Ферментативные реактивные чернила для использования в тест-полосках с заранее заданным кодом калибровки

Изобретение относится к медицине и описывает композицию ферментных чернил, содержащую фермент, способный избирательно распознавать глюкозу в пробе крови, медиатор и первый и второй пирогенный диоксид кремния, в которой первый пирогенный диоксид кремния имеет удельную поверхность по БЭТ в диапазоне от приблизительно 130 до 170 м²/г и содержание углерода от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,23% вес., а второй пирогенный диоксид кремния имеет удельную поверхность по БЭТ в диапазоне от приблизительно 270 до 330 м²/г и содержание углерода от приблизительно 1,4 до приблизительно 2,6% вес. Ферментные чернила настоящего изобретения делают возможным использование более совершенного способа производства партий тест-полосок с единым кодом калибровки и высокой эффективностью. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 6 пр.

 

Область применения изобретения

Изобретение относится к ферментативным реактивным чернилам или ферментным чернилам, которые применяются в электрохимических тест-полосках. В частности, настоящее изобретение относится к реактивным чернилам для использования в электрохимических тест-полосках с заранее заданным кодом калибровки.

Предпосылки создания изобретения

Электрохимические тест-полоски выполнены с возможностью измерения концентрации аналита, например глюкозы, в образце биологических жидкостей. В случае измерения концентрации глюкозы в пробе крови оценка уровня глюкозы основана на селективном окислении глюкозы, например, ферментом глюкозооксидазой. Глюкоза окисляется до глюконовой кислоты при реакции с окисленной формой глюкозооксидазы, и окисленный фермент переходит в свою восстановленную форму. На следующей стадии восстановленный фермент снова окисляется в результате реакции с промежуточным соединением, например феррицианидом. В процессе такого повторного окисления промежуточный феррицианид восстанавливается до ферроцианида.

Если такие реакции проводятся под тестовым напряжением, прилагаемым между двумя электродами, в результате повторного электрохимического окисления восстановленного промежуточного соединения на поверхности электрода создается тестовый ток. Поскольку в идеальных условиях количество восстановленного промежуточного соединения, получающееся в ходе данной химической реакции, прямопропорционально количеству глюкозы в образце между электродами, создаваемый тестовый ток пропорционален объему глюкозы в образце.

Измерительные приборы, которые опираются на данный принцип, дают возможность проводить отбор и анализ проб крови и определять концентрацию глюкозы в крови в любой момент времени. Создаваемый электрический ток определяют измерительным прибором и преобразуют в значение концентрации глюкозы; при этом используется алгоритм, основанный на простой математической формуле, отражающей зависимость тока в тестовой полоске и концентрации глюкозы. В целом такие измерительные приборы эксплуатируются с использованием одноразовых тестовых полосок, в состав которых, в дополнение к собственно ферменту и медиатору, может входить камера для приема образца и по меньшей мере два электрода, размещенные внутри камеры для приема образца.

Подобный тест на определение концентрации глюкозы с использованием измерительного прибора и тест-полоски опирается на данные калибровки набора тест-полосок, например данные о наклоне и отсекаемом отрезке, определяемые при изготовлении конкретного набора или партии полосок. Когда пользователь проводит тест на определение концентрации глюкозы с помощью полоски из определенной партии, пользователю необходимо ввести в измерительный прибор данные о наклоне и отсекаемом отрезке по партиям в виде кода калибровки, если такие данные меняются в зависимости от партии. Если пользователь забывает учесть возможные изменения калибровочных параметров, применяя различные партии тест-полосок, существует риск неточных результатов измерения концентрации глюкозы. Такая ошибка может привести к неверному выбору дозы инсулина, что может стать причиной гипо- или гипергликемии.

Чтобы избавиться от подобных недостатков использования тест-полосок, их изготовители разработали такие тест-полоски и способы их производства, при которых появляется возможность изготавливать партии тест-полосок, не требующих от пользователя ввода какой-либо информации о калибровке до проведения тестовых измерений, поскольку появляется возможность выпускать высокий процент партий тест-полосок с относительно постоянным среди партий наклоном и отсекаемым отрезком. Таким образом, партии тест-полосок, по сути, имеют одинаковые параметры калибровки, и при использовании тест-полосок в глюкометре, изготовленном с заданными параметрами калибровки, от пользователя не требуется вводить код калибровки при каждом использовании тест-полосок.

Краткое описание чертежей

На фиг.1A представлен вид в перспективе с пространственным разделением компонентов тест-полоски.

На фиг.1B представлен вид сверху в горизонтальной проекции полоски, показанной на фиг.1A.

На фиг.1C представлено увеличенное изображение фрагмента тест-полоски, показанной на фиг.1А.

На фиг.2 представлен график погрешностей в зависимости от уровня глюкозы в чернилах из примеров 2-6.

