Способ получения патулетина и патулетин-7-о-β-d-глюкопиранозида (патулитрина) из растительного сырья

Изобретение относится к способу одновременного получения двух флавоноидов - патулетина и его 7-O-β-D-глюкопиранозида - патулитрина. Способ заключается в том, что измельченные краевые лепестки цветков высокофлавоноидных сортов бархатцев распростертых экстрагируют гексаном, высушивают и повторно экстрагируют хлороформом, хлороформное извлечение концентрируют, сухой остаток растворяют в смеси петролейный эфир - хлороформ, выпавший осадок отфильтровывают, промывают петролейным эфиром и высушивают, полученный сухой порошок растворяют в смеси хлороформ - этанол, выпавший осадок отфильтровывают, промывают петролейным эфиром и высушивают, получая патулетин. Далее проводят экстракцию этанолом сырья, оставшегося после обработки хлороформом, спиртовое извлечение отфильтровывают и концентрируют, после чего водный остаток подвергают жидкофазной экстракции этилацетатом, затем органический слой концентрируют, сухой остаток растворяют в смеси хлороформ - этилацетат, выпавший осадок отфильтровывают, промывают охлажденным этилацетатом, раствором кислоты хлористоводородной в этаноле, этанолом и этилацетатом и высушивают, сухой порошок растворяют в смеси этилацетат-этанол, выпавший осадок отфильтровывают, промывают этилацетатом и высушивают, получая, патулитрин. Вышеописанный способ позволяет упростить получение высокочистых образцов патулетина и патулитрина, а также повысить выход целевого продукта. 4 ил., 3 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к области биоорганической химии и касается способа одновременного получения двух флавоноидов - патулетина и его 7-О-β-D-глюкопиранозида (патулитрина).

Известны следующие способы одновременного выделения патулетина и патулитрина из растительного сырья:

- из цветков Inula britannica (семейство Asteraceae) с применением экстракции сырья 80% метанолом, жидкофазной экстракцией метанольного экстракта гексаном, хлороформом и бутанолом, колоночной хроматографией бутанольной фракции на силикагеле, MCl геле, Сефадексе LH-20 и препаративной ВЭЖХ; выход патулетина - 8.97·10^-4%; патулитрина - 1.15-10^-4% [1];

- из травы Tagetes mendocina (семейство Asteraceae) с применением экстракции сырья гексаном, дихлорметаном и метанолом, жидкофазной экстракцией метанольного экстракта диэтиловым эфиром и этилацетатом, колоночной хроматографией эфирной фракции на Сефадексе LH-20 и препаративной ВЭЖХ; выход патулетина - 1.34·10^-2%; колоночной хроматографией водного остатка на Сефадексе LH-20; выход патулитрина - 5.40·10^-3% [2];

- из цветков Tagetes patula (семейство Asteraceae) с применением экстракции сырья 80% этанолом, препаративной ВЭЖХ спиртового извлечения; выход патулетина - 0.01%, патулитрина - 0.01% [3];

- из цветков Tagetes patula (семейство Asteraceae) с применением экстракции сырья метанолом, жидкофазной экстракцией метанольного экстракта петролейным эфиром и хлороформом, ступенчатой экстракцией водного остатка этилацетатом с последующим концентрированием и объединением фракций одинакового состава; выход патулетина - 0.55%, патулитрина - 0.11% [4].

Недостатками известных методов является применение хроматографических этапов, что повышает стоимость целевых продуктов, а также низкий выход целевого продукта вследствие применения цельной травы или цветков. Ранее было показано, что распределение флавоноидов в цветках бархатцев распростертых (Tagetes patula) неравномерно. Так суммарное содержание данного класса соединений в краевых лепестках составляет 10-11%, в трубчатых - 5-6%, в цветоложе - 4-5% [5]. В этой связи в качестве альтернативного источника для получения доминирующих флавоноидов бархатцев распростертых - патулетина и патулитрина предлагаются краевые лепестки цветков высокофлавоноидных сортов Tagetes patula.

Задачей изобретения является упрощение способа получения высокочистых образцов патулетина и патулитрина, а также повышение выхода целевых продуктов.

Технический результат изобретения (получение патулетина и патулитрина) достигается за счет использования краевых лепестков цветков высокофлавоноидных сортов бархатцев распростертых.

