Конъюгат для фотодинамической диагностики или терапии, а также способ его получения
Группа изобретений относится к конъюгату для фотодинамической диагностики или терапии рака, к способу получения конъюгата и к композиции, предназначенной для диагностики или терпаии рака, содержащей конъюгат. Конъюгат в виде наночастиц с размерами 100-250 нм представляет собой ацетилированный биологически совместимый полисахарид - хондроитин сульфат, связанный сложноэфирной связью с соединением на основе фталоцианина формулы
Конъюгат получают посредством ацетилирования хондроитин сульфата, растворения хондроитин сульфата в органическом растворителе и добавления соединения на основе фталоцианина указанной выше формулы и катализатора к хондроитин сульфату. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 16 ил., 2 пр.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к конъюгату ацетилированного биологически совместимого полисахарида и соединения на основе фталоцианина, предназначенному для фотодинамической диагностики или терапии, а также к способу получения такого конъюгата, а более конкретно к биологически совместимому конъюгату, в котором ацетилированный полисахарид связан с соединением на основе фталоцианина, который может иметь превосходное отношение накопления и таргетное распределение по отношению к раковым клеткам и который характеризуется превосходной стабильностью в клетках, отличных от раковых клеток, а также к способу получения такого конъюгата.
Уровень техники
Фотодинамическая терапия (PDT) представляет собой технологию лечения неизлечимых заболеваний, таких как рак и тому подобные, или лечения таких заболеваний, как акне и тому подобные, без проведения операций с использованием фоточувствительного материала (ниже упоминается как “фотосенсибилизатор”). PDT активно изучают с начала 21-го столетия, и в настоящее время ее используют для повышения иммунитета при диагностике и терапии рака, при аутологичной трансплантации костного мозга, при применении антибиотиков, при терапии СПИДа, при пересадке кожи или при терапии артрита и, таким образом, диапазон применения постепенно расширяется.
В частности, в случае PDT, используемой при терапии рака, когда фотосенсибилизатор, представляющий собой материал, чувствительный к свету, вводится в организм и облучается внешним светом, он под действием внешнего света претерпевает химические реакции со свободным кислородом с образованием синглетного кислорода или свободного радикала, которые индуцируют апоптоз в различных болезненных очагах и раковых клетках, разрушая их.
В настоящее время, в качестве фотосенсибилизаторов, используемых при PDT, известны производные порфирина, хлор, бактериохлорин, фталоцианин, производные 5-амино-левулиновой кислоты и тому подобное. Производные циклических тетрапирролов в качестве фотосенсибилизатора отличаются тем, что они селективно накапливаются в раковых клетках и флуоресцируют или фосфоресцируют, в зависимости от свойств соединения, что позволяет использовать их в качестве реагента для ранней диагностики. В дополнение к этому, поскольку металлопорфирин, в котором внутри циклического тетрапиррола связан металл, характеризуется рядом свойств, зависящих от вида связанного металла, такие металлопорфирины используются в качестве контрастного агента во время исследований методом ядерного магнитного резонанса (MRI) и, как следствие, применяются во время ранней диагностики опухолевых клеток, таких как раковые клетки. Производные 5-амино-левулиновой кислоты, которые являются наиболее широко известными фотосенсибилизаторами, являются простыми в использовании и имеют малую молекулярную массу, что относительно облегчает проникновение через кожу. Кроме того, они имеют малое число побочных эффектов и, таким образом, являются стабильными. В дополнение к этому, сообщалось, что соединение на основе металлофталоцианина с металлом, связанным внутри фталоцианина, в котором пиррольные группы циклического тетрапиррола конъюгированы с бензольными кольцами и соединяются через аза-азот, или внутри нафталоцианина, в котором каждое бензольное кольцо фталоцианина конъюгировано с другим бензольным кольцом, имеет более высокую длину волны поглощения и более высокий молярный коэффициент поглощения, чем обычное соединение на основе порфирина.
PDT позволяет селективно удалять только раковые клетки, сохраняя, в то время, нормальные клетки; устранять риски, связанные с общей анестезией, и даже осуществлять операцию при использовании только лишь местной анестезии.
Однако PDT сложно использовать в случае клеток объемных опухолей, через которые свет не проходит. В частности, PDT имеет недостатки, при которых фотосенсибилизатор медленно метаболизируется in vivo и, таким образом, остается в организме в течение продолжительного промежутка времени, приводя к фототоксичным побочным воздействиям, а также плохо накапливается в опухолевых клетках, приводя к уменьшению концентрации фотосенсибилизатора в опухолевых клетках, что не мешает эффективному терапевтическому воздействию.
Кроме того, период полужизни фотосенсибилизатора является довольно продолжительным, что принуждает пациентов к весьма неудобному нахождению в помещениях без света после лечения, и фотосенсибилизатор с трудом накапливается в опухолевых клетках. В дополнение к этому, лечебные соединения накапливаются в организме в течение продолжительного времени, включая, собственно, время терапии, что вызывает в организме различные побочные эффекты. Кроме того, большинство фотосенсибилизаторов, используемых для PDT, являются гидрофильными продуктами, и не могут легко проникать через кожу, и, таким образом, терапию необходимо осуществлять несколько раз в течение продолжительного периода времени, что делает терапию избыточно долгой.
Поэтому необходимо разработать новые фотодинамические терапевтические агенты, которые имели бы высокое отношение накопления, специфичное для раковых клеток, минимальное побочное действие, превосходное терапевтическое действие и которые эффективно использовали бы биологически совместимые полисахариды.
Описание
Техническая задача
Настоящее изобретение было сделано в попытке найти новый конъюгат для фотодинамической диагностики или терапии, который позволил бы повысить отношение накопления соединения на основе фталоцианина в качестве фотосенсибилизатора в опухолевых клетках, и характеризовался бы цитотоксичностью, специфичной только для раковых клеток, и при этом имел бы заметно сниженную фототоксичность в клетках, отличных от раковых клеток, благодаря подавлению флуоресценции.
Техническое решение
Настоящее изобретение основано на получении комплексного соединения из фталоцианина, в котором во фталоцианин или нафталоцианин вводят -COOH или бензольное кольцо, замещенное -COOH, и полисахарида, имеющего модифицированные химические свойства, получаемого посредством ацетилирования биологически совместимого нерастворимого в органических растворителях полисахарида. Более конкретно, настоящее изобретение основано на получении конъюгата ацетилированного биологически совместимого полисахарида, который способен повысить отношение накопления фотосенсибилизатора в опухолевых клетках и не является цитотоксичным для клеток, отличных от раковых клеток, благодаря подавлению флуоресценции, даже когда его облучают излучением из ближней инфракрасной области, и фотосенсибилизатора, имеющего более высокий коэффициент поглощения и поглощающую способность в ближней инфракрасной области.
Таким образом, настоящее изобретение относится к конъюгату для фотодинамической диагностики или терапии, в котором ацетилированный биологически совместимый полисахарид связан с фотосенсибилизатором.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения конъюгата для фотодинамической диагностики или терапии, включающему: ацетилирование биологически совместимого полисахарида; растворение ацетилированного биологически совместимого полисахарида в органическом растворителе и добавление соединения на основе фталоцианина и катализатора к биологически совместимому полисахариду для связывания фотосенсибилизатора с биологически совместимым полимером.