На фиг.3 приведен график зависимости значений Delta_150 от удельной поверхности для чернил из примеров 2-6.

На фиг.4 приведен график зависимости значений Delta_150 от содержания углерода для чернил из примеров 2-6.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение опирается на обнаруженный эффект зависимости смещения показателей партии тест-полосок для высоких и низких уровней глюкозы от выбора пирогенного диоксида кремния, применяемого в ферментных чернилах полосок. В частности, в основе настоящего изобретения лежит тот факт, что применение по меньшей мере двух пирогенных диоксидов кремния, один их которых имеет большую удельную поверхность и содержание углерода по сравнению с другим, в ферментных чернилах тест-полосок обеспечивает такое смещение показателей для тест-полосок в области низких и высоких уровней глюкозы, которое соответствует желательному целевому диапазону, таким образом позволяет предложить более совершенный способ производства партий тест-полосок с единым кодом калибровки и высокой эффективностью. В одном варианте осуществления тест-полоски процесса имеют погрешность, которая находится в пределах заранее заданного целевого диапазона, например, в пределах заранее заданного целевого диапазона.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается композиция ферментных чернил, по существу состоящая из фермента, способного избирательно распознавать глюкозу в пробе крови, медиатора и одного или более материалов, способных регулировать массоперенос медиатора, так что значения погрешности, вызванной одним или более из низкого и высокого значений концентрации глюкозы, для заранее заданного кода калибровки находятся в пределах заранее заданного целевого диапазона.

Настоящее изобретение может найти самое широкое применение в ферментных чернилах для использования в электрохимических тест-полосках для определения уровня глюкозы в образцах цельной крови. Более предпочтительно использовать ферментные чернила настоящего изобретения в электрохимических тест-полосках для измерения глюкозы, где в качестве электродов применяются копланарные электроды. Наиболее предпочтительно использовать чернила настоящего изобретения в тест-полосках типа ULTRA™ в соответствии с описанием в патентах США №№5,708,247, 5,95,836, 7,112,265, 6,241,862, 6,284,125, 7,462,265 и заявках на патент США №№20100112678 и 20100112612, которые полностью включены в текст настоящего документа путем ссылки.

Чернила настоящего изобретения предпочтительно содержат по меньшей мере два гидрофобных материала пирогенного диоксида кремния, которые являются химически эквивалентными, а значит, имеют одинаковую стабильность и состоят, по существу, из сходных компонентов, но отличаются по удельной поверхности по БЭТ и суммарному содержанию углерода. Под «удельной поверхностью по БЭТ» понимают удельную поверхность гидрофильного кремнезема, определяемую по методу БЭТ.

В качестве пирогенных диоксидов кремния, применяемых в настоящем изобретении, может выступать любой диоксид кремния, который в состоянии обеспечить желаемую погрешность при высоких и низких уровнях глюкозы. Предполагается, что этого можно добиться за счет использования материалов, которые регулируют массоперенос медиатора, таким образом стабилизируя работу противоэлектрода или контрольного электрода в течение времени тестирования. Пирогенные диоксиды кремния, применяемые в настоящем изобретении, производятся серийно или могут быть получены известными способами, например сжиганием тетрахлорида кремния в кислородно-водородном пламени или выпариванием кварцевого песка в электрической дуге. К допустимым диоксидам кремния без ограничений относятся выпускаемые под торговой маркой HDK® производства Wacker Chemie GmbH, CAB-O-SIL® производства Cabot и AEROSIL® производства Evonik deGussa Ltd. Предпочтительно использовать пирогенные диоксиды кремния марки HDK.

Специалистам в данной области известно, что вместо пирогенных диоксидов кремния можно применять любой материал, который является водорастворимым, инертным и в состоянии регулировать массоперенос медиатора в подложке сольватирующего реагента тест-полоски. При этом диоксиды кремния могут быть наилучшим материалом, поскольку в реагенте, как правило, применяется один диоксид кремния, и он может легко смешиваться с другим диоксидом кремния.

В предпочтительном варианте осуществления один материал из диоксида кремния с удельной поверхностью по БЭТ приблизительно от 130 до 170 м²/г и содержанием углерода приблизительно от 0,8 до 1,2% вес. смешивается со вторым диоксидом кремния с удельной поверхностью по БЭТ приблизительно от 270 до 330 м²/г и содержанием углерода приблизительно от 1,4 до 2,6% вес. Для целей настоящего изобретения удельную поверхность рассчитывают на основе теории БЭТ для физической адсорбции молекул газа на твердой поверхности в соответствии со стандартом испытаний DIN ISO 9277/DIN 66132. Предпочтительно применяют пирогенные диоксиды кремния марки HDK, а наиболее предпочтительно применяют смесь диоксидов кремния HDK H15 и HDK H30.