Для достижения указанного технического результата измельченный растительный материал (краевые лепестки цветков бархатцев распростертых) экстрагируют в аппарате Сокслета гексаном в соотношении сырье: экстрагент 1:3, после чего обезжиренное сырье экстрагируют аналогичным образом хлороформом в соотношении сырье:экстрагент 1:(3.5-4.5). Органическое извлечение концентрируют в вакууме до сухого остатка, который растворяют в смеси петролейный эфир - хлороформ (1:1) в соотношении 1:1 при нагревании до 40°C и оставляют при температуре 4°C в течение 36-40 часов. Выпавший осадок отфильтровывают на кварцевом фильтре, промывают петролейным эфиром до бесцветных промывных вод и высушивают в вакууме. Выход целевого продукта патулетина составляет 3.33-4.10% от массы растительного сырья. Растительное сырье после обработки хлороформом экстрагируют 90% этанолом в соотношении сырье:экстрагент 1:(15-20) трехкратно при температуре 85-90°C в течение 60-90 мин. Спиртовое извлечение отфильтровывают, объединяют и концентрируют в вакууме до 1/50 первоначального объема. Водный остаток подвергают жидкофазной экстракции этилацетатом в соотношении остаток:этилацетат 1:(0.3-0.5). Этилацетатные извлечения объединяют, концентрируют в вакууме досуха и растворяют в смеси хлороформ - этилацетат (1:2) в соотношении 1:1 при нагревании до 50°C и оставляют при температуре 48°C в течение 36-40 часов. Выпавший осадок отфильтровывают на кварцевом фильтре, промывают охлажденным этилацетатом (1-2°C), 0.1% раствором кислоты хлористоводородной в 96% этаноле, 96% этанолом и этилацетатом до бесцветных промывных вод и высушивают в вакууме. Выход патулитрина составляет 6.02-7.80% от массы растительного сырья.

Выявленные отличительные признаки позволяют сделать вывод о соответствии предлагаемого технологического решения критерию "новизна".

Предложенный способ позволяет получить субстанции патулетина и патулитрина со следующими свойствами:

- патулетин - аморфный зеленовато-желтый порошок, без вкуса и запаха, нерастворимый в гексане, петролейном эфире и воде, умеренно растворимый в 30% этаноле и этилацетате, хорошо растворимый в хлороформе, метаноле и 96% этаноле. Потеря массы при высушивании - 2-3%;

- патулитрин - аморфный желтый порошок, без вкуса и запаха, нерастворимый в гексане, петролейном эфире, хлороформе и воде, умеренно растворимый в 20% этаноле и этилацетате, хорошо растворимый в 80% метаноле и 70% этаноле. Потеря массы при высушивании - 2-3%.

Способ получения патулетина и патулитрина подтверждается нижеследующими примерами.

Пример 1. 250 г измельченных краевых лепестков бархатцев распростертых сорта «Петит оранж» помещают в патрон из фильтровальной бумаги, полученный патрон вносят в экстракционную колбу аппарата Сокслета. В колбу-приемник приливают 750 мл гексана, присоединяют к экстракционной колбе и обратному холодильнику и проводят экстрагирование при 60°C в течение 36 ч. Патрон после экстракции гексаном высушивают и повторяют экстракцию с 875 мл хлороформа в аналогичных условиях. Хлороформное извлечение концентрируют в вакууме при 60°C до полного удаления растворителя. Сухой остаток растворяют в 120 мл смеси петролейный эфир - хлороформ (1:1) при нагревании до 40°C и оставляют при температуре 4°C в течение 36-40 часов. Выпавший осадок отфильтровывают на кварцевом фильтре (пор 160), промывают 150 мл петролейного эфира и высушивают в вакууме. Сухой порошок растворяют в 100 мл смеси хлороформ - этанол (5:1) и оставляют при температуре 4°C в течение 24-30 часов. Выпавший осадок отфильтровывают на кварцевом фильтре (пор 160), промывают 100 мл петролейного эфира и высушивают в вакууме. Получено 10.25 г патулетина (4.10% от массы воздушно-сухого сырья).

