Способ получения вещества с противоопухолевой активностью при гепатоцеллюлярном раке печени
Владельцы патента RU 2540507:
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России) (RU)
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения вещества с противоопухолевой активностью при гепатоцеллюлярном раке печени, заключающийся в том, что слизистую оболочку тонкой кишки человека гомогенизируют с водой в соотношении 1:3-5 при +3-+5°С, гомогенат центрифугируют, супернатант прогревают в течение 7-10 мин при температуре от 20° до 38°С, доводят до 100°С и прогревают 15-20 мин при этой температуре, вновь центрифугируют, к охлажденному до +4-+6°С супернатанту добавляют охлажденный до (-15)-(-20)°С этанол до концентрации 65-70%, через 15-17 ч вновь центрифугируют, из супернатанта удаляют спирт, полученный целевой продукт замораживают и хранят при (-65)-(-70)°С до использования. Изобретение обеспечивает расширение ассортимента средств, обладающих противоопухолевой активностью. 1 табл., 1 пр.
Настоящее изобретение относится к способам получения биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине для подавления роста злокачественных опухолей.
Известен способ получения противоопухолевых агентов из слизистой оболочки тонкой кишки свиньи, включающий гомогенизацию, обработку этиловым спиртом, прогревание до 70°С, ультрафильтрацию и лиофилизацию [United States Patent 6,015,878, Jan. 18, 2000. Trifonov В.В., Roussev Je. К., Boshev N.A. Antitumor aqents isolated from intestinal mucosa, a method for their isolation and their application]. Указанные агенты обладают противоопухолевой активностью к лимфоме и миеломе мышей, карциноме глотки и эпителиоидной карциноме мочевого пузыря, эмбриональной рабдомиосаркоме.
Задачей изобретения является способ получения противоопухолевого вещества (ПВ), обладающего активностью в отношении гепатоцеллюлярного рака.
Поставленная задача решается способом получения ПВ, заключающимся в том, что слизистую оболочку тонкой кишки человека гомогенизируют с водой в соотношении 1:3-5 при +3-+5°С, гомогенат центрифугируют, супернатант прогревают в течение 7-10 мин при температуре от 20 до 38°С, доводят до 100°С и прогревают 15-20 мин при этой температуре, вновь центрифугируют, к охлажденному до +4-+6°С супернатанту добавляют охлажденный до (-15)-(-20)°С этанол до концентрации 65-70%, выдерживают 15-17 ч при (-15)-(-20)°С, вновь центрифугируют, из супернатанта удаляют спирт, полученный целевой продукт замораживают и хранят при (-65)-(-70)°С до использования.
Отличительными признаками предлагаемого способа являются использование в качестве исходного сырья слизистой оболочки тонкой кишки человека, центрифугирование гомогената в дистиллированной воде, прогревание супернатанта при температуре от 20 до 38°С, доведение температуры до 100°С и выдерживание в течение 15-20 мин при этой температуре, центрифугирование после прогревания, обработка этанолом до концентрации 65-70%, выдерживание с этанолом 15-17 ч при (-15)-(-20)°С, центрифугирование.
Испытания заявляемого ПВ на цитотоксическую (цитостатическую) и противоопухолевую активности были проведены на культурах опухолевых клеток (in vitro) и на крысах с перевиваемыми опухолями (in vivo).
Далее приведены примеры, иллюстрирующие способ получения ПВ и определение его биологической активности.
1. Пример получения ПВ.
Во время резекции тонкой кишки человека производят забор резецированного участка тонкой кишки длиной 5 см, в котором отсутствуют какие-либо образования. Тотчас после забора отделяют слизистую оболочку. Вес ее составляет 2,5 г. Слизистую оболочку измельчают, добавляют 7,5 мл дистиллированной воды, гомогенизируют при +3-+5°С, гомогенат центрифугируют для осаждения ядер (1000 об/мин, 10 мин). Полученный постъядерный нативный супернатант прогревают на водяной бане в течение 7-10 мин при температуре от 20 до 38°С, доводят до 100°С и выдерживают 15-20 мин при 100°С. Образовавшийся осадок термолабильного материала удаляют центрифугированием (5000 об/мин, 15 мин). К супернатанту, охлажденному до +4-+6°С, добавляют 16,1 мл 96% этанола, охлажденного до (-15)-(-20)°С и оставляют при этой температуре на 15-17 ч, центрифугируют в том же режиме, который указан выше. Спирт из супернатанта удаляют на роторном испарителе. Полученный экстракт (4 мл) имеет концентрацию белка 14,0-17,0 мг/мл по оптическому поглощению при D280. Экстракт (ПВ) замораживают и хранят при 65-70°С до использования.
2. Определение активности заявленного ПВ на культуре опухолевых клеток гепатомы-27, находящихся в стадии роста.
Для выполнения данной работы гепатома-27 была переведена в культуру из подкожной опухоли путем трипсинизации. Для этого забивали крысу с подкожной гепатомой, стерильно удаляли опухоль, выбирали участок, свободный от некрозов. Отделяли его, помещали в охлажденный раствор трипсина : версена (1:1) и 24 ч держали при +4°С. Через сутки сливали трипсин : версен, промывали несколько раз раствором Хенкса, заливали стандартной питательной средой с 10% фетальной сыворотки и 100 мкг/мл гентамицина и высевали на флаконы Карреля. Через 24 ч проводили смену среды для удаления не прикрепившихся клеток. Клетки культивировали на среде ДМЕМ+RPMI (1:1) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (Flow).