Количество каждого из диоксидов кремния, применяемых в настоящем изобретении, достаточно для обеспечения желательного уровня погрешности для высокого или низкого уровней концентрации глюкозы, или для обеих крайних точек диапазона концентраций. Как правило, содержание пирогенного диоксида кремния с наименьшей удельной площадью и наименьшим содержанием углерода, например HDK H15, составляет от приблизительно 99 до приблизительно 1, предпочтительно от 75 до приблизительно 45 и, более предпочтительно, от приблизительно 71 до приблизительно 68% вес. суммарного количества пирогенного диоксида кремния, используемого в ферментных чернилах. Содержание пирогенного диоксида кремния с большей удельной площадью и большим содержанием углерода, например HDK 30, составляет от приблизительно 1 до приблизительно 99, предпочтительно от 25 до приблизительно 55 и, более предпочтительно, от приблизительно 29 до приблизительно 32% вес.

Пирогенные диоксиды кремния могут смешиваться с соответствующим ферментом и медиатором для получения ферментных реактивных чернил. К применяемым ферментам относятся любые ферменты, которые в состоянии избирательно распознавать глюкозу в пробе крови и, предпочтительно, являются окислительно-восстановительными ферментами, в том числе, среди прочих, глюкозооксидаза или глюкозодегидрогеназа. В качестве кофакторов глюкозодегидрогеназы могут выступать пирролохинолинхинин или флавинадениндинуклеотид. Более предпочтительным ферментом является глюкозооксидаза. К допустимым медиаторам, среди прочих, относятся феррицианид, трихлорид гексааминрутения и т.п. Предпочтительным медиатором является феррицианид калия. Дополнительными компонентами ферментных чернил могут, среди прочих, быть буферный раствор, усилитель адгезии, предпочтительно поливиниловый спирт (ПВС), пленкообразующее вещество, предпочтительно поливинилпирролидон/винилацетат, пеногаситель, гелеобразователь и загуститель, предпочтительно гидроксиэтилцеллюлоза (ГЭЦ), вода, предпочтительно ЧДА, а также их комбинации.

Наиболее предпочтительный состав ферментных чернил настоящего изобретения: приблизительно 0,3% вес. пеногасящего соединения; приблизительно 0,6% вес. ПВС; приблизительно 0,6% вес. лимонной кислоты; приблизительно 1,9% вес. тринатрийцитрата; приблизительно 0,6% вес. сополимера винилпирролидона и винилацетата; приблизительно 3,27% вес. гидроксиэтилцеллюлозы; приблизительно 3,6% вес. пирогенного диоксида кремния с удельной поверхностью по БЭТ приблизительно от 130 до 170 м²/г и содержанием углерода приблизительно от 0,8% до 1,2% вес.; приблизительно 1,3% вес. пирогенного диоксида кремния с удельной поверхностью по БЭТ приблизительно от 270 до 330 и содержанием углерода приблизительно от 1,2% до 2,6% вес.; приблизительно 0,03% вес. гексацианоферрата (III) калия; приблизительно 23% вес. феррицианида калия; приблизительно 2,1% вес. глюкозооксидазы и приблизительно 62,4% вес. воды ЧДА. Ферментные реактивные чернила настоящего изобретения можно получить любым удобным способом.

Погрешность полосок настоящего изобретение может калиброваться любым удобным способом, в том числе, среди прочих, описанным ниже. Из партии случайным образом выбирают количество полосок, как правило, около 1500. Кровь 12-ти различных доноров обрабатывают до получения шести различных уровней концентрации глюкозы, и на восемь полосок наносят пробы крови одних и тех же доноров, так что в совокупности для данной партии проводится 12×6×8=576 тестов. Их сопоставляют с фактическими концентрациями глюкозы, измеряемыми с помощью стандартного лабораторного анализатора, например Yellow Springs Instrument (YSI). Строят график зависимости измеренной концентрации глюкозы от фактической концентрации глюкозы (или измеренного тока от тока YSI), и по методу наименьших квадратов проводят подгонку графика по формуле y=mx+c, чтобы получить значение для наклона партии m и отсекаемого отрезка партии c для остальных полосок из набора или партии. Разница в реакции на высокие и низкие содержания глюкозы в крови может описываться любым способом, который позволяет оценить изменение погрешности в реальном диапазоне измерений. Например, линейность может определяться коэффициентом a в квадратичной калибровке ax^2 mx+c, где m - наклон, а c - отсекаемый отрезок. Другим удобным показателем является параметр линейности Delta_150, который определяется как разность между процентом погрешности при концентрации глюкозы 500 мг/дл и 150 мг/дл и может быть представлен следующим уравнением:

Delta_150 = % погрешности_{500 мг/дл}-% погрешности_{150 мг/дл}

Содержание пирогенных диоксидов кремния в ферментных чернилах можно использовать для воздействия на диффузию феррицианида калия в полоске и, таким образом, регулирования эффективности противоэлектрода и контрольного электрода. Это свойство может применяться для регулирования погрешности при высоком и/или низком уровне глюкозы. После установки содержания пирогенных диоксидов кремния можно провести контрольное измерение, чтобы проверить, достигнута ли величина линейности, которая по существу соответствует целевым показателям. Если линейность по существу соответствует целевым значениям, тогда разработанные способы можно использовать для производства крупномасштабных партий. При этом если второй показатель линейности по существу не соответствует целевому диапазону, тогда производят коррекцию использованного соотношения пирогенных диоксидов кремния, а также готовят и тестируют больше полосок, чтобы удостовериться в том, что измененное содержание обеспечивает желаемую величину погрешности. При необходимости калибровку можно повторить.

Следует отметить, что на наклон партии и/или отсекаемый отрезок могут влиять и другие факторы, в том числе, среди прочих, количество медиатора, партия проводящих чернил, партия окисленного медиатора, время перемешивания, способ перемешивания, время простоя, подготовка субстрата, вид полимерной сетки, деформируемость полимерной сетки, длина рабочего электрода, площадь рабочего электрода, разнесение рабочего электрода и расстояние до поверхности полоски. Все эти факторы можно контролировать так, чтобы они были в значительной мере одинаковыми в каждом измерении, так чтобы от партии к партии обеспечить по существу постоянные величины наклона и отсекаемого отрезка. Площадь рабочего электрода и содержание восстановленного медиатора предпочтительно контролировать, как описано в публикации заявки на патент США № 20090208743A1, которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки, с тем чтобы добиться по существу постоянного наклона и отсекаемого отрезка.

Тест-полоску, использующую ферментные чернила настоящего изобретения, можно изготовить с использованием любого удобного известного способа, в том числе, среди прочих, рулонной печати, трафаретной печати или их комбинаций. Например, полоску можно изготовить последовательным центрированным наложением структурированного слоя проводника, слоя изолятора, слоя реагента, структурированного адгезивного слоя, гидрофильного слоя и покрывающей пленки на электроизоляционный субстрат.

Ниже приводится пример процесса рулонной печати. В качестве основы можно использовать нейлон, поликарбонат, полиимид, поливинилхлорид, полиэтилен, полипропилен, гликозилированный полиэфир, полиэфир и их комбинации. Предпочтительным субстратом является полиэфир, более предпочтителен Melinex ST328 производства DuPont Teijin Films. До подачи на один или более печатных станков субстрат может проходить предварительную обработку для ограничения риска удлинения и растяжения, которое может происходить в процессе изготовления полосок. На стадии предварительной обработки субстрат могут нагревать до температуры, которая не будет превышена на последующих стадиях печати. Например, субстрат может нагреваться приблизительно до 160°C. Как правило, нагревание происходит при натяжении под действием силы от приблизительно 150 Н и 180 Н, чаще всего приблизительно 165 Н. В альтернативном варианте при предварительной обработке субстрат можно нагревать до температуры, достаточной для удаления необратимых растяжек, опять же (необязательно) под воздействием упомянутого выше натяжения.

Субстрат предпочтительно находится под воздействием силы натяжения приблизительно 165 Н в течение всего процесса, чтобы обеспечить совмещение печатаемых слоев. Субстрат также подвергается воздействию различных температур приблизительно 140°C или ниже, с тем чтобы гарантировать высыхание наносимых чернил при каждой стадии печати. Перед печатью дополнительно можно использовать систему очистки, которая очищает верхнюю (или предназначенную для печати), боковую и тыльную поверхности субстрата с помощью пылесоса и системы щеток.

Для формирования слоя электрода можно нанести один или более печатных слоев углерода с частицами металла, чернил с серебром/хлоридом серебра или чернил на основе золота или палладия, или любой их комбинации. В одном варианте осуществления перед процессом печати и сразу же после сушки субстрат проходит через первый холодный ролик для быстрого охлаждения субстрата до заранее заданной температуры, как правило, комнатной температуры около 18-21°C, обычно до 19,5°C +/-0,5°C. После нанесения печатных углеродных структур в процессе печати субстрат можно протягивать через второй холодный ролик.

Можно использовать любые чернила, пригодные для применения в качестве изолирующих чернил и приемлемые для нанесения с помощью печатного станка в процессе рулонной печати, в том числе, среди прочих, чернила Ercon E6110-116 Jet Black Insulayer Ink, которые можно приобрести в Ercon, Inc. Сразу же после сушки субстрат с нанесенным углеродом и изолирующими структурами проходит через третий холодный ролик, как описано выше.

