Бициклические пиримидины или их фармацевтически приемлемые соли-активаторы антиоксидантной программы и их применение в качестве цитопротекторов

Изобретение относится к медицине, конкретно к неврологии, кардиологии, а также хирургии и травматологии, а именно лекарственным средствам, обладающим цитопротекторной активностью в условиях ишемии-реперфузии, хронического окислительного стресса и химической интоксикации. Применение соединения, представляющего собой производное бициклических пиримидинов в качестве активаторов транскрипционного фактора Nrf2. Соединения общей формулой (I) могут использоваться превентивно для повышения защитных сил организма перед работой с токсичными химикатами и высокими дозами радиации. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 7 табл., 11 пр., 9 ил.

 

Изобретение относится к медицине, конкретно к неврологии, кардиологии, а также хирургии и травматологии, а именно лекарственным средствам, обладающим цитопротекторной активностью в условиях ишемии-реперфузии, хронического окислительного стресса и химической интоксикации.

Инсульт - клинический синдром, характеризующийся внезапно возникшими клиническими симптомами, свидетельствующими об очаговом и/или общемозговом неврологическом дефиците, развивающемся в результате церебральной ишемии или геморрагии. Ежегодно в высокоразвитых странах среди каждых 10000 населения происходит 25-30 случаев инсульта. Экономические потери от инсульта в США составляют около 30 млрд. долл. в год. В России происходит свыше 400 тыс. инсультов, что по численности равно населению среднего областного города. Среди выживших у большинства наблюдаются различные функциональные нарушения: к концу острого периода почти у 80% больных имеются двигательные нарушения (чаще всего это парезы различной степени выраженности), более чем у трети больных - речевые нарушения.

По механизму развития выделяют три вида инсульта: ишемический (синонимы: инфаркт мозга, размягчение мозга), когда в результате закупорки мозгового сосуда или по другой причине развивается острый дефицит кровоснабжения (ишемия) определенного участка мозга; геморрагический (синонимы: кровоизлияние в мозг, внутримозговая гематома), когда вследствие разрыва мозгового сосуда в мозг изливается кровь, нарушая нормальное кровообращение мозговой ткани; субарахноидальное кровоизлияние - кровоизлияние в подпаутинное пространство мозга. На долю ишемических инсультов в среднем приходится 80% всех инсультов, на долю внутримозговых кровоизлияний - 17%, на долю субарахноидальных кровоизлияний - 3%.

Смертность при внутримозговых кровоизлияниях составляет до 52% в течение 30 дней после инсульта и в настоящее время не существует медикаментозной терапии или хирургии, которые бы уменьшили смертность. Комплекс лечебных мероприятий при инсульте условно делится на два блока: базисная терапия, направленная на поддержание всех жизненно важных функций организма, и нейропротекция в случае ишемического инсульта. Повреждение ткани происходит в первые минуты и часы после инсульта по быстрым механизмам некротической смерти клеток. Формирование ядерной зоны («сердцевины» инфаркта) завершается через 5-8 минут с момента острого нарушения мозгового кровообращения. Данная область мозга окружена потенциально жизнеспособной зоной «ишемической полутени» (пенумбра), в которой снижен уровень кровотока, однако, в целом сохранен энергетический метаболизм и присутствуют функциональные, но не структурные изменения. Формирование 50% от окончательного объема инфаркта происходит в течение первых 90 минут с момента развития инсульта, 70-80% - в течение 360 минут, в связи с чем первые 3-6 часов заболевания получили название «терапевтического окна», внутри которого лечебные мероприятия могут быть наиболее эффективными за счет спасения зоны пенумбры. В то же время окислительное повреждение (изменения метаболизма глутамата и кальция, свободнорадикальные реакции, перекисное окисление липидов, избыточное образование оксида азота и др.) продолжается и далее, приводя к "отдаленным последствиям ишемии». Отсроченное повреждение церебральной ткани реализуется через механизмы программированной клеточной смерти - апоптоза и апонекроза. «Отдаленные последствия ишемии» обусловливают «деформирование» инфаркта мозга за счет распространения повреждения от периинфарктной зоны к периферии пенумбры. Время «деформирования» инфарктных изменений в каждом случае индивидуально, составляя от 3 до 7 суток после нарушения мозгового кровообращения. Доказательства отсроченности необратимых повреждений мозга от момента острого нарушения мозгового кровообращения и появления первых симптомов заболевания укоренили отношение к инсульту как к неотложному состоянию, требующему быстрой и патогенетически обоснованной медицинской помощи, желательно в течение 3 ч с момента его развития. Экспериментальные исследования показали, что возвращение крови в ишемизированную зону через реваскуляризированный участок артерии не всегда приводит к полной нормализации локального мозгового кровотока. Чем длительнее дореперфузионный период, тем меньше шанс быстро нормализовать микроциркуляцию в ишемизированной зоне. Как ни парадоксально, но применение антиоксидантов при реперфузии позволяет значительно уменьшить зону повреждения, по-видимому, за счет подавления оксидантного механизма повреждения при реперфузии, обусловленного включением кислорода в процессы свободнорадикального окисления.

Основой специфической терапии при ишемическом инсульте являются два стратегических направления: реперфузия и нейропротекция, направленная на предохранение слабо или почти не функционирующих, однако все еще жизнеспособных нейронов, располагающихся вокруг очага инфаркта (зона "ишемической полутени"). Основными церебральными тромболитиками признаны урокиназа, стрептокиназа и их производные, а также тканевой активатор плазминогена (tPA). Последний применяется лишь в 4% случаев, в связи с возможной угрозой мозгового кровотечения. Нейропротекторными свойствами обладают: постсинаптические антагонисты глутаматных рецепторов (пока недоступные в клинической практике); пресинаптические ингибиторы глутамата (лубелузол); антиоксиданты (альфа-токоферол, карнозин, мексидол, милдронат, витамин Е, аскорбиновая кислота); блокаторы кальциевых каналов (нимодипин); препараты преимущественно нейротрофического действия (пирацетам, церебролизин, глицин, пикамилон) и другие.

Ишемическая болезнь сердца (ИБС), сердечная недостаточность и мозговой инсульт занимают в настоящее время лидирующее положение среди причин инвалидизации и смертности населения. Ожидается, что инфаркт миокарда к 2020 году станет первой причиной смертности [Lopez A.D., Murray С.С. / The global burden disease, 1990-2020 // NatMed. - 1998; - N4, - p.124-133].

От болезней сердца и сосудов умирают 57 процентов россиян. Такого показателя нет ни в одной развитой стране мира. Статистика по России выглядит пессимистично: из каждых 100 тысяч человек только от инфаркта миокарда мы ежегодно теряем 330 мужчин и 154 женщин, от инсультов - 204 мужчины и 151 женщину. Всего же от сердечно-сосудистых заболеваний каждый год умирает 1 миллион 300 тысяч человек в год - население крупного областного центра.

