Способ получения тест-системы для диагностики цитомеговирусной инфекции методом иммуноблоттинга
Группа изобретений относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, иммунохимии, и касается диагностики цитомегаловирусной инфекции методом иммунного блоттинга, который является референтным, наиболее высокочувствительным, высокоспецифичным, подтверждающим (или исключающим) диагноз при подозрении на инфицирование в случае получения положительных или сомнительных (неопределенных) результатов. Группа изобретений представляет собой способ получения тест-системы для диагностики цитомегаловирусной инфекции, включающий получение очищенного вирусного лизата, приготовление иммуносорбента, содержащего специфичные ЦМВ белки рр 150, рр 130, gp 75, рр 65, gp 55, pp52, p 38, pp 28, приготовление растворов для электрофореза, приготовление раствора для разведения сывороток, приготовление 5-кратного концентрата промывочного раствора, приготовление конъюгата, комплектацию тест-системы, а также тест-систему, полученную вышеуказанным способом.
Использование натурального лизатного высокоочищенного антигена цитомегаловируса штамм «CMV AD 169» при получении иммуносорбента и наличие в нем полного спектра белков, специфичных ЦМВ (всего 8 белков), имеет следующие преимущества: значительно повышается чувствительность анализа, сокращается время постановки, отсутствует необходимость в предварительном разведении образцов и отсутствует первоначальный этап блокировки иммуносорбента, более удобная упаковка значительно сокращает время исследования. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 табл.
Изобретение относится к медицине, в частности, к клинической лабораторной диагностике, иммунохимии и касается диагностики цитомегаловирусной инфекции методом иммунного блоттинга, который является референтным, наиболее высокочувствительным, высокоспецифичным, подтверждающим (или исключающим) диагноз при подозрении на инфицирование в случае получения положительных или сомнительных (неопределенных) результатов при диагностике различных вирусных, бактериальных и других инфекций.
Предшествующий уровень техники
Цитомегаловирусная инфекция связана с различными патологическими состояниями, такими как ретинит, пневмония, гепатит и энцефалит. Как правило, инфекция протекает бессимптомно, но у ослабленных лиц (реципиентов и больных СПИДом) и врожденно инфицированных новорожденных она может проявляться в виде различных заболеваний. Также цитомегаловирус ЦМВ предрасполагает пациента к развитию грибковых и бактериальных инфекций.
Особенно опасен ЦМВ для беременных женщин, поскольку инфицирование плода приводит к возникновению врожденных дефектов и аномалий развития, включающих неврологические осложнения: потеря слуха, неспособность к обучению и умственная отсталость.
Таким образом, быстрая и точная диагностика ЦМВ имеет важное значение.
Настоящее изобретение относится к способу получения тест-системы для диагностики цитомегаловирусной инфекции методом иммуноблоттинга.
Настоящее изобретение также раскрывает диагностическую тест-систему, полученную заявленным способом.
Как правило, для диагностики ЦМВ используются тест-системы, основанные на выявлении антител к вирусным антигенам, мобилизированным на сорбенте, полученные различными способами.
Так, например известен способ получения иммуносорбента тест-системы для диагностики цитомегаловирусной инфекции (заявка WO 9807033 (А1)). Данный способ относится к получению ″комбинированного Westem-Lineblot″ теста, включающего, как природные, так и рекомбинантные антигены. Сущность способа заключается в комбинировании на полученном иммуносорбенте двух секций полос. Полосы, которые составляют первую секцию, получены путем электрофореза натурального вирусного лизата и электропереноса белковых комплексов на нитроцеллюлозную мембрану. Полосы, которые представляют собой вторую секцию, формируются исключительно из рекомбинантных белков, которые включают в свою структуру антигенные детерминанты вирусных белков.
Недостатком этого способа является использование рекомбинантных белков, которые принято считать менее чувствительными, чем натуральные лизатные.
На сегодняшний день существует необходимость в улучшенных серологических тестах, обладающих более высокой чувствительностью и специфичностью.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к настоящему изобретению является способ получения тест-системы для диагностики цитомеговирусной инфекции методом иммуноблоттинга ″Anti-CMV (IgG) WESTERBLOT″ фирмы EUROIMMUN, Германия (патент RU 2400756). Библиографических данных о патенте на способ получения тест-системы ″Anti-CMV (IgG) WESTERBLOT″ фирмы EUROIMMUN (Германия) найдено не было. В имеющейся у нас инструкции к набору указано, что для получения данной тест-системы используются природные антигены.
Данные тест-системы содержат тестовые стрипы-мембраны с электрофоретически разделенными нативными антигенами цитомегаловируса соответственно их молекулярной массе. Для получения иммуносорбента используется очищенный вирусный лизат, полученный путем культивирования цитомегаловируса, который с помощью додецилсульфата натрия разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле на отдельные белки в соответствии с их молекулярными массами и переносят разделенные белки на нитроцеллюлозную мембрану.
Цель и сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является совершенствование существующего способа получения тест-системы для диагностики цитомегаловирусной инфекции методом иммунного блоттинга.
Сущность изобретения заключается в получении диагностической тест-системы путем получения очищенного вирусного лизата, приготовления иммуносорбента, включающего группу специфичных ЦМВ белков: рр 150, рр 130, gp 75, рр 65, gp 55, pp52, p 38, рр 28, приготовления растворов для электрофореза, приготовления раствора для разведения сывороток, приготовления концентрата промывочного раствора, приготовления конъюгата, комплектации тест-системы.
Технический результат настоящего изобретения относится к сокращению времени постановки иммуноблота (1 ч 45 мин, против 2 ч в случае с прототипом ″Anti-CMV (IgG) WESTERBLOT″ фирмы EUROIMMUN, Германия) за счет исключения из протокола анализа стадии предварительной блокировки стрипов; а также к повышению точности при выявлении цитомегаловирусного заболевания, что имеет большую практическую диагностическую значимость и достигается за счет использования в иммуносорбенте более полного спектра белков: рр 150, рр 130, gp 75, рр 65, gp 55, pp52, p 38, рр 28, специфичных ЦМВ против 6 белков, применяющихся в прототипе. Дополнительно вводятся белки рр150 и gp75, являющиеся натуральными антигенными белками штамма ″CMV AD 169″. В процессе изучения научной литературы (как российской, так и зарубежной) по антигенному составу цитомегаловируса сложилось представление о том, какие из белков, специфичных цитомегаловирусу человека, представляют наибольшую диагностическую ценность. Дальнейшим этапом стало подтверждение наличия заинтересовавших нас белков в получаемом нами вирусном лизате ЦМВ.
По данным зарубежных исследователей фосфопротеин рр150 является высоко иммунногенным белком и играет важную роль в сборке вирусных частиц и выходе их из клетки хозяина. Также рр150 имеет важное значение в поддержании стабильности цитоплазматических структур и направляет их движение. Соответственно, наличие данного белка в сыворотке крови обследуемого пациента свидетельствует об активном течении инфекционного процесса с нарастающей наработкой антител против ЦМВ иммунной системой.
