Способ и композиция для лечения рака

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для лечения рака у пациента. Способ включает введение, по меньшей мере, одного инкапсулированного химиотерапевтического агента и, по меньшей мере, одного амфифильного блок-сополимера данному пациенту. Также предложена композиция, набор для лечения рака у пациента и применение амфифильного блок-сополимера. Группа изобретений обеспечивает усиление действия инкапсулированного химиотерапевтического препарата путем стимулирования выхода активного химиотерапевтического агента из липосом за счет использования в композиции амфифильного блок-сополимера, которым является поли(этиленоксид)-поли(пропиленоксид)-поли(этиленоксид) триблок-сополимер. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 11 ил., 3 табл., 4 пр.

 

Данное изобретение было сделано при поддержке государственного гранта No. 2R01 СА89225, выданного Национальным Институтом Здоровья. Государство имеет определенные права на данное изобретение.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение в целом относится к терапии рака. Более конкретно, данное изобретение описывает композиции и методы для улучшенной доставки терапевтических веществ для лечения рака.

Уровень техники

Доксил (DOXIL®) (липосомальный доксорубицин HCl для инъекций) значительно уменьшает побочные эффекты, вызываемые доксорубицином. Необходимость вводить Доксил только раз в 4 недели внутривенно также делает его удобным для пациентов. Однако Доксил характеризуется недостаточной эффективностью по сравнению с доксорубицином. Следовательно, необходимы способы (методы) увеличения терапевтической активности Доксила, при этом сохраняющие его безопасность.

Краткое изложение сущности изобретения

В соответствии с данным изобретением предложены способы ингибирования рака. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ включает введение пациенту, по меньшей мере, одного инкапсулированного химиотерапевтического препарата и, по меньшей мере, одного амфифильного блок-сополимера. Инкапсулированный химиотерапевтический препарат и амфифильный блок-сополимер могут вводиться одновременно и/или последовательно. В частном варианте выполнения инкапсулированный химиотерапевтический препарат может вводиться первым. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения инкапсулированным химиотерапевтическим препаратом является доксорубицин. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения амфифильный блок-сополимер содержит, по меньшей мере, один блок этиленоксида и, по меньшей мере, один блок пропиленоксида.

В другом варианте исполнения изобретения предложены композиции, включающие, по меньшей мере, один инкапсулированный химиотерапевтический препарат, по меньшей мере, один амфифильный блок-сополимер, и, по меньшей мере, один фармацевтический носитель. Кроме того, заявляются наборы (kits), содержащие: а) одну композицию, содержащую, по меньшей мере, один инкапсулированный химиотерапевтический препарат и, по меньшей мере, одну фармацевтическую композицию; и б) вторую композицию, содержащую, по меньшей мере, один амфифильный блок-сополимер и, по меньшей мере, одну фармацевтическую композицию.

Краткое описание чертежей

Фиг.1А и 1Б показывают клеточный захват лекарственного препарата Доксил клетками рака яичников и рака молочной железы соответственно. Среднее значение флуоресценции доксорубицина было определено методом проточной цитометрии. Клетки были обработаны: 1) Доксилом в течение 2 часов, 2) Доксилом совместно с 0,1% Р85 в течение 2 часов; 3) Доксилом в течение 24 часов; 4) сначала обработаны 0,1% Р85 на протяжении 2 часов, отмыты три раза фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и далее инкубированы с Доксилом на протяжении 24 часов; 5) сначала обработаны Доксилом на протяжении 24 часов, отмыты 3 раза ФСБ и далее обработаны 0,1% Р85 в течение 2 часов. Данные представлены как среднее ± COC (стандартная ошибка среднего) (n=6), *p<0,05, н.з. означает незначительное отклонение. Значения p (наименьшая величина уровня значимости) были получены с помощью критерия Стьюдента после логарифмической трансформации данных.

На фиг.2 представлены данные ядерного накопления Доксила в клетках рака яичников. Клетки были обработаны: 1) Доксилом; 2) Доксилом совместно с 0,1% Р85 в течение 2 часов; 3) сначала обработаны 0,1% Р85 на протяжении 2 часов, отмыты три раза ФСБ и далее инкубированы с Доксилом на протяжении 24 часов; 4) сначала обработаны Доксилом на протяжении 24 часов, отмыты 3 раза ФСБ и далее обработаны 0,1% Р85 в течение 2 часов. После обработки клетки были отмыты 3 раза ФСБ, лизированы с помощью M-PER буфера и флуоресценция доксорубицина была измерена с помощью Specramax М5 планшет-ридера и нормализована на содержание белка. Данные представлены как среднее ± COC (n=6), *p<0,05, н.з. означает незначительное отклонение. Значения p были получены с помощью критерия Стьюдента после логарифмической трансформации данных.

На фиг.3 представлены конфокальные микрофотографии локализации доксорубицина в клетках рака яичников и рака молочной железы в присутствии и в отсутствие плюроника Р85. Фиг.3А показывает захват Доксила клетками линий А2780 и A2780/DOX после 2-х или 24-часовой инкубации. плюроник Р85 был помечен флуоресцентной меткой Atto 647. На фиг.3Б показан временной ряд микрофотографий последовательной обработки клеток А2780 0,1% плюроником после 24-часовой инкубации с 200 мкг/мл Доксила. На фиг.3В представлен захват Доксила/DOX клетками А2780 и A2780/DOX при различных методах обработки с 0,1% Р85. Крайние микрофотографии представляют собой цифровую суперпозицию двух предшествующих изображений и показывают ко-локализацию (изображения представлены с 63-кратным увеличением).

На фиг.4 изображены спектры флуоресценции свободного доксорубицина и липосом Доксила в отсутствие (фиг.4А) и присутствии (фиг.4Б) 0,1% Р85.

На фиг.5 представлены кривые высвобождения доксорубицина из липосом Доксила, опосредованный Р85 при 37°C (•) pH 5,5; (○) pH 5.5 в присутствии 0,1% Р85; (▲) pH 7,4; (Δ) pH 7,4 в присутствии 0,1% Р85. Данные представлены как среднее ± COC (n=4).

Фиг.6 демонстрирует эффект плюроника Р85 на объем А2780 ксенографтных опухолей. Только Доксил (■); Доксил с последующим введением 0,02% плюроника Р85 через 1 час (○); Доксил с последующим введением 0,02% плюроника Р85 через 48 часов (▲); Доксил с последующим введением 0,02% плюроника Р85 через 96 часов (▼). Лечение включало однократное внутривенное введение 12 мг/кг Доксила через 2 недели после имплантации опухоли. Данные представлены как среднее ± COC (n=8), *p<0,05. Значения p были получены с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (two-way ANOVA) путем сравнения объемов опухолей в группе Доксил с другими группами.

На фиг.7 представлена окраска гематоксилином и эозином тканей сердца, почек, селезенки и почек животных из 4 групп: контроль, Доксил, Доксил + Р85 через 48 часов, Доксил + Р85 через 96 часов.

На фиг.8 показан эффект Р85 на распределение лекарства в ксенографтных опухолях А2780. Через неделю после имплантации опухоли мышам внутривенно вводили 12 мг/кг Доксила. Р85 (0,02%) вводился внутривенно либо через 48 ч, либо 96 ч после лекарства. Животных умертвили и выделили опухоли через 1 или 6 часов спустя. На фиг.8А представлены флуоресцентные микрофотографии (×10) распределения лекарства (красный) на срезах опухолей, окрашенных на CD31 (зеленый) и клеточные ядра (синий). На фиг.8Б представлен анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) концентрации доксорубицина в гомогенатах тканей опухолей, представленных на (А). Данные представлены как среднее ± СОД (n=5), *p<0.05, н.з - незначительно (критерий Стьюдента для одной выборки). На фиг.8В представлены конфокальные микрофотографии (×10) распределения лекарства на срезах опухолей.

На фиг.9 представлен анализ концентрации лекарства в крови BALB/c мышей методом ВЭЖХ. Мышам сделали одноразовую внутривенную инъекцию 12 мг/кг Доксила. Р85 (0,02%, 100 мкл/мышь) ввели внутривенно через 48 часов после лекарства, образцы крови собирались каждые 12 часов после инъекции и анализировались методом ВЭЖХ. Данные представлены как среднее ± СОД (n=5), *p<0.05, (критерий Стьюдента для одной выборки).

На фиг.10 показан эффект плюроник сополимеров на высвобождение доксорубицина из липосом Доксила. На фиг.10А и 10Б - Доксил диспергировали либо в ацетатном буфере (pH 5,5, фиг.10А), либо в ФСБ (pH 7,4, фиг.10Б) в присутствии или в отсутствие Р85. Концентрация Доксила в дисперсии составляла 0,2 мг/мл. Концентрации плюроника в дисперсии были 0.0001%, 0.001%, 0.02%, 0.1%, 0.5%. Выход доксорубицина из диализного мешка (пунктирная линия) показан для сравнения. На фиг.10В и 10Г Доксил диспергировали либо в ацетатном буфере (pH 5,5, фиг.10В), либо в ФСБ (pH 7,4, фиг.10Г) в присутствии или в отсутствие 0,02% плюроник сополимеров. Данные представлены как среднее ± СОД (n=6).

На фиг.11 показаны спектры испускания флуоресценции тетраметилродамин В изотиоцианата (ТРИТЦ)-Р85 в отсутствие (кривая 1) или присутствии (кривая 2) пустых липосом. Конечная концентрация Р85 в ФСБ (pH 7,4) была 0,1%. Липосомы имели такой же липидный состав, как липосомы Доксила (3,19 мг/мл натриевой соли N-карбонилметоксиполиэтилен гликоль 2000-1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (ДМФЭ-ПЭГ 2000), 9,58 мг/мл полностью гидрированного фосфатидилхолина сои 3,19 мг/мл холестерола и приблизительно 2 мг/мл сульфата аммония, Encapsula NanoSciences Corp.Nashville, TN). Конечная концентрация липидов в дисперсии была 0,232 мг/мл. Спектры испускания флуоресценции измерялись на FLuorolog (Horiba Jobin Yvon Inc., NJ) при λ_возб=550 нм с шириной спектральной полосы 2 нм. I₀ и I₁ соответствуют максимумам интенсивности флуоресценции ТРИТЦ-Р85 в присутствии и в отсутствие липосом соответственно.