Преимущества
Конъюгат для фотодинамической диагностики или терапии по настоящему изобретению получают посредством связывания ацетилированного биологически совместимого полисахарида и соединения на основе фталоцианина. Он может легко накапливаться в раковых клетках in vivo, в то время как ткани, его не накапливающие, не подвержены цитотоксичности, благодаря подавлению флуоресценции, даже когда их облучают излучением из ближней инфракрасной области. Кроме того, когда конъюгат накапливается в раковых клетках, связь между биологически совместимым полисахаридом и фотосенсибилизатором разрушается под действием ферментов раковой клетки, и тогда, при облучении светом с длиной волны, соответствующей ближней инфракрасной области, конъюгат становится цитотоксичным и, таким образом, максимизирует противораковое действие во время облучения излучением из ближней инфракрасной области, а также демонстрирует флуоресценцию, в следствие которой он может использоваться для получения изображений.
Описание чертежей
Фиг.1 иллюстрирует механизм, согласно которому биологически совместимый конъюгат по настоящему изобретению, в котором соединение на основе фталоцианина связывается с ацетилированным биологически совместимым полисахаридом, демонстрирует цитотоксичность в раковой клетке;
Фиг.2 представляет собой график, показывающий коэффициенты поглощения фотосенсибилизаторов, таких как фталоцианин, нафталоцианин, хлор и бактериохлорин;
Фиг.3 представляет собой график, показывающий результаты анализа Maldi-TOF (ионизация с лазерной десорбцией и с использованием матрицы, времяпролетный режим) для соединения на основе фталоцианина, используемого в примерах по настоящему изобретению;
Фиг.4 представляет собой схему, показывающую структурную формулу конъюгата, Ac-Cs-Zn-Pc-COOH, в котором соединение на основе фталоцианина связано с сульфатом хондроитина посредством сложноэфирной связи;
Фиг.5 показывает результаты ЯМР анализа Ac-Cs-Zn-Pc-COOH;
Фиг.6 показывает результаты анализа FT-IR (инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием) для Ac-Cs-Zn-Pc-COOH;
Фиг.7-11 показывают результаты, полученные с помощью устройства для динамического рассеяния света и электронного микроскопа для конъюгата (нано-микросферы), предназначенного для фотодинамической диагностики или терапии и полученного в соответствии с одним из примеров по настоящему изобретению. В частности, показаны результаты для распределения размеров и формы, когда Ac-Cs-Zn-Pc-COOH, полученный в Примере 1 настоящего изобретения, находится в форме нано-микросфер;
Фиг.12 представляет собой график, сравнивающий интенсивности флуоресценции для случаев, когда эффект подавления флуоресценции имеет место и когда эффект подавления флуоресценции не показан, для нано-микросфер по настоящему изобретению, полученных в соответствии с одним из примеров настоящего изобретения, то есть для Ac-Cs-Zn-Pc-COOH, полученного в Примере 1, и показывающий посредством сравнения и наблюдения значения флуоресценции для различных концентраций Ac-Cs-Zn-Pc-COOH в DMSO и деионизованной воде и значения флуоресценции для немодифицированного Zn-Pc-COOH в DMSO и деионизованной воде;
Фиг.13 представляет собой график, показывающий потенциал образования синглетного кислорода при облучении лазером, для нано-микросфер по настоящему изобретению, полученных в соответствии с одним из примеров настоящего изобретения, то есть для Ac-Cs-Zn-Pc-COOH, полученного в Примере 1, где • - означает потенциал образования кислорода для немодифицированного Zn-Pc-COOH в DMSO; и -○-, -▼- и -□- означают потенциалы образования кислорода для 1 мг, 2 мг и 5 мг нано-микросфер по настоящему изобретению в DMSO, соответственно;
Фиг.14 показывает уровни флуоресценции, демонстрируемые благодаря разложению под действием фермента раковых клеток, когда 10 мкг нано-микросфер по настоящему изобретению, полученных в соответствии с одним из примеров настоящего изобретения, то есть Ac-Cs-Zn-Pc-COOH, полученного в Примере 1, обрабатывают культурной средой А без раковых клеток и культурной средой В с раковыми клетками, соответственно; и
Фиг.15 и 16 представляют собой сравнительные графики, когда нано-микросферы по настоящему изобретению, полученные в соответствии с одним из примеров настоящего изобретения, то есть Ac-Cs-Zn-Pc-COOH, полученный в Примере 1, и немодифицированный Zn-Pc-COOH, используемый в качестве контроля, поглощаются в клетках с последующим облучением лазером, после которого с помощью реагента МТТ наблюдается апоптоз. Общее время облучения лазером составляет 8 минут. Фиг.15 показывает сравнение уровня апоптоза для немодифицированного Zn-Pc-COOH для случая, когда лазером не облучают (•-), и для случая облучения лазером (-○-), а Фиг.16 показывает сравнение уровня апоптоза для конъюгата по настоящему изобретению, Ac-Cs-Zn-Pc-COOH, для случая, когда лазером не облучают (•-), и для случая облучения лазером (-○-).
Наилучший способ осуществления изобретения
Настоящее изобретение относится к конъюгату для фотодинамической диагностики или терапии, в котором соединение на основе фталоцианина в качестве фотосенсибилизатора связано с ацетилированным биологически совместимым полисахаридом.
Конъюгат ацетилированного биологически совместимого полисахарида и соединения на основе фталоцианина для фотодинамической диагностики или терапии в соответствии с настоящим изобретением предназначен для нового способа фотодинамической терапии, который может повысить отношение накопления в раковых тканях или раковых клетках и таргетное распределение в раковых тканях или раковых клетках, а также заметно уменьшить фототоксичность благодаря подавлению флуоресценции в клетках, отличных от раковых тканей или раковых клеток. Таким образом, описывается конъюгат для фотодинамической диагностики или терапии, в котором соединение на основе фталоцианина в качестве фотосенсибилизатора связано с ацетилированным биологически совместимым полисахаридом.
Как правило, биологически совместимый полисахарид имеет хорошую растворимость в воде, но низкую растворимость в органических растворителях и, таким образом, он плохо растворяется в существующем органическом растворителе, что усложняет его химическое связывание. Однако в соответствии с настоящим изобретением полисахарид ацетилируют для увеличения растворимости в органических растворителях, и делают возможными некоторые химические модификации. В дополнение к этому, существующий фотодинамический терапевтический агент, включающий один лишь фотосенсибилизатор, может вводиться только местным образом, поскольку он имеет высокую гидрофобность и, таким образом, непригоден для инъекций. Кроме того, он имеет низкую эффективность накопления и таргетную эффективность по отношению к раковым клеткам и, таким образом, не позволяет подавить флуоресценцию, что может in vivo привести к воздействию на нормальные клетки. Однако в настоящем изобретении уже сам биологически совместимый полисахарид, даже без отдельного материала, способного нацеливаться на раковые клетки, связывается, в результате ацетилирования, с некоторыми целевыми рецепторами среди тех рецепторов, которые сверх экспрессируются на поверхности раковой клетки. Это позволяет увеличить эффективность накопления в раковых тканях, а позже легко разложить конъюгат под действием ферментативной реакции. Затем эффект подавления флуоресценции ослабляется, и в этой ситуации, когда клетки облучают светом с длиной волны, соответствующей ближней инфракрасной области, раковые клетки будут уничтожаться.