Гликопротеин В (gB) (gp55) и гликопротеин Н (gH) (gp75) являются главными детерминантами развития защитной гуморальной реакции. А гуморальный ответ, в свою очередь, имеет важное значение для контроля над заболеванием.
Гликопротеин оболочки gp75 (другое название - гликопротеин Н, gH) наряду с гликопротеином gB (gp55) играет важную роль в активации цикла репликации. Кроме того, gp75 участвует в процессе уклонения вирусной частицы от иммунного ответа хозяина, воздействуя на рецепторы Т-лимфоцитов и предотвращая распознавание ими вируса. Таким образом, наличие в исследуемом образце антител к обоим гликопротеинам gB (gp55) и gH (gp75) имеет важное диагностическое значение.
Дополнительным плюсом тест-системы ″ИФА-Блот-ЦМВ-IgG″ производства ЗАО ″ЭКОлаб″ является большее количество индивидуальных белков цитомегаловируса на иммуносорбенте (дополнительно вводятся белки рр150 и gp75, имеющие важное диагностическое значение), и, соответственно, более широкий спектр выявляемых антител в исследуемом образце. Введение двух дополнительных специфических белков способствует более точному выявлению цитомегаловирусного заболевания и имеет большую практическую диагностическую значимость.
Использование настоящего изобретения позволяет избежать предварительного разведения образцов, и первоначального этапа блокировки иммуносорбента. Это связано с тем, что состав раствора для разведения сывороток не предусматривает предварительного разведения образцов. Данный раствор уже содержит блокирующие компоненты. Разведение образца в растворе в лунке ванночки происходит постепенно в процессе инкубирования. Стадия блокировки иммуносорбента тест-системы ″ИФА-Блот-ЦМВ-IgG″ является завершающим этапом при получении иммуносорбента на производстве.
Кроме этого, настоящее изобретение позволяет использовать меньшее количество исследуемого образца для постановки иммуноблота. Более удобная упаковка продукта, полученного заявленным способом, (иммуносорбент в виде стрипов упакован в стерильную пробирку, а не прикреплен на картонку и запаян в фольгу, как у прототипа) позволяет сократить время исследования, поскольку не требуется предварительного отделения каждого стрипа от картона.
Изобретение осуществляют следующим образом.
1. Получение очищенного вирусного лизата
1.1. Приготовление питательной среды.
Приготовление питательной среды проводится в ламинаре - боксе предварительно подготовленном для работы. Внести в ламинар - бокс все необходимые компоненты: ростовую питательную среду и фосфатно-солевой буферный раствор. Обработать снаружи все емкости с компонентами раствором пурсепта, выдержать в течение 15-20 секунд, убрать излишки дезсредства с помощью бумажного полотенца.
Внести 10% фетальной сыворотки, 1% антибиотика и 1% глютамина от объема питательной среды.
1.2. Инфицирование клеточных линий.
Разморозить вирусный штамм ″CMV AD″. Внести вирус в дозе 0,4 ТЦД90/клетку и провести его адсорбцию в течение двух часов при 37°C. Удалить вируссодержащую питательную среду и внести ростовую. Зараженную культуру инкубировать 2 суток до полного разрушения монослоя в результате цитопатического действия вируса. С поверхности инфицированного клеточного монослоя удалить ростовую среду и внести 10 мл фосфатно-солевого буферного раствора. После этого содержимое матраса подвергают однократно замораживанию при -40°C и оттаиванию при комнатной температуре. Слить содержимое в стерильную центрифужную пробирку и обработать ультразвуком в течение 2 минут. Отцентрифугировать вируссодержащую жидкость при 8000 об/мин в течение 30 мин, при 4±1°C. Присвоить серию выделенной партии антигена и заморозить его при -70°C.
2. Приготовление иммуносорбента
Иммуносорбент (стрипы из нитроцеллюлозной мембраны) готовят электрофоретическим разделением в двухфазном полиакриламидном геле лизата ЦМВ на антигены и электропереносом антигенов ЦМВ из геля на нитроцеллюлозную мембрану.
2.1. Приготовление полиакриламидного геля (ПААГ)
2.1.1. Подготовить столик для заливки ПААГ в соответствии с инструкцией производителя.
2.1.2. Приготовить раствор для полимеризации нижней фазы двухфазного полиакриламидного геля, смешивая ингредиенты в бакпечатке.
Нижняя фаза (11,7%): для приготовления одного полиакриламидного геля смешать 5,68 мл воды II степени очистки, 6,4 мл 30%-н ого раствора акриламида/бисакриламида, 4,1 мл трис-солянокислого буферного раствора (ТБР-1) в концентрации 1,25 моль/л, 0,17 мл 10%-ного раствора додецилсульфата натрия и 0,65 мл глицерина.
Смесь тщательно перемешать и добавить в каждую:
- 11,4 мкл ТЕМЕДа (N,N,N′N′-тетраметилэтилендиамина)
- 74,3 мкл 10% раствора персульфата аммония
2.1.3. Раствор перелить в прибор для формирования геля. В него поместить магнит для перемешивания.
2.1.4. Конец отводной трубки соединить шлангом с перистальтическим насосом, установить регулятором скорости режим работы 4 ед.
2.1.5. Включить мешалку, открыть кран отводной трубки и включить насос.
2.1.6. Произвести заливку нижней фазы ПААГ между стеклами столика. Сверху при помощи ручной пипетки наслоить 1 мл дистиллированной воды. Оставить ПААГ полимеризоваться на 4-5 часов при температуре 18-22°C.
2.1.7. Через 4-5 часов после заливки нижней фазы ПААГ приготовить раствор для формирования верхней фазы.
Верхняя фаза (4%): для приготовления одного полиакриламидного геля смешать 4,88 мл воды II степени очистки, 1,04 мл 30%-ного раствора акриламида/бисакриламида, 2,0 мл трис-солянокислого буферного раствора (ТБР-2) в концентрации 0,5 моль/л, 0,09 мл 10%-ного раствора додецилсульфата натрия.
Смесь тщательно перемешать и добавить в каждую:
- 5,26 мкл ТЕМЕДа (N,N,N′N′-тетраметилэтилендиамина)
- 33,8 мкл 10% раствора персульфата аммония.
2.1.8. Раствор тщательно перемешать и с помощью ручной пипетки произвести заливку верхней фазы ПААГ между стеклами столика. В заполненную камеру вставить спейсер таким образом, чтобы на поверхности не образовывались пузырьки. Растворы выдержать в камере 16-18 часов при температуре (20±2)°C. Завершение полимеризации контролировать визуально.
Непригодными для электрофореза считаются гели, в которых не произошла полимеризация (жидкие гели), и гели с наличием пузырьков воздуха и неровностями поверхности (ямки, бороздки).
2.2. Подготовка образцов
Приготовить рабочий раствор антигена (лизата) ЦМВ в зависимости от концентрации белка (из расчета 1 мкг на 1 мм2 ПААГ). Ширина рабочей поверхности сплошного геля составляет 130 мм, толщина - 1 мм.