Затем можно проводить первое печатное нанесение ферментных чернил с использованием чернил настоящего изобретения. После первого этапа печати ферментными чернилами и сразу же после сушки субстрат с нанесенным печатью слоем углерода и изолирующими структурами проходит через четвертый холодный ролик. Можно проводить одну или более процедур увлажнения верхней, тыльной и боковой поверхности. Например, сборка трубок может обеспечивать по существу постоянный поток увлажненного воздуха сверху, снизу и сбоку на поверхность субстрата и печатные слои, обеспечивая постоянный уровень содержания воды в чернилах. Интенсивность и организация систем увлажнения (обычно представляют собой систему труб, подающих увлажненный воздух) будут, среди прочего, зависеть от степени необходимого увлажнения, содержания воды в чернилах, влажности и температуры окружающего воздуха, температуры субстрата в момент приближения к печатному станку для нанесения фермента, температуры печатного ролика, размеров трафарета и воздействия окружающего сухого воздуха на трафарет.

На фиг.1A представлен вид в перспективе с пространственным разделением компонентов примера тест-полоски 100, которая может включать в себя семь слоев, нанесенных на субстрат 5. На фиг.1B представлен примерный вид сверху в горизонтальной проекции отдельных слоев фиг.1A. Семь слоев, нанесенных на субстрат 5, могут включать проводящий слой 50, который может также называться электродным слоем 50, изолирующий слой 16, два накладывающихся слоя реагента 22a и 22b, адгезивный слой 60, гидрофильный слой 70 и верхний слой 80.

В тест-полоске 100, как показано на фиг.1A-1C, проводящий слой 50 может включать в себя контрольный электрод 10, первый рабочий электрод 12, второй рабочий электрод 14, первую контактную площадку 13, вторую контактную площадку 15, контрольную контактную площадку 11, дорожку первого рабочего электрода 8, дорожку второго рабочего электрода 9, дорожку контрольного электрода 7 и детекторную полоску 17. Проводящий слой может быть образован из углеродных чернил. Первая контактная площадка 13, вторая контактная площадка 15 и контрольная контактная площадка 11 могут быть выполнены с возможностью электрического соединения с измерительным прибором. Дорожка первого рабочего электрода 8 обеспечивает электрически непрерывный путь от первого рабочего электрода 12 до первой контактной площадки 13. Аналогичным образом, дорожка второго рабочего электрода 9 обеспечивает электрически непрерывный путь от второго рабочего электрода 14 до второй контактной площадки 15. Аналогичным образом, дорожка контрольного электрода 7 обеспечивает электрически непрерывный путь от контрольного электрода 10 до контрольной контактной площадки 11. Детекторная полоска 17 имеет электрическое соединение с контрольной контактной площадкой 11. Глюкометр в состоянии определять правильность установки тест-полоски 100, измеряя неразрывность цепи между контрольной контактной площадкой 11 и детекторной полоской 17, как показано на фиг.1A-1C.

Слой ферментных чернил может быть нанесен на часть проводящего слоя 50, субстрат 5 и изолирующий слой 16, как показано на фиг.1A и 1B. В одном варианте осуществления на проводящий слой 50 трафаретной печатью можно нанести два последовательных слоя ферментных чернил 22a и 22b, как правило, также незначительно перекрывая изолирующий слой 16. Адгезивный слой 60 тест-полоски 100 может включать первую адгезивную прокладку 24, вторую адгезивную прокладку 26 и третью адгезивную прокладку 28, как показано на фиг.8A-8F и 9. Адгезивный слой 60 можно наносить на тест-полоску 100 после нанесения слоя реагента 22. Первая адгезивная прокладка 24 и вторая адгезивная прокладка 26 могут непосредственно примыкать к слою реагента 22, соприкасаться или частично перекрываться с ними. Адгезивный слой 60 может содержать самоклеящийся адгезив с акриловым сополимером на водной основе, который серийно производится фирмой Tape Specialties LTD, находящейся в г. Тринг, Хертфордшир, Великобритания (серийный номер A6435). Адгезивный слой 60 нанесен на часть изолирующего слоя 16, проводящего слоя 50 и субстрата 5. Адгезивный слой 60 соединяет гидрофильный слой 70 с тест-полоской 100.

Гидрофильный слой 70 может включать в себя дистальную гидрофильную часть 32 и проксимальную гидрофильную часть 34, как показано на фиг.8A и 8B. Гидрофильный слой 70 может состоять из полиэфирного материала, имеющего одну гидрофильную поверхность, например, из покрытия против запотевания, предлагаемого компанией 3M.

