Средство для восстановления барабанной перепонки или наружного слухового прохода

Группа изобретений относится к медицине и касается восстановления барабанной перепонки или наружного слухового прохода. Для этого предложено средство, включающее комбинацию желатиновой губки, основного фактора роста фибробластов и фибринового клея, а также применение этих компонентов для производства средства. Способ включает размещение желатиновой губки, содержащей терапевтически эффективное количество основного фактора роста фибробластов, в области перфорации барабанной перепонки или дефектной части мягкой ткани наружного слухового прохода и покрытие губки фибриновым клеем. Изобретения обеспечивают эффективное закрытие дефекта и восстановление тканей, в т.ч. и в тех случаях, когда обычные методы неприменимы. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 2 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к средству для восстановления барабанной перепонки или наружного слухового прохода, включающему комбинацию желатиновой губки, которая несет основной фактор роста фибробластов (bFGF), и покровного материала.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Перфорация барабанной перепонки является симптомом, который является причиной таких дефектов, как разрывы и прободения барабанной перепонки; существуют различные причины ее возникновения, и в случаях макроскопической степени сухости полости среднего уха без активного воспаления желательным, по-видимому, является закрытие перфорации как можно раньше. Наибольшим выигрышем от закрытия перфорации барабанной перепонки является увеличение способности слышать. При условии отсутствия нарушений во внутреннем ухе, при этом в среднем ухе не присутствуют особые патологические изменения, улучшение способности слышать обычно достигается во всех случаях после закрытия перфорации барабанной перепонки, что вносит значительный вклад в увеличение качества жизни пациента.

При наличии перфорации в барабанной перепонке не только барабанная перепонка не способна к улавливанию достаточного звука, но также способности слышать (слышать слова), кроме того, мешает компенсирующий эффект, при котором звук, который напрямую вошел в полость среднего уха, идет через окно улитки в улитку и накладывается на звук, который вошел в улитку нормальным путем. Кроме того, среднее ухо выходит напрямую в сторону наружного слухового прохода, что, в свою очередь, приводит к ослаблению устойчивости к инфекциям и, по-видимому, является причиной воспаления среднего уха. Длительное инфекционное состояние является причиной нейросенсорной тугоухости и нарушения функционирования лабиринта вследствие гипофункции внутреннего уха. По этим причинам предпочтительным является как можно лучшее закрытие перфорации барабанной перепонки.

Для закрытия перфорации барабанной перепонки проводится множество видов лечения в соответствии с размером перфорации, и, в сущности, большинство имеющихся в настоящее время видов лечения основано на хирургическом вмешательстве. Как правило, выполняют мирингопластику и тимпанопластику. При мирингопластике неотъемлемыми являются кожный разрез непосредственно за ушной раковиной и получение/трансплантация аутологичной ткани; при тимпанопластике, помимо этих процедур, неотъемлемой является очистка наружного слухового прохода. По мере увеличения размера перфорации барабанной перепонки становится более трудным выполнение хирургического способа трансплантации аутологичной ткани (височной фасции) в качестве заместителя барабанной перепонки. Отсюда, даже после проведения хирургического вмешательства способность слышать не всегда улучшается. Может возникать множество осложнений, таких как послеоперационная реперфорация барабанной перепонки, чувство чужеродности вокруг ушной раковины и шум в ушах. Кроме того, после операции барабанная перепонка становится далеко не интактной барабанной перепонкой из-за превращения процесса в латентный, гипертрофии и т.п., и способность слышать снижается. Эти операции обычно сопровождаются госпитализацией на период, составляющий от приблизительно одного дня до нескольких недель, обнажая такие недостатки, как увеличение психических, физических и экономических нагрузок на пациента.

Также, при дефектах мягкой ткани наружного слухового прохода, сопровождающихся экспонированием костной части, хирургическое лечение было единственным общепринятым лечением; непреложными были такие процедуры лечения, как внешний разрез непосредственно за ушной раковиной и получение аутологичной ткани.

Недавно были предложены ориентированные на регенеративную медицину способы восстановления барабанной перепонки, в которых используется биосовместимый каркасный материал, несущий фактор роста (см., например, патентный документ 1). В частности, опубликовано несколько случаев лечения, в которых используется основной фактор роста фибробластов (bFGF) в качестве фактора роста, а в качестве каркасного материала используется пластинчатая тонкая пленка, такая как коллагеновая пленка или хитиновая пленка (непатентные документы 1-3). Также описан формованный продукт для восстановления наружного слухового прохода, изготовленный из цилиндрического элемента из содержащего bFGF коллагена (патентный документ 2).

В качестве другого способа восстановления барабанной перепонки, который не основывается на хирургических вмешательствах, был опубликован способ, в котором перфорированную часть барабанной перепонки покрывают амниотической оболочкой и связывают с помощью фибринового клея (непатентный документ 2).

Однако эффективность общепринятых, ориентированных на регенеративную медицину видов лечения приурочена к относительно небольшим перфорациям в барабанной перепонке и дефектам наружного слухового прохода; эти виды лечения не применимы к дефектам барабанной перепонки, превышающим определенный размер, и дефектам, в которые вовлечены слуховые косточки, из-за неспособности к восстановлению.