Для загрузки в один ПААГ в микропробирке типа Эппендорф смешать:
- 0,108 мл лизата ЦМВ ([С]=1,2 мг/мл),
- 0,216 мл диссоциирующего буферного раствора
- 0,010 мл 2-меркаптоэтанола.
Тщательно перемешать. Пробирку поместить на водяную баню и выдержать при температуре 95-100°C в течение 4 минут.
2.2.1. Проведение электрофореза.
2.2.1.1 Извлечь спейсер из камеры с гелем. Вычистить карман от остатков геля при помощи бумаги. В полученный карман внести 1 мл однократного буферного раствора для электрофореза. Затем с помощью микрошприца внести рабочий раствор антигена
2.2.1.2 Приготовить однократный электродный буферный раствор (2500 мл на одну камеру). Для этого в стеклянный стакан отмерить при помощи мерного цилиндра 250 мл 10-кратного концентрата электродного буферного раствора и довести объем раствора до 2500 мл очищенной водой 1 категории.
2.2.1.3. Собрать камеру для проведения электрофореза, в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Залить 2000 мл однократного электродного буферного раствора в нижнюю часть камеры. В верхнюю часть залить 500 мл буфера. Поставить камеру на магнитную мешалку и включить ее.
2.2.1.4. Подключить камеру для электрофореза к охлаждающей циркуляционной бане в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Включить циркуляционную баню в режим охлаждения.
2.2.1.5 Прибор для электрофореза подключить к источнику питания в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Электрофорез проводить при температуре +7(±1)°C. Рабочее напряжение в начале процесса 100 В. Через 30-40 минут напряжение увеличить до 150 В, еще через 60 мин. напряжение увеличить до 250 В. Электрофорез остановить после того, как фронт бромфенолового синего достигнет нижнего края ПААГ или совсем выйдет из него.
По окончании электрофореза гель извлечь из камеры и поместить в однократный буферный раствор для электропереноса.
Данные о проведении электрофореза занести в рабочий журнал.
2.3. Проведение электропереноса
2.3.1. В камеру для проведения электропереноса поместить 5,0 л однократного буферного раствора для электропереноса (БП-1х).
2.3.2. К камере подключить охлаждающую циркуляционную водяную баню. Температура охлаждающей жидкости: +15(±1)°C.
2.3.3. Нитроцеллюлозную мембрану, размером 15×14 см, промаркировать карандашом, поместить рабочей поверхностью вверх в буферный раствор для электропереноса и выдержать в течение 30 минут.
2.3.4. Собрать ″сэндвич″: ″гель-мембрана″, используя бумагу для блоттинга или фильтровальную бумагу и губку, входящую в комплект ячейки для переноса. Следует обратить внимание на недопустимость наличия воздушных пузырьков между гелем и мембраной. Для устранения воздушных пузырьков вдоль геля прокатывают стеклянную палочку, смоченную буферным раствором для электропереноса. Собранный блок-сэндвич″ поместить в ячейку камеры для электропереноса, ориентируя мембрану в сторону анода.
2.3.5. Прибор для электропереноса подключить к источнику питания в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Процесс электрофоретического переноса белковых комплексов проводить при напряжении 100 В в течение 3 часов.
Данные о проведении электропереноса занести в рабочий журнал.
2.4.Первичный контроль иммуносорбента
2.4.1. По окончании переноса ″сэндвич″ разобрать, мембрану поместить в раствор для окраски мембраны на 1-2 минуты. После этого мембраны тщательно промыть в очищенной воде 1 категории и подсушить на фильтровальной бумаге.
На мембране должны отчетливо проявиться окрашенные зоны. Контролировать горизонтальность белковых зон, отметить участки (обычно на краю переноса), где горизонтальность искажена. Для приготовления стрипов эти участки не используют.
2.4.2. С помощью скальпеля обрезать непрокрашенные боковые части мембраны.
Непригодными для использования считаются мембраны, на которых после окрашивания не проявились белковые зоны, а также мембраны с наличием разводов, заминов и следов воздушных пузырей между гелем и мембраной при электропереносе (брак укладки геля).
2.5 Нанесение линии контроля реакции
2.5.1. Заполнить капиллярно-поршневое устройство раствором анти-IgG человека и на высушенной мембране, отступив от нижнего края 6 мм, - провести линию контроля реакции, начиная с листа фильтровальной бумаги, затем плавно переходя на мембрану и закончив снова на листе фильтровальной бумаги.
2.6. Блокировка и нарезка иммуносорбента
Отметить верхнюю окрашенную поверхность мембраны и поместить мембрану в блокирующий раствор. Блокирующий раствор готовят из 10-кратного концентрата Трис-солевого буфер (ТСБ×10) разведением очищенной водой до однократного. Инкубировать в течение 10-15 минут при комнатной температуре, после чего отмыть дистиллированной водой на шейкере 3 раза по 5 минут.
Мембраны подсушить на фильтровальной бумаге и осуществить нарезку на стрипы с шириной 2,4 мм на специальном резаке.
2.7. Контроль иммуносорбента в реакции иммунного блоттинга
2.7.1. Мембрану промыть, разрезать на полоски (стрипы) шириной 2,4 мм, используя прибор для нарезания стрипов и промаркировать.
2.7.2. Контролю подлежат краевые стрипы с каждой мембраны. В контроле использовать:
- сыворотки стандартной панели ОСО 42-28-360-01 (″Стандарт AT-G(+/-) ЦМВ″)
- несколько донорских сывороток, содержащих и не содержащих антител к ВИЧ-1 по скриннинговым тестам.
Оценивать наличие и интенсивность окрашивания зон, соответствующих антигенам ЦМВ:
в реакции с положительными сывортками панели должны быть выявлены зоны, соответствующие белкам ЦМВ: рр 150, рр 130, gp 75, рр 65, gp 55, pp52, p 38, pp 28; в реакции с отрицательными сыворотками не должны выявляться окрашенные зоны, кроме зоны линии контроля реакции.
2.8. Изготовление фотографий референс-стрипов
Референс-стрип с полным спектром белков, специфичных ЦМВ отсканировать, вставить в специальную компьютерную форму и распечатать фотографию.
2.9. Фасовка иммуносорбента
2.9.1. Промаркированные стрипы с помощью пинцета поместить по 24 штуки (номера 1-24) в пластиковые пробирки. Пробирке и референс-стрипу присвоить номер, соответствующий номеру иммуносорбента.
До комплектации готовый иммуносорбент можно хранить при температуре 2-8°C в течение 3 лет.
2.10. Этикетирование.
На пробирку со стрипами наклеить этикетку:
3. Приготовление растворов для электрофореза
3.1. Приготовление Трис-солянокислого буферного раствора (ТБР-1) в концентрации 1,25 моль/л
Приготовить навеску 15,14 г трис-(оксиметил)-аминометана, растворить его в 80 мл очищенной воды (2-ой ступени очистки) в мерном стакане при перемешивании на магнитной мешалке. Довести pH раствора до 8,8, добавляя по каплям концентрированную соляную кислоту (1300-1500 мкл). Объем раствора довести водой до 100 мл. Профильтровать через бумажный фильтр.