Детальное описание изобретения

Липосомальные лекарственные препараты играли важную роль в разработке нано лекарств первого поколения. Такие препараты, как Доксил, липосомальный доксорубицин для лечения таких раков, как рак яичников (Song et al., (2012) J. Liposome Res., 22:77-92; Schwendener, R.A. (2007) Adv. Exp. Med. Biol., 620:17-128; Maurer et al., (2001) Expert Opin. Biol. Ther., 1:923-947; Torchilin, V.P. (2005) Nat. Rev. Drug Discov., 4:145-160), уже достигли клинической стадии и показали эффективность при лечении пациентов. После системного введения липосомы Доксила проходят через неплотные сосуды опухоли и задерживаются там, что приводит к усиленному накоплению липосомального лекарства в опухоли по сравнению с низкомолекулярным доксорубицином. Этот общий феномен часто называют эффектом «Увеличенной проницаемости и задержания» (Maedaetal., (2001) JcontrolRelease, 74:47-61). Однако дальнейшая проницаемость липосомального лекарства от сосудов в отдаленные участки опухоли ограничена ((Kostarelos et al., (2004) Int. J. Cancer, 112:713-721; Chauhan et al., (2011) Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng., 2:281-298)), в частности, в случае фиброзных опухолей (Torchilin, V.P. (2005) Nat. Rev. Drug Discov., 4:145-160; Yuan et al., (1994) Cancer Res., 54:3352-3356). Они образуют упруговязкий гелеподобный внеклеточный матрикс, богатый фибронектином и коллагеном, что связно с плохой выживаемостью (Kalluri et al., (2006) Nat. Rev. Cancer, 6:392-401; Bhowmick et al., (2004) Nature, 432:332-337). Поэтому для улучшения распределения и эффективности липосомальных препаратов существуют способы повышения проницаемости матрикса, например, использующие ингибиторы синтеза коллагена, коллагеназы и гиалуронидазы (Diop-Frimpongetal., (2011) Proc. Natl. Acad. Sci., 108:2909-2914; Eikenes et al., (2010) Anticancer Res., 30:359-368; Sugahara et al., (2010) Science 328:1031-1035; Jain et al., (2010) Nat. Rev. Clin. Oncol., 7:653-664). Однако эти методы приводят к увеличению токсичности лекарства в нормальных тканях и/или повышают риск прогрессии опухоли и метастаз (Diop-Frimpongetal., (2011) Proc. Natl. Acad. Sci., 108:2909-2914). В других исследованиях изучалось влияние физических полей, например ультразвукового воздействия, температурного (гипертермия) или радиационного воздействия высокой энергии на проницаемость микрососудов и/или микросреды опухолей (Schroederetal., (2009) J. Control Release, 137:63-68; Kong et al., (2000) Cancer Res., 60:6950-6957; Hagtvet et al., (2011) Radiat. Oncol., 6:135; Harrington et al., (2000) Clin. CancerRes., 6:4939-4949; Khaibullinaetal., (2008) J. Nucl.Med., 49:295-302). Но эти методы сложны технически и ограничены в применении на удаленных и диффузных опухолях. Более того, несколько исследований указывают на то, что клеточный захват неповрежденных липосом в опухоли ограничен и что лекарство, заключенное во внутреннем пространстве липосом, остается неактивным до тех пор, пока не высвободится в свободной форме (Barenholzetal., (2012) J. Control Release, 160:117-34; Zamboni, W.C. (2008) Oncologist, 13:248-260; Zamboni, W.C. (2005) Clin. CancerRes., 11:8230-8234). Таким образом, было бы идеально высвободить низкомолекулярное лекарство из липосом в правильное время и правильном месте, когда липосомальный препарат накопится в сосудах опухоли. Это позволит низкомолекулярному лекарству диффундировать от сосудов в удаленные области опухоли и стимулировать цитотоксичный эффект в раковых клетках. Поэтому остро стоит необходимость развития способов, позволяющих усилить доставку лекарства в опухоль с последующим эффективным высвобождением лекарства непосредственно в опухоли с минимальными побочными эффектами (Kwonetal., (2012) J. Control Release, 164:108-114; Bae et al., (2011) J. Control Release, 153:198-205; Florence, A.T. (2012) J. Control Release, 161:399-402).

В заявляемом решении представлена новая простая и эффективная стратегия усиления выхода лекарства из липосомальных носителей в опухоль. Эта стратегия включает использование амфифильных блок-сополимеров (например, поли(этиленоксид)-b-поли(пропиленоксид)-b-поли(этиленоксид), ПЭО-ППО-ПЭО) для усиления доставки лекарств. Эта стратегия может быть использована с уже утвержденными липосомальными лекарствами, такими как Доксил.

Как отмечалось выше, Доксил это ПЭГелированная липосомальная лекарственная форма низкомолекулярного лекарства доксорубицина. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения Доксил содержит 2 мг/мл доксорубицина, 3,19 мг/мл натриевой соли N-карбонилметоксиполиэтилен гликоль 2000-1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (ДМФЭ-ПЭГ 2000), 9,58 мг/мл полностью гидрированного фосфатидилхолина сои и 3,19 мг/мл холестерола. Доксил активно используется в клинике для лечения различных типов рака. Однако эффективность Доксила ограничена.

В изобретении показано, что введение амфифильных блок-сополимеров, содержащих блоки полиоксиэтилена и полиоксипропилена, вместе с липосомальным доксорубицином вызывает значительное увеличение цитотоксичности доксорубицина по сравнению с тем, когда амфифильный блок-сополимер отсутствует. Представленные данные показывают, что обработка клеток рака молочной железы линий MCF7, MCF7/MX и MCF7/ADR амфифильным блок-сополимером и липосомальным доксорубицином вызывает цитотоксичность. В то же время 2-часовая обработка только липосомальным доксорубицином не вызвала цитотоксичность в данном диапазоне концентраций. Опуская теоретические подробности, увеличение токсичности можно объяснить значительно большим захватом липосомального доксорубицина раковыми клетками в присутствии или после предварительной обработки амфифильным блок-сополимером.

Здесь также показано, что обработка клеточных культур амфифильным блок-сополимером стимулирует высвобождение доксорубицина из липосом, например, в случае предварительной обработки амфифильным блок-сополимером, или когда амфифильный блок-сополимер добавляли вместе или после липосомального доксорубицина.

Эффект амфифильного блок-сополимера на клеточный захват липосомального доксорубицина в клетках рака молочной железы также был изучен. Обработка клеток рака молочной железы одним липосомальным доксорубицином привела к захвату и локализации лекарства во внутриклеточных везикулах. Когда клетки обрабатывали липосомальным доксорубицином в присутствии 0,1% амфифильного блок-сополимера, ядерная локализация лекарства наблюдалась уже через 15 минут, а через 60 минут большая часть лекарства была локализована в ядре.

Настоящее изобретение включает методы повышения эффективности инкапсулированного агента (например терапевтического препарата или диагностического препарата) с помощью совместного введения (например, до, вместе и/или после), по меньшей мере, одного амфифильного блок-сополимера. Настоящее изобретение также включает способы улучшения доставки инкапсулированного агента (например, терапевтического препарата или диагностического препарата) в ядро клеток путем совместного введения (например, до, вместе и/или после), по меньшей мере, одного амфифильного блок-сополимера. Терапевтический препарат может быть инкапсулирован в мицеллы или липосомы, в частности, липосомы. В конкретном варианте осуществления данного изобретения терапевтический препарат проявляет активность в ядре (т.е., терапевтический препарат должен быть доставлен в ядро, чтобы проявить терапевтический эффект). В конкретном варианте осуществления данного изобретения терапевтический препарат является химиотерапевтическим препаратом. В частности, химиотерапевтический препарат является ДНК-повреждающим препаратом (см. ниже), в частности ДНК интеркалятором, таким как антрациклин. В конкретном варианте осуществления данного изобретения химиотерапевтическим препаратом является доксорубицин.

Инкапсулированным веществом может быть любой биологически активный препарат, как терапевтический, так и диагностический. Данным веществом также может быть экспериментальный препарат, тестируемый как потенциальный терапевтический препарат. Инкапсулированные вещества включают (без ограничения) полипептиды, пептиды, гликопротеины, нуклеиновые кислоты, синтетические и натуральные лекарства, пептоиды, полиены, макроциклы, гликозиды, терпены, терпеноиды, алифатические и ароматические вещества, низкомолекулярные вещества и их производные и соли. В конкретном варианте осуществления данного изобретения инкапсулированное вещество является низкомолекулярным веществом.

Липосомальные лекарственные формы разрабатывались для многих противораковых препаратов на протяжении последних лет и в данный момент находятся на разных стадиях клинических исследований. Примеры включают, но не ограничиваются: липосомальный доксорубицин (DOXIL, Caelyx, Myocet), липосомальный даунорубицин (ДауноКсом), ПЭГилированный липосомальный цисплатин (SPI-077, Липоплатин, LiPlaCis), липосомальный инкапсулированный паклитаксел (LEP-ETU, PNU-93914), липосомальный винкристин (OncoTCS), липосомальный митоксантрон (MEM) и другие. Липосомальные лекарственные формы противораковых лекарств часто имеют улучшенные профили токсичности и лучшую противоопухолевую активность, однако необходимо проведение дальнейших исследований и разработок для получения более эффективных составов и препаратов. Комбинированная терапия с использованием липосомальных лекарственных форм в комбинации с другими противораковыми препаратами показали многообещающие результаты в различных клинических испытаниях (Hofheinz, etal., (2005) Anti-CancerDrugs, 16(7):691-707). В настоящем изобретении показано, что амфифильные блок-сополимеры, в частности, триблок-сополимеры, такие как полоксамеры или плюроники, состоящие из полиоксиэтилена-полиоксипропилена-полиоксиэтилена, могут быть использованы в различных режимах комбинированной терапии для усиления высвобождения лекарства в опухоли: 1) предварительное введение плюроник блок-сополимеров с последующим введением липосомальной лекарственной формы противоракового препарата, 2) одновременное введение плюроник блок-сополимеров и липосомальной лекарственной формы противоракового препарата, и 3) лечение липосомальной лекарственной формой противоракового препарата с последовательным введением плюроника. Предпочтительным является режим, когда пациенту сначала вводят липосомальную лекарственную форму противоракового препарата с последовательным введением сополимера. Тип рака для лечения таким методом может быть выбран исходя из того, для лечения какого типа рака первично применяется липосомальная лекарственная форма противоракового препарата.

В связи с тем, что вещество любого типа может быть доставлено в клетку, или может быть использовано в композициях и способах по настоящему изобретению, последующее описание изобретения для простоты представлено на примере терапевтического препарата, в частности, доксорубицина.

