33
3	10,0	4824744	16,644·10-6	8,322	83,22	$$S_{\overline{x}}=1,49$$
4	10,0	4687217	16,170·10-6	8,085	80,85	$$\Delta \overline{x}=4,14$$
5	10,0	4948924	17,072·10-6	8,536	85,36	$$\overline{\epsilon }=4,86$$

Таблица 3
Результаты определения 2-метоксигидроксибензола в ткани печени (n=5; P=0,95)
№	Внесено 2-метоксигидроксибензола, мг в 10 г печени	Найдено	Метрологические характеристики, %
площадь пика на хроматограмме, усл. ед.	мг в хроматографируемой пробе	мг в пересчете на навеску, внесенную в биоматериал	% от внесенной в биоматериал навески
1	10,0	64320893	15,824·10-6	7,912	79,12	$$\overline{x}=83,69$$
2	10,0	67443353	16,592·10-6	8,296	82,96	S=2,89
3	10,0	69329839	17,056·10-6	8,528	85,28	$$S_{\overline{x}}=1,29$$
4	10,0	70443841	17,330·10-6	8,665	86,65	$$\Delta \overline{x}=3,59$$
5	10,0	68703721	16,902·10-6	8,451	84,51	$$\overline{\epsilon }=4,29$$

Таблица 4
Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов (на примере определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в ткани печени)
Показатели	Предлагаемый способ	Известный способ
Чувствительность (открываемый минимум):
а) в 100 г биоматериала	3·10-6 г	1,5·10-5 г
б) в хроматографируемой пробе	5·10-12 г	5·10-10 г
Интервал линейности градуировочного графика (г в хроматографируемой пробе)	1·10-11-2·10-7 г	1·10-9-1·10-7 г

Способ определения замещенных 2-метоксигидроксибензола в биологическом материале, который заключается в том, что биологический объект двукратно по 30 минут обрабатывают этилацетатом, этилацетатные извлечения объединяют, этилацетат испаряют, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения объединяют, упаривают вначале в токе воздуха при температуре 18-22°С, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане, экстрагируют буферным раствором с pH 12-13, водно-щелочное извлечение отделяют, подкисляют до pH 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают при 18-22°C в токе воздуха, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей, хроматографируют в макроколонке с силикагелем, используя подвижную фазу, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки с неподвижной фазой (5%-фенил)-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, температура квадруполя составляет 150°C, температура источника ионов - 230°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество замещенного 2-метоксигидроксибензола по площади хроматографического пика, отличающийся тем, что, перед хроматографированием в макроколонке, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в соотношении 20:5:1 по объему, при хроматографировании в макроколонке используют силикагель КСС №3 80/120 мкм, подвижной фазой для хроматографирования в макроколонке является смесь растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в соотношении 20:5:1 по объему, перед проведением хромато-масс-спектрофотометрического определения остаток растворяют в дихлорметане и обрабатывают в течение 20 минут N-трет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамидом в условиях нагревания при температуре 60°C, для хромато-масс-спектрометрического определения применяется капиллярная колонка длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм, начальная температура термостата колонки составляет 70°C, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°C до 290°C со скоростью 20°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°C, температура интерфейса детектора - 300°C, вычисление количества замещенного 2-метоксигидроксибензола осуществляют по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.