Клетки высевали на 96-луночные планшеты (Costar) в 100 мкл питательной среды (ДМЕМ+RPMI (1:1)). Количество клеток, вносимое в лунку, зависело от длительности эксперимента: 1 сутки - 4 тыс./лунка, 3 суток - 2 тыс./лунка, 6 суток - 1 тыс./лунка. Преинкубацию (культивирование клеток без препаратов) проводили в течение 24 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2. Оттаянный ПВ вносили в лунки в концентрациях 0,25; 0,5; 1,0 и 2,0 мг/мл культуральной среды. Инкубацию проводили при 37°С в течение 1, 3 и 6 суток.
МТТ [3-(4,5-димелтиазол-2)2,5 дифенилтетразолиум бромид] (Sigma), растворенный в воде, добавляли в количестве 20 мкл (исходный раствор 5 мг/мл) в каждую лунку на 3 часа при тех же условиях. Затем среду отбирали и для лизиса клеток использовали диметилсульфоксид (60 мкл/лунку). Для гомогенного распределения красителя лизат тщательно перемешивали на шейкере (300 об/мин) в течение 3 минут. Количественное определение формазана проводили на приборе Multiskan (фильтр 540). Жизнеспособность клеток оценивали по соотношению оптической плотности растворов в лунках с контрольными клетками и в лунках с клетками, обработанными ПВ.
Ингибирование пролиферации клеток в культуре гепатомы-27 вычисляли по формуле:
,
где
ИП - ингибирование пролиферации;
По - уровень пролиферации в опыте;
Пк - уровень пролиферации в контроле.
В таблице представлены данные о влиянии ПВ на рост культуры клеток гепатомы-27 при различных концентрациях белка ПВ в 1 мл культуральной среды.
Из таблицы следует, что на 1 сутки инкубации ПВ во всех представленных концентрациях не оказывал ингибирующего действия на пролиферацию опухолевых клеток. На 3 сутки инкубации ПВ во всех концентрациях оказывал цитостатическое влияние на опухолевые клетки. Наибольшим ингибирующим эффектом обладал ПВ в концентрации 2 мг на 1 мл среды. На 6 сутки инкубации по сравнению с 3 сутками цитостатический эффект всех ПВ возрастал, ингибирование пролиферации клеток было наиболее выражено у экстрактов с концентрацией белка, равной 1 и 2 мг/ мл культуральной среды.
Таким образом, заявляемый ПВ характеризуется высоким уровнем ингибирования пролиферации в культуре клеток гепатомы-27, достигающим 73% (на 3 сутки инкубации) и 92% (на 6 сутки).
3. Определение активности заявленного ПВ in vivo.
Исследование проведено на беспородных крысах-самцах массой 100-150 г с перевитой внутрипеченочной гепатомой-27. Для этого на 10 сутки после прививки опухоли печени производили повторную лапаротомию, измеряли размеры опухоли (2 наибольших размера), после чего рану передней брюшной стенки ушивали. Животных делили на 2 группы. В 1 группе осуществляли внутрибрюшинное введение ПВ из расчета 100 мг белка на кг массы в объеме 1 мл. Введение производили через день в течение 14 дней (всего 7 введений). Животные 2 группы являлись контролем, ПВ им не вводили. Через 6 дней после последней инъекции крысам 1 группы (через 20 дней после начала лечения и 30 дней после прививки опухоли) животных обеих групп забивали и вновь измеряли опухоль.
Показатель торможения роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле:
,
где
Р оп. контр - размеры опухоли в контроле,
Р оп. опыт - размеры опухоли в опыте.
Было выявлено следующее. Через 10 дней после прививки опухоли (на момент начала лечения крыс 1 группы) достоверных различий в размерах опухоли печени в 1 и 2 группах не было: площадь опухоли составляла соответственно 27,0±6,7 и 24,7±7,5 мм2, Р>0,05. Через 30 дней после прививки опухоли размеры ее у крыс 1 группы увеличились недостоверно, составили 55,3±18,8 мм2, Р>0,05, тогда как у животных 2 группы размеры опухоли достоверно увеличились до 167,7±46,4 мм2, Р<0,05. Различия между группами через 30 дней после прививки опухоли были достоверными, что позволяет рассчитать показатель ТРО. Он составил 67%.
Таким образом, использование заявленного ПВ позволяет эффективно подавить рост гепатомы 27, а именно прекратить пролиферацию раковых клеток (in vitro) и способствовать торможению роста опухоли у крыс (in vivo).
Предлагаемый способ позволяет расширить ассортимент веществ, обладающих противоопухолевой активностью.
Способ получения вещества с противоопухолевой активностью при гепатоцеллюлярном раке печени, заключающийся в том, что слизистую оболочку тонкой кишки человека гомогенизируют с водой в соотношении 1:3-5 при +3-+5°С, гомогенат центрифугируют, супернатант прогревают в течение 7-10 мин при температуре от 20 до 38°С, доводят до 100°С и прогревают 15-20 мин при этой температуре, вновь центрифугируют, к охлажденному до +4-+6°С супернатанту добавляют охлажденный до (-15)-(-20)°С этанол до концентрации 65-70%, через 15-17 ч вновь центрифугируют, из супернатанта удаляют спирт, полученный целевой продукт замораживают и хранят при (-65)-(-70)°С до использования.