Хранить готовый раствор при температуре 2-8°C не более 1 месяца.
3.2. Приготовление Трис-солянокислого буферного раствора (ТБР-2) в концентрации 0,5 моль/л
Приготовить навеску 6,057 г трис-(оксиметил)-аминометана, растворить его в 80 мл очищенной воды (2-ой ступени очистки) в мерном стакане при перемешивании на магнитной мешалке. Довести pH раствора до 6,8, добавляя по каплям концентрированную соляную кислоту (3,5-4 мл). Объем раствора довести водой до 100 мл. Профильтровать через бумажный фильтр.
Хранить готовый раствор при температуре 2-8°C не более 1 месяца.
3.3. Приготовление диссоциирующего буферного раствора (ДБР)
3.3.1. Приготовление 0,5%-го раствора бромфенолового синего.
Приготовить навеску 0,1 г бромфенолового синего и растворить ее в 20 мл очищенной воды (2-й ступени очистки). Полученный раствор профильтровать через бумажный фильтр.
3.3.2. Приготовление диссоциирующего буферного раствора.
Во флакон из темного стекла с помощью мерного цилиндра отмерить 30 мл очищенной воды (2-ой ступени очистки), добавить 10,6 мл трис-солянокислого буферного раствора в концентрации 0,5 моль/л (ТБР-2), 16,8 мл 10% раствора додецилсульфата натрия (SDS), 21 мл глицерина и 1,6 мл 0,5%-ного раствора бромфенолового синего. Все тщательно перемешать.
Хранить готовый раствор при температуре 18-24°C в течение 12 месяцев.
3.4. Приготовление 30%-ного раствора акриламида/ бис-акриламида
Приготовить навески 29,2 г акриламида и 0,8 г бисакриламида. В стеклянную колбу при помощи мерного цилиндра отмерить 80 мл очищенной воды (2-ой ступени очистки), растворить в ней навески при перемешивании на магнитной мешалке и довести объем раствора до 100 мл. Раствор профильтровать через бумажный фильтр.
Хранить готовый раствор при температуре 2-8°C не более 1 месяца.
3.5. Приготовление 10%-ного раствора додецилсульфата натрия (SDS)
Приготовить навеску 10 г додецилсульфата натрия (SDS) и растворить в 90 мл очищенной воды (2-ой ступени очистки).
Хранить готовый раствор при температуре 18-24°C в течение 12 месяцев.
3.6. Приготовление 10%-ного раствора персульфата аммония (APS)
Приготовить навеску 0,1 г персульфата аммония и растворить ее в 900 мкл очищенной воды (2-ой ступени очистки).
Не хранить. Использовать только свежеприготовленный раствор!
3.7. Приготовление электродного буферного раствора (10-кратной концентрации)
Приготовить навески 30 г трис-(оксиметил)-аминометана; 144 г глицина и 10 г додецилсульфата натрия (SDS).
В стеклянную колбу при помощи мерного цилиндра отмерить 800 мл очищенной воды (1-й категории) и растворить в ней навески трис-(оксиметил)-аминометана и глицина. Объем раствора довести до 1 л.
Измерить pH (значение pH должно составлять 8,2-8,4)*. Затем добавить навеску додецилсульфата натрия (SDS). Раствор тщательно перемешать на магнитной мешалке. Профильтровать через бумажный фильтр.
Хранить готовый раствор при температуре 2-8°C в течение 6 месяцев.
3.8. Приготовление раствора для окраски мембраны
3.8.1. Приготовление 2%-го раствора трихлоруксусной кислоты.
Приготовить навеску 30 г концентрированной трихлоруксусной кислоты и растворить ее в 970 мл очищенной воды (1 категории) при перемешивании на магнитной мешалке.
3.8.2. Приготовление раствора для окраски мембраны.
Приготовить навеску 1 г Пунцового S. Растворить в 1000 мл 3%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Хорошо перемешать и профильтровать через бумажный фильтр.
Хранить готовый раствор при температуре 18-24°C в течение 6 месяцев.
3.9. Приготовление буфера для электропереноса (10-кратной концентрации)
Для приготовления 1 л 10-кратного концентрата буфера для элетропереноса в стеклянную колбу отмерить мерным цилиндром 800 мл очищенной воды 1 категории.
Приготовить навески из 28,8 г трис-(оксиметил)-аминометана и 140 г глицина и растворить их в воде при тщательном перемешивании. Объем раствора довести до 1 л и тщательно перемешать на магнитной мешалке.
Хранить готовый раствор при температуре 2-8°C в течение 6 месяцев.
3.10. Приготовление однократного буфера для электропереноса
Для приготовления 5 л однократного буфера для электропереноса в стеклянную колбу объемом 6 л отмерить мерным цилиндром 500 мл 10-кратного буфера для электропереноса, 1000 мл метанола и довести объем раствора до 5000 мл очищенной водой 1 ступени. Полученный раствор тщательно перемешать стеклянной палочкой. Работу проводить в вытяжном шкафу.
Хранить готовый раствор при температуре 2-8°C не более 1 месяца.
3.11. Приготовление раствора сыворотки диагностической моноспецифической против IgG человека (Анти-IgG)
В раствор карбонат-бикарбонатного буфера (КББ) внести краситель Пунцовый S из расчета 0,001 г красителя на 10 мл КББ. Перемешать на магнитной мешалке в течение 30 мин.
Сыворотку диагностическую моноспецифическую (лиофилизированную) развести в 1 мл очищенной воды (2 ступени очистки) и тщательно встряхнуть на вортексе.
Приготовить разведение анти-IgG сыворотки в растворе КББ исходя из расчета 0,1 мл сыворотки на 6 мл КББ.
Хранить готовый раствор при температуре 2-8°C в течение 3 месяцев.
4. Приготовление раствора для разведения сывороток
4.1 Приготовление 10-кратного концентрата Трис-солевого буфера (ТСБ×10).
В колбу отмерить с помощью мерного цилиндра 800 мл очищенной воды 1-ой категории. Приготовить навески трис-(оксиметил)-аминометана - 24,2 г и натрия хлорида-234 г. Растворить в воде при постоянном перемешивании на магнитной мешалке.
Проверить pH раствора: pH должен составлять 7,5±0,1. При необходимости pH скорректировать с помощью концентрированной соляной кислоты (конц. HCl). На 1 л раствора расходуется от 7 до 20 мл концентрированной соляной кислоты.
Затем добавить 0,1 г тимерозала (мертиолята), после растворения осторожно влить 10,0 мл Твин-20. Довести объем раствора до 1000 мл очищенной водой 1-ой категории. Все тщательно перемешать на магнитной мешалке до полного растворения.
Полученный раствор профильтровать через обеззоленный фильтр или фильтр из фильтровальной бумаги.
Хранить готовый ТСБ×10 при температуре 2-8°C в течение 12 месяцев.
4.2. Приготовление казеина (10%-ного раствора сухого обезжиренного молока).