Патрон после экстракции хлороформом высушивают, освобождают растительное сырье, переносят его в колбу со шлифом вместимостью 5 л, приливают 3.75 л 90% этанола, присоединяют обратный холодильник и проводят экстракцию на водяной бане при температуре 85-90°C в течение 90 мин. Спиртовое извлечение отфильтровывают. Экстракцию 90% этанолом повторяют в аналогичных условиях еще два раза. Объединенное спиртовое извлечение концентрируют в вакууме до 1.0-1.2 л. Водный остаток переносят в делительную воронку объемом 2 л, приливают 400 мл этилацетата, перемешивают в течение 10 мин и оставляют до полного расслоения. Органический слой отбирают; жидкофазную экстракцию водного слоя повторяют еще три раза. Объединенный органический слой концентрируют в вакууме до полного удаления растворителя. Сухой остаток растворяют в 100 мл смеси хлороформ - этилацетат (1:2) при нагревании до 50°C и оставляют при температуре 4°C в течение 36-40 часов. Выпавший осадок отфильтровывают на кварцевом фильтре, промывают 50 мл охлажденного этилацетата (1-2°C), 100 мл 0.1% раствора кислоты хлористоводородной в 96% этаноле, 200 мл 96% этанола и 100 мл этилацетата и высушивают в вакууме. Сухой порошок растворяют в 150 мл смеси этилацетат - этанол (3:1) и оставляют при температуре 4°C в течение 24-30 часов. Выпавший осадок отфильтровывают на кварцевом фильтре (пор 160), промывают 100 мл этилацетата и высушивают в вакууме. Получено 19.49 г патулитрина (7.80% от массы воздушно-сухого сырья).

Пример 2. Процесс выделения патулетина и патулитрина проводят аналогично примеру 1; отличие в том, что экстракцию проводят из краевых лепестков бархатцев распростертых сорта «Болеро». Выход целевого продукта патулетина - 8.32 г (3.33% от массы воздушно-сухого сырья), патулитрина - 15.04 г (6.02% от массы воздушно-сухого сырья).

Пример 3. Процесс выделения патулетина и патулитрина проводят аналогично примеру 1; отличие в том, что экстракцию проводят из краевых лепестков бархатцев распростертых сорта «Красная вишня». Выход патулетина - 9.25 г (3.70% от массы воздушно-сухого сырья), патулитрина -17.33 г (6.93% от массы воздушно-сухого сырья).

Пример 4. Процесс выделения патулетина и патулитрина проводят аналогично примеру 1; отличие в том, что экстракцию проводят из краевых лепестков бархатцев распростертых сорта «Дюна». Выход патулетина - 9.04 г (3.62% от массы воздушно-сухого сырья), патулитрина - 16.58 г (6.63% от массы воздушно-сухого сырья).

Физико-химические свойства патулетина и патулитрина

Выделенные соединения согласно данным физико-химического анализа представляют собой 3,5,7,3',4'-тетрагидрокси-6-метоксифлавон (патулетин) и 3,5,7,3',4'-тетрагидрокси-6-метоксифлавон-7-О-β-D-глюкопиранозид (патулитрин) (рис.1). Основные свойства соединений приведены ниже.

Паулетин. УФ-спектр (МеОН, λ_max, нм): 258, 370. Брутто-формула: C₁₆Н₁₂O₈. HR-ESI-MC-спектр (m/z): 355.014 [M+Na]⁺. EI⁺-МС-спектр (m/z): 333 [М+Н]⁺. ¹³С-ЯМР спектр (125 МГц; δ, м.д.): 61.1 (СН₃, 6-ОСН₃), 94.7 (СН, С-8), 104.4 (C, C-10), 116.4 (CH, С-2'), 116.7 (СН, С-5'), 120.8 (СН, С-6'), 121.3 (С, С-10, 132.3 (С, С-6), 137.6 (С, С-3), 146.2 (С, С-30, 148.0 (С, С-2), 148.7 (С, С-4'), 151.7 (С, С-5), 152.8 (С, С-9), 158.9 (С, С-7), 177.2 (С, С-4).