Последний слой, наносимый на тест-полоску 100, представляет собой наружный слой 80, показанный на фиг.1A и 1B. Верхний слой 80 может включать в себя прозрачную часть 36 и непрозрачную часть 38, как показано на фиг.1A и 1B. Наружный слой 80 нанесен и приклеен к гидрофильному слою 70. Наружный слой 80 может состоять из полиэфира с нанесенным на одну сторону клеевым покрытием. Необходимо отметить, что прозрачная часть 36 по существу перекрывает дистальную гидрофильную часть 32, благодаря чему пользователь может наглядно убедиться в надлежащем заполнении камеры для приема образца 92. Непрозрачная часть 38 позволяет пользователю видеть контраст между окрашенной жидкостью, например кровью, внутри камеры для приема образца 92 и непрозрачной частью 38.

Для подробного разъяснения сути настоящего изобретения приведены следующие неограничивающие примеры.

Пример 1

Для приготовления одного примера ферментных чернил настоящего изобретения использовали следующую процедуру. Раствор ПВС-пеногаситель-лимонная кислота готовили приливанием 0,5 мл пеногасителя DC 1500 (серийно выпускается BDH/Merek Ltd.) к 7500 грамм воды (ЧДА, серийно выпускается BDH/Merck Ltd.). Затем к раствору добавляли 90 грамм ПВС (Sigma-Aldrich, мол. вес 85 000-124 000, гидролизован на 87%-89%) и гомогенизировали при >7000 об/мин в течение 2 часов. После гомогенизации к раствору добавляли 81,5 грамма лимонной кислоты и перемешивали.

Раствор для корректировки рН готовили растворением 270 грамм тринатрий-цитрата в 1000 мл воды. Затем корректировали рН раствора ПВС-пеногаситель-лимонная кислота до рН 5, добавляя достаточное количество раствора тринатрий-цитрата.

Раствор с рН 5 фильтровали через сито 125 микрон и переносили в реактор из нержавеющей стали объемом 30 литров. В стальной реактор объемом 30 л добавляли воду, до тех пор пока общий вес раствора не достигал 9250 грамм. Затем в реактор из нержавеющей стали добавляли 44,5 мл пеногасителя DC 1500.

В смесителе Dispersmat устанавливали мешалку с диаметром лопасти 90 мм и монтировали в реакторе из нержавеющей стали, так чтобы лопасти мешалки находились в 2 см от дна реактора. Смеситель устанавливали на 800 об/мин, а затем в течение первых двух минут перемешивания добавляли 90 грамм сополимера поливинилпирролидон-винилацетат (сополимер ПВП/ВА S-630, производство компании ISP, имеет соотношение 60/40 и молекулярный вес от 24000 до 30000) и 449 грамм ГЭЦ (серийно выпускается под маркой Natrosol 250G). После этого скорость перемешивания увеличивали до 5500 об/мин, и перемешивание продолжали еще пять минут до получения раствора ГЭЦ.

После завершения перемешивания раствор ГЭЦ переносили в 15-литровую бочку и осторожно перемешивали (например, покачиванием) в течение 12-25 часов. Затем измеряли вязкость, чтобы удостовериться в том, что она находится в диапазоне от 13000 до 17000 сП (измеряемая при 25°C и 5 об/мин).

Раствор ГЭЦ после перемешивания уравновешивали при температуре от 7°C до 10°C. Далее 9000 грамм раствора ГЭЦ после перемешивания и уравновешивания смешивали с 446 граммами гидрофобного кремнезема Н15 и 209 г гидрофобного кремнезема Н30 (категории Wacker HDK, производства компании Wacker Chemie AG) в 30-литровом реакторе из нержавеющей стали, чтобы получить смесь ГЭЦ/кремнезем.

В смесителе Dispersmat устанавливали мешалку с диаметром лопасти 175 мм и монтировали в реакторе из нержавеющей стали, так чтобы лопасти мешалки находились у дна реактора. Объединенную смесь ГЭЦ/кремнезем перемешивали при 2600 об/мин в течение 16 минут. Затем измеряли плотность состава (с помощью пикнометра Cole-Parmer), так чтобы она находилась в диапазоне от приблизительно 0,9650 г/см³ до приблизительно 1,0150 г/см³.

После этого смесь ГЭЦ/кремнезем переносили в 15-литровую бочку и осторожно перемешивали покачиванием от 8 до 16 часов. Затем измеряли вязкость, чтобы удостовериться в том, что она находится в диапазоне от 37000 до 50000 сП (измеряемая при 25°C и 10 об/мин).

4515 грамм смеси ГЭЦ/кремнезем объединяли с 1386 граммами феррицианида калия, 1,6 г гексациоаноферрата (II) калия и 126 граммами глюкозооксидазы в 15-литровом реакторе из нержавеющей стали. В смесителе Dispersmat устанавливали мешалку с диаметром лопасти 125 мм и монтировали в реакторе из нержавеющей стали, так чтобы лопасти мешалки находились у дна реактора, и смесь перемешивали при 1500 об/мин в течение 15 минут. После перемешивания рН находился в диапазоне от приблизительно 4,8 до 5,4, а вязкость была в диапазоне от приблизительно 36 000 до 48 000 сП (измеряемая при 25°C и 10 об/мин).