В конкретном варианте осуществления данного изобретения амфифильный блок-сополимер является сополимером, содержащим, по меньшей мере, один блок поли(оксиэтилена) и, по меньшей мере, один блок поли(оксипропилена). Примером амфифильных блок-сополимеров являются блок-сополимеры со следующими формулами:

,

где x, y, z, i и j имеют значения от примерно 2 до примерно 800, предпочтительно от примерно 5 до примерно 200, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 80, и где для каждого R¹ и R², как показано в формулах IV и V, один является водородом, а второй является метильной группой. Любой специалист со средним уровнем знаний в данной области определит, что значения x, y и z обычно представляют среднее статистическое и что значения x и z часто, но не обязательно, одинаковые. Формулы с (I) по (III) являются упрощенными в связи с тем, что ориентация изопропилен радиклов в блоке Б является случайной. Эта случайная ориентация представлена в формулах (IV) и (V). Подобные соединения поли(оксиэтилен)-поли(оксипропилена) были описаны Santon (Am. Perfumer Cosmet. (1958) 72(4):54-58), Schmolka (Loc. Cit. (1967) 82(7):25-30), Schick, ed. (Non-ionic Surfactants, Dekker, N.Y. 1967 pp 300-371). Ряд подобных соединений коммерчески доступны под такими непатентованными названиями, как «липолоксамеры» («lipoloxamers»), «Плюроники» (Pluronics®), «полоксамеры»(«poloxamers») и «синпероники» («synperonics»). Полимеры типа плюроников в рамках формулы В-А-В часто называют как ″обращенные″ плюроники, ″плюроник R″ или ″мероксапол″. В общем, блок-сополимеры можно описать с точки зрения наличия гидрофильного «А» и гидрофобного «В» блоков. Так, например, сополимер, имеющий А-В-А формулу, является триблок-сополимером, состоящим из гидрофильного блока, соединенного с гидрофобными блоком, соединенного с другим гидрофильным блоком. «Полиоксаминовый» полимер формулы (IV) доступен от компании БАСФ (BASF, Wyandotte, MI) под торговой маркой Тетроник® (Tetronic®). Порядок следования полиоксиэтиленовых и полиоксипропиленовых блоков, указанный в формуле (IV), может быть изменен на обратный, что дает Тетроник RT® (Tetronic RT®), который также доступен от компании БАСФ (См. Schmolka, J. Am. Oil Soc., 59:110 (1979)).

Полиоксипропилен-полиоксиэтиленовые блок-сополимеры могут быть также получены с участием гидрофильных блоков, включающих случайную смесь повторяющихся звеньев этиленоксида и пропиленоксида. Для поддержания гидрофильности блока количество этиленоксида делают доминирующим. Аналогично, гидрофобный блок может представлять собой смесь этиленоксидных и пропиленоксидных повторяющихся единиц. Такие блок-сополимеры доступны от компании БАСФ под торговой маркой Плюрадот™ (Pluradot™). Единицы блока Поли(оксиэтилен)-поли(оксипропилена), составляющие первый сегмент, не должны состоять исключительно из этиленоксида. Также не обязательно, чтобы все сегменты типа В состояли исключительно из единиц пропиленоксида. Альтернативно, в простейшем случае, например, по меньшей мере, один из мономеров сегмента А может быть заменен боковой цепью.

Создано множество плюроников, которые соответствуют следующей формуле:

Примеры полоксамеров включают без ограничения плюроник L31, L35, F38, L42, L43, L44, L61, L62, L63, L64, Р65, F68, L72, Р75, F77, L81, Р84, Р85, F87, F88, L92, F98, L101, Р103, Р104, Р105, F108, L121, L122, L123, F127, 10R5, 10R8, 12R3, !7R1, 17R2, 17R4, 17R8, 22R4, 25R1, 25R2, 25R4, 25R5, 25R8, 31R1, 31R2 и 31R4. Название плюроника включает буквенную приставку и двух- или трехзначное число. Буквенные приставки (L, Р или F) указывают на физическое состояние каждого полимера (от англ. Liquid (жидкое), paste (паста) или flakeable solid (хлопьевидное твердое)). Цифровой код определяет структурные параметры блок-сополимера. Последняя цифра данного кода означает приблизительное весовое содержание блока этиленоксида в десятках процентов по весу (например, 80% по весу, если стоит цифра 8, или 10% по весу, если стоит цифра 1). В оставшихся первых одной или двух цифрах зашифрован молекулярный вес центрального блока пропиленоксида. Чтобы расшифровать этот код, необходимо умножить соответствующее число на 300, чтобы получить приблизительный молекулярный вес в дальтонах (Да). Таким образом, номенклатура плюроников предоставляет удобный метод для оценки характеристик блок-сополимера в отсутствие соответствующей литературы. Например, код F127 определят блок-сополимер в твердом состоянии с блоком пропиленоксида 3600 Да (12×300), и в котором 70% веса приходится на этиленоксид. Точные молекулярные характеристики каждого блок-сополимера плюроника могут быть получены у производителя.

В конкретном варианте осуществления данного изобретения амфифильный блок-сополимер является ПЭО-ППО-ПЭО триблок-сополимером. В конкретном варианте осуществления данного изобретения ПЭО-ППО-ПЭО триблок-сополимер содержит от примерно 15 до примерно 35, в частности от примерно 20 до примерно 30 мономеров ЭО (этиленоксида) на каждом конце и от примерно 30 до примерно 50, в частности от примерно 35 до примерно 45 мономеров ПО (пропиленоксида) в центральном блоке. В одном варианте осуществления данного изобретения отношение единиц мономеров ПЭО/ППО/ПЭО составляет 26/40/26. В конкретном варианте осуществления данного изобретения амфифильным блок-сополимером является полоксамер 235.

Амфифильные блок-сополимеры могу содержать по меньшей 30% по весу, 40% по весу или, по меньшей мере, 50% по весу ППО. Молекулярный вес ППО блока амфифильного блок-сополимера может быть, по меньшей мере, от примерно 120 или 1700 до примерно 3000, 3600 или 4200. В конкретном варианте осуществления данного изобретения амфифильный блок-сополимер является ПЭО-ППО-ПЭО триблок-сополимером с содержанием ППО, по меньшей мере, 30% по весу и с молекулярным весом ППО блока от примерно 1200 до примерно 4200; содержанием ППО, по меньшей мере, 40% по весу и с молекулярным весом ППО блока от примерно 1700 до примерно 3600; или, более конкретно, содержанием ППО, по меньшей мере, 50% по весу и с молекулярным весом ППО блока от примерно 1700 до примерно 3000.

Из вышесказанного следует, что может быть использовано более одного блок-сополимера. Другими словами, может использоваться смесь или комбинация блок-сополимеров. Например, смесь может содержать, по меньшей мере, один первый амфифильный блок-сополимер и, по меньшей мере, один второй амфифильный блок-сополимер. В конкретном варианте осуществления данного изобретения (1) первым амфифильным блок-сополимером является ПЭО-ППО-ПЭО триблок-сополимер с содержанием ППО, по меньшей мере, 30% по весу, а вторым амфифильным блок-сополимером является ПЭО-ППО-ПЭО триблок-сополимер с содержанием ППО, по меньшей мере, 70% по весу или меньше; (2) первым амфифильным блок-сополимером является ПЭО-ППО-ПЭО триблок-сополимер с содержанием ППО, по меньшей мере, 40% по весу, а вторым амфифильным блок-сополимером является ПЭО-ППО-ПЭО триблок-сополимер с содержанием ППО, по меньшей мере, 60% по весу или меньше; (3) первым амфифильным блок-сополимером является ПЭО-ППО-ПЭО триблок-сополимер с содержанием ППО, по меньшей мере, 50% по весу, а вторым амфифильным блок-сополимером является ПЭО-ППО-ПЭО триблок-сополимер с содержанием ППО, по меньшей мере, 50% по весу или меньше;(4) первым амфифильным блок-сополимером является ПЭО-ППО-ПЭО триблок-сополимер с содержанием ППО, по меньшей мере, 60% по весу, а вторым амфифильным блок-сополимером является ПЭО-ППО-ПЭО триблок-сополимер с содержанием ППО, по меньшей мере, 40% по весу или меньше; или (5) первым амфифильным блок-сополимером является ПЭО-ППО-ПЭО триблок-сополимер с содержанием ППО, по меньшей мере, 70% по весу, а вторым амфифильным блок-сополимером является ПЭО-ППО-ПЭО триблок-сополимер с содержанием ППО, по меньшей мере, 30% по весу или меньше. В случае смесей ПЭО-ППО-ПЭО блок-сополимеры, независимо друг от друга, могут иметь ППО блок с молекулярной массой от примерно 900 до примерно 4200, от примерно 1700 до примерно 3600 или, более конкретно, от примерно 1700 до примерно 3000.

Введение лекарства

Данное изобретение включает композиции, содержащие, по меньшей мере, один амфифильный блок-сополимер, по меньшей мере, один инкапсулированный терапевтический препарат (например, липосомальный доксорубицин) и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель. Данное изобретение также включает одну композицию, содержащую, по меньше мере, один амфифильный блок-сополимер и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель, и вторую композицию, содержащую, по меньшей мере, один инкапсулированный терапевтический препарат, и, по меньшей мере, один терапевтический препарат. Композиции данного изобретения могут также содержать другие терапевтические препараты (например, другие химиотерапевтические препараты).

Настоящее изобретение также охватывает методы предотвращения, ингибирования и/или лечения заболеваний или нарушений (например, рака/неоплазм) у пациента. Методы включают введение пациенту, по меньшей мере, одного амфифильного блок-сополимера и, по меньшей мере, одного инкапсулированного терапевтического препарата (относящегося к заболеванию или нарушению). Фармацевтическая(ие) композиция(и) данного изобретения могут вводиться животным, в частности млекопитающим, более конкретно - людям, для лечения/ингибирования рака. Амфифильный блок-сополимер может вводиться одновременно и/или последовательно с инкапсулированным терапевтическим препаратом. К примеру, амфифильный блок-сополимер может вводиться пациенту до введения инкапсулированного терапевтического препарата, может вводиться одновременно с инкапсулированным терапевтическим препаратом и/или может вводиться после введения инкапсулированного терапевтического препарата.

В конкретном варианте осуществления данного изобретения амфифильный блок-сополимер вводится после инкапсулированного терапевтического препарата (липосомального доксорубицина). Амфифильный блок-сополимер может вводиться через достаточное количество времени, чтобы обеспечить накопление (наибольшего количества) инкапсулированного лекарственного препарата в интересующей области (например, опухоли). Момент времени максимального накопления (t_max [ч]) Доксила в модельных опухолях после одноразовой инъекции был определен ранее (PenateMedinaetal. (2011) J. Drug Deliv., 2011:160515; Laginha et al., (2005) Clin. Cancer Res., 11:6944-6949; Charrois et al., (2003) J. Pharmacol. Exp. Ther., 306:1058-1067; Vaage et al., (1997) Br. J. Cancer, 75:482-486). В конкретном варианте осуществления данного изобретения амфифильный блок-сополимер вводится в течение 96 часов, в течение 72 часов, в течение 48 часов, в течение 12 часов, в течение 6 часов, в течение 4 часов, в течение 2 часов, в течение 1 часа, в течение 0,5 часа или менее после введение инкапсулированного терапевтического препарата. Оптимальное время введения амфифильного блок-сополимера определяется временем максимального накопления липосом Доксила в тканях опухоли, зависящем от фармакокинетических характеристик Доксила. В конкретном варианте осуществления данного изобретения амфифильный блок-сополимер вводится через примерно от 1 часа до 96 часов после введения инкапсулированного терапевтического препарата. Исследования фармакокинетики и биологического распределения липосомального доксорубицина на пациентах показали, что 1/3 введенного пэгилированного липосомального доксорубицина распределяется в ткани в первые 4-5 часов после введения, зачем следует продолжительная фаза клиренса со средним временем полувыведения в 45-55 часов (Gabizon et al., (1994) Cancer Res, 54:987-992). Также было показано, что наибольшее накопление пэгилированного липосомального доксорубицина наблюдается спустя несколько дней после введения (от 3 до 5 дней) (Stewart et al., (1997) Oncology 11(Suppl 11:)33-37). В конкретном варианте осуществления данного изобретения пациентам амфифильный блок-сополимер может вводиться предпочтительно от 10 часов до 168 часов после введения инкапсулированного терапевтического препарата, более предпочтительно от 24 до 144 часов после введения инкапсулированного терапевтического препарата, более предпочтительно от 48 до 120 часов после введения инкапсулированного терапевтического препарата.