Паулитрин. УФ-спектр (МеОН, λ_max, нм): 259, 372. Брутто-формула: C₂₂Н₂₂O₁₃. HR-ESI-MC-спектр (m/z): 517.112 [M+Na]⁺. EI⁺-МС-спектр (m/z): 495 [М+Н]⁺, 333 [(M-глюкоза)+Н]⁺. ¹³С-ЯМР спектр (125 МГц; δ, м.д.): агликон - 61.2 (СН₃, 6-ОСН₃), 94.7 (СН, С-8), 104.1 (С, С-10), 116.2 (СН, С-2'), 116.9 (СН, С-5'), 120.7 (СН, С-6'), 121.8 (С, С-1'), 132.4 (С, С-6), 137.5 (С, С-3), 146.3 (С, С-3'), 148.1 (С, С-2), 148.7 (С, С-4'), 151.7 (С, С-5), 152.9 (С, С-9), 156.9 (С, С-7), 177.3 (С, С-4); глюкоза - 60.8 (СН₂, С-6”), 70.3 (СН, С-4”), 74.0 (СН, С-2”), 77.4 (СН, С-3”), 78.0 (СН, С-5”), 101.1 (СН, С-1”).

Рациональность использованной схемы выделения подтверждается данными ВЭЖХ. Патулетин и патулитрин являются доминирующими компонентами краевых лепестков Т.patula (рис.2). Патулетин как липофильный флавоноид обладает большим сродством к такому неполярному экстрагенту как хлороформ, в связи с чем обеспечивается его избирательное извлечение. Содержание патулетина в хлороформной фракции Т.patula составляет 75-80% (от массы фракции) (рис.3a). Применение перекристаллизации из смеси хлороформ - этанол (5:1) позволяет получить целевой продукт с содержанием ≥98% (рис.3б). После удаления патулетина из сырья для экстракции более гидрофильного патулитрина применяли 90% этанол, позволяющий извлечь до 96% соединения (рис.4а). После перекристаллизации технического продукта из смеси этилацетат - этанол (3:1) получено целевое соединение с чистотой ≥98% (рис.4б).

Методика количественного анализа субстанции

Около 10 мг (точная навеска) субстанции помещают в колбу со шлифом вместимостью 10 мл, растворяют в 5 мл метанола и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. 1 мл полученного раствора фильтруют через кварцевый фильтр Millipore (⌀0.45 мкм) в хроматографическую виалу и используют для анализа методом микроколоночной ВЭЖХ-УФ. Условия ВЭЖХ-УФ: жидкостный хроматограф Милихром Ф-02 (Эконова); колонка ProntoSIL-120-5-С18 AQ (2×75 мм, ⌀5 мкм; Metrohm AG); подвижная фаза: (4.1 М LiClO₄ в 0.1 М HClO₄):Н₂O 5:95 (A), MeCN (B); градиентный режим B в A: 10-100% (0-20 мин); ν 200 мкл/мин; Т_{колонки} 408°C; V_пробы 1 мкл; детектор при 360 нм.

Содержание патулетина (патулитрина) в субстанции в процентах (X) вычисляют по формуле:

$$X=\frac{S_1\cdot K_1^V}{m_1}\cdot \frac{m_2}{S_2\cdot K_2^V}\cdot \frac{100}{100-W}\cdot 100$$ ,

где S₁ - площадь пика патулетина (патулитрина) в исследуемом растворе; $$K_1^V$$ - коэффициент разбавления исследуемого раствора (10); m₁ - масса навески субстанции, г; S₂ - площадь пика патулетина (патулитрина) в растворе РСО; $$K_2^V$$ - коэффициент разбавления раствора РСО патулетина (патулитрина) (1); m₂ - масса навески патулетина (патулитрина), г; W - потеря в массе при высушивании субстанции, %.

Приготовление раствора РСО патулетина (патулитрина)

Около 1 мг (точная навеска) патулетина (патулитрина) переносят в пробирку Эппендорфа, приливают 1 мл метанола и перемешивают.

Метрологический анализ разработанной методики показал, что относительная ошибка определения хроматографическим методом не превышает 3%. Полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительных валидационных параметрах методик, что указывает на возможность их использования в практике фармакопейного анализа для определения показателей качества субстанций патулетина и патулитрина.

Таблица 1
Метрологические характеристики методики количественного анализа патулетина и патулитрина в субстанции*
Соединение	$$\overline{x}$$ , %	S2	Sx	$$\pm \Delta \overline{x}$$ , %	E,%
патулетин	98.52	2.05	0.64	1.79	1.82
патулитрин	98.94	2.91	0.76	2.12	2.14
*n=5, P=0.95, tP,f=2.78.