В настоящем изобретении связывание соединения на основе фталоцианина и биологически совместимого полисахарида никак не ограничено, при условии, что связь между соединением на основе фталоцианина и биологически совместимым полисахаридом может расщепляться под действием ферментативной реакции, когда конъюгат накапливается в раковой клетке. Например, связь может представлять собой амидную связь, то есть связь -CO-NH-, или сложноэфирную связь, и предпочтительно представляет собой сложноэфирную связь, образующуюся в результате связывания группы CH2OH биологически совместимого полисахарида и группы -COOH, введенной в соединение на основе фталоцианина. Причина этого заключается в том, что сложноэфирная связь имеет более высокую эффективность разложения in vivo по сравнению с другими видами связей, включая амидную связь, и, таким образом, демонстрирует высокое терапевтическое воздействие при использовании малого количества фотосенсибилизатора.
В дополнение к этому, конъюгат для фотодинамической диагностики или терапии по настоящему изобретению может иметь форму нано-геля или нано-микросфер, в виде наноразмерной самоорганизующейся системы, которая является стабильной в водной системе, в результате баланса между гидрофильными свойствами биологически совместимого производного ацетилированного полисахарида и гидрофобными свойствами фотосенсибилизатора.
В соответствии со способом получения конъюгата, в котором соединение на основе фталоцианина связано с ацетилированным полисахаридом в соответствии с настоящим изобретением, нерастворимый в органическом растворителе полисахарид ацетилируют, так чтобы конъюгат можно было получить с использованием соединения на основе фталоцианина в качестве фотосенсибилизатора в органическом растворителе, подобном DMSO или формамиду. Ниже способ получения конъюгата для фотодинамической диагностики или терапии по настоящему изобретению будет описан более подробно и постадийно.
Первая стадия: ацетилирование биологически совместимого полисахарида
Для получения конъюгата для фотодинамической диагностики или терапии по настоящему изобретению сначала ацетилируют биологически совместимый полисахарид.
Полисахарид должен иметь превосходную биологическую совместимость и биодеградируемость in vivo, иметь превосходную стабильность in vivo и эффективно накапливаться в раковых тканях.
В качестве полисахарида, пригодного для использования в настоящем изобретении, можно использовать любой полисахарид или производное полисахарида, которое может иметь биологическую совместимость in vivo. Например, можно использовать пуллулан, гиалуроновую кислоту, декстран или хондроитин сульфат, но настоящее изобретение не ограничивается этими вариантами. В одном из примеров настоящего изобретения используют производное сульфата хондроитина.
Среди полисахаридов, пригодных для использования в настоящем изобретении, пуллулан представляет собой материал, полученный посредством выделения и очистки полисахарида, получаемого из Aureobasidium pullulans ((DE BARY) ARN.), и его главный компонент представляет собой нейтральный полисахарид. Пуллулан хорошо растворим в воде, но нерастворим в спиртах и маслах, и имеет более низкую вязкость, чем другие смолы, но является стабильным под действием кислоты, щелочи, тепла и тому подобного. В частности, пуллулан имеет высокую прочность адгезии, а также пленкообразующие свойства, и имеет два типа средних молекулярных масс, 200000 и 100000. В дополнение к этому, пуллулан имеет вязкость 1~2 сантипуаз при комнатной температуре.
<Структурная формула пуллулана>
В дополнение к этому, полисахарид, пригодный для использования в настоящем изобретении - гиалуроновая кислота - известна как важный мукополисахарид, вместе с хондроитином сульфатом и т.п. Гиалуроновая кислота представляет собой соединение, в котором N-ацетилглюкозамин и глюкуроновая кислота связаны в цепь чередующимся образом. Гиалуроновая кислота присутствует в гиалиновом теле глаза или пуповине, имеет большую вязкость и играет важную роль в предотвращении инвазии бактерий или проникновения ядов. Она сходна с пектиновым веществом растений и гидролизуется под действием гиалуронидазы. Гиалуроновая кислота была получена из гиалоидов бычьих глазных яблок в 1934 Мейером (Meyer), и ее название обозначает уроновую кислоту гиалоидов. Для придания амфифильности и увеличения растворимости в органической кислоте пиридин и уксусный ангидрид объединяют друг с другом в формамиде.
<Структурная формула гиалуроновой кислоты>
В дополнение к этому, полисахарид, пригодный для использования в настоящем изобретении - хондроитин сульфат - состоит из N-ацетилгалактозамина, известного в качестве главного компонента хрящей, уроновой кислоты (глюкуроновой кислоты или идуроновой кислоты) и серной кислоты, и также содержится в различных соединительных тканях, таких как кожа, пуповине, массе избыточных грануляций на ране и т.п.
Хондроитин сульфат классифицируют на типы A, B, C, D, E и т.п., в зависимости от вида уроновой кислоты и положения сульфатной группы.
<Структурная формула хондроитина сульфата>
Полимер по настоящему изобретению может быть куплен на рынке или выделен и очищен из природного материала с помощью способов, известных в данной области техники. Предпочтительно примеси, присутствующие в полимерном материале, удаляют, и полимер для увеличения чистоты тщательно очищают.
В дополнение к этому, ацетилирование может осуществляться с помощью растворения полисахарида, то есть полимера, в органическом растворителе, а затем добавления пиридина и уксусного ангидрида к получившемуся раствору. Ацетилирование может осуществляться с помощью растворения хондроитин сульфата в формамидном растворителе, а затем добавления к нему пиридина и уксусного ангидрида, с последующим перемешиванием в течение 10~14 часов при температуре более высокой, чем комнатная температура.
<Ацетилирование хондроитин сульфата>
Вторая стадия: растворение ацетилированного биологически совместимого полисахарида в органическом растворителе
На стадии, на которой ацетилированный полисахарид растворяют в органическом растворителе, предпочтительно используют соответствующее количество органического растворителя, с тем чтобы полисахарид мог в достаточной степени раствориться в органическом растворителе. Если используемое на этой стадии количество органического растворителя является слишком большим, следующий далее процесс его удаления с помощью диализа может доставлять некоторые проблемы, в зависимости от вида растворителя, такого как DMSO или формамид. При этом если используемое количество органического растворителя является слишком малым, полимеры могут застыть.
Примеры органических растворителей, пригодных для использования в настоящем изобретении, представляют собой, но не ограничиваются только этим, DMSO, формамид и DMF, и DMSO или формамид.
Третья стадия: связывание фотосенсибилизатора с ацетилированным биологически совместимым полимером
После того как ацетилированный биологически совместимый полисахарид (то есть полимер) растворяют в органическом растворителе в ходе второй стадии, к нему добавляют соединение на основе фталоцианина и катализатор, связывая таким образом соединение на основе фталоцианина с биологически совместимым полисахаридом.