Амфифильный блок-сополимер может присутствовать в композиции в любой концентрации. В конкретном варианте осуществления данного изобретения амфифильный блок-сополимер присутствовал при концентрациях от примерно 0,001% до примерно 5%. В конкретном варианте осуществления данного изобретения амфифильный блок-сополимер использовался в концентрации от примерно 0,05% до примерно 2%.

В конкретном варианте осуществления данного изобретения терапевтическим препаратом является химиотерапевтический препарат. Термин «химиотерапевтический препарат» означает противораковый или иной препарат для гиперполиферативных заболеваний. Химиотерапевтическими препаратами являются вещества, обладающие противораковой активностью и/или наносящие вред клетке. Химиотерапевтические препараты включают без ограничения: (1) ДНК-повреждающие препараты (например, препараты, ингибирующие синтез ДНК): антрациклины (например, доксорубицин, даунорубицин, эпирубицин), алкилирующие препараты (например, азотистые иприты, бендамустин, альтретамин, эфиры метансульфаната, бусульфан, карбоплатин, нитрозомочевина, кармустин, цисплатин, хлорамбуцил, циклофосфамид, дакарбазин, гексаметилмеламин, изофамид, ифосфамид, ломустин, мехлорэтамин, алкилсульфонаты, эпирубицин, идарубицин, триазины, этиленимины, мелфалан, митотан, митомицин, пипоброман, прокарбазин, стрептозоцин, азиридины, тиотепа, урамустин и триэтиленмеламин), платиновые производные (например, цисплатин, карбоплатин, тетраплатин, ормаплатин, тиоплатин, сатраплатин, недаплатин, оксаплатин, гептаплатин, ипроплатин, трансплатин, лобаплатин и cis-диаминдихлороплатина), ингибиторы теломеразы и топоизомеразы (например, топотекан, иринотекан, этопозид, тенипозид, амсакрин, меногарил, амонафид, дактиномицин, даунорубицин, N,N-дибензил даунорубицин, эллиптицин, дауномицин, пиразолоакридин, идарубицин, митоксантрон, m-ANSA, доксорубицин, деоксирубицин, оксантразол, рубидазон, эпирубицин и блеомицин), препараты, связывающиеся с малой бороздкой ДНК (например, пликамицин); (2) препараты, взаимодействующие с тубулином (например, винкристин, винбластин, паклитаксел, таксаны, доцетаксел и BAY 59-8862); (3) антиметаболиты, такие как капецитабин, хлородеоксиаденозин (кладрибин), цитарабин, цитозин арабинозид, аспарагиназа, азацитидин, дакабазин, флоксуридин, флударабин, 5-флорурацил, доксифлуридин, гемцитабин, гидроксимочевина, 6-меркаптопурин, метотрексат, пентостатин, пеметрексед, триметрексат и 6-тиогуанин; (4) антиангиогенные препараты (например, Авастин, талидомид, сунитиниб, леналидомид) и препараты, повреждающие сосуды (например, флавоноиды/флавоны, вадимизан, производные комбретастатина такие, как CA4DP, ZD6126, AVE8062A); (5) антитела или фрагменты антител (например, трастузумаб, бевацизумаб, ритуксимаб, ибритумомаб, гемтузумаб, алемтузумаб, цетуксимаб, ранибизумаб); и (6) гормональные препараты/эндокринная терапия: ингибиторы ароматазы (например, 4-гидроандростендион, эксеместан, аминоглутетимид, анастрозол, летрозол), антиэстрогены (например, Тамоксифен, Торемифен, Раоксифен, Фаслодекс), антиандрогенные препараты (например, флутамид), антиадреналовые препараты (например, митотан и аминоглутетимид) и стероиды (например, адреналовые кортикостероиды, преднизон, дексаметазон, метилпреднизолон и преднизолон); и (7) антимитотические препараты такие, как навелбин, эпотилоны, таксаны (например, паклитаксел, таксотер, доцетаксел), алколоиды винка, эстрамустин, винбластин, винкристин, виндесин и винорелбин.

Раковые заболевания, которые можно лечить данным методом включают, но не ограничиваются следующими: рак простаты, ободочной и прямой кишки, поджелудочной железы, шейки матки, желудка, эндометрия, головного мозга, печени, мочевого пузыря, яичников, яичек, головы, шеи, кожи (включая меланому и базальную карциному), мезотелиома плевры, белых клеток крови (включая лимфому и лейкемию), пищевода, молочной железы, мышц, соединительной ткани, легких (включая мелкоклеточную карциному и немелкоклеточную карциному), надпочечников, щитовидной железы, почек или кости; глиобластома, мезотелиома, почечно-клеточная карцинома, карцинома желудка, саркома, хориокарцинома, базоклеточная карцинома кожи, плоскоклеточная карцинома кожи и карцинома яичников. В конкретном варианте осуществления данного изобретения раковым заболеванием, которое можно лечить данным способом, может быть рак яичников, рак легких, включая мелкоклеточную карциному и немелкоклеточную карциному, рак желудка, рак молочной железы, саркома Капоши, рак матки, рак крови, включая множественную миелому, лимфому, лимфому Ходжкина и неходжскинскую лимфому.

Композиции, описанные в изобретении, в основном будут вводиться пациентам как фармацевтический препарат. Термин «пациент» в настоящем описании распространяется на людей или животных. Композиции могут применяться терапевтически под наблюдением врача.

Композиции, описанные в настоящем изобретении, могут быть приготовлены стандартным образом для введения с любым фармацевтически приемлемым носителем(и). Например, препараты могут быть приготовлены в любой приемлемой среде, как вода, забуференный физиологический раствор, этанол, полиол (например, глицерол, пропилен гликоль, жидкий полиэтилен гликоль и т.п.), диметил сульфоксид (ДМСО), масла, детергенты, суспендирующее средство или в подходящей смеси сред. Концентрация препаратов в выбранной среде может варьироваться, и выбор среды может быть основан на желаемом методе введения фармацевтического препарата. Кроме случаев, когда любая обычно применяемая среда или препарат несовместим с вводимым препаратом, их использование в фармацевтическом препарате предполагается изобретением. Стоит отметить, что применяемый состав и дозы липосомального доксорубицина (ДОКСИЛ) хорошо известны в своей области (см. DOXIL® Product information (2010) Centocor Ortho Biotech Products).

В соответствии с изобретением доза и схема приема композиций, подходящие для введения конкретному пациенту, могут быть определены врачом, учитывая возраст, пол, конкретное состояние пациента и сложность заболевания, для лечения которого используются композиции. Врач может также принимать во внимание метод введения фармацевтического носителя и биологическую активность композиции.

Выбор подходящей фармацевтической смеси также будет зависеть от выбранного способа введения. К примеру, композиции данного изобретения могут вводиться путем прямой инъекции в желательный участок (например опухоль). В этом случае фармацевтический препарат будет содержать вещества, диспергированные в среде, совместимой с участком введения. Композиции настоящего изобретения могут вводиться любым методом. Например, композиции настоящего изобретения могут вводиться без ограничения, парентерально, подкожно, орально, наружно, легочно, ректально, вагинально, внутривенно, внутрибрюшинно, интратекально, внутрицеребрально, эпидурально, внутримышечно, внутрикожно или интракаротидно. В конкретном варианте осуществления данного изобретения композиции вводятся путем инъекции, такой как внутривенная или внутрибрюшинная. Фармацевтические смеси для инъекций известны в данной области. Если инъекция выбрана как метод введения композиции, необходимо принять меры, чтобы обеспечить доставку достаточного количества молекул к клеткам назначения, чтобы проявить биологический эффект.

Фармацевтические композиции, содержащие лекарственные средства настоящего изобретения в качества активного компонента в непосредственной смеси с фармацевтически приемлемым носителем, могут быть приготовлены в соответствии с общепринятыми фармацевтическими методами. Носитель может иметь множество разнообразных форм в зависимости от формы препарата, желаемой для введения, например, внутривенной или прямой инъекции.

В конкретном варианте осуществления данного изобретения инкапсулированный терапевтический препарат (например липосомальный доксорубицин) вводится путем инъекции, в частности внутривенной инъекции. В конкретном варианте осуществления данного изобретения амфифильный блок-сополимер вводится путем инъекции, например, внутривенно, подкожно или внутримышечно.

Фармацевтический препарат данного изобретения может быть приготовлен в форме дозированной единицы для облегчения введения и обеспечения единообразия лечения. Каждая дозированная единица должна содержать определенное количество активного компонента, рассчитанное, чтобы получить желаемый эффект, в связи с выбранным фармацевтическим носителем. Методы определения соответствующей дозированной единицы хорошо известны опытным в данной области людям.

Дозированные единицы могут быть пропорционально увеличены или уменьшены в зависимости от веса пациента. Подходящие концентрации для облегчения конкретного патологического состояния могут быть определены исходя из расчетов кривой концентраций, как принято в данной области.

В соответствии с данным изобретением подходящие дозированные единицы для введения композиций данного изобретения могут быть определены путем исследования токсичности молекул или клеток в животных моделях. Различные концентрации препаратов в фармацевтической смеси могут быть введены мышам, и минимальная и максимальная дозы могут быть определены исходя из положительных результатов и побочных эффектов, наблюдаемых в результате лечения. Подходящие дозированные единицы также могут быть рассчитаны путем исследования эффективности лечения препаратом в комбинации с другими стандартными лекарствами. Дозированные единицы композиций могут быть определены по отдельности или в комбинации для каждого лечения в соответствии с зафиксированным эффектом.

Фармацевтическая смесь, содержащая препараты настоящего изобретения, может вводиться через подходящий промежуток времени, к примеру, по меньшей мере, дважды в день или более, до тех пор, пока патологические симптомы не уменьшены или частично сняты, после чего дозировка может быть уменьшена до уровня поддержания. Соответствующий промежуток времени в конкретном случае будет обычно зависеть от состояния пациента.

Методы, предложенные в данном изобретении, могут быть использованы в комбинации с другими методами лечения рака. К примеру, другие химиотерапевтические препараты могут быть использованы (например, одновременно и/или последовательно). Методы лечения рака, такие как радиотерапия и/или хирургический (например, вырезание опухоли), также могут использоваться вместе с композициями, описанными в данном изобретении.

Определения

«Фармацевтически приемлемый» означает одобренный управляющим органом федерального или местного правительства или перечисленный в Фармакопии США или другой общепризнанной фармакопии для использования в отношении животных и людей.