В колбу отмерить с помощью мерного цилиндра 90 мл 10-кратного концентрата Трис-солевого буфера (ТСБ×10) затем добавить 810 мл очищенной воды 1-ой категории. Перемешать на магнитной мешалке 15-20 минут. К полученному раствору добавить 100 гр сухого обезжиренного молока. Тщательно перемешать на магнитной мешалке с подогревом до полного растворения сухого молока в течение 20-24 часов при температуре 28-42°C. Добавить 200 мл хлороформа. Перемешивать на магнитной мешалке с подогревом в течение 20-24 часов при температуре 56-70°C. Работу проводить в вытяжном шкафу.
Полученный раствор открутить на центрифуге при 8000 об/мин и температуре 8±2°C в течение 1 часа. Образовавшийся осадок удалить.
Хранить готовый 10% раствор Казеина при температуре 2-8°C в течение 12 месяцев.
4.3. Обработка концентрата блокирующего раствора (КБР).
В колбу отмерить с помощью мерного цилиндра 1000 мл концентрата блокирующего раствора (КБР) затем добавить 100 мл хлороформа. Перемешивать на магнитной мешалке в течение 24±2 часа при температуре 18-25°C. Работу проводить в вытяжном шкафу.
Полученный раствор открутить на центрифуге при 8000 об/мин. и температуре 8±2°C в течение 1 часа. Образовавшийся осадок удалить.
Хранить готовый КБР при t=2-8°C в течение 24 месяцев.
4.4. Приготовление раствора для разведения сывороток (РРС).
В колбу отмерить с помощью мерного цилиндра 68,5 мл 10-кратного концентрата Трис-солевого буфера (ТСБ×10), 616,5 мл очищенной воды 1-ой категории, 100 мл КБР, 200 мл 10%-ного раствора казеина, 5 мл Тритона Х-100. Тщательно перемешать с помощью магнитной мешалки. Взвесить 0,1 г тимерозал, добавить в раствор и тщательно перемешать на магнитной мешалке.
Хранить готовый РРС при температуре 2-8°C в течение 18 месяцев.
4.5. Контроль раствора для разведения сывороток (РРС) в реакции иммунного блоттинга (ИБ).
Провести контрольновой серии РРС путем его сравнения с предыдущей производственной серией в соответствии с инструкцией по применению ИФТС ″ИФА-БЛОТ-ЦМВ-IgG″. Следует использовать компоненты реакции ИБ одной и той же производственной серии ИФТС ″ИФА-БЛОТ-ЦМВ-IgG″.
РРС можно считать пригодным для производства ИФТС, если:
1. Положительные сыворотки панели ОСО 42-28-360-01 выявляют зоны, соответствующие белкам ЦМВ: рр 150, рр 130, gp 75, рр 65, gp 55, pp52, p 38, pp 28 и линию контроля реакции.
2. Отрицательные сыворотки панели ОСО 42-28-360-01 выявляют только зону линии контроля реакции или зоны белков, неспецифичных ЦМВ.
При несоблюдении одного из выше перечисленных условий раствор следует приготовить заново.
4.6. Розлив раствора для разведения сывороток (РРС).
Разлить РРС по 30 мл с помощью дозирующего насоса во флаконы.
Во время розлива проводить контроль точности дозировки с помощью откалиброванного цилиндра или автоматической пипеткой не менее 3х раз на 50 флаконов Погрешность розлива:±1,0 мл.
Каждый флакон плотно закрутить крышкой и сложить в маркированный контейнер.
Хранить готовый РРС до фасовки при температуре 2-8°C в течение 6 месяцев.
4.7 Этикетирование
На флакон с РРС наклеить этикетку:
5. Приготовление 5-кратного концентрата промывочного раствора (ПР-5x)
5.1. Приготовление 5-кратного промывочного раствора (ПР-5x)
В колбу отмерить с помощью мерного цилиндра 31,4 мл 10-кратного концентрата Трис-солевого буфера (ТСБ×10), 282,6 мл очищенной воды 1-ой категории, 225 мл обработанного концентрата блокирующего раствора (КБР). Перемешать на магнитной мешалке в течение 15-20 мин. Отмерить с помощью мерного цилиндра 450 мл раствор казеина и затем добавить в колбу. Перемешать. Отмерить с помощью цилиндра, а затем добавить 11 мл тритона Х-100 по стенке перелить в колбу. Тщательно перемешать с помощью магнитной мешалки. Взвесить 0,1 г тимерозала, добавить в раствор и тщательно перемешать на магнитной мешалке.
При необходимости (выпадение осадка) полученный раствор профильтровать через фильтр обеззоленный или фильтр из фильтровальной бумаги.
Хранить готовый ПР×5 при температуре 2-8°C в течение 18 месяцев.
5.2. Контроль 5-кратного концентрата промывочного раствора (ПР-5x) в реакции иммунного блоттинга (ИБ)
Контрольновой серии ПР-5x производят путем его сравнения с предыдущей производственной серией ПР-5x в реакции ИБ в соответствии с инструкцией по применению ИФТС ″ИФА-БЛОТ-ЦМВ-IgG″ и при употреблении других компонентов постановки реакции одной и той же серии.
Концентрат промывочного раствора (ПР-5х) можно считать пригодным для производства ИФТС, если при использовании в ИБ:
1. Положительные сыворотки панели ОСО 42-28-360-01 выявляют зоны, соответствующие белкам ЦМВ: рр 150, рр 130, gp 75, рр 65, gp 55, pp52, p 38, рр 28 и линию контроля реакции.
2. Отрицательные сыворотки панели ОСО 42-28-360-01 выявляют только зону линии контроля реакции или зоны белков, неспецифичных ЦМВ.
При несоблюдении одного из выше перечисленных условий раствор следует приготовить заново.
5.3. Розлив 5-кратного концентрата промывочного раствора (ПР-5x)
Разлить ПР-5x по 50 мл с помощью дозирующего насоса во флаконы.
Во время розлива проводить контроль точности дозировки с помощью откалиброванного цилиндра или автоматической пипеткой не менее 3х раз на 50 флаконов.
Погрешность розлива: ±1,0 мл.
Каждый флакон плотно закрутить крышкой и сложить в маркированный контейнер.
Хранить готовый ПР-5x до фасовки при температуре 2-8°C в течение 6 месяцев.
5.4. Этикетирование
На флакон с ПР-5x наклеить этикетку:
6. Приготовление конъюгата
6.1. Приготовление раствора для стабилизации конъюгата
В колбу отмерить с помощью мерного цилиндра 400 мл очищенной воды 1-ой категории. Для приготовления 500 мл раствора для стабилизации коньюгата приготовить навески трис-(оксиметил)-аминометана - 2,4 г и натрия хлорида - 44 г. Растворить их в колбе при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в 400 мл очищенной воды 1 -ой категории, долить до 500 мл и перемешать. Проверить pH раствора, pH должен составлять 7,4±0,1. При необходимости скорректировать pH, добавляя по каплям концентрированную соляную кислоту.