В ходе связывания соединения на основе фталоцианина и биологически совместимого полисахарида образуется сложноэфирная или амидная связь, и в соответствии с этим связь соединения на основе фталоцианина и биологически совместимого полисахарида может расщепляться под действием фермента, когда конъюгат накапливается в раковой клетке. Сложноэфирная связь может быть сформирована посредством связывания группы -CH2OH биологически совместимого полимера и группы -COOH, вводимой в соединение на основе фталоцианина.
В качестве соединения на основе фталоцианина в настоящем изобретении можно использовать соединение, которое флуоресцирует в присутствии света из ближней инфракрасной области, является гидрофобным и содержит группу -COOH, как карбоксилированное соединение. Конкретный тип его не ограничивается, при условии что это соединение активно в ближней инфракрасной области и представляет собой соединение на основе фталоцианина, имеющего химически активную группу -COOH.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения соединение на основе фталоцианина может представлять собой фталоцианин, его производное, нафталоцианин или его производное, содержащие ион металла в центре структуры. В настоящем изобретении центральный ион металла может представлять собой Zn, Cu, Al, Ga, Co, Fe, Ni, P или Cr.
Более конкретно, соединение на основе фталоцианина по настоящему изобретению может представлять собой соединение химической формулы 1, представленное ниже.
[Химическая формула 1]
Здесь, R1, R2, R3 и R4 каждый могут независимо представлять собой атом водорода, атом галогена, C1-C10 алкил, -COOH, -SO3H или бензольное кольцо, незамещенное или замещенное -COOH или -SO3H, и M может представлять собой Zn, Cu, Al, Ga, Co, Fe, Ni, P или Cr.
В одном из примеров настоящего изобретения можно использовать соединение на основе фталоцианина, представленное химической формулой 1-1 ниже.
[Химическая формула 1-1]
Соединение на основе фталоцианина химической формулы 1-1, используемое в одном из примеров настоящего изобретения, представляет собой материал, пригодный для использования в качестве превосходного фотодинамического терапевтического агента, при этом он имеет более высокий молярный коэффициент поглощения на длинах волн ближней инфракрасной области 600~800 нм, чем существующий фотосенсибилизатор, и, таким образом, имеет большую глубину проникновения внутрь целевого рака, и, что крайне выгодно, благодаря высокому молярному коэффициенту поглощения воздействие достигается даже при введении малого количества этого соединения.
Катализатор в реакции связывания представляет собой материал, который служит для активации группы -COOH соединения на основе фталоцианина и используется посредством растворения в органическом растворителе, таком как DMSO, формамид или что-либо подобное, вместе с соединением на основе фталоцианина. Примеры катализаторов представляют собой 4-гидроксиметилбензойную кислоту (DMAP) или 1,3-дициклогексилкарбодиимид (DCC).
В дополнение к этому, поскольку реакция связывания соединения на основе фталоцианина с биологически совместимым полисахаридом с помощью сложноэфирной связи осуществляется посредством взаимодействия полисахарида, имеющего относительно большую молекулярную массу, с катализатором и соединением на основе фталоцианина, которые имеют относительно малую молекулярную массу, реакцию можно осуществлять, прибавляя смесь соединения на основе фталоцианина в органическом растворителе и катализатора в биологически совместимый полисахарид капля за каплей, так чтобы сложноэфирная связь между полимером и фотосенсибилизатором успевала в достаточной степени образоваться. В дополнение к этому, для хороших результатов синтеза реакцию можно осуществлять при тщательном перемешивании реагентов в окружающей среде без влажности и света в течение примерно 45~50 часов.
Как указано выше, конъюгат для фотодинамической диагностики или терапии по настоящему изобретению, в котором соединение на основе фталоцианина связано с биологически совместимым полисахаридом, может быть получен с помощью указанной выше схемы реакции.
После этого органический растворитель, используемый в процедуре связывания, может предпочтительно быть удален. Органический растворитель можно удалять посредством фильтрования или диализа, обычно используемого в данной области техники. Предпочтительно органический растворитель может быть удален посредством использования диализной мембраны.
Когда органический растворитель удаляют через диализную мембрану, необходимо следить, чтобы температура окружающей среды не была слишком высокой и чтобы температура во время процедуры диализа поддерживалась на комнатном уровне, поскольку диализная мембрана не выдерживает нагрева. Более конкретно, поскольку диализная мембрана может легко повреждаться под действием тепла, генерируемого когда DMSO или формамид и вода встречаются друг с другом, небольшое количество воды наливают в контейнер после реакции, чтобы тем самым охладить контейнер, перед тем как прореагировавшую жидкость помещают в диализную мембрану. После этого, прореагировавшую жидкость помещают в диализную мембрану, которую затем помещают на водяную баню, и здесь предпочтительно менять дистиллированную воду до тех пор, пока органический растворитель не будет полностью удален.
В дополнение к этому, реакционный раствор, подвергаемый процедуре диализа, может быть высушен замораживанием. Конъюгат, в котором соединение на основе фталоцианина связано с биологически совместимым полисахаридом, может быть легко выделен с помощью процедуры сушки замораживанием. Можно использовать любой способ сушки замораживанием, который известен в данной области техники, и предпочтительно сушку замораживанием можно осуществлять с использованием жидкого азота. Реакционный раствор полностью замораживают в жидком азоте в течение примерно 5-15 минут, а затем влага полностью выпаривается с использованием вакуумной сушки, чтобы тем самым собрать желаемый конъюгат.
После этого конъюгат, полученный с помощью сушки замораживанием, опять растворяют в органическом растворителе, таком как DMSO, формамид или что-либо подобное, а затем растворитель удаляют с помощью диализа и сушки замораживанием для удаления непрореагировавшего материала. Эти стадии выделения конъюгата повторяют, так что чистота собранного конъюгата повышается.
В одном из примеров настоящего изобретения конъюгат биологически совместимого полимера и фотосенсибилизатора для фотодинамической диагностики получают посредством ацетилирования хондроитин сульфата в качестве биологически совместимого полисахарида с помощью добавления к нему пиридина и уксусного ангидрида, а затем связывания соединения на основе фталоцианина в качестве фотосенсибилизатора с ацетилированным полисахаридом. Методика проиллюстрирована на следующей далее схеме.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения конъюгата ацетилированного полисахарида и соединения на основе фталоцианина для фотодинамической диагностики или терапии, а более конкретно этот способ может включать: ацетилирование биологически совместимого полисахарида; растворение биологически совместимого полисахарида в органическом растворителе и добавление соединения на основе фталоцианина, растворенного в органическом растворителе, и катализатора к биологически совместимому полисахариду для связывания полисахарида с соединением на основе фталоцианина.
Конъюгат для фотодинамической диагностики или терапии по настоящему изобретению, который получают с помощью указанного выше способа, может находиться в форме наночастиц, то есть нано-геля или нано-микросфер, которые являются стабильными в водной системе, и могут иметь средний размер 100~250 нм.