«Носитель» относится к, например, растворителю, адъюванту, консерванту (например, тимерсол, бензил алкоголь), антиоксиданту (например, аскорбиновая кислота, метабисульфат натрия), солюбилизатору (например, Твин 80, Полисорбат 80), эмульгатору, буферу (например, Трис-HCl, ацетатный или фосфатный), противомикробному раствору, веществам, увеличивающим объем (например, лактоза, маннитол), наполнителям, вспомогательным веществам или средам, с которыми вводится активный агент настоящего изобретения. Подходящими фармацевтическими носителями могут быть стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая таковые нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения. Вода или водные солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерола предпочтительны в качестве носителей, в частности, для растворов и для инъекций. Подходящие фармацевтические носители описаны в книге Э.В. Мартина “Remington's Pharmaceutical Sciences” (Mack Publishing Co., Easton, PA); Gennaro, A.R., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, (Lippincott, Williams and Wilkins), 2000; Liberman, et al., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; and Kibbe, et al., Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients (3rd Ed.), American Pharmaceutical Association, Washington, 1999.

Термин «лечить» в данном контексте означает любой вид лечения, который оказывает пользу пациенту, страдающему от заболевания, включая улучшение состояния пациента (например, по одному или более симптомам), отставание в развитии состояния и т.п.

«Терапевтически эффективное количество» вещества или фармацевтической композиции означает количество, эффективно предотвращающее, ингибирующее, лечащее или уменьшающее симптомы определенного нарушения или заболевания. Лечение рака в данном контексте может означать излечение, облегчение и/или ингибирование рака, его симптомов или предрасположенности к нему.

Термин «терапевтический препарат» в данном контексте означает химическое вещество или биологическую молекулу, включая, без ограничения нуклеиновые кислоты, пептиды, белки и антитела, используемые для лечения патологического состояния, заболевания или нарушения или для уменьшения симптомов патологического состояния, заболевания или нарушения.

Термин «низкомолекулярное вещество (малая молекула)» в данном контексте означает субстанцию или вещество, имеющее относительно низкую молекулярную массу (например, менее 4000, менее 2000, в частности, менее 1 кДа или 800 Да). Обычно малые молекулы являются органическими, но не белками, полипептидами или нуклеиновыми кислотами, хотя они могут быть аминокислотами или дипептидами.

Термин «амфифильный» в данном контексте означает способность растворяться как в воде, так и в липидах/неполярных средах. Обычно амфифильное вещество содержит гидрофильную часть и гидрофобную часть. «Гидрофобный» означает предпочтение к неполярным средам (например, гидрофобное вещество или группа лучше растворяется или смачивается неполярными растворителями, такими как углеводороды, чем водой). В данном контексте термин «гидрофильный» означает способность растворяться в воде.

В данном контексте термин «полимер» определяет молекулы, образованные путем химической связи двух или более повторяющихся единиц, или мономеров. В наиболее простом представлении термин «блок-сополимер» определяет конъюгаты, по меньшей мере, двух разных полимерных сегментов, где каждый полимерный сегмент содержит две или более последовательные единицы одного типа.

Следующие примеры описывают показательные способы применения настоящего изобретения и никаким образом не ограничивают сферу действия изобретения.

ПРИМЕР 1

ПЭГилированная липосомальная лекарственная форма низкомолекулярного противоракового лекарства доксорубицина Доксил широко применяется в клинической практике для лечения различных типов рака (например, рак яичников, СПИД-ассоциированная саркома Капоши и множественная миелома) (Amanteaetal., (1997) ., 61:301-311; Sharpe et al., (2002) Drugs 62:2098-2126; Gabizon et al., (2001) Cancerlnvest., 19:424-436). Тем не менее, показатель эффективности Доксила как монотерапии ограничен, и было показано, что комбинации Доксила с другими химиотерапевтическими лекарствами (Таксол, Хикамтин) хорошо переносятся пациентами и имеют большую эффективность (Camposetal., (2003) Gynecol.Oncol., 90:610-618; Dunton, C.J. (1997) Semin. Oncol., 24:S5-2-S5-11). Таким образом, исследования новых комбинаций Доксила с другими препаратами вызывают большой интерес для развития новых методов лечения рака. Амфифильные блок-сополимеры плюроники, состоящие из блоков полиоксиэтилена-полиоксипропилена, использовались в данном исследовании в нескольких режимах комбинированной терапии: предварительная обработка блок-сополимером с последующим введением Доксила, совместное введение Доксила и плюроника и введение Доксила с последующим введением плюроника. Исследования цитотоксичности на клеточных линиях рака яичников, чувствительных А2780 и устойчивых к лекарству A2780/DOX, а также на чувствительных и устойчивых клеточных линиях рака молочной железы MCF7 и MCF7/ADRinvitro показали, что совместное введение с Доксилом, предварительная или последующая обработка клеток плюроником при нетоксичных концентрациях приводит к накоплению значительно большего количества доксорубицина в клеточном ядре, по сравнению с одним Доксилом. Кривые высвобождения доксорубицина из липосом Доксил in vitro и анализ гашения флуоресценции показали, что плюроник вызывает увеличение подвижности и проницаемости липосомальной мембраны, что может вызывать высвобождение лекарства из липосом. Введение плюроника через 1 и 48 часов после Доксила показала значительно лучшую противоопухолевую активность по сравнению с группой, где вводился один Доксил.

Комбинации хорошо охарактеризованных лекарств, которые успешно применялись в клинической практике для лечения раковых пациентов, с новыми материалами/активаторами, а также применение новых схем лечения может предоставить решение и дать значительные преимущества по сравнению с терапевтическими препаратами, используемые как монотерапия. ПЭГилированная липосомальная лекарственная форма доксорубицина Доксил активно использовалась в фазе I и фазе II комбинированных исследований для лечения различных типов рака. Частота клинической эффективности этих комбинаций, в частности, в раке яичников, устойчивом к платиновой терапии, была выше, по сравнению с монотерапией ПЭГилированным липосомальным доксорубицином (Roseetal., (2008) Am. J. Clin. Oncol., 31:476-480; Markman et al., (2004) Semin. Oncol., 31:91-105; Gabizon et al., (1994) Acta Oncol., 33:779-776; Eltabakh et al., (2001) Expert Opin. Pharmacother., 2:109-124). Тем не менее, комбинированная терапия не лишена побочных эффектов, и введение более одного цитотоксичного агента может привести к более серьезной общей токсичности, вызванной лекарственной формой, по сравнению с монотерапией. Идеальный агент для комбинированной терапии должен иметь низкую общую токсичность и обладать синергическим действием с другим лекарством в лекарственном препарате. Были описаны комбинации липосомального доксорубицина с сенсибилизаторами АТФ (аденозинтрифосфорной кислоты) (DiNicolantonioetal., (2002) Anticancer Drugs, 13:625-630; Cree I.A. (2003)Cancer Res., 161:119-125; Knight et al., (2009) BMC Cancer, 9:38). Плюроник блок-сополимеры являются очень сильными хемосенсибилизаторами раков с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) (Batrakova et al., (2010) J. Control Release, 143:290-301; Batrakova et al., (2003) Pharm Res., 20:1581-1590). Плюроник блок-сополимеры ингибируют АТФазную активность Pgp, основного белка, связанного с множественной лекарственной устойчивостью в ряде раков, ответственного за выброс цитотоксичных лекарств из клеток (Kabanov et al., (2003) J. Control Release, 91:75-83). Более того, плюроник вызывает снижение уровня АТФ, ингибирование поглощения кислорода и ингибирование комплексов I и IV дыхательной цепи митохондрий в МЛУ клетках. Взятые вместе, эти эффекты значительно увеличивают цитотоксичность доксорубицина в устойчивых к лекарствам клетках (Alakhova et al., (2010) J. Control Release, 142:89-100). Особенно важно, SP1049C, лекарственная форма, содержащая плюроники L61 и F127 и доксорубицин, успешно завершила фазу II клинических испытаний в распространенном раке пищевода (Batrakova et al., J Control Release, 130:98-106).

Здесь описывается новый терапевтический подход для лечения рака с использованием комбинации липосомального доксорубинина Доксил и плюроник блок-сополимера, а также лекарственная схема, значительно улучшающая противораковую активность Доксила.

Материалы и методы

Химические реагенты и материалы

Доксил (липосомальный доксорубицин (DOX) HCL для инъкций) был приобретен в ALZA Соф (Mountain View, CA). Набор реактивов для измерения концентрации АТФ (#FLAA-1KT), тиазолил голубой тетразолиум бромид (МТТ, #M5655-1G), фосфатный солевой буфер Дульбекко (ФСБ) были приобретены в Sigma-Aldrich (St.Louis, МО), плюроник Р85 (лот #WPYE357B) был предоставлен BASF Corporation (North Mount Olive, NJ). Отношение мономеров ПЭО-ППО-ПЭО в Р85 равно 26/40/26. Рабочий раствор имел следующий состав: 122 мМ хлорид натрия, 10 мМ HEPES, 3 мМ хлорид калия, 1,2 мМ сульфат магния, 1,4 мМ хлорид кальция и 0,4 мМ двуосновный фосфат калия, pH доведен до 7,4.

Клеточные линии и условия культивирования

Клеточные линии А2780, МСР7были приобретены в АТСС. Клетки А2780 и A2780/DOX культивировали в среде RPMI 1640, клетки MCF7 и MCF7/ADR культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, СА), 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина. Клетки A2780/DOX и MCF7/ADR6bmH культивированы в присутствии 1 мкг/мл доксорубицина. Клетки росли при 37°C во влажной воздушной атмосфере с 5%ным содержанием CO₂ (по объему). Все эксперименты на клетка проводились в стадии экспоненциального роста.

Вестерн-блоттинг

Чтобы определить клеточный фенотип, ассоциированный с Pgp, был использован метод иммуноблоттинга. Моноклональные антитела к Pgp, С219 (Dako Corp. Carpinteria, CA) были использованы при разведении 1:100. Моноклональные антитела к β-актину (Sigma Inc.) были использованы при разведении 1:15000. Антимышиные вторичные антитела с пероксидазой хрена (разбавление 1:20000) были приобретены в Sigma Inc.

Определение цитотоксичности

Клетки посеяли в 96-луночные планшеты при начальной плотности 8×10³ клеток/лунку за 24 часа до эксперимента. На следующий день клетки были обработаны доксорубицином или Доксилом в присутствии или в отсутствие 0,1% (вес/объем) Р85 в течение 2х или 24х часов при 37°C во влажной воздушной атмосфере с 5% содержанием CO₂. После обработки среду удалили, клетки отмыли три раза ФБС и культивировали три дня в свежей среде. Цитотоксичность определяли с помощью стандартного метода МТТ, поглощение измерялось на 562 нм используя Spectramax MX М5. Каждое значение концентрации определялось из образцов восьми отдельных лунок. Значения ИК₅₀ были рассчитаны из процентного отношения обработанных клеток и необработанного контроля, используя программное обеспечение GraphPad Prizm 5 (GraphPad Software, San Diego, CA).