Между тем, желатиновые губки используются в качестве хирургического кровоостанавливающего средства, а также используются в качестве носителя для замедленного высвобождения лекарственных средств при лечении ушных болезней (патентный документ 3).

Документы известного уровня техники

Патентные документы

Патентный документ 1: описание международной заявки на патент № 2006/007417

Патентный документ 2: JP-A-2007-125252

Патентный документ 3: описание заявки на патент США, № публикации - 2007/0160648

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Hakuba et al., Journal of Otolaryngology of Japan, Vol. 110, No. 4, p. 261, 2007.

Непатентный документ 2: Hakuba et al., Head and Neck Surgery, Vol. 16, No. 1, p. 9-13, 2006.

Непатентный документ 3: Futai et al., Journal of Otolaryngology of Japan, Vol. 110, No. 4, p. 299, 2007.

Краткое изложение сущности настоящего изобретения

Задачи, решаемые настоящим изобретением

Существует большая необходимость в разработке способа восстановления барабанной перепонки и наружного слухового прохода, основанного на методе регенеративной медицины, который делает возможным устранение даже больших перфораций барабанной перепонки и дефектов мягкой ткани наружного слухового прохода, при которых по традиции лечение было неизбежно основано на хирургических вмешательствах. Соответственно, задачей настоящего изобретения является предоставление нового средства для восстановления барабанной перепонки/наружного слухового прохода, способного к устранению дефектов независимо от положения дефектной части.

Способ решения задач

Автор настоящего изобретения провел обширные исследования для выполнения вышеописанной задачи и обратил внимание на то обстоятельство, что все общепринятые методы предназначены для устранения дефектных частей посредством предоставления возможности окружающей ткани распространяться вдоль основы пластинчатого каркасного материала, соединенной с перфорацией барабанной перепонки или дефектом мягкой ткани наружного слухового прохода. Поскольку преследуемой целью является регенерация, в основном, ткани мембраны, идея использования пластинчатого материала в качестве каркаса, по-видимому, является несомненно обоснованной. Однако восстановление было бы возможным при условии, что перфорация барабанной перепонки или дефект мягкой ткани наружного слухового прохода локализован(а) только в плоской части; однако барабанная перепонка является сложной по форме, и к ней прилегают слуховые косточки, вследствие чего по мере увеличения размера дефекта барабанной перепонки все в большей мере трудно покрыть всю поверхность плоским пластинчатым материалом. Неспособность к полному покрытию дефектной части сделала бы восстановление барабанной перепонки невозможным или могла бы привести к сращению с окружающей тканью, приводя к осложнениям. Это же касается мягкой ткани наружного слухового прохода.

По вышеприведенным причинам автор настоящего изобретения внес изменения в общепринятую идею использования пластинчатого материала и внедрил желатиновую губку в качестве каркасного материала, фокусируясь на использовании материала, который позволяет стерильно покрыть всю дефектную часть. А именно, желатиновую губку, пропитанную раствором bFGF, размещали так, что губка закрывала дефектную часть барабанной перепонки или наружного слухового прохода. Поскольку желатиновая губка является полученным при расщеплении коллагена материалом, имеющим большее число разрывов и большую степень свободы, чем коллаген, она характеризуется тем, что во время функционирования в качестве каркаса для роста клеток она не вносит помехи в направление распространения клеток. Соответственно, желатиновая губка имеет своей целью предоставление возможности регенерирующейся ткани входить в желатиновую губку и распространяться, а не предоставление возможности регенерирующейся ткани распространяться вдоль основы общепринятого пластинчатого материала.

Кроме того, при этой операции на поверхность губки наносили фибриновый клей или альгиновую кислоту или ее соль, и губку использовали в качестве покрытия и фиксировали над дефектной частью. Хотя известен метод, в котором основный материал для регенерации ткани фиксируют к окружающей ткани, используя биоадгезивный материал, автор настоящего изобретения покрыл поверхность губки покровным материалом не только в качестве адгезивного агента, но и с целью изоляции регенерирующей части от наружной стороны для создания среды, подходящей для in vivo культивирования. В том же разрезе, когда край перфораций барабанной перепонки и дефектов мягкой ткани наружного слухового прохода был старым, его освежали, используя хирургический нож или средство для денатурации белков и т.п.

В результате, даже при перфорациях барабанной перепонки с дефектом, в который было вовлечено более 2/3 перепонки, и при дефектах мягкой ткани наружного слухового прохода, превышающих 2 см в диаметре раны, при которых не применимы общепринятые способы, отмечали во всех случаях закрытие дефекта и улучшение способности слышать, при этом осложнений не наблюдали.

Из вышесказанного автор настоящего изобретения подтвердил, что посредством использования комбинации bFGF-несущей желатиновой губки и покровного материала можно недорого, удобно и безопасно восстановить барабанную перепонку и наружный слуховой проход даже у пациентов с серьезной перфорацией барабанной перепонки или серьезным дефектом мягкой ткани наружного слухового прохода, при которых обычно лечение было неизбежно основано на хирургических вмешательствах, и разработал настоящее изобретение.