Примеры 2-6

Для приготовления ферментных чернил использовали способ из примера 1, при этом содержание используемых пирогенных диоксидов кремния менялось в соответствии с данными, приведенными в таблице 1.

Таблица 1
Пример	% H30 Удельная поверхность Содержание углерода	% H15 Удельная поверхность Содержание углерода	Смесь Удельная поверхность Содержание углерода
2	0% 300 м2/г 2	100% 150 м2/г 1	--- 150 м2/г 1
3	100% 300 м2/г 2	0% 150 м2/г 1	--- 300 м2/г 2
4	20% 300 м2/г 2	80% 150 м2/г 1	--- 180 м2/г 1,2
5	50% 300 м2/г 2	50% 150 м2/г 1	--- 225 м2/г 1,5
6	80% 300 м2/г 2	20% 150 м2/г 1	--- 270 м2/г 1,8

Тест-полоски изготавливали с использованием ферментных чернил в соответствии со способом, описанным в приведенной выше спецификации. Калибровка полосок проводилась на основе случайной выборки из 1500 полосок. Кровь 12-ти различных доноров обрабатывали так, чтобы получить 6 различных значений уровня концентрации глюкозы (50, 100, 150, 200, 300 и 500 мг), и на 8 полосок наносили пробы крови одних и тех же доноров так, что для каждой тестируемой партии проводилось всего 576 тестов (12×6×8). Их сопоставляли с фактическими концентрациями глюкозы, измеряемыми с помощью стандартного лабораторного анализатора, Yellow Springs 2300 (YSI). Затем строили график зависимости концентрации глюкозы от фактической концентрации глюкозы (или измеренного тока от тока YSI), и по формуле y = mx+c проводили подгонку графика по методу наименьших квадратов, чтобы получить значение для наклона партии m и отсекаемого отрезка партии c. Кроме того, для каждого уровня концентрации глюкозы рассчитывали погрешность (уровень 50 мг) и процент погрешности (уровни 100-500 мг) наряду с Delta_150 для смеси чернил из каждого примера. Значения погрешности, процента погрешности и Delta_150 приведены ниже в таблице 2. График разброса погрешностей или процента погрешностей в зависимости от уровня концентрации глюкозы приведен на фиг.2.

Таблица 2
Пр.	Среднее значение погрешности (50 мг) % погрешности (100-500 мг)	Delta 150
50	100	150	200	300	500
2	-4,2	-6,1	-5,4	-4,7	-5,2	-9,4	-4,1
3	-7,3	-10,0	-7,2	-4,2	-1,9	0,6	7,7
4	-5,9	-8,8	-7,2	-6,6	-5,8	-8,7	-1,6
5	-6,2	-8,5	-6,5	-4,9	-3,9	-4,4	2,1
6	-6,4	-8,6	-5,6	-3,4	-0,8	0,5	6,2

Результаты показывают, что ферментные чернила с более высоким уровнем пирогенного диоксида кремния H30 давали более высокие значения концентрации глюкозы при 500 мг/дл с небольшой погрешностью. Чернила с малым или нулевым содержанием Н30 демонстрировали более низкие значения концентрации глюкозы при 500 мг/дл. График зависимости Delta_150 от нормальной эффективной площади пирогенного диоксида кремния для приготовленной смеси H30-H15 и конечная регрессия приведены на фиг.3.

Отображена высокая корреляция между Delta_150 и удельной поверхностью. График зависимости Delta_150 от процента содержания углерода в пирогенном диоксиде кремния каждого сорта (H30 и H15), принимая во внимание, что используемые сорта содержат номинальное для данного сорта количество углерода, и конечная регрессия приведены на фиг.4. Одинаково высокие значения R-квадрата на уровне 99,6% свидетельствуют о четкой корреляции между Delta_150 и содержанием углерода.

1. Композиция ферментных чернил, содержащая фермент, способный избирательно распознавать глюкозу в пробе крови, медиатор и первый и второй пирогенный диоксид кремния, в которой первый пирогенный диоксид кремния имеет удельную поверхность по БЭТ в диапазоне от приблизительно 130 до 170 м²/г и содержание углерода от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,23% вес., а второй пирогенный диоксид кремния имеет удельную поверхность по БЭТ в диапазоне от приблизительно 270 до 330 м²/г и содержание углерода от приблизительно 1,4 до приблизительно 2,6% вес.

2. Ферментные чернила по п.1, в которых первый пирогенный диоксид кремния присутствует в количестве от приблизительно 99 до приблизительно 1% вес. общего количества пирогенных диоксидов кремния, а второй пирогенный диоксид кремния присутствует в количестве от приблизительно 1 до приблизительно 99% вес.