Исследования клеточного захвата

Клетки посеяли в 24-луночные планшеты при начальной плотности 8×10³ клеток/лунку, в день эксперимента клетки образовывали 70-80% непрерывный слой. Через 2 или 24 часа инкубации в присутствии или в отсутствие 0,1% Р85, клетки отмыли 3 раза ФСБ, трипсинизировали, добавили по 1 мл среды и осадили центрифугированием при 1500 об/мин в течение 3 минут. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл ФСБ с 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА). Флуоресценция доксорубицина была проанализирована методом проточной цитометрии в центре клеточного анализа Медицинского Центра Университета Небраски.

Конфокальная микроскопия

Клетки посеяли в 8-луночные предметные стекла за 48 часов до эксперимента при начальной плотности 1×10⁴ клеток/лунку. Непрерывный слой клеток обработали Доксилом (200 или 400 мкг/мл) в течение 24 или 48 часов, чтобы определить внутриклеточную локализацию доксорубицина. Клеточные ядра были дополнительно окрашены Hoechst 33258 (Sigma, St.Louis, МО). Atto 647 флуоресцентно меченный плюроник Р85 был синтезирован, как описано ранее (Yi et al., (2010) Free Radic. Biol. Med., 49:548-558). 0,007% Atto 647-меченый P85, смешанный с 0,1% немеченым Р85, использовался для изучения колокализации плюроника. Клетки были визуализированы системой конфокальной визуализации живых клеток (Carl Zeiss LSM 510 Meta, Peabody, MA).

Исследование высвобождения доксорубицина

Эффект Р85 на высвобождение доксорубицина из липосом Доксила был исследован методом равновесного диализа. 1 мл раствора Доксила с концентрацией доксорубицина 0,2 мг/мл в ФСБ был помещен в диализный мешок и диализирован против 25 мл ФСБ при постоянном помешивании при 37°C в темноте. Образцы в 1 мл диализированного раствора отбирались в определенные моменты времени (1, 2, 4, 8 и 24 часа) с заменой на равное количество свежей среды. Концентрация доксорубицина в образцах диализата была определена путем измерения поглощения при 485 нм, используя Lambda 25 UV/VIS спректрофотометр. Количество доксорубицина, высвободившегося из липосом Доксила, было выражено как процент от общего количества доксорубицина и графически изображено как функция времени.

Флуоресцентный анализ

Спектры флуоресценции свободного доксорубицина и липосом Доксил в присутствии 0,1% Р85 были записаны, используя спектрофлуориметр Fluorolog® HORIBA Jobin Yvon Inc., NJ при возбуждающей длине волны 480 нм с шириной полосы возбуждения и испускания в 5 нм. Использованные растворы свободного доксорубицина и доксорубицина содержали 50 мкМ доксорубицина. Измерения флуоресценции ТРИТЦ-меченного Р85 осуществлялось при λ_возб=550 нм с шириной полосы возбуждения и испускания 2 нм.

Измерения размера и ζ-потенциала.

Эффективный гидродинамический диаметр (D_eff) и зета-потенциал частиц измеряли с помощью Zetasizer (Marven Instruments Limited. U.K.) при 25°C. Размер частиц, индексы полидисперсности и зета-потенциал липосом были проанализированы с помощью программного обеспечения, предоставленного производителем. Средние значения были рассчитаны из, по крайней мере, трех измерений.

Животные

Все эксперименты производились с разрешения комитета по институциональному уходу за животными и их использованию Медицинского Центра Университета Небраски и, в соответствии с руководством Национального Института Здоровья для использования лабораторных животных. Для создания опухолевой модели в данном исследовании использовались бестимусные мыши (6- и 8-недельные самки, Национальный Институт Здоровья, Frederick, MD). Животных содержали в группах по 5 с неограниченным доступом еды.

Животная опухолевая модель и противоопухолевая активность

Ксенотрансплантатная модель человеческой карциномы яичников использовалась, как описано, ранее (Rakunlu et al., (2006) Clin. Cancer Res., 14:3607-3616). Клетки линии A2780 человеческой карциномы яичников (4×10⁶) были подкожно введены в правый бок поясницы самкам бестимусных nu/nu мышей. Когда опухоли достигли размера 0,5 см³ (через 10-15 дней после трансплантации), мышам сделали внутривенные инъекции Доксил (12 мг доксорубицина/кг на одну инъекцию). В группе последовательной обработки через 1, 48 или 96 часов мышам вкололи 0,02% Р85 в таком же объеме, как Доксил. Вес мышей и объем опухолей измерялся каждый второй день.

Статистический анализ

Отличия между разными группами анализировали t-тестом Стьюдента для парных сравнений и однофакторным дисперсионным анализом для множественных сравнений. Значение p менее 0,05 было принято статистически достоверным. Весь статистический анализ производился, используя программное обеспечение Prism Software (Version 5.0 GraphPad Software, SanDiego, CA, USA).

Результаты

Эффект Плюроника на цитотоксичность Доксила в раковых клетках in vitro

В большинстве экспериментов использовались чувствительные и устойчивые к лекарству клетки рака яичников А2780 и A2780/DOX. В некоторых экспериментах были использованы чувствительные и устойчивые к лекарству клетки рака молочной железы MCF7 и MCF7/ADR. Сначала клетки обработали возрастающими концентрациями Доксила в течение 2 часов в присутствии или в отсутствие Р85 (0,1% вес/объем). Как показано в таблице 1, двухчасовая обработка одним Доксилом при концентрациях до 200 мг/мл (из расчета на концентрацию доксорубицина в липосомальном препарате) не вызвала цитотоксичности ни в одной клеточной линии. Однако совместная обработка с Р85 увеличила токсичность Доксила как в чувствительных, так и в МЛУ клетках. Двухчасовая обработка одним 0,1% Р85 не вызвала токсичности в этих же клетках. Подобные результаты были получены для клеток рака молочной железы (Таблица 2).

Таблица 1
Обработка	Доксил® ИК50, мкг/млa
A2780	A2780/Dox
Доксил® (2 ч)	H.O.§	H.O.
Доксил® + 0.1% Р85 (2 ч, совместно)b	7.55±0.72	8.32±1.12
Доксил® (24 ч)	48.02±9.70	H.O.
Доксил® (24 ч)+0.1% Р85 (2 ч, предварительно)c	17.48±2.28(*)	H.O.
Доксил® (24 ч)+0.1% Р85 (2 ч, последовательно)d	14.76±6.48(*)	H.O.
Таблица 1. Значения ИК50 (мкг/мл) Доксила в клетках рака яичников при разных обработках. а - Эксперименты производились в четырех повторениях, данные представлены как среднее ± СОС по меньшей мере четырех независимых экспериментов. H.O. - не определено до 200 мкг/мл. Статистическое сравнение было осуществлено t-тестом Стьюдента между группой Доксила (24 ч) и группами предварительной и совместной обработки: *p<0,05. b - Клетки инкубировали совместно с Доксилом и 0,1% Р85 в течение 2 часов, затем отмыли три раза ФСБ и культивировали в свежей среде 72 часа перед измерением цитотоксичности. c - Клетки сначала обработали 0,1% Р85 в течение 2 часов, затем отмыли 3 раза ФСБ и далее инкубировали с Доксилом в течение 24 часов, отмыли 3 раза ФСБ и культивировали в свежей среде 72 часа перед измерением цитотоксичности. d - Клетки сначала обработали Доксилом в течение 24 часов, отмыли 3 раза ФСБ, а затем в течение 2 часов инкубировали с 0,1% Р85.

Таблица 2
Обработка	Доксил® ИК50, мкг/млa
MCF7	MCF7/ADR
Доксил® (2 ч)	H.O.a	H.O.b
Доксил® + 0.1% Р85 (2 ч, совместно)b	43,24±0,38	852,49±0,73
Доксил® (24 ч)	6,24±0,26	H.O.
Доксил® (24 ч)+0.1% Р85 (2 ч, предварительно)c		H.O.
Доксил® (24 ч)+0.1% Р85 (2 ч, последовательно)d		H.O.
Таблица 2. Значения ИК50 (мкг/мл) Доксила в клетках рака молочной железы при разных обработках. См. Таблицу 1 для пояснений.

Эффект Р85 на цитотоксичность Доксила изучался при 24-часовой обработке. Чтобы избежать токсичность, вызванную Р85, сополимер добавляли к клеткам только на 2 часа, либо непосредственно до или после обработки Доксилом. Таким образом, также предотвращалось прямое взаимодействие Р85 и Доксил в среде. Один Доксил при 24-часовой обработке вызывал токсичность в чувствительных, но не в МЛУ клетках (Таблицы 1 и 2). Предварительная и последовательная обработка Р85 также увеличила токсичность Доксила в клетках линии А2780 по сравнению только с Доксилом.

Эффект Плюроника Р85 на захват лекарства раковыми клетками.

Внутриклеточная аккумуляция Доксила исследовалась методом проточной цитометрии. Данный метод не позволяет различить доксорубицин, находящийся в липосомах, и высвободившийся из частиц Доксила, но позволяет измерить общую флуоресценцию доксорубицина в клетках. Р85 добавляли точно так же, как при измерении цитотоксичности, описанном выше: либо одновременно с Доксилом в случае 2-часовой обработки, либо на 2 часа до или после Доксила в случае 24-часовой обработки. В каждом случае за исключением предварительной обработки в МЛУ клетках 0,1% Р85 вызвал значительное увеличение внутриклеточного накопления лекарства (фиг.1А и 1Б). В похожем эксперименте клетки были лизированы и флуоресценция была нормализована на содержание белка. Результат этого эксперимента был схож с данными проточной цитометрии (фиг.2), что свидетельствует о том, что изменения в накоплении лекарства являются следствием общего захвата лекарства клетками, а не перераспределения внутри клетки между свободной и инкапсулированной формой, которые имеют разную флуоресценцию.

Вызванное Р85 увеличение захвата лекарства наиболее сильно было выражено в случае совместной обработки, когда сополимер и Доксил присутствовали в клеточной среде одновременно. Это указывает на то, что совместная обработка Р85 с Доксилом стимулировала высвобождение лекарства из липосом. Такая тенденция наблюдалась как в чувствительных, так и в лекарственно устойчивых клетках. Стоит отметить, что в МЛУ клетках уровень захвата лекарства был значительно ниже, чем в чувствительных (Фиг.1А и 1Б). Это может быть обусловлено либо более низкой скоростью интернализации частиц Доксила, либо быстрым выбросом свободного доксорудицина, высвободившегося из захваченных липосом внутри клетки. Так как Р85 является хорошо известным ингибитором Pgp, вероятно, что в данном случае он также ингибировал выброс доксорубицина из МЛУ клеток. Подобное, вероятнее всего, могло произойти в случае совместной обработки Доксилом с Р85, когда условия для высвобождения доксорубицина из липосом, вызванного сополимером, наиболее благоприятные. В результате при таких условиях различия в захвате лекарства между чувствительными и МЛУ клетками сильно уменьшились. В случае предварительной обработки Р85 становится менее вероятно, что сополимер будет воздействовать на высвобождение лекарства из липосом, что может объяснить менее выраженный эффект Р85 на захват лекарства в МЛУ клетках.