Корреляция между окислительным стрессом, воспалительным повреждением и ишемическим инсультом направляет интерес на изыскание новых препаратов, которые запускали бы генетически заложенную программу антиоксидантной защиты на клеточном уровне [DuY., ZhangX., JiH., LiuH., LiS., LiL. / Probucol and atorvastatinin combination protect rat brains in MCAO model: up regulating Peroxiredoxin 2,F oxo 3a and Nrf2 expression. // Neurosci. Lett. - 2012. - N509, - p.110-115].

Транскрипционный фактор "Nrf2" (NFE2L2, erythroid-derived 2-like 2) является главным регулятором антиоксидантого ответа на клеточном уровне. Nrf2 связывается с т.н. элементом антиоксидантного ответа (antioxidant response element, ARE) в промоторной области генов программы антиоксидантного ответа, отвечающей за детоксификацию ксенобиотиков и нейтрализацию активных форм кислорода (reactive oxygen species, ROS). В отсутствие стресса, приводящего к окислительной модификации активных тиолов в белках, Nrf2 входит в состав комплекса с убихитинлигазой, взаимодействие с которой опосредовано через димерный белок Keap1, имеющий в своем составе более 20 активных тиолов, легко подвергающихся алкилированию. Nrf2 убихитинируется и направляется таким образом на протеасомную деградацию. При ковалентной модификации наиболее активных тиолов Keap1-димера комплекс распадается, Nrf2 стабилизируется и направляется в ядро, где взаимодействует с ARE-содержащими промоторами и тем самым включает синтез белков антиоксидантой защиты. Полезные эффекты активации Nrf2 были продемонстрированы при различных патологиях, таких как диабет [Zheng Н., Whitman S.A., Wu W. et al. / Therapeutic potential of Nrf2 activators in streptozotocin-induced diabetic nephropathy // Diabetes. - 2011, -v.60, - N.11, - p.3055-3066], химическая интоксикация [Kwak M.K. and Kensler T.W. / Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention // Toxicology and Applied Pharmacology. - 2010, - v.244, - N.1, - p.66-76], кардиоваскулярные [Mann G.E., Bonacasa В., Ishii Т., and Siow R.C. / Targeting the redox sensitive Nrf2-Keap1 defense pathway in cardiovascular disease: protection afforded by dietary isoflavones // Current Opinion in Pharmacology. - 2009, - v.9, - N.2, - p.139-145] и неврологические заболевания [Zhang M., An С., Gao Y., Leak R.K., Chen J., and Zhang F. / Emerging roles of Nrf2 and phase II antioxidant enzymes in neuroprotection // Progress in Neurobiology. - 2013, - v.100, - N.1, - р.30-47]. Активация Nrf2 защищает при ишемии-реперфузии мозга [Wang В., Cao W., Biswal S., Dore S.. / Carbon monoxide-activated Nrf2 pathway leads to protection against permanent focal cerebral ischemia. // Stroke. - 2011, - N42, - p.2605-2610], глазного дна [Wei Y., Gong J., Yoshida Т., Eberhart C.G., Xu Z., Kombairaju P., et al. / Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury. // Free RadicBiol Med. - 2011, - N51, - p.216-224], сердца [Calvert J.W., Jha S., Gundewar S., Elrod J.W., Ramachandran A., Pattillo C.B., et al. / Hydrogen sulfide mediates cardioprotection through Nrf2 signaling. // Circ Res. - 2009, - N105, - p.365-374] и кишечника [Zhao H.D., Zhang F., Shen G., Li Y.B., Li Y.H., Jing H.R., et al. / Sulforaphane protects liver injury induced by intestinal ischemia reperfusion through Nrf2-ARE pathway. // World J. Gastroenterol. - 2010, - N16, - p.3002-3010].

Влияние активации Nrf2 на жизнеспособность донорных трансплантатов (стволовых клеток печени и сердца) было показано недавно [Shen X.D., Ke В., Ji Н. et al. / Disruption of type-I IFN pathway ameliorates preservation damage in mouse orthotopic liver transplantation via HO-1 dependent mechanism // The American Journal of Transplantation. - 2012, - v.12, - N.7, - p.1730-1739; Mohammadzadeh M., Halabian R., Gharehbaghian A. et al. / Nrf-2 overexpression in mesenchymal stem cells reduces oxidative stress-induced apoptosis and cytotoxicity // Cell Stress and Chaperones. - 2012, - v.17, - N.5, - p.553-565; Gorbunov N., Petrovski G., Gurusamy N., Ray D., Kim D. H., and Das D.K. / Regeneration of infarcted myocardium with resveratrol-modified cardiac stem cells // Journal of Cellular and Molecular Medicine. - 2012, - v.16, - N.1, - p.174-184]. Печень от старых доноров имеет более низкий уровень Nrf2, что ухудшает клинические показатели при пересадке печени [Zaman М.В., Leonard М.О., Ryan E.J., Nolan N.P., Hoti E., Maguire D., et al. / Lower expression of Nrf2 mRNA in older donor livers: a possible contributor to increased ischemia-reperfusion injury? // Transplantation. - 2007, - 84, - p.1272-1278].

Активация Nrf2, как выяснилось относительно недавно, антагонизирует воспалительные каскады, инициируемые TGF-β1 [Oh С.J., Kim J.Y., Min А.К. et al. / Sulforaphane attenuates hepatic fibrosis via NF-E2-related factor 2-mediated inhibition of transforming growth factor-β/Smad signaling. // Free Radical Biology and Medicine, - 2012, - v.52, - N.3, - p.671-682) and NF-кB (Jiang J., Mo Z. C, Yin K. et al. / Epigallocatechin-3-gallate prevents TNF-α-induced NF-кB activation thereby up regulating ABCA1 via the Nrf2/Keap1 pathway in macrophage foam cells // International Journal of Molecular Medicine. - 2012, v.29, - N.5, - p.946-956], и это дополнительно подогревает интерес к разработке лекарственных препаратов, активирующих Nrf2.

Большинство экспериментальных работ использует сульфорафан или куркумин как активаторы Nrf2: оба соединения обладают ярко-выраженной способностью к алкилированию (ковалентной модификации активных тиоловых групп в белках). Недавно утвержденный к применению в США диметилфумарат (разработанный фирмой BioGen для лечения рассеянного склероза, препарат BG-12) также обладает способностью к алкилированию белков, и основным побочным эффектом является 30% падение уровня белых кровяных телец. Клинические испытания мощного активатора Nrf2 - бардоксолона (разработанного фирмой Reata Pharmaceuticals и проданного фирме Abbott Laboratories) были приостановлены из-за смерти пациента. Таким образом, в настоящий момент не-алкилирующие активаторы Nrf2 неизвестны.