Соответственно, описываемым ниже изобретением является:

[1] Средство для восстановления барабанной перепонки или наружного слухового прохода, включающее комбинацию желатиновой губки, которая несет основной фактор роста фибробластов, и покровного материала.

[2] Средство, описанное в [1], в котором покровным материалом является фибриновый клей или водорастворимый полимерный полисахарид или его производное.

[3] Средство, описанное в [2], в котором водорастворимым полимерным полисахаридом является хитин, хитозан или альгиновая кислота или ее соль.

[4] Средство, описанное в любом из [1]-[3], для восстановления после освежения края перфорации барабанной перепонки или дефекта мягкой ткани наружного слухового прохода.

[5] Способ восстановления барабанной перепонки или наружного слухового прохода, включающий размещение желатиновой губки, которая несет терапевтически эффективное количество основного фактора роста фибробластов, в перфорации барабанной перепонки или дефектной части мягкой ткани наружного слухового прохода у пациента с перфорацией барабанной перепонки или дефектом мягкой ткани наружного слухового прохода и покрытие губки покровным материалом.

[6] Способ восстановления, описанный в [5], в котором покровным материалом является фибриновый клей или водорастворимый полимерный полисахарид или его производное.

[7] Способ восстановления, описанный в [6], в котором водорастворимым полимерным полисахаридом является хитин, хитозан или альгиновая кислота или ее соль.

[8] Способ восстановления, описанный в любом из [5]-[7], в котором заранее освежают край перфорации барабанной перепонки или дефекта мягкой ткани наружного слухового прохода.

[9] Применение покровного материала и основного фактора роста фибробластов, который несет желатиновая губка, для производства средства для восстановления барабанной перепонки или наружного слухового прохода.

[10] Применение, описанное в [9], в котором покровным материалом является фибриновый клей или водорастворимый полимерный полисахарид или его производное.

[11] Применение, описанное в [10], в котором водорастворимым полимерным полисахаридом является хитин, хитозан или альгиновая кислота или ее соль.

[12] Применение, описанное в любом из [9]-[11], после освежения края перфорации барабанной перепонки или дефекта мягкой ткани наружного слухового прохода.

Эффект настоящего изобретения

Посредством использования желатиновой губки в качестве каркасного материала можно стерильно покрыть всю дефектную часть барабанной перепонки или наружного слухового прохода с достижением полного закрытия дефектной части. Кроме того, при развитии в желатиновой губке ткань барабанной перепонки саморегенерируется. Поэтому в соответствии с настоящим изобретением восстановление барабанной перепонки или наружного слухового прохода возможно даже в случаях серьезных или сложных дефектов.

Покрытие поверхности желатиновой губки покровным материалом предупреждает высыхание и инфицирование, делая возможным создание хорошей среды для культивирования, отделенной с внешней стороны.

Кроме того, желатиновая губка подвергается гидролизу и исчезает in vivo в пределах 1 месяца, что действует в пользу восстановления барабанной перепонки или мягкой ткани наружного слухового прохода.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 - изображение, демонстрирующее в качестве примера лечение для восстановления барабанной перепонки, используя средство для восстановления барабанной перепонки по настоящему изобретению. А. Отмечена большая перфорация, в которую вовлечено приблизительно 2/3 барабанной перепонки. B. Край перфорации барабанной перепонки повреждают, используя нож для разреза барабанной перепонки, для создания вокруг свежей раны. С. Желатиновую губку, несущую bFGF, размещают в перфорированной части и фиксируют с помощью фибринового клея. D. Спустя 3 недели после лечения перфорация барабанной перепонки полностью закрыта эпителиальным слоем. Е. Спустя 6 недель после лечения эпителий слегка истончается, становясь более похожим на барабанную перепонку. F. Спустя 12 недель после лечения эпителий еще больше становится похожим на нормальную барабанную перепонку.

Фиг.2 - изображение, демонстрирующее в качестве примера лечение для восстановления наружного слухового прохода, используя средство для восстановления наружного слухового прохода по настоящему изобретению. А. В ране от удаленной из нее холестеатомы отмечены дефект мягкой ткани и экспонирование костной части. В. Массу желатиновой губки пропитывают bFGF, и массу желатиновой губки, несущей bFGF, размещают так, чтобы рана была полностью закрыта. С. Массу губки фиксируют с помощью альгиновой кислоты или ее соли (или фибринового клея). D. Спустя 2 недели после лечения удаляют остающуюся на поверхности альгиновую кислоту или ее соль и т.п.; убеждаются, что рана полностью закрыта, и что достигнуто восстановление почти до состояния, одинакового с таковым нормальной ткани.

ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Фактор роста bFGF, используемый в средстве для восстановления барабанной перепонки/наружного слухового прохода по настоящему изобретению, оказывает непосредственное действие на пролиферацию клеток и обладает способностью к неоваскуляризации. Барабанная перепонка имеет трехслойную структуру; для обеспечения максимально полного проявления весьма важной функции проведения звука важным является сохранение этой трехслойной структуры. Однако часто встречаются случаи разрыва барабанной перепонки и его самостоятельного лечения, в которых барабанная перепонка является тонкой с восстановленным лишь эпителиальным слоем, в то время как трехслойная структура не сохраняется.

