Штамм бактерий paenibacillus sp. для получения биопрепарата против заболеваний пшеницы, вызываемых фитопатогенными грибами
Владельцы патента RU 2539738:
Закрытое акционерное общество научно-производственное предприятие "Биомедхим" (ЗАО НПП "Биомедхим") (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Уфимского научного центра РАН (ФГБУН ИБ УНЦ РАН) (RU)
Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии. Штамм бактерий Paenibacillus sp. ИБ-1 обладает антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибов. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ В-2823D и может быть использован для получения биопрепарата для защиты растений от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами. Изобретение позволяет сократить сороки культивирования и повысить выход биомассы микроорганизма. 4 табл., 4 пр.
Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается штамма, который оказывает антагонистическое действие на возбудителей заболеваний пшеницы корневыми гнилями и повышает урожайность пшеницы. Новый штамм может быть реализован в микробиологической промышленности для получения биопрепарата для защиты от болезней и повышения урожайности злаковых культур.
Известен штамм Pseudomonas sp. ЦМПМ В-348, используемый для получения препарата при защите злаковых от возбудителя обыкновенной корневой гнили Helminthosporium sativum [1]. Однако этот штамм неэффективен для подавления корневой гнили злаков, вызываемой комплексом грибов Fusarium spp. и Helminthosporium sativum.
Известны штаммы Pseudomonas putida, подавляющие рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum [2], и Pseudomonas putida ВКМ В-1743 Д, подавляющий рост грибов рода Fusarium [3]. Недостатком известных штаммов является узкий спектр антагонистического действия.
Известен штамм Azotobacter chroococcum N В-3173, предназначенный для получения бактериального удобрения [4], повышающий урожайность злаковых культур. Недостатком является отсутствие антагонизма по отношению к фитопатогенным грибам.
Известен штамм Azotobacter chroococcum 92 [5], обладающий способностью подавлять рост некоторых фитопатогенных грибов. Недостатком штамма является узкий спектр антагонистического действия и сравнительно невысокая продуктивность.
Наиболее близким к заявляемому является штамм Azotobacter vinelandii ИБ 1 [6], обладающий способностью подавлять рост фитопатогенных грибов и повышающий урожайность пшеницы. Недостатком штамма является сравнительно высокая продолжительность культивирования и сравнительно невысокая антагонистическая активность.
Технической задачей изобретения является выделение нового природного штамма с широким спектром антагонистического действия на возбудителей грибных заболеваний пшеницы, обладающего высокой продуктивностью при невысокой продолжительности культивирования, нитрогеназной активностью, возможностью перевода почвенных фосфатов в растворимые формы.
Поставленная задача достигается выявлением и использованием штамма Paenibacillus sp. ИБ-1, выделенного из образца пахотной почвы Республики Башкортостан. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ В - 2823D.
1. Культурально-морфологические признаки
1.1. На агаризованной питательной среде, имеющий состав, г/л: KH2PO4 - 0,3; CaHPO4 - 0,2; MgSO4 - 0,3; K2SO4 - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl3 - 0,01; CaCO3 - 5,0; сахароза - 20 г; агар - 1,5%; смесь микроэлементов - 1 мл; дистиллированная вода до 1000 мл, pH 6,8-7,2 культура образует круглые колонии диаметром 3-4 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, с гладкими краями, мягкой тягучей консистенции. На 24-м часу роста клетки - мелкие палочки 0,5×1,5 мкм, подвижные.
1.2. На питательной агаризованной среде Берка, имеющей состав, г/л: K2HPO4 - 0,8; KH2PO4 - 0,2; MgSO4 - 0,3; NaCl - 0,2; CaSO4 - 0,1; Fe2(MoO4) - 0,01; глюкоза - 10 г; дистиллированная вода до 1000 мл; агар-агар - 1,5%; pH 6,8-7,0, культура образует круглые колонии диаметром 2-3 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, бесцветные, с гладкими ровными краями, однородной структуры.
1.3. На жидкой питательной среде Федорова с мелассой, имеющей состав, г/л: K2HPO4 - 0,3; CaHPO4 - 0,2; MgSO4 - 0,3; K2SO4 - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl2 - 0,01; CaCO3 - 5,0; меласса - 40 г; смесь микроэлементов - 1 мл; pH 6,8-7,0, выращивание при температуре 28°C и режиме аэрации-перемешивания 180 об/мин в течение 36 часов. Круглые колонии диаметром 0,5 см, выпуклые с ровными краями, слизистой консистенции.
1.4. На питательной среде КГА колонии круглые диаметром 6 мм, выпуклые, белого полупрозрачного цвета, консистенция тягучая мягкая. Пигмента не образуют. На 24-м часу роста - мелкие подвижные палочки.