В качестве ближайшего аналога может быть указана заявка на патент ЕР 1813269 (A1) - 2007-08-01, описывающая фармацевтические агенты, способные активировать фактор транскрипции Nrf2 для использования в лечении, профилактике, или облегчения заболевания или состояния, которые можно лечить, предотвратить, или улучшать от активации транскрипционных факторов Nrf2 (например, атеросклероз, гипертонию, диабет, нервные дегенеративные заболевания, кожные заболевания, заболевания глаз, астма и рак). Агенты повышают потенциал в защите от окислительного стресса.

Задачей настоящего изобретения является разработка новых средств активирующих антиоксидантную программу и, которые могут быть использованы как эффективные цитопротекторы при самых различных неблагоприятных воздействиях на клетки организма.

Задача решается применением соединения, представляющего собой производное бициклических пиримидинов общей формулы I:

или его фармацевтически приемлемой соли, где

R₁ - пара-заместитель: метоксигруппа, этоксигруппа, алкил линейный или разветвленный (C₁-C₄), галоген, моно-, ди-, три- (С₁-C₄)алкиламиногруппа;

Y=CH, если X=S, и Y=CH или N, если X=N;

R₂ представляет собой галоген,

R₃ отсутствует, если X=S, и если X=N, то R₃ представляет собой атом водорода, алкил C₁-C₃, гидроксил, карбоксил, который может быть этерифицирован, или аминогруппу; в качестве активаторов транскрипционного фактора Nrf2.

Галоген может быть выбран из хлора, брома, иода, фтора. Наиболее предпочтительно представляет собой хлор.

Технический результат: отсутствие тушения активации антиоксидантной программы, индуцируемой соединениями формулы (1), при добавлении тиоловых восстановителей типа глутатиона и цистеина, и возможность комбинирования препарата со стехиометрическими антиоксидантами без компрометирования основного эффекта.

Соединения общей формулы I являются стабилизаторами транскрипционного фактора Nrf2 и таким образом активаторами антиоксидантной программы, триггером которой является Nrf2. Соединения формулы I индуцируют синтез белков и ферментов антиоксидантной защиты фазы II таких как гемоксигеназа-1 и NADPH:хинон оксидоредуктаза и остальных, приводя к сильному увеличению содержания восстановленного глутатиона в тканях.

Соединения I обладают способностью повышать жизнеспособность тканей в условиях ишемии-реперфузии (пересадка органов, стволовых клеток, инсульт, инфаркт), хронической дегенерации связанной с окислительным стрессом (нейродегенеративные заболевания, почечная недостаточность); химической интоксикации различной природы, включая защиту нормальных клеток при химиотерапии раковых заболеваний и тем самым уменьшая побочные эффекты химиотерапии (например, доксирубицина на сердце). Соединения I могут использоваться превентивно для повышения защитных сил организма перед работой с токсичными химикатами и высокими дозами радиации.

Соединения формулы I использовались исключительно как исходные компоненты для синтеза тиенопиримидиновых киназных ингибиторов. Ни в одном из известных источников не описаны свойства согласно изобретению.

Соединения формулы I доступны коммерчески (например, от фирмы AlfaAesar, Oakwood, http://www.alfa.com/ru/catalog/H50537) и могут быть получены следующими методами.

Например, для получения тиенопиридинов формулы (I) может быть использована следующая последовательность реакций, где в качестве палладиевого катализатора может выступать Cl₂Pd(PPh₃)₂ в присутствии карбоната натрия и диметилового эфира:

В качестве предпочтительных соединений могут быть указаны 4-хлоро-5-(4-метоксифенил)тиено[2,3-d]пиримидин (соединение X1), 4-хлоро-5-(4-фенил)тиено[2,3-d]пиримидин (соединение Х2), 4-хлоро-5-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-2-ил)тиено[2,3-d]пиримидин (соединение X3) и 4-хлоро-5,6,7,8-тетрагидробензо[4,5]тиено[2,3-d]пиримидин (соединение Х4).

Для получения пиразолопиримидинов может быть использована следующая схема реакций:

В качестве предпочтительных соединений могут быть указаны 4-хлоро-3-(4-метоксифенил)-1H-пиразоло[3,4-d]пиримидин или 4-хлоро-3-фенил-1H-пиразоло[3,4-d]пиримидин.

Для получения пирролопиримидинов может быть использована следующая схема реакций:

В качестве предпочтительных соединений могут быть указаны 4-хлоро-5-(4-метоксифенил)-7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин или 4-хлоро-5-фенил-7Н-пирроло[2,3-d] пиримидин.

Еще одним объектом является цитопротекторная и анткэксидантная фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного начала активатор транскрипционного фактора Nrf2, представляющий собой производное бициклических пиримидинов общей формулы (I), или его фармацевтически приемлемую соль в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.

Термин "фармацевтически приемлемая соль" предназначен для индикации солей, которые не опасны для пациента. Такие соли включают соли фармацевтически приемлемых кислот, например, соли неорганических и органических кислот, и аминокислот. Примеры неорганических кислот включают кислоты, такие как соляная, бромистоводородная, фосфорная, серная, азотная. Представители подходящих органических кислот включают уксусную, трихлоруксусную, бензойную, коричную, лимонную, фумаровую, гликолевую, молочную, малеиновую, яблочную, салициловую янтарную, а в качестве аминокислот может использоваться глутатион, цистеин или его производные, и т.п.

В качестве фармацевтически приемлемого носителя выбираются вспомогательное вещество или вещества в зависимости от подходящей формы введения (таблетки, инъекции, растворы, эмульсии, свечи, капсулы): вода, лактоза, сахарные спирты, производные целлюлозы, фосфаты, стеараты, тальк, ПАВ, ПЭГ, ПВП, спирты и т.д.

Пример 1

Совместное добавление глутатиона или ацетилцистеина не влияет на активацию антиоксидантной программы соединениями формулы (1)

Получение репортерной клеточной линии: ARE-люциферазный репортер был воспроизведен по протоколу [Wang X.J., Hayes J.D., Wolf C.R. / Generation of a Stable Antioxidant Response Element-Driven Reporter Gene Cell Line and Its Use to Show Redox-Dependent Activation of Nrf2 by Cancer Chemotherapeutic Agents // Cancer Res - 2006; - 66: p.10983-10994]. А именно, был использован pGL3 вектор фирмы Promega (Великобритания), содержащий SV40 промотор перед геном люциферазы светляков. Перед промотором люциферазы была сделана вставка по сайтам рестрикции NheI и XhoI восьми ARE-последовательностей мыши:

Линкер с последовательностью 5-ССС-3 и 5-GGG-3 на противоположной цепи был помещен между индивидуальными cis-элементами.