Для ее восстановления совершенно необходимы пролиферация фибробластов в качестве каркаса и сохранение кровотока, достаточные для поддержания трехслойной структуры. В этом разрезе, bFGF обладает идеальными свойствами. А именно, как указывает его название, bFGF оказывает непосредственное стимулирующее действие на пролиферацию фибробластов, а также оказывает индуцирующее действие на развитие кровеносных сосудов и поставку питательных веществ окружающей ткани.

В качестве bFGF в настоящем изобретении может использоваться его гомолог. В настоящем изобретении bFGF и/или его гомолог получают в виде природного продукта или путем выделения и очистки, используя микроорганизм или культивируемые клетки, полученные с использованием технологии рекомбинации генов, или путем его химической модификации или биологической модификации. В качестве bFGF, используемого в настоящем изобретения, особенно предпочтительным является bFGF человека или его гомолог.

Под гомологом bFGF подразумевается полипептид [I] или [II], описываемый ниже.

[I] Полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, по существу одинаковой с таковой bFGF, продуцируемого у млекопитающего. Здесь под «по существу одинаковой аминокислотной последовательностью» подразумевается аминокислотная последовательность, которая имеет 1-6 аминокислот, замещенных другими видами аминокислот, и которая обладает биологической активностью bFGF.

[II] Полипептид, в котором дополнительный аминокислотный сегмент добавлен к N-концу и/или С-концу bFGF, продуцируемого у млекопитающего, или к N-концу и/или С-концу описанного выше полипептида [I]. Под дополнительным аминокислотным сегментом подразумевается сегмент, который состоит из 1-12 аминокислот и который не оказывает влияние на биологическую активность bFGF или биологическую активность описанного выше полипептида [I].

bFGF человека является полипептидом из 146 аминокислот; при осуществлении настоящего изобретения в качестве гомолога bFGF человека (вышеотмеченного гомолога [I])), например, может использоваться полипептид из 146 аминокислот, описанный в публикации при рассмотрении на национальной фазе международной заявки на патент № JP-2-504468. Этот полипептид является полипептидом, в котором каждый из цистеина (Cys) в положении 69 и цистеина (Cys) в положении 87, входящий в состав аминокислотной последовательности bFGF человека, заменен серином (Ser).

В качестве вышеотмеченного гомолога [II], например, может использоваться полипептид из 155 аминокислот, описанный в публикации при рассмотрении на национальной фазе международной заявки на патент № JP-63-500843. Этот полипептид является полипептидом, в котором сегмент из 9 аминокислот добавлен к N-концу bFGF человека.

Также может использоваться полипептид из 147 аминокислот с добавлением Met к N-концу и полипептид из 157 аминокислот с состоящим из 11 аминокислот сегментом, добавленным к N-концу, описанные в публикации при рассмотрении на национальной фазе международной заявки на патент № JP-63-501953.

Особенно предпочтительным bFGF является трафермин (полученный с помощью генетической рекомбинации).

При осуществлении настоящего изобретения может использоваться лишь один вид bFGF, или может использоваться множество видов в комбинации. Кроме того, как отмечено выше, существует множество гомологов bFGF, и эти гомологи могут использоваться сами по себе или использоваться в комбинации.

Поскольку относительное содержание bFGF в живом организме является крайне низким, особенно предпочтительным для обеспечения препарата по настоящему изобретению в больших количествах и устойчивым образом является использование bFGF или его гомолога, продуцируемого, используя микроорганизм, такой как Escherichia coli, или культивируемые клетки, полученные методом рекомбинации генов. Когда ген для продукции bFGF или его гомолога (в этом случае обычно вышеупомянутый полипептид (I)) включен в микроорганизм или культивируемые клетки, продуктом этого микроорганизма или культивируемых клеток обычно является продукт с дополнительным аминокислотным сегментом, добавленным к N-концу и/или С-концу bFGF или N-концу и/или С-концу полипептида [I], указанного выше, т.е. вышеупомянутый полипептид [II].

Вариант желатина, который служит в качестве исходного вещества для желатиновой губки в настоящем изобретении, особенно не ограничивается; может использоваться любой имеющийся в продаже вариант. Например, можно упомянуть неочищенный коллаген, полученный посредством обработки кости, связки, сухожилия или кожи быка, свиньи, цыпленка, лосося и т.п. кислотой или щелочью, экстрагированный водой при термической обработке и т.п. В соответствующих смесях может использоваться не только один вариант желатина, но также желатины с различными веществами и различными физическими свойствами, такими как растворимость, молекулярная масса и изоэлектрическая точка.

Используемая в настоящем изобретении желатиновая губка может быть сшита для увеличения ее водоустойчивости для того, чтобы позволить ей служить в качестве каркаса для регенерации ткани в течение периода времени, достаточного для закрытия дефекта барабанной перепонки или наружного слухового прохода, при условии, что она не теряет мягкости, что делает возможным полное покрытие морфологически сложного края перфорации барабанной перепонки и края дефекта наружного слухового прохода. Способ сшивания особенно не ограничен; примеры включают способ, включающий использование сшивающего агента, вакуумной термической дегидратации, сухого жара, облучения γ-лучами, облучения ультрафиолетовыми лучами, облучения электронными лучами, облучения рентгеновскими лучами и т.п.