Клеточный транспорт Доксила в раковых клетках в присутствии и в отсутствие Плюроника

Внутриклеточная локализация лекарств играет важнейшую роль для их активности и токсичности. Доксорубицин встраивается в ДНК и ингибирует топоизомеразу II, которая развинчивает ДНК для транскрипции и таким образом останавливает процесс репликации (Gewirtz, D.A. (1999) Biochem. Pharmacol., 57:727-741). Поэтому важно, чтобы доксорубицин дошел до ядра. Захват липосомального доксорубицина, Доксила, достаточно медленный процесс и после 24-часовой инкубации с 200 мкг/мл Доксила, захват был низким и флуоресценция доксорубицина наблюдалась во внутриклеточных везикулах, но не в ядре (фиг.3А). Однако в присутствии 0,1% Р85 клеточный захват доксорубицина и ядерная локализация значительно возросли как в чувствительных, так и в МЛУ клетках (фиг.3А). В присутствии 0,1% Р85 клеточный захват лекарства наблюдался уже через 5 минут и доксорубицин быстро накапливался в ядре (фиг.3Б). Внутриклеточную локализацию Р85 наблюдали, используя Atto 647 флуоресцентно меченный плюроник. Клетки были обработаны 0,007% меченым плюроником с добавлением 0,1% немеченого плюроника (фиг.3А).

Далее эффект последовательной обработки клеток 0,1% Р85 на транспорт Доксила/доксорудицина был исследован в клетках А2780 (фиг.3С). Клетки инкубировали с 200 мкг/мл Доксила в течение 24-х часов, отмыли и на 1 час добавили 0,1% Р85. Через час инкубации с плюроником его колокализация с доксорубицином из Доксила практически отсутствовала. Спустя 24 часа можно было наблюдать частичную колокализацию доксорубицина и плюроника, однако ядерного захвата лекарства не было. Далее инкубацию с Доксилом продлили до 48 часов, а предварительную и последовательную обработку Р85 до 2-х часов (фиг.3С).

Анализ тушения флуоресценции доксорубицина в Доксиле в присутствии и в отсутствие 0,1% Р85

В липосомах Доксил доксорубицин находится в кристаллическом виде, вследствие чего его флуоресценция тушится (примерно на 82%). По мере высвобождения доксорубицина интенсивность флуоресценции увеличивается. Интенсивность флуоресценции Доксила была измерена в присутствии и в отсутствие 0,1% Р85 чтобы изучить высвобождение доксорубицина из липосом. Испускание флуоресценции одного Доксила не изменялось в течение часа. При добавлении плюроника через 30 минут наблюдалось значительное увеличение флуоресценции, что указывает на быстрое высвобождение лекарства, достигшее максимума в первые 30 минут (фиг.4).

Эффект плюроника на выход доксорубицина из Доксила in vitro был также исследован. Как видно на фиг.5, доксорубицин быстрее высвобождался из липосом в присутствии плюроника как при pH 5,5, так и при pH 7,4.

Противоопухолевая активность Доксила в сочетании с Плюроником

Противоопухолевая активность Доксила в присутствии или в отсутствие плюроника исследовалась с целью определить, может ли плюроник усилить накопление лекарства в опухоли и вызвать подавление опухоли. Мыши с опухолями, образованными клетками рака яичников линии А2780, получили одноразовую внутривенную инъекцию 12 мг/кг Доксила. Спустя 1, 48 или 96 часов мыши получили такой же объем 0,02% Р85 внутривенно. Объемы опухолей в контрольной и экспериментальных группах показаны на фиг.6. Последовательное введение Р85 вызвало значительное ингибирование роста опухолей по сравнению с одноразовым введением Доксила даже в группе, где Р85 вводили через час после Доксила. Наиболее сильный эффект наблюдался в группе, где Р85 вводили через 48 часов после Доксила. Наблюдаемая разница в противоопухолевых эффектах Доксила в присутствии или в отсутствие плюроника может быть связана с фармакокинетичекими характеристиками Доксила, который хорошо известен как долго циркулирующий в крови препарат докосрубицина. Как было показано выше (фиг.4), плюроник вызывает увеличение подвижности и проницаемости липосомального липидного бислоя, что приводит к быстрому высвобождению доксорубицина из липосом.

Чтобы изучить системную токсичность разных схем лечения, сердце, печень, селезенку и почки были выделены из мышей с опухолями в конце эксперимента. Гистологический анализ не выявил токсичности во всех случаях (фиг.7).

ПРИМЕР 2

Плюроник Р85 вводился либо через 48, либо через 96 часов после Доксила, что соответствует самому большому увеличению противоопухолевой активности и, когда изменений не наблюдалось, соответственно. Животных умертвили через 1 или 6 часов после введения сополимера для анализа флуоресценции лекарства на срезах опухолей. Кровеносные сосуды (CD31) и ядра клеток (DAPI) были окрашены для сравнения. Как видно из анализа флуоресценции, при последовательном введении Р85 через 48 часов наблюдается значительное увеличение общей флуоресценции доксорубицина на срезах опухоли по сравнению с одним Доксилом (фиг.8А). Этот эффект был наиболее выражен спустя 6 часов после введения блок-сополимера. Стоит отметить, что в отсутствие Р85 флуоресценция лекарства преимущественно колокализировалась с кровеносными сосудами, в то время как после добавления Р85 лекарство распространилось по всей опухоли, достигая удаленных участков. Из этого следует, что через 48 часов частицы Доксила в основном накапливались в кровеносных сосудах, тогда как Р85 стимулировал высвобождение доксорубицина из липосом в ткани опухоли. Изображения полных срезов опухолей очевидно подтверждают увеличение флуоресценции лекарства в опухоли после введения сополимера (фиг.8В, верхний ряд). Однако совершенно другая картина наблюдалась, когда сополимер вводился через 96 часов после Доксила. В этом случае лекарство оказалось уже высвобожденным из липосом и его флуоресценция в опухоли не изменилась после введения сополимера (фиг.8В, нижний ряд).

Анализ накопления лекарства методом ВЭЖХ свидетельствует о том, что Р85 вызвал небольшое, но значительное увеличение количества спустя 6 часов после введения сополимера, когда сополимер вводили через 48 часов после введения Доксила (фиг.8Б). Максимальное накопление лекарства в солидных опухолях в мышах наблюдается в промежутке между 24 и 48 часами после введения препарата (Laginhaetal., (2005) Clin.CancerRes., 11:6944-6949). Таким образом, введение сополимера после Доксила в тот момент, когда наблюдается максимальное накопление лекарства в солидной опухоли, приводит к усилению высвобождения лекарства по всей опухоли и, как показано на фиг.7, усиливает противоопухолевую активность. В отличие от этого введение сополимера слишком рано, например через час после Доксила, или слишком поздно, например, через 96 часов после Доксила, не приводит к усилению высвобождения лекарства и не улучшает противоопухолевую активность.

Материалы и методы

Животная опухолевая модель -аналогично примеру 1.

Иммуногистохимия. Иммуногистохимический анализ был произведен на срезах опухолей, выделенных у бестимусных мышей с развитыми А2780 опухолями, которых лечили либо только Доксилом, либо в комбинации с Р85. Фиксированные формалином и залитые парафином опухолевые ткани были окрашены ФИТЦ-мечеными анти CD31 антителами (BD Biosciences., разбавление 1:100). В конце окраски на 5 минут был добавлен Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, St.Louis, МО) для окрашивания клеточных ядер. Визуализация образцов производилась на микроскопе Zeiss Axioplan 2.

ПРИМЕР 3

Значительное количество липосом Доксила все еще циркулирует в крови через 48 часов после введения. Прямого метода измерения концентраций свободного и липосомального лекарств не существует. Метод ВЭЖХ позволяет измерить только общую концентрацию лекарства. Введение Р85 через 48 часов после Доксила практически не изменило фармакокинетичекий профиль лекарства, который остался схожим с профилем одного Докисла (фиг.9). Это указывает на то, что последовательное введение плюроника не вызвало высвобождение лекарства из циркулирующих липосом Доксила, так как свободный доксорубицин был бы быстро выведен из крови. Таким образом, в этом примере показано, что введение блок-сополимера после Доксила не вызывает высвобождение лекарства из циркулирующих липосом, а как показано выше в примере 1, высвобождает лекарство из липосом, накопившихся в опухоли.

Материалы и методы

Животная опухолевая модель - аналогично примеру 1.

Определение концентрации лекарства в плазме крови.

Шестинедельные самки BALB/C мышей были приобретены в Charles River Breeding Laboratories (Raleigh, NC, USA). Мышам сделали одноразовую внутривенную инъекцию 12 мг/кг Доксила. Р85 (0,02%, 100 мкл/мышь) вводили внутривенно спустя 48 часов после лекарства. Животных умертвляли для получения образцов крови каждые 12 часов после введения лекарства. Образцы крови подвергли гематологическому анализу и анализу методом ВЭЖХ.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Концентрация доксорубицина в тканях опухолей определялась методом ВЭЖХ. Перед анализом опухоли сначала гомогенизировали с помощью гомогенизатора TEADOR® (Biospec Products, Inc.). К тканям добавили равный объем воды квалификации «ВЭЖХ» и гомогенизировали. На 40 мкл гомогената ткани 8 мкл даунорубицина (0,2 мг/мл) использовали в качестве внутреннего стандарта (ВС). К каждому образцу добавили 100 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ 10%) и перемешали на вортекс-миксере в течение 30 сек. Затем образцы центрифугировали при 15000 g в течение 10 мин при 4°C. Супернатант (40 мкл) был помещен в пробирку и испарялся в течение 2 часов под потоком газа на 40-градусном греющем мате. Остаток растворили в 80 µл подвижной фазы и аликвота, 60 мкл было использовано для ВЭЖХ анализа. Анализ проводился используя С18 колонку с обращенными фазами (Agilent Eclipse XDB, 150×4.6 mmi.d., размер частиц 5 µм) на Agilent 1200 ВЭЖХ (детектор УФ G1353B, детектор флуоресценции G1321A, насос G1311A, Автодозатор G1329A, термостат колонок G1316A) при скорости потока 1,2 мл/мин. Подвижная фаза: 1% уксусная кислота: ацетонитрил в соотношении 48%:52%. Флуоресцентная детекция доксорубицина производилась при λ_возб=480 нм и λ_исп=590 нм.

ПРИМЕР 4

Исследование высвобождения лекарства из липосом Доксила проводилось методом равновесного диализа (номинально отсекаемая молекулярная масса 3500 кДа). Стоковые растворы Доксила (2 мг/мл доксорубицина) были разбавлены в 10 раз в присутствии или в отсутствие Р85 либо в ФСБ, pH 7.4, либо в ацетатном буфере, pH 5.5. Полученные растворы Доксила, содержащие или не содержащие плюроник сополимеры (1 мл), были помещены в диализные мешки и диализованы против 25 мл соответствующего буфера при постоянном помешивании при 37°C в темноте. Образцы (1 мл) диализата отбирались в различные моменты времени (1, 2, 4, 8, 24 и/или 48 ч) и заменялись равным объемом соответствующего буфера. Концентрация доксорубицина в образцах диализата определялась спектрофотометрически путем измерения абсорбции при 485 нм, используя Lambda 25 UV/VIS спектрофотометр (PerkinElmer). Количество доксорубицина, высвобожденного из липосом ДОКСИЛ, было выражено как процент общего количества доксорубицина и изображено графически как функция времени.