Для получения стабильной клеточной линии, экспрессирующей сконструированный репортер, трансформировали клеточную линию MCF7 (карцинома груди человека) полученной конструкцией в присутствии на порядок более низкой концентрации плазмиды pcDNA3.1, содержащей неомициновый маркер для селекции (антибиотик генетицин) с помощью липофектамина. Трансформированные клетки селектировали на DMEM-glutamax среде с 10% FBS и антибиотиках (включая 0,8 мг/мл генетицина). Клетки культивировали при 37°C, в инкубаторе (95% воздух и 5% CO₂), пересевая каждые 3-4 дня. Генетицин-резистетные клоны анализировали на индукцию люциферазной активности в присутствии 20 мкМ трет-бутилгидрохинона (t-BHQ) при инкубации в течение 8 часов, и положительные клоны отбирали для последующих пассажей. Стабильная линия, полученная через 4 недели после трансформации, была использована для скрининга тиенопиримидинов и пирролопиримидиновых структурных аналогов. Клетки засевали в белые 96-луночные планшеты с плотностью 12 тысяч клеток на лунку (100 мкл среды), инкубировали ночь, и затем добавляли по 2 мкл раствора соединения в DMSO (диметилсульфоксид), до конечной концентрации 2, 1, 0.5; 0,25; и 0.125 мкМ в присутствии или отсутствие 2 мМ глутатиона или N-ацетилцистеина. Через 8 часов инкубации клетки солюбилизировали раствором NP-40 в течение 10 минут и люциферазную активность (люминесценцию) измеряли с помощью люциферазного реагента фирмы Биолюкс (Россия) на приборе фирмы Molecular Devices (500 мсек интеграция сигнала). В качестве контроля использовали DMSO, уровень люциферазной активности принимали за базальный. Активацию рассчитывали делением сигнала в присутствии соединения на базальный уровень.

Соединение X1 является наилучшим активатором (Рис.1А, 1Б), главное структурное требование - наличие ароматического заместителя в положении 5 бицикла, в то время наличие фенильного кольца в положении 7 бицикла (R3 у пирролопиримидинов) приводит к подавлению активации в субмикромолярном диапазоне. Комбинация соединений формулы (I) с неспецифическими внутриклеточными тиоловыми восстановителями типа цистеина, ацетилцистеина, или глутатиона не влияет на параметры активации (Рис.1В), что объясняется неспособностью Соединений формулы (I) к алкилированию указанных тиолов в водных растворах in vitro. Механизм активации репортера соединениями формулы (I) (Рис.1) в настоящий момент достоверно не установлен, но предполагается, что соединения формулы I в субмикромолярном диапазоне алкилируют Keap1 (ингибитор Nrf2) исключительно по активным цистеинам, поскольку, как указано выше, неспецифические тиолы не модифицируют.

Таким образом, соединения формулы 1 являются активаторами ARE-люциферазного репортера и следовательно активаторами антиоксидантной генетической программы на молекулярном уровне. Для подтверждения этого в примере 2 проведено измерение активационного эффекта лучших соединений на содержание матричной РНК двух наиболее значимых генов, регулируемых Nrf2, а именно гемоксигеназа-1 и NADPH:хинон оксидоредуктаза-1.

Пример 2

Индукция синтеза генов, контролируемых Nrf2, под действием соединений формулы 1

Эмбриональные мышиные фибробласты обрабатывали Соединениями X1 и -X2 (0,5 мкМ) в течение 8 часов. РНК выделяли, используя Тризол-реагент фирмы Invitrogen в соответствии с методикой производителя. Один микрограмм выделенной РНК обрабатывали обратной транскриптазой, используя набор "High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit" фирмы Invitrogen (США), полученную кДНК разбавляли, и 100 нанограмм использовали для амплификации на приборе фирмы Applied Biosystems (ABI prism 7900HT Real-time PCR system) для получения транскриптов Nrf2-зависимых генов: гемоксигеназы-1 (НО-1, 5′-GGGTGATAGAAGAGGCCAAGA-3′ and 5′-AGCTCCTGCAACTCCTCAAA-3′) и NADPH:хинон оксидоредуктазы 1 (NQO1, 5′-AGCGTTCGGTATTACGATCC-3′ and 5′-AGTACAATCAGGGCTCTTCTCG-3′) используя Fast SYBR_ Green Master Mix (Invitrogen, США). Параметры цикла PCR: 10 сек при 95°C, затем 1 мин при 60°C. Полученные значения нормализовали на уровень экспрессии бета-актина (праймеры для амплификации бета-актина: 5′-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3′ and 5′-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3′).

Как следует из Рис.2, соединения формулы 1 активируют синтез гемоксигеназы-1 и NADPH:хинон оксидоредуктазы-1, главных мишеней Nrf2. При этом степень активации (уровень мРНК) соответствует активности соединений в репортерном анализе (Рис.1), а именно, соединение X1 показывает лучшую активацию репортера, чем соединение X2 (Пример 1). В дальнейших экспериментах использованы эти два соединения.

Примеры разнообразных видов биологической активности, проявляемых соединениями общей формулы (I) in vitro и in vivo, приведены ниже.

Пример 3

Антиоксидантная и гепатопротекторная активности одного из соединений общей формулы (I) в опыте in vivo

Антиоксидантная активность тестировалась в опыте in vivo на модели острого токсического поражения печени четыреххлористым углеродом (CCl₄).

Эксперимент проведен на 50 беспородных крысах-самцах с исходной массой 190-200 г, содержавшихся на стандартном рационе вивария. В каждой группе было по 10 животных. Поражение печени (экспериментальный гепатит) у животных вызывали введением CCl₄ внутрижелудочно в виде 50% раствора в вазелиновом масле в объеме 0,25 мл на 100 г массы тела в течение 3 дней [Венгеровский А.И., Чучалин B.C., Паульс О.В., Саратиков А.С. / Влияние гепатопротекторов на метаболизм липидов при CCl₄ - гепатите. // Бюлл. экспер. биол. - 1987. - N4. - с.430-432]. Одно из исследуемых соединений (X2) вводили животным внутрижелудочно в дозах 0,25, 0,5 и 1 мг/кг в течение трех суток в дни введения CCl₄ (3, 4 и 5 группы). Животным контрольной группы вводили CCl₄, как описано выше (2 группа). Интактные животные получали перорально физиологический раствор в эквивалентном количестве (1 группа). Через 24 часа после последнего введения препаратов животных декапитировали. Печень выделяли, промывали в солевом растворе, подсушивали и делили на образцы. Ткани замораживали в жидком азоте, если не использовали сразу. В образцах печени определяли антиоксидантный статус и содержание белка, часть образцов консервировали в 4% параформальдегиде для последующей гистологии.