Полученный раствор смешать 1:1 с глицерином. Добавить консерванты: гентамицина сульфат - 0,5 г и натрия азид - 0,5 г.
Хранить готовый раствор для стабилизации коньюгата при температуре 2-8°C в течение 12 месяцев.
6.2. Приготовление концентрата коньюгата
Во флакон с лиофилизированно высушенным концентратом конъюгата добавить 1 мл очищенной воды (2-й ступени очистки) и тщательно встряхнуть на вортексе.
Для приготовления 100 мл конъюгата во флакон из темного стекла отмерить с помощью мерного цилиндра 98,3 мл раствора для стабилизации конъюгата и добавить 1,7 мл концентрата конъюгата. Полученный раствор конъюгата тщательно перемешать на магнитной мешалке.
Хранить готовый конъюгат в темном месте при температуре 2-8°C в течение 12 месяцев.
6.3. Приготовление конъюгата
Для приготовления 1 л конъюгата (не требующего предварительного разведения) в стеклянную колбу отмерить с помощью мерного цилиндра 1000 мл раствора для разведения сывороток и добавить 20 мл концентрата конъюгата. Полученный раствор тщательно перемешать на магнитной мешалке.
Хранить готовый конъюгат в темном месте при температуре 2-8°C в течение 12 месяцев.
6.4. Контроль конъюгата в реакции ИБ (иммуноблот)
Провести контрольновой серии конъюгата путем его сравнения с предыдущей производственной серией, в соответствии с инструкцией по применению ИФТС ″ИФА-БЛОТ-ЦМВ-IgG″. Следует использовать компоненты реакции ИБ одной и той же производственной серии ИФТС ″ИФА-БЛОТ- ЦМВ-IgG″.
Конъюгат можно считать пригодным для производства ИФТС, если:
1. Положительные сыворотки панели ОСО 42-28-360-01 выявляют зоны, соответствующие белкам ЦМВ: рр 150, рр 130, gp 75, рр 65, gp 55, pp52, p 38, pp 28 и линию контроля реакции.
2. Отрицательные сыворотки панели ОСО 42-28-360-01 выявляют только зону линии контроля реакции или зоны белков, неспецифичных ЦМВ.
При несоблюдении одного из выше перечисленных условий раствор следует приготовить заново.
6.5. Розлив конъюгата
Разлить конъюгат по 30 мл с помощью откалиброванного цилиндра во флаконы.
Во время розлива проводить контроль точности дозировки с помощью откалиброванного цилиндра не менее 3х раз на 50 флаконов. Погрешность розлива не более 1 мл.
Каждый флакон плотно закрутить крышкой и сложить в маркированный контейнер. Хранить готовый конъюгат до фасовки при температуре 2-8°C в течение 2-х недель.
6.6. Этикетирование.
На флакон наклеить этикетку:
7. Комплектация тест-системы
Собрать из кроя коробки для тест-системы ″ИФА-Блот-ЦМВ-IgG″, поместить в них вкладыши и разместить в коробках маркированные компоненты тест-системы в следующем количестве:
| Иммуносорбент | 24 стрипа в пластмассовом контейнере |
| Конъюгат | 2 фл. (30 мл) |
| Окрашивающий раствор | 2 фл. (30 мл) |
| РРС | 2 фл. (30 мл) |
| ПР×5 | 3 фл. (50 мл) |
| Фотография референс-стрипа | 1 шт. |
В каждую коробку вложить инструкцию по применению, бланк протокола, бланк потребителя, пинцет и 3 или 4 планшета-ванночки для ИФА по 6 ячеек в полиэтиленовом пакете.
Авторам не известны технические решения, имеющие совокупность признаков, подобную заявляемому изобретению. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию - новизна.
Использование натурального лизатного высокоочищенного антигена цитомегаловируса штамм ″CMV AD″ при получении иммуносорбента и наличие в нем полного спектра белков (рр 150, рр 130, gp 75, рр 65, gp 55, pp52, p 38, рр 28), специфичных ЦМВ (всего 8 белков) позволяет значительно повысить чувствительность анализа, сокращенное время постановки, отсутствие необходимости в предварительном разведении образцов и отсутствие первоначального этапа блокировки иммуносорбента, а также более удобная упаковка значительно сокращает время исследования, меньшее количество требуемого исследуемого образца для постановки иммуноблота, экономически более выгодно.
Тест-система для диагностики цитомегаловирусной инфекции методом иммуноблоттинга, получаемая по предлагаемому способу, найдет широкое применение в здравоохранении, в частности, в клинических лабораториях, для проведения иммунохимического и иммунологического анализа и может быть использована для подтверждения маркера цитомегаловирусной инфекции. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию промышленной применимости.
Способ применения тест-системы осуществляется следующим образом.
Пример. Проведение анализа с использованием тест-системы, полученной по предлагаемому способу.
Проведение анализа методом иммунного блоттинга
1. Вскрыть упаковку стрипов. Осторожно, пластмассовым пинцетом, переложить стрипы маркированной стороной вверх в лунки ванночек для проведения иммунного блотинга, чтобы стрипы с нанесенными вирусными белками были покрыты растворами реагентов в течение всего исследования. Лунки ванночек промаркировать в соответствии с номерами исследуемых образцов.
2. Внести в каждую лунку ванночки по 2,0 мл раствора для разведения сывороток (РРС) и инкубировать 5 мин при температуре от 18 до 25°C, на шейкере
3. Добавить по 20 мкл каждого из исследуемых образцов в соответственно промаркированные лунки. Инкубировать в течение 30 мин при температуре от 18 до 25°C, на шейкере.
4. После инкубации, используя вакуумный насос, полностью удалить жидкость из каждой лунки в емкость с дезинфицирующим раствором. Следует соблюдать осторожность, чтобы при отсасывании жидкости из лунок не выпал стрип. Наконечник отсасывающего устройства после каждого контакта с различными образцами сывороток следует промыть очищенной водой или использовать для каждого образца отдельный одноразовый наконечник во избежание перекрестной контаминации.
5. Внести в каждую лунку по 2,0 мл рабочего промывочного раствора и промыть стрипы в течение 5 мин, на шейкере. Промывку выполнить 3 раза. После последней промывки раствор удалить из лунок.
6. Внести в каждую лунку по 2,0 мл коньюгата. Инкубировать в течение 30 мин при температуре от 18 до 25°C, на шейкере.
7. 3 раза промыть каждый стрип, как указано в п.5.
8. Внести в каждую лунку по 2,0 мл окрашивающего раствора. Инкубировать в защищенном от света месте при температуре от 18 до 25°C, на шейкере 5-10 мин.
9. Для остановки реакции удалить из лунок окрашивающий раствор и промыть стрипы 3 раза очищенной водой, наливая в каждую лунку по 2,0 мл воды.
10. Осторожно, пинцетом, извлечь стрипы из лунок ванночки. Осушить стрипы между двумя листами фильтровальной бумаги при комнатной температуре. Расположить их маркированной стороной кверху для оценки результатов
Учет и интерпретация результатов
Перечень индивидуальных белков, входящих в состав ЦМВ
Присутствие в образце сыворотки (плазмы) крови человека антител к белкам ЦМВ обнаруживается по появлению окрашенных полос.Их расположение соответствует молекулярным массам белков, указанным в табл.1.