Желатиновая губка по настоящему изобретению имеет большое число мелких пор и обеспечивает большую степень свободы, чем коллаген. Благодаря наличию большого числа мелких пор желатиновая губка, при использовании в качестве каркасного материала, позволяет окружающим клеткам легко входить в губку, что делает возможным отвечающее цели восстановление барабанной перепонки и наружного слухового прохода. Это является явным отличием от общепринятых средств для восстановления, приготовленных, используя пластинчатый каркасный материал. А именно, в случае каркасов, подобных пластинчатой коллагеновой пленке, ткань саморегенерируется не при продвижении в каркас, а в действительности саморегенерируется либо вверх, либо вниз. Это делает невозможным полное покрытие дефектной части дефекта барабанной перепонки, превышающей определенный размер, вследствие чего восстановление барабанной перепонки невозможно, или возникает сращение с окружающей тканью, и возникают осложнения.

Принимая во внимание то обстоятельство, что клетки легко входят в губку, для обеспечения хорошей адгезии клеток предпочтительно, чтобы средний диаметр мелких пор желатиновой губки по настоящему изобретению составлял приблизительно 10 мкм или больше, а для предотвращения снижения скорости восстановления барабанной перепонки или наружного слухового прохода вследствие низкой плотности клеток предпочтительно, чтобы средний диаметр составлял приблизительно 500 мкм или меньше. Более предпочтительный диапазон составляет от приблизительно 100 до приблизительно 400 мкм.

Желатиновая губка по настоящему изобретению может содержать другие биорассасывающиеся полимерные материалы при условии, что не оказывается вредное влияние на ее функционирование. Такие биорассасывающиеся полимерные материалы включают, например, синтетические полимеры, такие как полимолочная кислота, полигликолевая кислота, поли-ε-капролактон, сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты, сополимер гликолевая кислота-ε-капролактон, сополимер молочная кислота-ε-капролактон, полилимонная кислота, полияблочная кислота, поли-α-цианоакрилат, поли-β-спиртокислота, политриметиленоксалат, политетраметиленоксалат, полиортоэфиры, полиортокарбонаты, полиэтиленкарбонат, поли-γ-бензил-L-глутамат, поли-γ-метил-L-глутамат и поли-L-аланин; природные полимеры, такие как полисахариды, такие как крахмал, альгиновая кислота, гиалуроновая кислота, хитин, пектиновая кислота и их производные, и белки, такие как желатин, коллаген, альбумин, фибрин и т.п.

Желатиновую губку по настоящему изобретению можно получить, например, посредством перемешивания и вспенивания водного раствора желатина, используя гомогенизатор, со скоростью вращения, составляющей от приблизительно 3000 до приблизительно 10000 оборотов/мин в течение от приблизительно 10 секунд до приблизительно 5 минут, затем заливки водного раствора желатина в форму соответствующего размера и заморозки при от приблизительно -40 до приблизительно -80°С в течение приблизительно 30-120 минут, впоследствии лиофилизации этого замороженного материала в условиях, например, приблизительно 0,1 торр. Если концентрация водного раствора желатина является слишком высокой, мягкость получаемой желатиновой губки уменьшается, вследствие чего предпочтительным является доведение концентрации, например, до приблизительно 3 вес.% или меньше. При необходимости дальнейшего сшивания можно соответствующим образом выполнить сшивание.

В качестве желатиновой губки по настоящему изобретению может использоваться имеющееся в продаже кровоостанавливающее средство (например, Spongel (зарегистрированный товарный знак) (Astellas Pharma), Gelfoam (зарегистрированный товарный знак) (Pharmacia & Upjohn) и т.п.).

Форма и размер желатиновой губки по настоящему изобретению особенно не ограничиваются при условии, что она является достаточно большой для покрытия дефектной части барабанной перепонки или наружного слухового прохода пациента.

Способ предоставления возможности приготовленной таким образом желатиновой губке нести bFGF особенно не ограничивается; например, водный раствор bFGF может быть добавлен капля по капле к желатиновой губке, или желатиновую губку можно сделать набухшей посредством добавления водного раствора bFGF.

Количество bFGF, которое несет желатиновая губка, особенно не ограничивается при условии, что оно представляет собой количество, достаточное для восстановления барабанной перепонки или наружного слухового прохода; оно, например, составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 1000 мкг; предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 100 мкг на каждое место применения.

Приготовленный таким образом препарат в виде несущей bFGF желатиновой губки может быть также подвергнут лиофилизации. При желании лиофилизацию проводят, например, посредством заморозки препарата в жидком азоте в течение 30 минут или дольше при -80°С в течение 1 часа или более или затем сушки препарата, используя лиофилизатор, в течение 1-3 дней.