Биохимические тесты: Печень гомогенизировали в 50 мМ натрий-фосфатном буфере, содержащем 0,15 М хлорида натрия, pH 7,4. Супернатант отделяли цетрифугированием при 15000g в течение 20 мин, при 4°C. Уровень перекисного окисления липидов в гомогенатах печени определяли по тесту с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. / Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты. // В кн: Современные методы в биохимии. -М. -Медицина. -1977. -с. 66-69], проводя предварительную экстракцию липидов по Фолчу [Кейтс М. Техника липидологии. - М. - Мир. - 1975. - с.74-76] [Коробейникова Э.Н. / Модификация определения продуктов перекисного окисления липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой. // Лаб. дело. - 1989. - N7. - с.8-10]. Образцы инкубировали с 8,1% SDS и 20% уксусной кислотой. Затем супернатанты смешивали с 0.8% ТХУ (трихлоруксусной кислотой) и нагревали при 95°C в течение 1 часа. Образовавшийся хромоген экстрагировали смесью 1-бутанол/пиридин (15:1, о/о) и измеряли поглощение на 532 нм. Концентрацию ТБК-активных продуктов в наномолях малонового диальдегида на мг белка рассчитывали с помощью уравнения регрессии. Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли на 438 нм по уменьшению поглощения формазанового продукта окисления WST-1 супероксид-радикалом, генерируемым системой ксантин/ксантинокисдаза в соотвествии с протоколом фирмы BioLabs (США). Белок в гомогенатах определяли методом Бредфорд. Результаты эксперимента обрабатывались статистически с применением t-критерия Стьюдента [Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавание патологических процессов. - М. - Наука. - 1978. - с.365].

Гепатопротекторная активность определялась следующим образом. Образцы печени помещали в пластиковые кассеты и заливали 4% параформальдегидом на 48 часов. После фиксации степень повреждения печени оценивалась по измерению области некроза посекционно при окрашиваниии гематоксилином и эозином под микроскопом. (Olympus ВХ51, Япония). Некротические зоны определялись визуально и процент некроза рассчитывали в программе Cell F v3.1, Olympus Soft Imaging Solutions, Мюнстер, Германия.

Как следует из Рис.3а, соединение X2 обладает гепатопротекторным действием, выражающимся в существенном уменьшении области некротического повреждения печени при остром отравлении четыреххлористым углеродом.

Результаты, представленные на Рис.3б, свидетельствуют, что введение крысам CCl₄ приводило к накоплению продуктов ПОЛ в печени. У животных экспериментальных групп, которым вводили одно из исследуемых соединений, отмечалось достоверное снижение содержания первичных продуктов ПОЛ в печени. Результаты, представленные на Рис.3в, свидетельствуют, что введение крысам CCl₄ приводило к падению уровня супероксиддисмутазы. У животных экспериментальных групп, которым вводили одно из исследуемых соединений, отмечалось достоверное повышение активности фермента вплоть до нормального уровня.

Таким образом, соединение общей формулы (1) обладает выраженным антиоксидантным действием в модели острого токсического поражения печени.

Пример 4

Защитное действия Соединения формулы (1) от повреждающего действия 4-оксиноненаля, основного продукта перекисного окисления липидов при ишемии-реперфузии

Активные формы кислорода (ROS) атакуют ненасыщенные жирные кислоты мембран и запускают реакцию перекисного окисления липидов, которая приводит к образованию α,β-ненасыщенных альдегидов, таких как 4-окси-2-ноненаль (HNE). Высокие концентрации ненасыщенных альдегидов являются главным повреждающим фактором при ишемии-реперфузии сердечной ткани. Данный пример показывает что предварительная обработка соединением формулы 1 (X1) защищает кардиомицеты от летальных доз 4-окси-2-ноненаля.

Неонатальные вентрикулярные миоциты из 1-2-дневных беспородных крыс-самцов подвергались градиентному центрифугированию и дифференциальному высеванию с целью обогащения культуры кардиомиоцитами. Жизнеспособность клеток определяли с помощью коммерческого набора (LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay Kit, Life Technologies Corp., США), принцип действия которого основан на одновременном определении живых и мертвых клеток с помощью кальцеина AM и этидиум гомодимера-1, специфичных к внутриклеточной эстеразной активности и целостности мембраны соответственно. Флуоресцентные микрографии (живые клетки окрашены зеленым, а ядра мертвых клеток красным) были получены на флуоресцентном микроскопе BZ-9000 (Keyence, Япония).

Для изучения влияния соединения формулы 1, кардиомиоциты были обработаны 0,25 мкМ соединения X1 и контролем, не содержащим данного вещества, инкубированы в течение 14 ч и затем обработаны цитотоксической концентрацией HNE в течение 24 часов. Жизнеспособность контрольных кардиомиоцитов составила 24,6%±4,3% для 20 мкМ HNE и 15,4%±1,8% для 30 мкМ HNE. Предобработка соединением X1 (0,25 мкМ) значительно увеличила жизнеспособность кардиомиоцитов до 72,0%±5,5% (20 мкМ HNE) и 38,6%±4,1% (30 мкМ HNE) соответственно (Рис.4а, б).

Как следует из Рис.4, Соединение общей формулы (1) обладает кардиопротекторными свойствами: предобработка им существенно повышает выживаемость кардиомиоцитов при последующей обработке 4-оксиноненалем, основным фактором повреждения при ишемии-реперфузии.

Пример 5

Уменьшение кардиотоксичности доксорубицина при одновременной администрации Соединения формулы (1)

Доксорубицин (DOX), антрациклиновый антибиотик, широко используемый в химиотерапии опухолей и злокачественных заболеваний крови, имеет существенные ограничения применения в связи с кумулятивной дозозависимой кардиотоксичностью. Механизм кардиотоксичности DOX непонятен до сих пор, но индукция апоптоза DOXом у кардиомицетов достоверно установлена. До настоящего времени не разработано контрагентов, которые могли бы оказывать превентивное действие и предотвращать высокую кардиотоксичность DOXа при совместной администрации.

Беспородные крысы-самцы 220-240 г содержались в клетках с контролируемой температурой (25°C) и циклом день-ночь (12/12) и свободным доступом к воде и пище. Самцы были разделены случайным образом на 4 группы по 10 крыс: контрольная группа, X группа, DOX группа и DOX+X группа. Крысам групп X и DOX+X вводили одно из исследуемых соединений (а именно X1) внутрижелудочно в дозе 1 мг/кг в течение 3 дней, животные двух первых групп получали перорально физиологический раствор в эквивалентном количестве. Начиная с четвертого дня животные получали каждый второй день (7 раз, 14 дней) внутрибрюшинно: физиологический раствор (контрольная группа), DOX 2.5 мг на кг в DOX группе; 1 мг/кг соединения X1 внутрижелудочно за час до инъекции DOX в группе DOX+X; 1 мг/кг соединения X1 внутрижелудочно в X группе. Через 24 часа после последней дозы DOX, эхокардиографические измерения (17.5-МГц RMV 707 насадка) проводились у крыс под анестезией пентабарбиталом натрия. Левый вентрикулярный (LV) конечный диастолический и систолический диаметры определялись в М-модальном режиме. Левый вентрикулярный конечный диастолический объем (LVEDV), ударный объем (SV), и LV глобальная сократимость (фракция выброса) (EF) рассчитывались по программе. Данные усреднялись по трем последовательным сердечным циклам.