Интерпретация результатов
Антигены ЦМВ, в зависимости от их способности вызывать иммунный ответ, подразделяются на три класса (табл.2):
Результаты, полученные после проведения анализа могут быть разделены на положительные, неопределенные (сомнительные) и отрицательные (табл.3).
Неопределенный результат может означать, что:
- образец получен в период сероконверсии;
- наблюдается неспецифическая реакция, вызванная наличием антител к другим герпесвирусам.
Проведенные нами испытания с использованием тест-системы по настоящему изобретению и тест-системы (по прототипу) на клиническом материале и на сыворотках доноров показали более высокую чувствительность и специфичность первого. Данные результаты отражены в сводной сравнительной таблице 4 по чувствительности и специфичности иммуноблота
Диагностическая эффективность новой тест-системы была оценена вначале на сыворотках панели ″Стандарт AT-G (+/-) ЦМВ″ ЗАО ″Медико-биологический союз″ (г.Новосибирск).
Результаты этого исследования приведены в табл.4.
Результаты, приведенные в табл.4, показывают полное совпадение оценок сывороток панели, полученных в исследовании, с их паспортными характеристиками.
Далее, для оценки диагностической эффективности новой тест-системы исследовали 30 сывороток, полученных из коммерческой лаборатории ″ИНВИТРО″ (Москва), предварительно оцененных в ИФА с помощью ИФТС ″ИФА-ЦМВ- IgG″ производства ЗАО ″ЭКОлаб″ и в РИФ с помощью набора ″Цитомегаловирус-IgG-РИФ″ фирмы ViroImmun (Германия). Образцы с 1 по 26 в обеих указанных тест-системах (и в ИФА, и в РИФ) показывали положительный результат, а образцы с 27 по 30 - отрицательный.
Результаты исследования приведены в табл.5.
Из приведенных данных следует, что результаты ИБ полностью подтвердили оценки исследованных образцов, полученные в ИФА и РИФ.
Для сравнения диагностической эффективности новой тест-системы с аналогичным импортным набором 15 образцов были исследованы в ней и в тест-системе ″Anti-CMV (IgG) WESTERBLOT″ фирмы Euroimmun AG (Германия). Полученные при этом результаты представлены в табл.6.
Как следует из табл.6, в проведенных испытаниях было получено полное совпадение итоговых оценок исследованных образцов и практически полное совпадение оценок наличия антител почти ко всем отдельным антигенам ЦМВ, в том числе и по антигену gp75, учет наличия антител к которому не предусмотрен инструкцией по применению набора фирмы Euroimmun (коэффициенты корреляции полученных оценок составили 0,94-1,00). С достаточно высоким коэффициентом корреляции, равным 0,66 было получено соответствие оценок наличия антител к антигену рр150, которые также не учитываются при использовании набора сравнения.
| Таблица 1 | |||
| Белок (антиген) | Продукт гена | Описание | Визуальная характеристика окрашенной полосы на стрипе |
| рр 150 | UL32 | Фосфопротеин оболочки вируса | Четкая полоса темно-фиолетового цвета |
| рр 130 | UL57 | Неструктурный фосфопротеин вируса | Четкая полоса темно-фиолетового цвета |
| gp 75 | UL82 | Гликопротеин Н антиген gH | Полоса темно-фиолетового цвета с диффузными границами |
| рр 65 | UL83 | Фосфопротеин тегумента | Четкая полоса темно-фиолетового цвета |
| gp 55 | UL55 | Гликопротеин В антиген gB | Четкая полоса темно-фиолетового цвета |
| рр 52 | UL44 | ДНК-связывающий фосфопротеин | Четкая полоса темно-фиолетового цвета |
| р 38 | UL38 | Структурный фосфопротеин | Четкая полоса темно-фиолетового цвета |
| рр 28 | UL99 | Фосфопротеин тегумента капсида | Диффузная полоса с краями темно-фиолетового цвета |
| Таблица 2 | ||
| Класс | Свойства | Антигены |
| 1 | Перекрестно-реагирующие | рр 65 |
| 2 | Низкоспецифичные | gp 75, gp 55, pp52, p 38 |
| 3 | Высокоспецифичные | pp 150, pp 130, pp 28 |
| Таблица 3 | |
| Результат | Описание |
| Положительный | Как минимум одна полоса класса 3, в дополнение несколько полос класса 1 и 2. |
| Неопределенный | Слабая полоса класса 3 или более чем одна полоса класса 2. |
| Отрицательный | Отсутствие полос. Полосы, несоответствующие белкам ЦМВ. Одна полоса класса 1 или одна слабая полоса класса 2. |
| Таблица 4 | |||||||||||
| Результаты исследования сывороток панели МБС ″Стандарт AT-G (+/-) ЦМВ″ | |||||||||||
| № п/п | Паспортная характеристика образца (наличие антител к ЦМВ) | Наличие антител к антигенам… | Результат | ||||||||
| рр 150 | рр 130 | gp 78 | рр 65 | gp 55 | рр 52 | р 42 | р 38 | рр 28 | |||
| 1 | отрицательный | - | - | - | +/- | - | - | - | - | - | отрицательный |
| 2 | отрицательный | - | - | - | +/- | - | - | - | - | - | отрицательный |
| 3 | отрицательный | - | - | - | +/- | - | - | - | - | - | отрицательный |
| 4 | отрицательный | - | - | - | +/- | - | - | - | - | - | отрицательный |
| 5 | отрицательный | - | - | - | +/- | - | - | - | - | - | отрицательный |
| 6 | отрицательный | - | - | - | +/- | - | - | - | - | - | отрицательный |
| 7 | отрицательный | - | - | - | +/- | - | - | - | - | - | отрицательный |
| 8 | отрицательный | - | - | - | +/- | - | - | - | - | - | отрицательный |
| 9 | отрицательный | - | - | - | +/- | - | - | - | - | - | отрицательный |
| 10 | отрицательный | - | - | - | +/- | - | - | - | - | - | отрицательный |
| 11 | отрицательный | - | - | - | +/- | - | - | - | - | - | отрицательный |
| 12 | положительный | + | + | + | + | - | - | - | + | - | положительный |
| 13 | положительный | + | + | - | + | - | - | - | - | - | положительный |
| 14 | положительный | + | - | - | + | - | - | - | - | - | положительный |
| 15 | положительный | + | + | - | + | - | + | + | - | - | положительный |
| 16 | положительный | + | + | +/- | + | - | + | + | + | + | положительный |
| 17 | положительный | + | + | - | + | - | - | - | + | - | положительный |
| 18 | положительный | + | +/- | +/- | + | - | +/- | - | - | - | положительный |
| 19 | положительный | + | +/- | +/- | + | - | +/- | - | - | - | положительный |
| 20 | положительный | + | +/- | +/- | + | +/- | - | - | - | - | положительный |