3. Ферментные чернила по п.2, в которых первый пирогенный диоксид кремния присутствует в количестве от приблизительно 75 до приблизительно 45% вес. общего количества пирогенных диоксидов кремния, а второй пирогенный диоксид кремния присутствует в количестве от приблизительно 25 до приблизительно 55% вес.

4. Ферментные чернила по п.1, в которых фермент выбран из группы, состоящей из глюкозооксидазы, глюкозодегидрогеназы, глюкозодегидрогеназы с пирролохинолоновым кофактором и глюкозодегидрогеназы с флавинадениндинуклеотидным кофактором, а медиатор выбран из группы, состоящей из феррицианида и трихлорида гексааминрутения.

5. Ферментные чернила по п.1, в которых ферментом является глюкозооксидаза, а медиатор представляет собой феррицианид.

6. Ферментные чернила, содержащие приблизительно 0,3% вес. пеногасящего соединения, приблизительно 0,6% вес. поливинилового спирта, приблизительно 0,6% вес. лимонной кислоты, приблизительно 1,9% вес. тринатрий-цитрата, приблизительно 0,6% вес. сополимера поливинилпирролидон-винилацетат, приблизительно 3,27% вес. гидроксиэтилцеллюлозы, приблизительно 3,6% вес. первого пирогенного диоксида кремния с удельной поверхностью по БЭТ от приблизительно 130 до 170 м²/г и содержанием углерода от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,23% вес., приблизительно 1,3% вес. второго пирогенного диоксида кремния с удельной поверхностью по БЭТ от приблизительно 270 до 330 м²/г и содержанием углерода от приблизительно 1,4 до приблизительно 2,6% вес., приблизительно 0,03% вес. гексацианоферрата (II) калия, приблизительно 23% вес. феррицианида калия; приблизительно 2,1% вес. глюкозооксидазы и приблизительно 62,4% вес. воды.

7. Тест-полоска, содержащая по меньшей мере два копланарных электрода, причем по меньшей мере один электрод содержит композицию ферментных чернил, содержащую фермент, способный избирательно распознавать глюкозу в пробе крови, медиатор и первый и второй пирогенный диоксид кремния, в которой первый пирогенный диоксид кремния имеет удельную поверхность по БЭТ в диапазоне от приблизительно 130 до 170 м²/г и содержание углерода от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,23% вес., а второй пирогенный диоксид кремния имеет удельную поверхность по БЭТ в диапазоне от приблизительно 270 до 330 м²/г и содержание углерода от приблизительно 1,4 до приблизительно 2,6% вес.

8. Тест-полоска по п.7, в которой первый пирогенный диоксид кремния присутствует в количестве от приблизительно 99 до приблизительно 1% вес. общего количества пирогенных диоксидов кремния, а второй пирогенный диоксид кремния присутствует в количестве от приблизительно 1 до приблизительно 99% вес.

9. Тест-полоска по п.7, в которой первый пирогенный диоксид кремния присутствует в количестве от приблизительно 75 до приблизительно 45% вес. общего количества пирогенных диоксидов кремния, а второй пирогенный диоксид кремния присутствует в количестве от приблизительно 25 до приблизительно 55% вес.

10. Тест-полоска по п.7, в которой фермент выбран из группы, состоящей из глюкозооксидазы, глюкозодегидрогеназы, глюкозодегидрогеназы с пирролохинолоновым кофактором и глюкозодегидрогеназы с флавинадениндинуклеотидным кофактором, а медиатор выбран из группы, состоящей из феррицианида и трихлорида гексааминрутения.

11. Тест-полоска по п.7, в которой ферментом является глюкозооксидаза, а медиатор представляет собой феррицианид.

12. Тест-полоска по п.7, в которой ферментные чернила содержат приблизительно 0,3% вес. пеногасящего соединения, приблизительно 0,6% вес. поливинилового спирта, приблизительно 0,6% вес. лимонной кислоты, приблизительно 1,9% вес. тринатрий-цитрата, приблизительно 0,6% вес. сополимера поливинилпирролидон-винилацетат, приблизительно 3,27% вес. гидроксиэтилцеллюлозы, приблизительно 3,6% вес. первого пирогенного диоксида кремния с удельной поверхностью по БЭТ от приблизительно 130 до 170 м²/г и содержанием углерода от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,23% вес., приблизительно 1,3% вес. второго пирогенного диоксида кремния с удельной поверхностью по БЭТ от приблизительно 270 до 330 м²/г и содержанием углерода от приблизительно 1,4 до приблизительно 2,6% вес., приблизительно 0,03% вес. гексацианоферрата (II) калия, приблизительно 23% вес. феррицианида калия; приблизительно 2,1% вес. глюкозооксидазы и приблизительно 62,4% вес. воды.