Как следует из приведенных данных, Соединение X1 улучшает кардиологическую функцию крыс, подвергнутых действию доксорубицина. В конце эксперимента все крысы были живы, однако крысы в группах, подвергнутых действию доксорубицина, были довольно слабы. Эхокардиографические исследования (Таблица 1) показывают, что DOX значительно уменьшает параметры LVEDV, SV, EF, на 25-30%, а Соединение X1 позволяет избежать такого сильного ухудшения - наблюдается 10-15% падение.

Выводы таблицы 1 совпадают с результатами гистопатологии (Рис.5). Образцы сердечной ткани были фиксированы 10% формалином (забуференным ацетатом) и затем заключены в парафин. Парафиновые блоки были нарезаны по 5 мм и окрашены гематоксилином и эозином. Апопотоз миокарда определяли с помощью TUNEL анализа (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay), используя набор ApopTag фирмы Roche AppliedScience (Германия). После обработки протеиназой K и инактивации эндогенной пероксидазы 0.3% раствором H₂O₂, парафиновые слайды инкубировали в реакционной среде, содержащей рабочий раствор TdT и дигоксигенин-конъюгированного dUTP в течение 1 часа при 37°C. Затем меченая ДНК определялась анти-дигоксин-антителами, меченными пероксидазой. Пероксидазу прокрашивали тетрахлоридом 3,3′-диаминобензидина. Апоптотический индекс рассчитывали как процентное отношение количества клеток в стадии апоптоза к общему числу клеток.

Таким образом, Соединение формулы (1) при совместной администрации с доксорубицином уменьшает кардиотоксичность последнего как на уровне поражения клеток (апоптоза), так и на функциональном уровне (параметры сердечных сокращений).

Пример 6

Повышение жизнеспособности трансплантата сердца при администрации Соединения формулы (1) реципиенту

Две группы C57BL/6 Мыши 8-12-недельного возраста - контрольная и получающая предобработку Соединением X1 были использованы для трансплантации. Две группы по шесть 8-месячных мышей Balb/c mice были использованы как доноры для трансплантации. Все животные получали воду и пищу ad libitum. Животным группы X ежедневно внутримышечно вводили соединение X1 (1 мг/кг) начиная за день до шеечной гетеротопической аллотрансплантации (контрольной группе вводили физиологический раствор). Гетеротопическая аллотрансплантация сердца является удобной моделью для дальнейших изысканий оптимальных способов создания толерантности организма к аллотрансплантатам. По сравнению с ортотопической пересадкой эта модель трансплантации имеет определенные преимущества. Во-первых, она значительно упрощает технику операции, так как требует наложения только двух сосудистых анастомозов. Во-вторых, определение жизнеспособности трансплантата не представляет труда, поскольку с началом процесса отторжения сокращения сердца прекращаются. Мониторинг жизнеспособности графта проводился ежедневно, и как только графт переставал биться, животных декапитировали.

Как следует из данных таблицы 2, Соединение формулы (1) увеличивает продолжительность жизни графта с 10 до 13 и больше дней. Таким образом Соединение формулы (1) обладает способностью увеличения жизнеспособности трансплантов.

Пример 7

Уменьшение нефротоксичности цисплатина при администрации Соединения формулы (1)

Повреждение почек вызывали одной внутрибрюшинной инъекцией цисплатина (Sigma Chemical Со, США) (7 мг/кг). 30 беспородных крыс-самцов разбили на 4 группы: 1 группа контрольная (физиологический раствор), группа 2 - 1 мг/кг Соединения X1 ежедневно в течение 12 дней, начиная за 2 дня до инъекции цисплатина, группа 3 - одна инъекция цисплатина, группа 4 - инъекция цисплатина и администрация Соединения X1 по той же схеме, что и группа 2. На 12-й день крыс декапитировали. Образцы крови были взяты на анализ и почки были взяты для гистологических исследований.

Биохимический анализ: образцы крови центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин, для получения сыворотки. Сывороточный азот (мочевина-N) и креатинин были измерены на биохимическом анализаторе Flexor Junior (Vital Scientific B.V., Нидерланды). Белок экстрагировали при гомогенизации почек крыс в 1 мл ледяного гипотонического буфера А, содержащего 10 мМ HEPES (pH 7,8), 10 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол (DTT), 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), и 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF). К гомогенату добавляли 80 мкл 10% раствор Nonidet Р-40 (NP-40), и центрифугировали в течение 2 мин при 14000 g. Осадок содержал ядерную фракцию и использовался далее для иммуноблоттинга - определения транскрипционных факторов NFκВ (воспаление) и АР-1 (апоптоз). Осадок промывали 500 мкл буфера А, в который добавляли 40 мкл 10% NP-40, центрифугировали, ресуспендировали в 200 мкл буфера С (50 мМ HEPES (рН 7,8), 50 мМ KCl, 300 мМ NaCl, 0,1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 0,1 мМ PMSF, 20% глицерин), центрифугировали 5 мин при 14800 g. Надосадочную жидкость собирали для иммуноблоттинга. Белок определяли по Лоури набором фирмы Sigma (St. Louis, Миссури, США). SDS-PAGE проводили в присутствии 2% 2-меркаптоэтанола в образцах, которые во всех случаях содержали одинаковое колическтво белка (50 мкг), и затем проводили перенос на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher and Schuell Inc., CUIA). Мембрану затем промывали дважды по 5 мин PBS (фосфатным буфером с NaCl), а затем инкубировали 1 час в 1% BSA в PBS (для уменьшения неспецифического связывания антител). Антитела против NFκВ (р65) и АР-1 были куплены у Abeam (Великобритания). Первичные антитела разводили (1:1000) в том же буфере, содержащем 0,05% Tween-20. Нитроцеллюлозную мембрану инкубировали ночь при 4°C с первичными антителами. Блоты промывали и инкубировали с HRP (пероксидаза из корней хрена) - конъюгированными противомышиными козьими антителами (Abeam, Великобритания). Окрашивание проводили пероксидом водорода и диаминобензидином. Моноклональные антитела против β-актина использовали в качестве контроля содержания белка (А5316; фирмы Sigma). Интенсивность окрашивания измеряли на денситометре.