1.5. На питательной среде Эшби с маннитом в качестве источника углерода колонии слизистые прозрачные диаметром 3 мм, консистенция тянущаяся. На 24-36 часу роста клетки - длинные тонкие палочки 6 мкм, подвижные.
2. Физиолого-биохимические признаки
Штамм является аэробным микроорганизмом, оптимальная температура роста 28°C.
Отношение к источникам углерода: очень хорошо усваивает глюкозу, сахарозу; хорошо усваивает маннит, мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, лактозу, декстрин, галактозу, маннозу, глицерин, фруктозу, этанол; слабо усваивает арабинозу, мезоинозитол.
Отношение к источникам азота: растет на безазотистых средах, сохраняя высокую продуктивность не менее 8·1010 кл/мл. Не погибает при нагревании при 50°C в течение 15 мин.
Штамм не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля при нанесении на них уколом живых клеток штамма.
Штамм хранится на косяках со средой Федорова в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, а также в лиофильновысушенном состоянии.
Штамм идентифицирован по определителю Bergey Manual of Determinative Bacteriology.
Пример 1. Для сравнения продолжительности культивирования нового штамма Paenibacillus sp. ИБ-1 с известным штаммом Azotobacter vinelandii ИБ-1 проводили выращивание в колбах на качалке при 180-200 об/мин, при температуре 28°C на жидкой питательной среде следующего состава, %: сахароза 3,0; K2HPO4 0,03; CaHPO4 0,02; NaCl 0,05; CaCO3 0,5; K2SO4 0,02. до достижения количества жизнеспособных клеток 80 млрд/мл. Результаты приведены в табл.1.
Пример 2. Изучение антагонистической активности нового штамма Paenibacillus sp. ИБ-1
На чашки Петри с агаризованной средой КГА (картофель тертый 200 г; глюкоза 20 г; агар 20 г; вода водопроводная 1 л) высевают сплошным газоном суспензию спор грибного фитопатогена. Затем в эти же чашки уколом сажают бактерии штамма Paenibacillus sp. ИБ-1. Чашки инкубируют при 28°C в течение 3 суток. Учет проводят по зонам отсутствия или подавления роста гриба вокруг колонии штамма. Результаты приведены в табл.2 и свидетельствуют о широком спектре антагонистического действия нового штамма.
Пример 3. Антагонистическое действие нового штамма против комплекса возбудителей корневых гнилей пшеницы испытывают в лабораторных условиях на пшенице сорта "Жница" с естественным уровнем заражения посевного материала, полученного в условиях опытного поля Института биологии УНЦ РАН. Посевной материал дополнительно инфицируют спорами фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum и Bipolaris sorokiniana (титр споровой суспензии обоих патогенов составил 5-104 КОЕ/мл). Семена пшеницы обрабатывают суспензией штамма (с титром 109 КОЕ/мл) из расчета 1 мл суспензии на 1 кг семян. Семена переносят на увлажненную до полной влагоемкости полоску фильтровальной бумаги, поверх которой накладывают полоску полиэтилена, сворачивают в рулон, помещают вертикально в лабораторный стакан и оставляют при комнатной температуре. В контрольных опытах обработку семян осуществляют водопроводной водой. Эксперимент выполняют в четырехкратной повторности. Обработку результатов проводят через 7 дней. Эффективность штамма определяют при сопоставлении степени проявления корневых гнилей проростков пшеницы в опыте и контроле. Результаты приведены в табл.3.
Пример 4. Определение ростстимулирующей активности заявляемого штамма.
Некоторые микроорганизмы, обитающие в ризосфере растений, способны синтезировать цитокинины. Цитокинины представляют собой природные соединения, участвующие в гормональной регуляции онтогенеза растений, характеризующиеся способностью индуцировать деление растительных клеток и являющиеся наиболее активными среди открытых рострегулирующих веществ. Наличие цитокининов в культуральной жидкости обуславливает наличие ростстимулирующей активности микроорганизма. Образование заявляемым штаммом цитокининов с концентрацией 330 нг/мл культуральной жидкости обнаружено методом непрямого конкурентного иммуноферментного анализа [7].
Пример 5. Штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 обладает нитрогеназной активностью (определяли ацетиленовым методом), сопоставимой по величине с активностями азотфиксирующих микроорганизмов рода Azotobacter (табл.4), предлагаемых для использования под различные сельскохозяйственные культуры [8-11].
Пример 6. Штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 способен к переводу малорастворимых фосфатов в растворимые формы, используемые в метаболизме растений.