Средство для восстановления барабанной перепонки/наружного слухового прохода применимо во всех случаях при условии, что перфорация барабанной перепонки или дефект мягкой ткани наружного слухового прохода у пациента не сопровождается инфекциями/воспалением в среднем ухе/наружном ухе. Например, случаи перфорации барабанной перепонки включают хроническое воспаление среднего уха, реперфорацию после хирургической операции для закрытия перфорации барабанной перепонки или тимпанопластики, перфорацию барабанной перепонки в результате давней травмы, перфорацию, остающуюся после разреза барабанной перепонки или вставки в барабанную перепонку трубки в случае воспаления среднего уха с выпотом, и т.п. Случаи примеров дефекта мягкой ткани наружного слухового прохода включают случаи с дефектом мягкой ткани наружного слухового прохода и экспонированием костной части наружного слухового прохода после резекции холестеатомы наружного слухового прохода, тимпанопластики или резекции опухоли наружного слухового прохода.

Предпочтительно средство для восстановления барабанной перепонки/наружного слухового прохода по настоящему изобретению особенно используют для пациентов с большой перфорацией барабанной перепонки или большим дефектом мягкой ткани наружного слухового прохода, в случае которых не предписаны виды лечения, используя общепринятый метод регенеративной медицины. В частности, восстановление барабанной перепонки возможно у пациентов с перфорацией барабанной перепонки, при которой дефектной являются 1/3, особенно более 2/3, барабанной перепонки. Восстановление наружного слухового прохода возможно у пациентов, имеющих дефект мягкой ткани наружного слухового прохода с максимальным диаметром, составляющим 1 см или более, особенно 2 см или более.

Размер несущей bFGF желатиновой губки устанавливают так, чтобы он превышал размер дефектной части барабанной перепонки или наружного слухового прохода, и губку размещают так, чтобы была покрыта вся дефектная часть. Здесь в случае старого края дефектной части желательным является освежение края для ускорения регенерации ткани. Способы освежения включают, например, способ, в котором эпителий края удаляют посредством повреждения края, используя хирургический нож или т.п., или посредством обработки лекарственным средством, оказывающим эффект денатурации белков, таким как ацетат алюминия, или высокими концентрациями местного анестетика.

Этот основанный на использовании лекарственного средства способ особенно эффективен в тех случаях, когда наружный слуховой проход столь узок по конфигурации, что освежение края перфорации барабанной перепонки является затруднительным; сначала в дефектной части размещают желатиновую губку, содержащую ацетат алюминия, и ее удаляют спустя приблизительно 30 минут. Впоследствии осуществляют анестезию с использованием 4% лидокаина гидрохлорида, после чего денатурированную ткань края (обесцвеченного до белого цата) удаляют в максимально возможной степени, посредством чего можно успешно выполнить освежение.

Дальнейший признак настоящего изобретения состоит в том, что поверхность несущей bFGF желатиновой губки, размещаемой в месте дефекта, покрывают покровным материалом. В качестве покровного материала, используемого в настоящем изобретении, может использоваться любой биосовместимый материал при условии, что он обладает адгезионной способностью, достаточной для удержания несущей bFGF желатиновой губки в фиксированном состоянии на дефектной части барабанной перепонки или наружного слухового прохода, и способен к обеспечению на поверхности и внутренней части губки среды, подходящей для культивирования клеток регенерирующейся ткани при отделении от внешней среды; примеры включают фибриновый клен (экстракты фибриногена и тромбина из крови; имеющиеся в продаже как Bolheal (зарегистрированный товарный знак) (Astellas Pharma), TISSEEL (зарегистрированный товарный знак) (Baxter) или Beriplast (зарегистрированный товарный знак) (CSL Behring), альгиновую кислоту или ее соль (например, кальция альгинат, натрия альгинат) и водорастворимые полимерные полисахариды, такие как хитин и хитозан.

В качестве способа приготовления соли альгиновой кислоты (кальция альгината) и придания ей формы, например, пленки, 3,3 мл 2% водного раствора натрия альгината равномерно распределяют так, чтобы все основание чашки Петри емкостью 10 мл приходило в контакт с этим водным раствором. Впоследствии 5 мл 3% водного раствора кальция хлорида равномерно распределяют по этой же чашке Петри для обеспечения приведения водного раствора натрия альгината и водного раствора кальция хлорида в достаточный контакт друг с другом, после чего ждут несколько минут. После удаления остающейся жидкости, чашку промывают дистиллированной водой и позволяют высохнуть самопроизвольно, посредством чего готовят пленку из кальция альгината. После высыхания пленку отделяют, формуют к определенному размеру и подвергают стерилизации с использованием газа этиленоксида, посредством чего можно приготовить соль альгиновой кислоты в качестве покровного материала.

Когда покровным материалом является жидкость, ее можно применять посредством литья нескольких ее капель на поверхность несущей bFGF желатиновой губки, размещаемой в дефектной части, или посредством ее распыления, используя, по сути, известный распылитель. Когда покровным материалом является пластинчатый материал, его можно разместить так, чтобы была покрыта поверхность несущей bFGF желатиновой губки, размещенной в дефектной части.

Настоящее изобретение ниже описывается конкретнее посредством следующих примеров, которые, однако, не ограничивают настоящее изобретение никоим образом.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Восстановление барабанной перепонки

1) Отбор пациентов

Субъекты исследования включали различных пациентов, которые, как было подтверждено, имеют перфорацию барабанной перепонки и не имеют активной инфекции или воспаления в среднем ухе/наружном ухе, в том числе случаи хронического воспаления среднего уха (n=9), случаи реперфорации после хирургического вмешательства для закрытия перфорации барабанной перепонки или тимпанопластики (n=7), случаи перфорации барабанной перепонки в результате давней травмы (n=5), случаи перфораций, остающихся после разреза барабанной перепонки или вставки в барабанную перепонку трубки в случае воспаления среднего уха с выпотом (n=10), и т.п. Размер перфорации барабанной перепонки не имел значения.