В соответствии с одним из примеров настоящего изобретения в ходе синтеза
конъюгаты получают с использованием различных концентраций гидрофобного соединения на основе фталоцианина, а размеры и формы соответствующих конъюгатов затем измеряют с использованием устройства для динамического рассеяния света и электронного микроскопа. Результаты показывают, что чем большее количество соединения на основе фталоцианина используют, тем больше увеличивается гидрофобность и, таким образом, повышается прочность когезии, что приводит к уменьшению размеров конъюгата (нано-микросфер).
В то же время, фотосенсибилизатор для фотодинамической диагностики или терапии, используемый в данной области техники, имеет низкое отношение накопления и таргетное распределение по отношению к раковым клеткам и не характеризуется подавлением флуоресценции. Таким образом, он является цитотоксичным для обычных клеток, то есть нормальных клеток in vivo, при облучении их светом, что приводит к уменьшению эффективности терапии и вызывает ряд побочных эффектов.
Напротив, конъюгат для фотодинамической диагностики или терапии по настоящему изобретению не является цитотоксичным во время циркуляции в крови или при попадании в нормальные клетки, даже когда их облучают излучением из ближней инфракрасной области, поскольку конъюгат селективно нацеливается на раковые ткани или раковые клетки и накапливается и разлагается только в раковых тканях или раковых клетках и, таким образом, генерирует синглетный кислород или свободные радикалы, когда его облучают светом из ближней инфракрасной области для цитотоксичного действия, что приводит к индуцированию апоптоза в раковых тканях. Таким образом, эффективность фотодинамической терапии может быть доведена до максимума.
Кроме того, конъюгат для фотодинамической диагностики или терапии по настоящему изобретению может дополнительно содержать материал, нацеливающийся на раковые клетки, чтобы селективно нацеливать конъюгат на раковые ткани или раковые клетки. При фотодинамической терапии, когда делают внутривенную инъекцию одного лишь гидрофобного фотосенсибилизатора, он связывается с белком в крови и перемещается в клетку через рецептор, расположенный на поверхности клетки. Этот вариант не является предпочтительным, поскольку специфичность фотосенсибилизатора при выборе клеток определяется только свойствами гидрофобности фотосенсибилизатора, а время его пребывания в клетке или ткани сильно зависит от обстоятельств. В дополнение ко всему этому, это обстоятельство может рассматриваться как фактор, понижающий эффективность фотодинамической терапии и увеличивающий вероятность рецидива после терапии.
Для решения этих проблем, по сути, с помощью метода проб и ошибок проверяют, воздействует ли тот или иной из различных видов фотосенсибилизаторов селективно на конкретные области или нет. Однако когда материал, нацеливаемый на раковые клетки, дополнительно связан с фотосенсибилизатром для эффективного и тканеспецифичного транспорта фотосенсибилизатора, селективность по отношению к раковым клеткам можно улучшить дополнительно. Материал для нацеливания на раковые клетки может эффективно нацеливаться и проникать в раковые клетки, отличающиеся от нормальных клеток, поскольку на поверхности раковой клетки представлено большое количество специфичных рецепторов.
Материал для нацеливания на раковые клетки по настоящему изобретению может связываться со специфичными рецепторами раковой клетки, и примеры материалов для нацеливания на раковые клетки могут представлять собой фолиевую кислоту или моноклональные антитела против CD133, CD44, CD34 или белка Вс1-2.
В дополнение к этому, конъюгат для фотодинамической диагностики или терапии по настоящему изобретению имеет потенциал образования синглетного кислорода или свободных радикалов, которые могут обеспечивать цитотоксичность во время облучения конъюгата лазером. В соответствии с одним из примеров настоящего изобретения показано, что конъюгат, полученный в настоящем изобретении, то есть нано-микросферы, имеют сходный уровень потенциала образования синглетного кислорода, если сравнивать с соединением на основе фталоцианина, используемым в качестве группы положительного контроля.
В соответствии с другим примером настоящего изобретения осуществляют эксперимент для подтверждения того, является ли конъюгат для фотодинамической диагностики или терапии по настоящему изобретению, который не накапливается в раковых клетках, цитотоксичным для клетки или нет. Было показано, что конъюгат, находящийся, как предполагают, в форме нано-микросфер для индуцирования подавления флуоресценции, в водной системе в условиях, сходных с условиями в организме, не был химически активен, даже когда его облучали светом с длиной волны, соответствующей ближней инфракрасной области. В то же время, было показано, что когда конъюгат накапливался в раковых клетках, конъюгат оказывался цитотоксичным и, таким образом, приводил к повышенному апоптозу раковых клеток.
По этой причине авторы настоящего изобретения из приведенных выше результатов сделали вывод, что когда конъюгат по настоящему изобретению не накапливается в раковых клетках, он не будет иметь химической активности, даже при облучении его светом и, таким образом, не будет цитотоксичным и, таким образом, будет стабильным in vivo. И только когда конъюгат накапливается в раковых клетках, он является цитотоксичным и, таким образом, оказывает терапевтическое воздействие.
В дополнение к этому, когда конъюгат по настоящему изобретению селективно нацеливается на раковые клетки и проникает в них, сложноэфирная связь расщепляется (разлагается) под действием ферментов раковой клетки, то есть такого фермента, как эстераза, который представляет собой фермент in vivo, так что подавление флуоресценции прекращается, в результате чего имеет место флуоресценция.
По этой причине, в соответствии с настоящим изобретением, когда конъюгат по настоящему изобретению селективно накапливается в раковой ткани или раковых клетках, подавление флуоресценции под действием фермента в раковой клетке может прекращаться, и фотосенсибилизатор на основе фталоцианина может флуоресцировать под действием облучения лазером только лишь в раковой клетке, так что можно осуществлять диагностику рака по присутствию или отсутствию такой флуоресценции.
Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции для терапии рака, содержащей конъюгат в качестве эффективного компонента.
Термин 'терапия' в настоящем документе, если не утверждается иного, означает обращение хода, ослабление, подавление развития или предотвращение заболевания, расстройства, или одного или нескольких симптомов заболевания или расстройства, к которому применяется этот термин.
Композиция для терапии рака в соответствии с настоящим изобретением может содержать фармацевтически эффективное количество конъюгата для фотодинамической диагностики или терапии по настоящему изобретению самого по себе, или может дополнительно содержать по меньшей мере одну фармацевтически приемлемую добавку, такую как носитель, связующее вещество, разбавитель или что-либо подобное. Термин фармацевтически эффективное количество означает количество, достаточное для предотвращения, облегчения и лечения симптомов рака.
Фармацевтически эффективное количество конъюгата для фотодинамической диагностики или терапии по настоящему изобретению составляет 0,5~100 мг/день/кг массы тела, а предпочтительно - 0,5~5 мг/день/кг массы тела. Однако фармацевтически эффективное количество может соответствующим образом изменяться в зависимости от тяжести симптомов, возраста, массы, состояния здоровья и пола пациента, способа введения, продолжительности лечения, и тому подобного.
В настоящем изобретении термин фармацевтически приемлемая добавка означает, что такая добавка является физиологически приемлемой и не вызывает желудочно-кишечных расстройств, аллергических реакций, таких как головокружение, или сходных реакций при введении человеку. Примеры носителя, связующего вещества и разбавителя могут представлять собой лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, смолу акации, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. В дополнение к этому они могут дополнительно содержать наполнитель, антикоагулянт, смазывающее вещество, смачивающий агент, отдушку, эмульгатор и консервант.