| 21 | положительный | + | + | + | + | + | + | + | + | - | положительный |
| 22 | положительный | + | + | + | + | + | +/- | + | + | - | положительный |
| Таблица 5 | |||||||||||
| Результаты иммунного блоттинга сывороток | |||||||||||
| № п/п | Предварительная оценка образца в ИФА и РИФ | Наличие антител к антигенам… | Результат ИБ | ||||||||
| рр 150 | рр 130 | gp 78 | рр 65 | gp 55 | рр 52 | р 42 | р 38 | рр 28 | |||
| 1 | положительный | + | + | + | + | + | + | + | + | + | положительный |
| 2 | положительный | + | + | + | + | + | + | + | + | + | положительный |
| 3 | положительный | + | + | + | + | - | + | + | + | - | положительный |
| 4 | положительный | + | + | - | + | + | + | + | + | - | положительный |
| 5 | положительный | + | +/- | + | + | + | + | + | + | + | положительный |
| 6 | положительный | + | + | + | + | +/- | - | + | + | +/- | положительный |
| 7 | положительный | + | + | + | + | + | + | + | + | + | положительный |
| 8 | положительный | + | - | + | + | - | - | - | - | - | положительный |
| 9 | положительный | + | + | + | + | + | + | + | + | + | положительный |
| 10 | положительный | + | + | + | + | + | + | + | + | + | положительный |
| 11 | положительный | + | + | +/- | + | - | + | - | +/- | - | положительный |
| 12 | положительный | + | + | + | + | + | + | + | + | + | положительный |
| 13 | положительный | + | + | +/- | + | + | + | + | + | - | положительный |
| 14 | положительный | + | + | - | + | +/- | - | +/- | +/- | + | положительный |
| 15 | положительный | + | +/- | +/- | + | - | + | +/- | + | +/- | положительный |
| 16 | положительный | + | + | +/- | + | - | + | + | + | + | положительный |
| 17 | положительный | + | + | + | + | + | - | - | - | + | положительный |
| 18 | положительный | + | + | + | + | + | + | + | + | +/- | положительный |
| 19 | положительный | + | + | +/- | + | + | + | + | + | + | положительный |
| 20 | положительный | + | +/- | - | + | - | + | + | + | + | положительный |
| 21 | положительный | + | + | + | + | + | + | + | + | + | положительный |
| 22 | положительный | + | + | + | + | + | + | + | + | - | положительный |
| 23 | положительный | + | + | + | + | + | + | + | + | + | положительный |
| 24 | положительный | + | + | + | + | + | + | + | + | + | положительный |
| 25 | положительный | + | + | + | + | - | + | + | + | - | положительный |
| 26 | положительный | + | + | + | + | + | + | + | + | + | положительный |
| 27 | отрицательный | - | - | - | +/- | - | - | - | - | - | отрицательный |
| 28 | отрицательный | - | - | - | +/- | - | - | - | - | - | отрицательный |
| 29 | отрицательный | - | - | - | +/- | - | - | - | - | - | отрицательный |
| 30 | отрицательный | - | - | - | +/- | - | - | - | - | - | отрицательный |
| Таблица 6 | ||||||||||
| Результаты сравнительных испытаний тест-систем ″Anti-CMV (IgG) WESTERBLOT″ (Euroimmun AG, Германия) и ″ИФА-Блот-ЦМВ-IgG″ (ЗАО ″ЭКОлаб″) | ||||||||||
| Тест-система фирмы | № образца | Наличие антител к антигенам… | Результат ИБ | |||||||
| рр 150 | рр 130 | gp 75 | рр 65 | gp 55 | рр 52 | р 38 | рр 28 | |||
| Euroimmun | 1 | - | + | - | - | - | - | - | + | положительный |
| ЭКОлаб | - | + | - | - | - | - | - | + | положительный | |
| Euroimmun | 2 | - | - | - | +/- | - | - | - | - | отрицательный |
| ЭКОлаб | - | - | - | +/- | - | - | - | - | отрицательный | |
| Euroimmun | 3 | - | + | - | + | + | + | + | + | положительный |
| ЭКОлаб | - | + | - | + | + | + | + | + | положительный | |
| Euroimmun | 4 | - | - | - | +/- | - | - | - | - | отрицательный |
| ЭКОлаб | - | - | - | +/- | - | - | - | - | отрицательный | |
| Euroimmun | 5 | - | - | - | +/- | - | - | - | - | отрицательный |
| ЭКОлаб | - | - | - | +/- | - | - | - | - | отрицательный | |
| Euroimmun | 6 | - | - | - | +/- | - | - | - | - | отрицательный |
| ЭКОлаб | - | - | - | +/- | - | - | - | - | отрицательный | |
| Euroimmun | 7 | - | + | - | +/- | - | - | +/- | + | положительный |
| ЭКОлаб | - | + | - | +/- | - | - | +/- | + | положительный | |
| Euroimmun | 8 | + | + | + | + | + | + | + | + | положительный |
| ЭКОлаб | + | + | + | + | + | + | + | + | положительный | |
| Euroimmun | 9 | + | + | + | + | + | + | + | + | положительный |
| ЭКОлаб | +/- | + | + | + | + | + | + | + | положительный | |
| Euroimmun | 10 | - | + | +/- | + | + | + | + | + | положительный |
| ЭКОлаб | + | + | + | + | + | + | + | +/- | положительный | |
| Euroimmun | 11 | - | + | +/- | + | + | + | +/- | + | положительный |
| ЭКОлаб | + | + | + | + | + | + | +/- | +/- | положительный | |
| Euroimmun | 12 | + | + | + | + | + | + | + | + | положительный |
| ЭКОлаб | + | + | + | + | + | + | + | + | положительный | |
| Euroimmun | 13 | + | + | + | + | + | +/- | +/- | + | положительный |
| ЭКОлаб | + | + | + | + | + | + | +/- | + | положительный | |
| Euroimmun | 14 | - | - | - | +/- | +/- | - | - | - | отрицательный |
| ЭКОлаб | - | - | - | - | - | - | - | - | отрицательный | |
| Euroimmun | 15 | - | - | - | - | - | - | - | - | отрицательный |
| ЭКОлаб | - | - | - | - | - | - | - | - | отрицательный |
1. Способ получения тест-системы для диагностики цитомегаловирусной инфекции методом иммунного блоттинга, включающий получение очищенного вирусного лизата, приготовление иммуносорбента, содержащего специфичные ЦМВ белки рр 150, рр 130, gp 75, рр 65, gp 55, pp52, p 38, рр 28, выделенные из вирусного лизата, приготовление растворов для электрофореза, приготовление раствора для разведения сывороток, приготовление концентрата промывочного раствора, приготовление конъюгата и комплектацию тест-системы с вложением фотографии референс-стрипа.
2. Способ по п.1, в котором используют лизат штамма «CMV AD169».
3. Способ по п.1, в котором иммуносорбент представляет собой стрипы из нитроцеллюлозной мембраны, упакованные в стерильную пробирку.
4. Диагностическая тест-система, полученная способом по пп.1-3.