Пациенты были разделены на три группы в соответствии с размером перфорации барабанной перепонки. А именно, пациентов, имеющих перфорацию барабанной перепонки, в которую вовлечено менее 1/3, 1/3-2/3 или более 2/3 всей барабанной перепонки, оценивали в степени I, II и III, соответственно.

2) Способ лечения и последующее врачебное обследование

После подтверждения наличия перфорации барабанной перепонки и отсутствия активных инфекций и воспаления пропитанную 4% лидокаина гидрохлорида вату помещали в наружный слуховой проход так, что она приходила в контакт с перфорированной частью барабанной перепонки. Спустя 15 минут, под микроскопом, край перфорации барабанной перепонки повреждали, используя нож для разреза барабанной перепонки или т.п., и вокруг удаляли эпителий края перфорации (фиг.1В), Впоследствии массу желатиновой губки (Spongel (зарегистрированный товарный знак): Astellas), превышающую перфорацию барабанной перепонки, пропитывали bFGF (Fibroblast (зарегистрированный товарный знак): Kaken Pharmaceutical), и массу желатиновой губки, несущей bFGF, размещали так, что перфорированная часть барабанной перепонки была полностью закрыта (фиг.1С). После этого ее фиксировали с помощью нескольких капель фибринового клея (Beriplast (зарегистрированный товарный знак): CSL Behring).

После лечения пациентов инструктировали не делать ничего, что оказывает давление на их уши, например, сильное засасывание через нос и дутье через нос, и не позволять воде входить в их уши во время мятья волос и купания.

Обследование спустя 3 недели выявило крепкое сцепление покровного материала и остающуюся на поверхности желатиновую губку; после ее осторожного удаления, используя зонд (иглу) Розена и т.п., под ней была отмечена восстановленная барабанная перепонка (фиг.1D). В тех случаях, когда перфорация не была закрыта с помощью одного лечения, это же самое лечение повторяли.

В это время восстановленная барабанная перепонка наблюдалась в виде утолщенной, богатой сосудами ткани, но она утончалась с истечением периода времени (фиг.1Е) и становилась неотличимой от нормальной барабанной перепонки через приблизительно 2 месяца (фиг.1F).

3) Результаты

Этим способом регенеративное лечение барабанной перепонки было выполнено на 31 ухе 26 субъектов. Результаты представлены в таблице 1. Результаты суммированы по размеру перфораций (степени I-III) относительно числа видов лечения, требуемых для достижения закрытия, степени закрытия, степени улучшения способности слышать, времени лечения за исключением времени анестезии и наличия или отсутствия последствий. Результаты, полученные от пяти пациентов, в перфорированной части барабанной перепонки которых была размещена желатиновая губка, пропитанная только физиологическим солевым раствором без использования bFGF, представлены в таблице 2.

Таблица 1
Оценка по размеру перфорации барабанной перепонки	Степень I (n=3)	Степень II (n=15)	Степень III (n=13)
Число видов лечения (среднее значение)	1 (1,0)	1-3 (1,6)	1-4 (1,8)
Степень закрытия	100%	100%	100%
Степень улучшения способности слышать (способ с использованием 3-фракций)	15,8 децибел	23,3 децибел	28,5 децибел
Время лечения за исключением времени анестезии	8 минут 50 секунд	9 минут 20 секунд	11 минут 40 секунд
Последствия	Нет	Нет (преходящая оторея n=2, углубление стенки барабанной перепонки n=1)	Нет (преходящая оторея n=3, углубление стенки барабанной перепонки n=1)
Степень I перфорация менее 1/3	Степень II перфорация 1/3-2/3	Степень III перфорация более 2/3

Таблица 2
Оценка по размеру перфорации барабанной перепонки	Степень I (n=0)	Степень II (n=3)	Степень III (n=2)
Число видов лечения		4 раза	4 раза
Степень закрытия		0%	0%

Даже в случае желатиновой губки, пропитанной только физиологическим солевым раствором без использования bFGF, отмечалась слабая тенденция к закрытию перфорации барабанной перепонки. Это свидетельствует о том, что восстановление барабанной перепонки ускоряется даже при размещении одного каркаса; закрытие, по-видимому, возможно в случае очень маленьких перфораций барабанной перепонки; однако, когда перфорация барабанной перепонки была большой, она не могла быть закрыта, даже когда увеличивали число видов лечения.

Между тем, после добавления bFGF перфорация барабанной перепонки закрывалась во всех случаях, независимо от размера перфорации барабанной перепонки. Это свидетельствует о том, что при использовании одного каркаса клеточная регенерация подвержена ограничениям; полагают, что в случаях перфораций барабанной перепонки, которые превышают определенный размер, добавление фактора роста, такого как bFGF, по-видимому, необходимо и незаменимо. Что касается степени улучшения способности слышать, был восстановлен нормальный уровень независимо от размера перфорации барабанной перепонки; отмечалось восстановление барабанной перепонки с функциональной нормализацией.