В дополнение к этому композиции по настоящему изобретению можно получать с использованием способов, известных в данной области техники, так что активный компонент получают в форме с быстрым высвобождением, распределенным по времени высвобождением, или замедленным высвобождением после введения композиции млекопитающему. Дозированная форма может представлять собой порошок, гранулу, таблетку, эмульсию, сироп, аэрозоль, мягкую или твердую желатиновую капсулу, стерильный раствор для инъекций или стерильный порошок.
Композиция для терапии рака в соответствии с настоящим изобретением может вводиться с помощью нескольких способов, включая пероральный, трансдермальный, подкожный, внутривенный и внутримышечный способы, а дозировка активного компонента может выбираться соответствующим образом в зависимости от ряда факторов, таких как способ введения, возраст, пол, масса и тяжесть симптомов у пациента.
В дополнение к этому в случае, когда конъюгат по настоящему изобретению или композиция, содержащая этот конъюгат, используются для осуществления терапии или диагностики заболеваний, источник света, пригодный для использования в настоящем изобретении, может представлять собой (но не ограничивается только этим) по меньшей мере один источник, выбранный из группы, состоящей из источников света для облучения светом in vitro, включая излучатель с ультразвуковым облучением, светодиод, лазерный диод, лазер на красителях, галогеновую лампу, лампу-вспышку, источник флуоресцентного света с механическим фильтром, лампу накаливания с механическим фильтром, источник света с нитью накаливания, и тому подобные; и источников света для облучения светом in vivo, включая лазерное волокно для фотодинамической терапии и тому подобные. В настоящем изобретении фотосенсибилизатор может быть активен в отношении излучения в ближней инфракрасной области в диапазоне от 600 нм до 700 нм.
В дополнение к этому, поскольку конъюгат по настоящему изобретению содержит гидрофильный полисахарид и гидрофобное соединение на основе фталоцианина, конъюгат, как предполагается, находится в форме нано-микросфер. Нано-микросфера может дополнительно содержать медицинский или биологический агент, имеющий терапевтическую активность, а предпочтительно - содержать противораковый агент. В настоящем изобретении медицинский или биологический агент может находиться внутри нано-микросферы.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылками на конкретные примеры. Эти примеры предназначены только для пояснения настоящего изобретения, и специалисту в данной области будет очевидно, что рамки настоящего изобретения не ограничиваются данными примерами.
<Пример 1> Получение нано-микросфер для фотодинамической диагностики или терапии
<1-1> Получение соединения на основе фталоцианина
<1-1-1> Синтез предшественника R1
4-метокси-3,6-трет-бутилфенол, 3,66 г (15,6 ммоль), и 4-нитрофталонитрил, 2,70 г (15,6 ммоль), добавляют к 100 мл DMSO и продувают N2, а затем температуру повышают до температуры кипения с обратным холодильником. 2,86 г K2CO3 вводят в эту смесь в течение 4 часов с начала нагрева с обратным холодильником и затем нагрев продолжают в течение 24 часов.
После нагрева с обратным холодильником в течение 24 часов к смеси добавляют 100 мл воды с последующим перемешиванием, а затем добавляют K2CO3 и DMSO удаляют с осаждением в результате белого немного вязкого материала. К смеси добавляют такое количество простого эфира, чтобы его было достаточно для экстракции продукта, который затем сушат с использованием испарителя. При этом получают Продукт 1-1-1 бледно-желтого цвета.
<1-1-2> Синтез COOH-предшественника R2
Пентил-4-гидроксибензоат, 2,405 г (12,37 ммоль), и 4-нитрофталонитрил, 2 г (11,56 ммоль), добавляют к 82,5 мл безводного DMSO и продувают N2. Затем температуру повышают до температуры кипения с обратным холодильником. К смеси каждый час от начала нагрева с обратным холодильником и до 4 часов добавляют 1,054 г K2CO3. Затем нагрев продолжают в течение 29 часов, а после этого методом ТСХ (тонкослойной хроматографии) убеждаются, что 4-нитрофталонитрил в смеси отсутствует.
После нагрева с обратным холодильником в течение 29 часов с помощью испарителя осуществляют сушку с получением темно-коричневого продукта. К продукту добавляют такие количества ЕА (этилацетата) и воды, которых достаточно для растворения всего продукта с последующей его экстракцией. Отделенный водный слой несколько раз экстрагируют с помощью ЕА, и полученный таким образом раствор сушат с использованием испарителя, пока раствор не достигнет объема всего лишь примерно 150 мл. Затем его промывают 200 мл насыщенного водного раствора NaHCO3. После тщательного перемешивания в разделительной воронке получают EA-слой с помощью прохождения через MgSO4, а затем его опять сушат с помощью испарителя с получением темно-коричневого продукта в жидкой фазе, а также примерно 1 г Продукта 1-1-2 в жидкой фазе, очищенной с использованием колонки.
<1-1-3> Синтез производного фталоцианина
Полученный Продукт 1-1-2, бензоатный предшественник, 0,334 г, и Продукт 1-1-1, алкиловый предшественник, 0,837 г, добавляют к 50 мл безводного пентанола, а затем к полученной смеси добавляют ZnCl2, 0,409 г. Затем в смесь вводят в достаточном количестве газообразный Ar. Температуру реакционной жидкости повышают до 150°C с последующим добавлением по каплям 2,25 мл DBU, а затем осуществляют нагрев с обратным холодильником в течение 24 часов. Через 24 часа осуществляют выпаривание с получением темного сине-зеленого продукта. Полученный продукт очищают посредством колоночной хроматографии с помощью MC и MeOH с получением сине-зеленого твердого материала 1-1-3.
Полученный таким образом материал 1-1-3 растворяют в 40 мл THF, а затем смешивают с раствором, в котором LiOH·H2O (1 г, 23,34 ммоль) растворен в метаноле и H2O, 7:3. Температуру повышают до 75°C с последующим нагревом с обратным холодильником в течение 17 часов. После нагрева с обратным холодильником в течение 17 часов раствор выпаривают. Остаток растворяют примерно в 100 мл MC и титруют до pH 2, добавляя по каплям водный раствор 0,1M HCl. Затем смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. После этого осуществляют экстрагирование (прохождение через MgSO4) достаточным количеством воды с последующей колоночной хроматографией с использованием CHCl3 и MeOH. Молекулярную массу готового продукта проверяют с помощью Maldi-TOF. Результаты показаны на Фиг.3.
С помощью указанного выше примера получают соединение, имеющее химическую формулу 1-1, на основе фталоцианина (показано ниже).
[Химическая формула 1-1]
<1-2> Ацетилирование хондроитин сульфата
Хондроитин сульфат (0,5 г) растворяют в 10 мл формамидного растворителя. После этого к раствору добавляют 55 мл пиридина и 55 мл безводного ацетата, а затем реакции дают возможность протекать при тщательном перемешивании в течение примерно 12 часов при 55°C, с учетом того, что эта температура является несколько высоковатой. Полученный таким образом в результате реакции образец выделяют с помощью диализа через диализную мембрану, а затем сушат вымораживанием.