Исследование высвобождения лекарства из липосом Доксила методом равновесного диализа показало, что добавление плюроник блок-сополимеров (Р85, F127, L61, F68) к липосомам при pH 7,4 или 5,5 значительно усиливает скорость высвобождения доксорубицина (фиг.10). В данном случае примерно 50% лекарства высвободилось за время проведения эксперимента в присутствии плюроника Р85(фиг.10А, 10Б) или других плюроник блок-сополимеров (фиг.10В, 10Д), в то время как только 15% доксорубицина высвободилось из Доксила без добавления плюроника. Стоит отметить, что способность плюроника Р85 стимулировать высвобождение лекарства из липосом зависит от концентрации сополимера. В частности, усиление высвобождения лекарства было достаточно значительным при концентрации Р85 0,02%-0,05%, значительно меньшим при 0,001% Р85 и совершенно не проявлялось при 0,0001% Р85 (фиг.10А, 10Б).

При концентрации сополимера 0,02% по весу схожий с плюроником Р85 плюроник F127, а также смесь плюроников F127 и L61 (1:8 по весу) значительно увеличили высвобождение лекарства из липосом - за 48 часов высвободилось примерно 50% лекарства по сравнению с 15% в случае только Доксила. Однако плюроник F68 имел меньший эффект на высвобождение лекарства из липосом, что может быть связано с более гидрофильной природой F68 и меньшим взаимодействием с мембраной липосом по сравнению с другими сополимерами, использованными в данном примере (фиг.10В, 10Г). Таким образом, было показано, что сополимеры с высоким содержанием ППО (примерно 30% в плюронике F127, или примерно 50% в плюронике Р85, или примерно 90% в плюронике L61), а также сополимеры с большей молекулярной массой блока ППО (примерно 2250 в плюронике Р85, примерно 3800 в плюронике F127) наиболее эффективно высвобождают лекарство из липосом Доксил. Наименьшей активностью обладали сополимеры с наименьшим содержанием ППО (примерно 20% в плюронике F68) и наименьшей молекулярной массой блока ППО (примерно 1740). Молекулярные массы блоков ППО и ПЭО и их массовый процент в блок-сополимерах представлены в литературе и пропорциональны числу единиц пропиленоксида и этиленоксида в соответствующих блоках (Kabanov, A.V., Batrakova, E.V., Alakhov, V.Y. (2002) Pluronic® block copolymers as novel polymer therapeutics for drug and gene delivery, J.Control. Release 82 (2-3), 189-212). Молекулярные массы единиц пропиленоксида и этиленоксида составляют 58 и 44 соответственно. Также стоит заметить, что наибольшую активность проявляют относительно более гидрофобные плюроники с гидрофильно-липофильным балансом (ГЛБ) 22 и менее (22 для плюроника F127, 16 для плюроника Р85 и 3 для плюроника L61), в то время как наименьшую активность имеют гидрофильные плюроники с ГЛБ более 22 (29 для плюроника F68). Также важно заметить, что наиболее активные плюроники имеют низкую критическую концентрацию мицелообразования (ККМ) при 37°C - примерное 0.0028 мМ у плюроника F127, или примерно 0,067 мМ у плюроника Р85, или примерное 0,11 мМ у плюроника L61, в то время как наименьшую активность показал гидрофильный плюроник F68 с ККМ примерно 0,48 мМ. Значения ГЛБ и ККМ, условия и методы их измерения и их связь с длинами блоков ППО и ПЭО можно найти в литературе (Batrakova, Е, Lee, S., Li, S., Venne, A., Alakhov, V., Kabanov, A. (1999) Fundamental relationships between the composition of Pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379; Kozlov, M.Y., Melik-Nubarov, N.S., Batrakova, E.V., Kabanov, A.V. (2000) Relationship between Pluronic® block copolymer structure, critical micellization concentration and partitioning coefficients of low molecular mass solutes, Macromolecules 33, 3305-3313; Kabanov, A.V., Batrakova, E.V., Alakhov, V.Y. (2002) Pluronic® block copolymers as novel polymer therapeutics for drug and gene delivery, J. Control. Release 82 (2-3), 189-212).

Интересно, что размер и полидисперсность липосом в присутствии еще более высоких концентраций Р85 не изменились за тот же промежуток времени (Таблица 3), что означает, что усиление высвобождения лекарства в присутствии блок-сополимера не связано с разрушением липосом. В то же время при смешивании ТРИЦ-меченого Р85 с пустыми липосомами наблюдалось тушение флуоресценции ТРИЦ (на примерно 50%), что означает, что сополимер встраивается в липосомальную мембрану (фиг.11).

Способность Р85 увеличивать скорость диффузии доксорубицина через плоские липидные и липосомальные мембраны была ранее описана. Исследования, представленные в данной работе, также показали, что блок-сополимер значительно увеличивает скорость высвобождения доксорубицина из липосом ДОКСИЛ. Более того, здесь также было показано, что сополимер не влияет на размер липосом. Тем не менее, он встраивается в липосомальную мембрану, что предположительно включает инкорпорирование гидрофобного блока полиоксипропилена в неполярную часть липидного бислоя. Исследование также показало, что гидрофобные плюроники встраиваются в липидные мембраны и нарушают упаковку липидов, что приводит к пермеабилизации мембраны.

Таблица 3
	Dэфф	PDI
Доксил (pH5.5)	83.9±2.20	0.036±0.01
Доксил (pH7.4)	82.9±1.21	0.011±0.01
Доксил + 0.5% Р85 (pH5.5)	89.8±0.44	0.032±0.01
Доксил + 0.5% Р85 (pH7.4)	87.1±0.68	0.067±0.01
Доксил + 0.1% Р85 (pH5.5)	88.2±1.07	0.067±0.01
Доксил + 0.1% Р85 (pH7.4)	85.5±0.91	0.067±0.01
Доксил + 0.02% Р85 (pH5.5)	88.1±0.95	0.049±0.01
Доксил + 0.02% Р85 (pH7.4)	85.5±0.73	0.067±0.01
Доксил + 0.01% Р85 (pH5.5)	88.6±0.06	0.036±0.01
Доксил + 0.01% Р85 (pH7.4)	86.8±0.47	0.046±0.01
Доксил + 0.001% Р85 (pH5.5)	88.0±0.25	0.058±0.01
Доксил + 0.001% Р85 (PH7.4)	84.8±0.94	0.059±0.01
Доксил + 0.0001% Р85 (pH5.5)	87.2±0.36	0.056±0.01
Доксил + 0.0001% Р85 (pH7.4)	85.2±1.07	0.027±0.02
Таблица 3. Эффективный гидродинамический диаметр (Dэфф) и индексы полидисперсности (PDI) частиц Доксил в дисперсии (0,2 мг/мл в расчете на концентрацию доксорубицина) в присутствии различных концентраций плюроника Р85 при pH 5,5 и pH 7,4, были измерены с помощью фотонно-корреляционной спектроскопии в термостатируемой ячейке при угле рассеивания 90°.

В вышеизложенной спецификации цитируются некоторые публикации и патенты, чтобы описать состояние области, к которой относится настоящее изобретение. Полное описание каждой из этих статей приведено в ссылках.

В то время как вышеизложенное изобретение было детально проиллюстрировано с помощью примеров, для ясности понимания могут быть сделаны многочисленные изменения и модификации, не отступая от сути изобретения, которое ограничено исключительно объемом прилагаемой формулы изобретения.

1. Способ лечения рака у пациента, включающий введение, по меньшей мере, одного инкапсулированного химиотерапевтического агента и, по меньшей мере, одного амфифильного блок-сополимера данному пациенту.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанный инкапсулированный химиотерапевтический препарат и указанный амфифильный блок-сополимер содержатся в одной композиции.

3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанный инкапсулированный химиотерапевтический препарат и указанный амфифильный блок-сополимер содержатся в разных композициях.

4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что указанный инкапсулированный химиотерапевтический препарат и указанный амфифильный блок-сополимер вводят, по меньшей мере, последовательно.

5. Способ по п.4, характеризующийся тем, что указанный инкапсулированный химиотерапевтический препарат вводят до указанного амфифильного блок-сополимера.

6. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанный инкапсулированный химиотерапевтический препарат и указанный амфифильный блок-сополимер вводят, по меньшей мере, одновременно.

7. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанным инкапсулированным химиотерапевтическим препаратом является липосомальный доксорубицин.

8. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанный амфифильный блок-сополимер содержит, по меньшей мере, один блок этиленоксида и, по меньшей мере, один блок пропиленоксида.

9. Способ по п.8, характеризующийся тем, что указанный амфифильный блок-сополимер является поли(этиленоксид)-поли(пропиленоксид)-поли(этиленоксид) триблок-сополимером.

10. Способ по п.9, характеризующийся тем, что содержание поли(пропиленоксид)а в амфифильном блок-сополимере составляет, по меньшей мере, 30%.

11. Способ по п.10, характеризующийся тем, что молекулярный вес блока поли(пропиленоксид)а в амфифильном блок-сополимере составляет в пределах от примерно 1200 до примерно 4200.

12. Способ по п.1, характеризующийся тем, что включает введение одного амфифильного блок-сополимера и второго амфифильного блок-сополимера, при этом первый и второй блок-сополимеры разные.

13. Композиция для лечения рака у пациента, включающая, по меньшей мере, один инкапсулированный химиотерапевтический препарат, по меньшей мере, один амфифильный блок-сополимер и, по меньшей мере, один фармацевтический носитель.

14. Композиция по п.13, характеризующаяся тем, что указанным инкапсулированным химиотерапевтическим препаратом является липосомальный доксорубицин.

15. Композиция по п.13, характеризующаяся тем, что указанный амфифильный блок-сополимер содержит, по меньшей мере, один блок этиленоксида и, по меньшей мере, один блок пропиленоксида.

16. Набор для лечения рака у пациента, включающий: а) одну композицию, содержащую, по меньшей мере, один инкапсулированный химиотерапевтический препарат и, по меньшей мере, одну фармацевтическую композицию; и б) вторую композицию, содержащую, по меньшей мере, один амфифильный блок-сополимер и, по меньшей мере, одну фармацевтическую композицию.

17. Набор по п.16, характеризующийся тем, что указанным инкапсулированным химиотерапевтическим препаратом является липосомальный доксорубицин.

18. Набор по п.16, характеризующийся тем, что указанный амфифильный блок-сополимер содержит, по меньшей мере, один блок этиленоксида и, по меньшей мере, один блок пропиленоксида.

19. Применение амфифильного блок-сополимера для усиления действия инкапсулированного химиотерапевтического препарата путем стимулирования выхода активного химиотерапевтического агента из липосом.

20. Применение по п.19, характеризующееся тем, что указанный амфифильный блок-сополимер вводят после инкапсулированного химиотерапевтического препарата через промежуток времени, достаточный для накопления инкапсулированного химиотерапевтического препарата в тканях опухоли.