Пример 2: Регенерация мягкой ткани наружного слухового прохода

1. Отбор пациентов

Субъекты исследования включали пациентов после резекции холестеатомы наружного слухового прохода (n=7), пациентов после тимпанопластики (n=2) и пациентов после резекции опухоли наружного слухового прохода (n=1), у всех из которых наблюдался дефект мягкой ткани наружного слухового прохода и экспонирование костной части наружного слухового прохода. Размер дефекта не имел значения.

2. Способ лечения и последующее врачебное обследование

После подтверждения отсутствия активных инфекций/воспаления в ране осуществляли местную анестезию. Под микроскопом иссекали холестеатому и опухоль изнутри наружного слухового прохода в случае пациентов с холестеатомой наружного слухового прохода или опухолью наружного слухового прохода, и создавали, используя хирургический нож или т.п., свежую рану в случае пациентов с экспонированием костной части наружного слухового прохода после тимпанопластики, после чего массу желатиновой губки, превышающую рану, пропитывали bFGF, и массу желатиновой губки, несущей bFGF, размещали так, что она полностью закрывала дефектную часть (фиг.2В). После этого ее покрывали несколькими каплями фибринового клея или пленкой из кальция альгината.

Пациентов инструктировали удерживаться от чистки своих ушей и не позволять воде входить в их наружные слуховые проходы во время купания, мятья волос и умывания.

Обследования спустя 2-3 недели выявило крепкое сцепление покровного материала и остающуюся на поверхности желатиновую губку; после ее осторожного удаления, используя зонд (иглу) Розена и т.п., под ней были отмечены полностью регенерированные эпителий и мягкая ткань наружного слухового прохода (фиг.2D). Если регенерация была недостаточной при одном лечении, это же самое лечение повторяли.

3. Результаты

Этим способом регенеративное лечение наружного слухового прохода было выполнено на 10 пациентах. Результаты представлены в таблице 3. Результаты суммированы по размеру дефекта (степени I-III) относительно числа видов лечения, требуемых для достижения закрытия, степени закрытия, времени лечения за исключением времени анестезии и наличия или отсутствия последствий.

Таблица 3
Оценка по размеру раны	Степень I (n=6)	Степень II (n=3)	Степень III (n=1)
Число видов лечения (среднее значение)	1-2 (1,3)	1-3 (2,0)	1 (1,0)
Степень закрытия	100%	100%	100%
Время лечения за исключением времени анестезии	7 минут 30 секунд	8 минут 40 секунд	15 минут 10 секунд
Последствия	Нет	Нет	Нет
Степень I максимальный диаметр раны <1,0 см	Степень II 1,0-2,0 см	Степень III >2,0 см

Промышленная применимость

В соответствии с настоящим изобретением, лечение перфораций барабанной перепонки и дефектов мягкой ткани наружного слухового прохода можно просто осуществлять амбулаторно в течение приблизительно 10 минут, что не сопровождается полным хирургическим лечением, вследствие чего отпадает необходимость в госпитализации и частых посещениях лечебницы. Поскольку восстановление барабанной перепонки/наружного слухового прохода возможно независимо от размера и причины дефекта, настоящее изобретение применимо к пациентам, которым не предписано лечение общепринятым методом регенеративной медицины. Кроме того, включенный хирургический метод является простым, многократное лечение не вызывает осложнений, и возможно восстановление полностью нормальной барабанной перепонки/наружного слухового прохода. Кроме того, сразу после лечения нормализуется способность слышать, не вызывающая торможения в ежедневной активности. Следовательно, уменьшаются психические, физические, гражданские и экономические нагрузки на пациента, так что настоящее изобретение является в высокой степени полезным с медико-экономической точки зрения.

Эта заявка основана на заявке на патент № 2008-167744, поданной в Японии (с датой подачи: 26 июня 2008), содержание которой в целом включено сюда.

1. Средство для восстановления барабанной перепонки или наружного слухового прохода, включающее комбинацию желатиновой губки, которая несет основной фактор роста фибробластов, и фибринового клея.

2. Средство по п.1 для восстановления после освежения края перфорации барабанной перепонки или дефекта мягкой ткани наружного слухового прохода.

3. Способ восстановления барабанной перепонки или наружного слухового прохода, включающий размещение желатиновой губки, которая несет терапевтически эффективное количество основного фактора роста фибробластов, в перфорации барабанной перепонки или дефектной части мягкой ткани наружного слухового прохода у пациента с перфорацией барабанной перепонки или дефектом мягкой ткани наружного слухового прохода и покрытие губки фибриновым клеем.

4. Способ восстановления по п.3, в котором заранее освежают край перфорации барабанной перепонки или дефекта мягкой ткани наружного слухового прохода.

5. Применение фибринового клея и основного фактора роста фибробластов, который несет желатиновая губка, для производства средства для восстановления барабанной перепонки или наружного слухового прохода.

6. Применение по п.5 после освежения края перфорации барабанной перепонки или дефекта мягкой ткани наружного слухового прохода.