Соединение формулы (1) обладает способностью уменьшать нефротоксичность цисплатина, как следует из данных таблицы 3, а именно понижает уровень азота (в 3 раза) и креатинина (в 2 раза), которые показывают сильное увеличение при поражении почек цисплатином, и значительно понижают уровень транскрипционных факторов, активация которых характерна для воспалительного процесса (NFkB) и апоптоза (АР-1) (рис.6).

Пример 8

Нейропротекторные свойства соединения формулы (1) при ишемическом инсульте

Крыс-самцов Спрег-Доули подвергали модельному инсульту (зажим средней мозговой артерии) и случайным образом делили на 4 группы. Контроль (0.9% физиологический раствор), низкая доза (0,25 мг/кг) и высокая доза (1 мг/кг) Соединения X1.

Соединение вводили внутрибрюшинно непосредственно после инсульта. Объем инфаркта измеряли через 24 часа после инсульта. Иммуногистохимию и биохимические анализы проводили, как описано в Примере (см выше).

Стандартная модель окклюзии средней мозговой артерии (СМА) была использована для создания постоянной очаговой (фокальной) ишемии, как описано в литературе (Longa E.Z., Weinstein P.R., Carlson S., Cummins R. / Reversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcraniectomyinrats. // Stroke. - 1989, - 20, - p.84-91). А именно, крыс подвергали анестезии внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (50 мг/кг). Под анестезией, правосторонняя общая сонная артерия была изолирована. Окклюзию СМА проводили введением монофиламента с нейлоновым покрытием во внутреннюю сонную артерию вплоть до начала СМА (Kuge Y., Minematsu K., Yamaguchi Т., Miyake Y. Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats // Stroke. - 1995. - 26. - P.1655-1658), в которой поток крови регистрировали в течение всего эксперимента на мониторе moorVMS-LDF фирмы Moor Instruments Ltd, (Великобритания), с помощью оптического волокна прикрепленного к черепу в районе СМА (6 мм латерально и 2 мм позади от брегмы) до и после зажима правой СМА. Крыс, у которых кровопоток через СМА уменьшался менее чем на 70%, исключали из эксперимента. Ректальная температура контролировалась на уровне at 37+/-0.5°C. У контрольной группы без инфаркта группы проводилась та же хирургия, за исключением введения филамента.

Область инфаркта после окклюзии СМА определяли с помощью 2,3,5-трифенилтетразолий-хлорида (ТФТХ) через 24 часа после окклюзии. Животных декапитировали и мозги быстро выделяли и нарезали на 5 секций по 3 мм, прокрашивали 2% раствором ТФТХ при 37°C в течение 20 мин и фиксировали 4% параформальдегидом. Нормальная ткань при этом окрашивалась в темно-красный цвет, а область инфаркта была бледно-серого цвета. Секции фотографировали и изображение обрабатывали с помощью программы Image-Pro Plus 5.1. Область повреждения рассчитывалась умножением области инфакта на толщину секции. Для учета эффекта эдемы мозга при расчете объема повреждения применяли формулу: Объем повреждения, %={[общий объем инфаркта - (разница объемов интактной и псилатерального и контралатерального полушария)/объем контралатерального полушария}x100% (Tatlisumak Т., Carano R.A., Takano K., Opgenorth T.J., Sotak С.Н., Fisher М. / A novel endothelin antagonist, A-127722, attenuates is chemic lesion size in rats with temporary middle cerebral artery occlusion: a diffusion and perfusion MRI study. // Stroke. - 1998, - N29, - p.850-857).

Иммуногистохимия и биохимия проводились по тем же методикам, что в примере 7 и 3 соответственно.

Таблица 4. Нейропротекторные свойства Соединений формулы (1): повышение уровня супероксиддисмутазы и уменьшение продуктов перекисного окисления липидов.

Соединения формулы (1) обладают нейропротекторными свойствами при ишемическом инсульте, уменьшая объем инсульта (Рис.7) и воспаление (уровень активации NFкВ, Рис.8), а также уменьшая уровень продуктов перекисного окисления липидов и повышая уровень супероксиддисмутазы (таблица 4).

Пример 9

Противоинсультное действие Соединения формулы (1) на модели геморрагического инсульта (интрацеребральная посттравматическая гематома) у крыс

Моделирование локального кровоизлияния в головном мозге - создание геморрагического инсульта (интрацеребральной посттравматической гематомы) проводилось согласно методике А.Н. Макаренко и соавт. (Макаренко А.Н. и др. А.с. №1767518 от 03.11.1990). Опыты проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 200-250 г. Крысы содержались в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде. С целью создания инсульта у крыс, наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг, в/м), проводилась трепанация черепа и затем при помощи специального устройства (мандрен-нож) и стереотаксиса осуществлялась деструкция мозговой ткани в области внутренней капсулы с последующим (через 2-3 мин) введением в место повреждения крови, взятой из-под языка животного (0,02-0,03 мл). Таким способом достигается локальный аутогеморрагический билатеральный инсульт в области внутренней капсулы (диаметр - 2 мм, глубина - 3 мм) без существенных повреждений вышерасположенных образований мозга и неокортекса. Животные были поделены на несколько групп: ложно оперированные крысы, которых наркотизировали и которым затем проводили трепанацию черепа, но не осуществляли разрушения мозговой ткани; животные с геморрагическим инсультом; животные с геморрагическим инсультом, которым вводили Соединение X1 в дозе 1 мг/кг внутрь (интрагастрально, с использованием специального зонда) через 30 мин после операции, затем - ежедневно однократно в течение 7 дней. Контрольным животным вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме интрагастрально.

Таблица 5. Влияние Соединения X1 (1 мг/кг, внутрь) на неврологический дефицит (по шкале McGrow) у крыс после геморрагического инсульта. Приведено количество животных с различной неврологической симптоматикой (%) в 1-е сутки после операции.

Таблица 6. Влияние Соединения X1 на выживаемость животных после ГИ

Соединение формулы (1) обладает нейропротекторными свойствами при геморрагическом инсульте - уменьшает смерность (Таблица 6) и неврологический дефицит (Таблица 5).

Пример 10

Радиопротекция

Получение лимфоцитов из селезенки 6-8-недельных BALB/c самцов-мышей (весом 20-25 г) проводили следующим образом. Селезенку асептически вырезали и помещали в стерильную посуду, содержащую RPMI 1640 среду. Одноклеточную суспензию получали, аккуратно натирая селезенку о стерильную нейлоновую сетку в той же посуде. Спленоциты центрифугировали и красные кровяные тельца лизировали кратковременным гипотоническим шоком. В экспериментах in vitro клетки предварительно обрабатывали Соединением X1 (0,05-0,5 мкМ) за 2 часа перед облучением. DMSO использовали как контроль in vitro. Лимфоциты суспендировали в среде и подвергали облучению ⁶⁰Co γ-источником дозой 2,93 Грей/мин. Для подсчета живых и мертвых клеток использовали Live/DeadCellAssaykit (LifeTechnologiesCorp., США).