<1-3> Связывание ацетилированного хондроитин сульфата и фотосенсибилизатора
50 мг ацетилированного хондроитин сульфата, который выделяют с помощью сушки вымораживанием в <1-2>, растворяют в 10 мл обезвоженного органического растворителя, DMSO или формамида, соответственно. Тем временем, 1 мг, 2 мг и 5 мг соединения на основе фталоцианина, используемого в качестве фотосенсибилизатора и полученного в <1-1>, в достаточной степени растворяют в 3 мл DMSO или формамида, вместе с DMAP и DCC, соответственно, для активации группы -COOH. 3 мл каждого из растворов фотосенсибилизатора, имеющего активированные группы -COOH, помещают в 10 мл органического растворителя, в котором растворяют ацетилированный хондроитин сульфат, а затем дают возможность реакции сложноэфирного связывания протекать в достаточной степени в течение примерно 48 часов при тщательном перемешивании. Раствор после завершения реакции выделяют с помощью такой же процедуры, как в Примере <1-2>, а затем выдерживают в морозилке, чтобы получить конъюгат для фотодинамической диагностики или терапии по настоящему изобретению, то есть нано-микросферы. Соответствующие образцы называют Ac-Cs-Zn-Pc-COOH1, Ac-Cs-Zn-Pc-COOH2, Ac-Cs-Zn-Pc-COOH3, соответственно.
Фиг.4 представляет собой схему, показывающую структурную формулу конъюгата, Ac-Cs-Zn-Pc-COOH, в котором хондроитин сульфат и соединение на основе фталоцианина химической формулы 1-1 связаны друг с другом с помощью сложноэфирной связи. Результаты анализа FT-IR Ac-Cs-Zn-Pc-COOH, как показано на Фиг.6, а также данные для Ac-Cs-Zn-Pc-COOH демонстрируют пик при 1730 см-1, соответствующий сложноэфирной связи, что представляет собой характеристику связывания между биологически совместимым полимером и соединением на основе фталоцианина.
<Пример 2> Анализ характеристик нано-микросфер
<2-1> Измерение размеров и формы нано-микросфер
Три образца биологически совместимого материала, полученного в Примере 1, в котором соединение на основе фталоцианина связано с ацетилированным хондроитин сульфатом, растворяют с концентрацией 1 мг/мл, а затем их размеры измеряют с использованием динамического рассеяния света (DLS), а их форму подтверждают с использованием автоэмиссионного сканирующего электронного микроскопа (FE-SEM). Далее для точного измерения размеров образцы разбавляли 0,1М NaCl. Результаты показаны на фиг.7-11. Было показано, что размеры и формы нано-микросфер, сформированных посредством связывания соединения на основе фталоцианина с хондроитин сульфатом в качестве биологически совместимого полисахарида с помощью сложноэфирной связи, распределены в пределах 100~800 нм и сходятся к максимуму примерно при 230 нм, как показано на фиг.9-11. В дополнение к этому, в 3A, большие частицы представляют собой случай, соответствующий малому количеству фотосенсибилизатора (Ac-Cs-Zn-PC-COOH1), а малые частицы представляют собой случай, соответствующий большому количеству фотосенсибилизатора (Ac-Cs-Zn-PC-СООН2). Соответственно, видно, что чем большее количество фотосенсибилизатора связывается с полисахаридом, тем сильнее повышается гидрофобность конъюгата и, таким образом, увеличивается прочность когезии, приводя к уменьшению размеров нано-микросфер.
<2-2> Подтверждение присутствия или отсутствия эффекта подавления флуоресценции
Несколько образцов полученного в Примере 1 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH растворяют с различными концентрациями в DMSO и деионизованной воде, соответственно. Затем флуоресцентные явления в них регистрируют с использованием фотолабораторной станции KODAK и флуоресцентного спектрофотометра (фиг.12). Во время измерения в диапазоне длин волн 650~750 нм интенсивности флуоресценции и получаемые изображения, как было показано, различаются в зависимости от концентрации DMSO, то есть органического растворителя (А), но само подавление флуоресценции имело место для случая деионизованной воды и, таким образом, демонстрируется значительно более низкая флуоресценция по сравнению с DMSO. Считается, что причина этого явления заключается в том, что Ac-Cs-Zn-COOH не образует микросфер в органическом растворителе и, таким образом, не индуцирует подавления флуоресценции, но при этом образует нано-микросферы в деионизованной воде и, таким образом, индуцирует подавление флуоресценции в этой среде. Авторы настоящего изобретения из этих результатов сделали вывод, что при фотодинамической терапии нано-микросферы, которые не накапливаются в раковых клетках, не являются цитотоксичными и, таким образом, могут стабильно использоваться in vivo.
<2-3> Оценка потенциала образования синглетного кислорода для нано-микросфер
Для проверки пригодности конъюгата из Примера 1 (Ac-Cs-Zn-Pc-COOH) для использования в качестве агента для фотодинамической диагностики или терапии измеряют его потенциал образования синглетного кислорода в зависимости от облучениг лазером, проводя сравнение с немодифицированным фотосенсибилизатором на основе фталоцианина, полученным в Примере 1-1. Сначала конъюгат Ac-Cs-Zn-Pc-COOH и немодифицированный фотосенсибилизатор на основе фталоцианина растворяют в 2 мл DMF и PBS, органических растворителях, (фотосенсибилизатор на основе фталоцианина: 1,5 мкг/мл), соответственно, а затем добавляют к нему малое количество 9,10-диметилантрацена, который способен детектировать синглетный кислород, с доведением концентрации до 20 мкг/мл. Облучение лазером осуществляют во временном интервале 40 секунд, используя при этом лазер с длиной волны 670 нм, на которой фотосенсибилизатор на основе фталоцианина, как известно, генерирует синглетный кислород. Затем осуществляют измерение флуоресценции при возбуждении 360 нм и эмиссии 380~550 нм с использованием спектрофлуорофотометра. Указанные выше экспериментальные результаты подтверждают, что конъюгат по настоящему изобретению Ac-Cs-Zn-Pc-COOH способен генерировать синглетный кислород почти на таком же уровне, как немодифицированный Zn-Pc-COOH, как показано на фиг.13. Таким образом, видно, что нано-микросферы по настоящему изобретению способны уничтожать раковые клетки посредством генерирования синглетного кислорода в целевых (раковых) клетках.
<2-4> Эксперимент по регистрации прекращения подавления флуоресценции под действием фермента раковых клеток
Клетки HeLa распределяются в количестве 1×104, а затем инкубируются на 96-луночном планшете. Клетки обрабатывают с помощью 10 мкг нано-микросфер по настоящему изобретению, а затем в них наблюдают флуоресцентные явления с использованием устройства фотолабораторной станции KODAK. При этом культурная среда без клеток HeLa, обработанных нано-микросферами по настоящему изобретению, используется в качестве контрольной группы. В результате наблюдают, что подавление флуоресценции не прекращается для лунок, содержащих обычную культурную среду без клеток HeLa, но подавление флуоресценции исчезает с появлением через некоторое время флуоресценции для лунок, содержащих культурную среду, в которой распределены клетки HeLa, как показано на фиг.14. Таким образом, авторы настоящего изобретения из приведенных выше результатов сделали вывод, что когда нано-микросферы, полученные в соответствии с настоящим изобретением, нацеливаются на раковые клетки и накапливаются в них, подавление флуоресценции под действием фермента раковых клеток прекращается, и затем, когда их облучают излучением из ближней инфракрасной области, фотосенсибилизатор нано-микросфер уничтожает раковую клетку, вследствие чего нано-микросферы по настоящему изобретению могут лечить рак.