Дефосфорилирующую активность определяли на среде Муромцева, куда вносили фосфат кальция методом осаждения, предложенным Герретсеном, в модификации Муромцева [12]. Приготовленные питательные среды разливали по чашкам Петри, подсушивали в термостате и сажали уколом исследуемый штамм микроорганизмов. Чашки инкубировали в термостате при 28°C в течение семи суток. О растворении фосфатов судили по образованию вокруг колоний бактерий зон просветления питательной среды. В результате проведенных испытаний было установлено, что штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 способен к активному растворению трифосфата кальция, диаметр зоны просветления среды значительно превышает диаметр колонии бактерии
Таким образом, выделен новый штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 с широким спектром антагонистического действия на возбудителей грибных заболеваний пшеницы, обладающий высокой продуктивностью при невысокой продолжительности культивирования, нитрогеназной активностью, возможностью перевода почвенных фосфатов в растворимые формы.
| Таблица 1 | |
| Продолжительность ферментации штамма Paenibacillus sp. ИБ-1 для достижения числа жизнеспособных клеток (КОЕ) 80 млрд/мл | |
| Штамм | Время ферментации, ч |
| Paenibacillus sp. ИБ-1 | 36 |
| Azotobacter vinelandii ИБ 1 (по прототипу) | 60 |
| Таблица 2 | ||
| Антагонистическое действие штаммов Paenibacillus sp. ИБ-1 и штамма по прототипу на грибные фитопатогены | ||
| Вид фитопатогенных грибов | Диаметр зоны подавления роста гриба, мм | |
| Штаммы | ||
| Paenibacillus sp. ИБ-1 | прототип | |
| Fusarium culmorum | 29 | 22 |
| Fusarium gibbosum | 28 | 21 |
| Fusarium graminesrum | 20 | 12 |
| Fusarium nivale | 15 | 8 |
| Fusarium semitectum | 24 | 16 |
| Fusarium solani | 18 | 12 |
| Fusarium avenaceum | 28 | 19 |
| Fusarium moniliforme | 28 | 18 |
| Bipolaris sorokiniana | 40 | 28 |
| Penicillium funiculosum | 18 | 11 |
| Fusarium culmorum | 30 | 22 |
| Fusarium oxysporum | 21 | 13 |
| Alternaria alternata | 48 | 33 |
| Таблица 3 | ||||
| Эффективность нового штамма Paenibacillus sp. ИБ-1 против корневых гнилей пшеницы | ||||
| Варианты опытов | Развитие болезни проростков пшеницы, % | Проростки с дефектами, % | ||
| Alternaria + Penicillium | Bipolaris sorokiniana | Fusarium oxysporum | ||
| Контроль | 28,0 | 11,0 | 15,5 | 8,0 |
| Прототип | 15,5 | 6,1 | 9,5 | 3,5 |
| Paenibacillus sp. ИБ-1 | 12,0 | 4,5 | 7,2 | 3,1 |
| Таблица 4 | |
| Нитрогеназная активность предлагаемого штамма Paenibacillus sp. ИБ-1 и свободноживущих азотфиксаторов | |
| Культура | Нитрогеназная активность, мкг N2/мл/час |
| Paenibacillus sp ИБ-1 | 0,77 |
| Прототип | 0,65 |
| Azotobacter chroococcum В 35 [8] | 0,26 |
| Azotobacter chroococcum Ш 25 [9] | 0,45 |
| Azotobacter chroococcum Ц 40 [10] | 0,11 |
| Azotobacter chroococcum Б 1 [11] | 0,22 |
Литература
1. Авторское свидетельство СССР 1464468, кл. A01N 63/00, 1988.
2. Патент США 4714614, кл. 424-93, 1987.
3. Патент RU 1805849, кл. A01N 63/00, 1993.
4. Авторское свидетельство СССР 1359272, кл. C05F 11/08, 1985.
5. Авторское свидетельство СССР 9221105, кл. C05F 11/08, 1982.
6. Патент RU 2224791, кл. C12N 1/20, 2004.
7. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравайко Н.Н., Гюли-заде В.З., Чередова Е.П., Мустафина А.Р., Мошков И.Е., Кунаева О.Н. Иммуноферментная система для определения цитокининов // Физиология растений. - 1990. - Т.37, вып.1. - С.193-199.
8. Патент RU №2074159, кл. C05F 11/08, 1997.
9. Патент RU №2074158, кл. C05F 11/08, 1997.
10. Патент RU №2074157, кл. C05F 11/08, 1997.
11. Патент RU №2076088, кл. C05F 11/08, 1997.
12. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1991 - 304 с.
Штамм бактерий Paenibacillus sp., депонированный во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ В-2823D, обладающий антагонистической активностью в отношении заболеваний пшеницы, вызываемых фитопатогенными грибами.