Соединение X1 обладает радиопротекторными свойствами, предварительная обработка клеток существенно повышает их жизнеспособность, причем этот эффект имеет четкую концентрационную зависимость от добавленного Соединения X1 (Рис.9).

Пример 11

Соединение формулы (1) защищает от нейродегенерации в токсической модели Паркинсона

Использовалась токсическая модель на основе МФТП (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагилропиридин), предшественника нейротоксина метилфенилпиридиния, который вызывает постоянную симптоматику болезни Паркинсона, разрушая дофаминергичные нейроны в substantia nigra. Нейропротекторные свойства Соединения X (X1) изучали на BALB/c самцах-мышах (весом 20-25 г) в дозе 1 мг/кг/день (растворяли в 3% DMSO в масле). Соединение X вводили интрагастрально раз в день за 4 дня до и 3 дня после администрации МФТП, причем в день администрации МФТП Соединение X давали за 2 часа до МФТП. Контрольная группа вместо Соединения X получала 3% DMSO в масле по той же схеме. МФТП в дозе 10 мг/кг (30 мг/кг кумулятивная доза) вводили 3 раза через каждые 2 часа. Животных декапитировали на 7-й день после введения МФТП. Мышей разбили на 4 группы (контроль, X, МФТП, X+МФТП). Соединение X1 никаких видимых изменений в поведении мышей не вызывало. Уровень дофамина и его метаболитов - дофамин превращается в 3,4-диоксифенилуксусную кислоту (ДОФУК) и далее в гомованиллиновую кислоту (ГВК) - измеряли в полосатом теле с помощью HPLC и электрохимического детектирования.

Таблица 7. Концентрация дофамина и его основных метаболитов при администрации соединения X1 в токсической модели болезни Паркинсона.

Как видно из представленных данных, Соединение формулы (1) при 1 мг/кг/день защищает от нейродегенерации, вызванной администрацией МФТП. Соединение X1 обладает нейропротекторными свойствами в токсической модели Паркинсона, практически возвращая уровень дофамина и его основных метаболитов в норму (таблица 7).

Как следует из представленных данных, соединения общей формулы (1) являются активаторами транскрипционного фактора Nrf2 (Примеры 1 и 2), который запускает генетическую программу антиоксидантного ответа, которая позволяет значительно уменьшить токсические эффекты и повреждения при целом ряде заболеваний (Примеры 3-11). Для ряда соединений, соответствующих общей формуле (I), не выявлено отрицательных побочных действий и не обнаружено противопоказаний к применению. Готовят лекарственные формы ряда соединений общей формулы (I) общеизвестным методом.

На основании результатов проведенных исследований предлагается использование соединений общей формулы (I) для лечения и профилактики следующих состояний:

1. Интоксикации, включая токсические поражения печени (Пример 3) и поражения при перекисном окислении липидов при ишемии-реперфузии (Пример 4)

2. Уменьшение токсичности препаратов химиотерапии при совместной администрации (уменьшение кардиотоксичности доксорубицина, см. Пример 5, и нефротоксичности цисплатина, Пример 7)

3. Увеличение жинеспособности графта при трансплантации (Пример 6, трансплантация сердца)

4. Ишемический инсульт (Пример 8);

5. Геморрагический инсульт (Пример 9)

6. Радиационное поражение, профилактика радиотерапии (Пример 10);

7. Заболевания нервной системы (болезнь Паркинсона, Пример 11).

Список сокращений.

NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат

Nrf2 - транскрипционный фактор, кодируемый геном NFE2L2 (Nuclearfactor (erythroid-derived 2)-like 2)

tPA - тканевой активатор плазминогена

ARE - элемент антиоксидантного ответа

ROS - активные формы кислорода (reactive oxygen species)

Keapl - белок, кодируемый геном Keapl (Kelch-like ECH-associated protein 1)

TGFβ1 - трансформирующий ростовой фактор, бета-1

NFκВ - транскрипционный фактор NF-κВ (ядерный фактор «каппа-би»)

BG-12 - диметиловый эфир фумаровой кислоты (диметилфумарат)

FBS - фетальная бычья сыворотка

DMSO - диметилсульфоксид

PCR - полимеразная цепная реакция

НО-1 - гемоксигеназа-1

NQOl -NADPH:хинон оксидоредуктаза 1

ТБК - тиобарбитуровая кислота

SDS - лаурилсульфат натрия (додецилсульфат натрия)

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ПОЛ - перекисное окисление липидов

HNE - 4-окси-2-ноненаль

DOX - доксорубицин

LVEDV - левый вентрикулярный конечный диастолический объем

SV - ударный объем

EF - фракция выброса (LV глобальная сократимость)

TdT - ДНК нуклеотидилэкзотрансфераза

dUTP - дэзоксиуридин трифосфат

DTT - дитиотрейтол

HEPES - (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

BSA - бычий сывороточный альбумин

PBS - фосфатный буфер, содержащий хлорид натрия

HRP - пероксидаза из корней хрена

Tween-20 - Полисорбат 20

СМА - средняя мозговая артерия

МФТП - 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагилропиридин

ДОФУК - 3,4-диоксифенилуксусная кислота

ГВК - гомованиллиновая кислота

HPLC - высокоэффективная жидкостная хроматография

ЛД - летальная доза

МДА - малоновый диальдегид

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ХЛ - хемилюминесценция

DMF - N,N′-диметилформамид

EtOAc - этилацетат

OEt - этокси-

OMe - метокси-

Ме - метил-

NAC - N-ацетилцистеин

GSK - глутатион

1. Применение соединения, представляющего собой производное бициклических пиримидинов общей формулы I:

или его фармацевтически приемлемой соли,где
R₁ - пара-заместитель: метоксигруппа, этоксигруппа, алкил линейный или разветвленный (C₁-C₄), галоген, моно-, ди-, три- (C₁-C₄)алкиламиногруппа;
Y=СН, если X=S, и Y=СН или N, если X=N;
R₂ представляет собой галоген
R₃ отсутствует, если X=S, и если X=N, то R₃ представляет собой атом водорода, алкил C₁-C₃, гидроксил, карбоксил, который может быть этерифицирован, или аминогруппу; в качестве активаторов транскрипционного фактора Nrf2.

2. Применение соединения по п.1, в котором производное бициклических пиримидинов общей формулы I представляет собой 5-(4-метоксифенил)тиено[2,3-d]пиримидин-4-хлорид.

3. Цитопротекторная и антиоксидантная фармацевтическая композиция, характеризующаяся тем, что содержит в качестве активного начала активатор транскрипционного фактора Nrf2, представляющий собой производное бициклических пиримидинов общей формулы (I) по п.1 или 2 или его фармацевтически приемлемую соль в эффективном количестве, и фармацевтически приемлемый носитель.