<2-5> Эксперимент по оценке цитотоксичности
Исследование цитотоксичности осуществляют для полученных в Примере 1 нано-микросфер по настоящему изобретению. Клетки HeLa в качестве раковых клеток инкубируют в культурной сред RPMI 1640, содержащей 10% FBS и 1% пенициллина, в присутствии 5% CO2 при температуре 37°C. Затем для исследования цитотоксичности инкубируемые клетки HeLa распределяют по 96-луночному планшету с количеством клеток 1×104, а затем их инкубируют в течение 24 часов. На следующий день нано-микросферы (нано-микросферы с добавлением 1,25 мг фотосенсибилизатора) по настоящему изобретению разбавляют до соответствующих концентраций, а затем разбавленные концентрации помещают в каждую лунку в количестве 100 мкл.
После этого клетки дополнительно инкубируют в течение 12 часов, чтобы нано-микросферы имели возможность подействовать на клетки. Затем клетки облучают светом с длиной волны, соответствующей ближней инфракрасной области (670 нм), при интенсивности 1,2 Дж/см2. Здесь в качестве группы контроля используют группу клеток, имеющую такую же концентрацию и время обработки, но не подвергаемую облучению светом по сравнению с соответствующими образцами. После этого клетки инкубируют в инкубаторе в течение одного дня.
Наконец, 20 мкл реагента МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромида) добавляют к клеткам после завершения инкубирования, с последующим инкубированием в течение 3~4 часов. Через 4 часа культурную среду, реагент МТТ и тому подобное, удаляют, а затем к лункам добавляют 150 мл DMSO для растворения нерастворимого формазана, имеющего сине-фиолетовый цвет и образующегося на клетках. После этого анализатор ELIZA используют для измерения коэффициента поглощения на 595 нм и, таким образом, осуществляют сравнение количества образующегося формазана, чтобы подтвердить тем самым выживаемость клеток (%) и цитотоксичность конъюгата (фиг.15 и 16).
В результате можно увидеть, что, как показано на фиг.15 и 16, когда немодифицированный Zn-Pc-COOH и нано-микросферы, полученные в настоящем изобретении, добавляют к соответствующим клеткам, которые затем инкубируют, апоптоза не происходит, если их не облучают излучением из ближней инфракрасной области, и апоптоз происходит пропорционально времени облучения в случае, когда их облучают излучением из ближней инфракрасной области. Таким образом, выживаемость клеток (%) уменьшается. Соответственно, опять было подтверждено, что, как показывают приведенные выше результаты, фотосенсибилизатор генерирует синглетный кислород только тогда, когда его облучают светом, и, таким образом, он уничтожает клетки, а когда к клеткам добавляют нано-микросферы, подавление флуоресценции, осуществляемое с помощью полимера, прекращается под действием фермента, с генерированием синглетного кислорода и уничтожением, таким образом, клеток.
Выше настоящее изобретение описывалось на примере предпочтительных вариантов осуществления.
Специалистам в данной области будет понятно, что могут быть осуществлены различные модификации, изменения и замены настоящего изобретения, не отклоняющиеся от основных признаков настоящего изобретения. Соответственно, варианты осуществления, описанные в настоящем изобретении, и прилагаемые чертежи используются не для ограничения, но лишь для описания духа настоящего изобретения. Рамки настоящего изобретения не ограничиваются только лишь конкретными вариантами осуществления и прилагаемыми чертежами. Границы защиты настоящего изобретения должны анализироваться с использованием прилагаемой формулы изобретения, и следует учитывать, что формула изобретения включает также и все эквиваленты по духу настоящего изобретения.
Промышленное применение
Конъюгат по настоящему изобретению может легко накапливаться в раковых клетках in vivo, и те материалы по настоящему изобретению, которые не накапливаются в них, не будут демонстрировать цитотоксичности из-за подавления флуоресценции, даже если их облучают светом с длиной волны, соответствующей ближней инфракрасной области. Кроме того, когда конъюгат по настоящему изобретению накапливается в раковых клетках, связь между биологически совместимым полисахаридом и фотосенсибилизатором разрывается под действием ферментов раковых клетках, и тогда, если их облучают светом с длиной волны, соответствующей ближней инфракрасной области, конъюгат оказывается цитотоксичным и, таким образом, во время облучения излучением в ближней инфракрасной области доводится до максимума противораковое воздействие, а также имеет место флуоресценция и, как следствие, конъюгат может быть использован для получения соответствующих изображений.
1. Конъюгат для фотодинамической диагностики или терапии рака, в котором ацетилированный биологически совместимый полисахарид связан с соединением на основе фталоцианина формулы 1-1:
[Химическая формула 1-1]
где биологически совместимый полисахарид представляет собой хондроитин сульфат и
где указанный конъюгат представляет собой наночастицы, имеющие средний размер 100-250 нм, и получен посредством сложноэфирной связи между биологически совместимым полисахаридом и соединением на основе фталоцианина.
2. Конъюгат для фотодинамической диагностики или терапии рака по п.1, в котором соединение на основе фталоцианина флуоресцирует под действием света из ближней инфракрасной области.
3. Конъюгат для фотодинамической диагностики или терапии рака по п.1, в котором к биологически совместимому полисахариду дополнительно присоединен материал, нацеленный на раковые клетки.
4. Конъюгат для фотодинамической диагностики или терапии рака по п.3, в котором материал, нацеленный на раковые клетки, представляет собой фолиевую кислоту или моноклональное антитело против CD133, CD44, CD34 или белка Bcl-2.
5. Способ получения конъюгата для фотодинамической диагностики или терапии рака по п.1, включающий стадии:
ацетилирования биологически совместимого полисахарида, растворения ацетилированного биологически совместимого полисахарида в органическом растворителе и добавления соединения на основе фталоцианина формулы 1-1 и катализатора к биологически совместимому полисахариду для связывания фотосенсибилизатора с биологически совместимым полисахаридом:
[Химическая формула 1-1]
где биологически совместимый полисахарид представляет собой хондроитин сульфат и
где указанный конъюгат представляет собой наночастицы, имеющие средний размер 100-250 нм, и получен посредством сложноэфирной связи между биологически совместимым полисахаридом и соединением на основе фталоцианина.
6. Способ получения конъюгата для фотодинамической диагностики или терапии рака по п.5, в котором катализатор представляет собой 4-гидроксиметилбензойную кислоту (DMAP) или 1,3-дициклогексилкарбодиимид (DCC).
7. Композиция, предназначенная для диагностики или терапии рака, содержащая конъюгат по любому из пп.1-4.