По данным проведенных исследований определены общие показатели качества субстанций патулетина и патулитрина, обобщенные в таблицах 2 и 3. Для стандартизации субстанций было предложено определение внешнего вида, подлинности, потери в массе при высушивании, количественное определение содержания основного вещества в субстанции и содержание посторонних примесей.

Рассчитать экономическую целесообразность предлагаемого способа в настоящее время не представляется возможным по причине отсутствия коммерчески доступных образцов сравнения патулетина и патулитрина, однако вышеуказанные преимущества в сочетании с простой схемой получения способствуют рациональному использованию лекарственного растительного сырья и определяют перспективность внедрения данного способа получения в химическую промышленность.

Таблица 2
Показатели качества субстанции патулетина
Показатель	Метод	Норма
Описание, внешние признаки	Визуальный, органолептический	Рассыпчатый негигроскопичный аморфный порошок, цвет от желтого до зеленовато-желтого, запах отсутствует.
Подлинность:
- УФ-спектр	Спектрофотометрический	Ультрафиолетовый спектр 0.001% раствора патулетина в 96% этаноле в области длин волн от 200 до 500 нм должен содержать максимумы поглощения при длинах волн 258±2 и 370±2 нм. На хроматограмме после проявления должна быть единственная зона желтого цвета, совпадающая по подвижности с таковой РСО патулетина; присутствие других зон не допускается.
- патулетин	-ВЭТСХ
Потеря в массе при высушивании	Гравиметрический	Не более 5%
Количественное определение: - содержание патулетина.	ВЭЖХ	Не менее 98%
Посторонние примеси	ВЭЖХ	На хроматограмме, полученной при количественном анализе субстанции, должен присутствовать единственный доминирующий пик с tR ~ 6.50-6.53 мин. Суммарная площадь других пиков не должна превышать 2%.
Хранение		В защищенном от света месте при температуре 12-15°C

Таблица 3
Показатели качества субстанции патулитрина
Показатель	Метод	Норма
Описание, внешние признаки	Визуальный, органолептический	Рассыпчатый негигроскопичный аморфный порошок, цвет желтый, запах отсутствует.
Подлинность:
- УФ-спектр	Спектрофотометрический	Ультрафиолетовый спектр 0.001% раствора патулитрина в 70% этаноле в области длин волн от 200 до 500 нм должен содержать максимумы поглощения при длинах волн 259±2 и 372±2 нм. На хроматограмме после проявления должна быть единственная зона желтого цвета, совпадающая по подвижности с таковой РСО патулитрина; присутствие других зон не допускается.
- патулитрин	-ВЭТСХ
Потеря в массе при высушивании	Гравиметрический	Не более 5%
Количественное определение: - содержание патулитрина.	ВЭЖХ	Не менее 98%
Посторонние примеси	ВЭЖХ	На хроматограмме, полученной при количественном анализе субстанции, должен присутствовать единственный доминирующий пик с tR~4.65-4.69 мин. Суммарная площадь других пиков не должна превышать 2%.
Хранение		В защищенном от света месте при температуре 12-15°С

Краткое описание чертежей

На рис.1 изображены структурные формулы патулетина (а) и патулитрина (б).

На рис.2 изображена хроматограмма спиртового извлечения из краевых лепестков Tagetes patula, на которой числами обозначены соединения: 1 - патулитрин, 2 - патулетин.

На рис.3 изображена хроматограмма хлороформной фракции из краевых лепестков Tagetes patula (а) и патулетина (б), на которой обозначено положение патулетина (2).

На рис.4 изображена хроматограмма спиртовой фракции из краевых лепестков Tagetes patula (а) и патулитрина (б), на которой обозначено положение патулитрина (7).

Источники информации

1. Park E.J., Kim Y., Kim J. Acylated flavonol glycosides from the flower of Inula britannica II Journal of Natural Products. 2000. Vol.63. P.34-36. - прототип.

2. Schmeda-Hirschmann G., Tapiaa A., Theoduloz C, Rodriguez J., Lopez S., Feresin G.E. Free radical scavengers and antioxidants from Tagetes mendocina II Zeitschrift fur Naturforschung. 2004. Vol.59c. P.345-353. - прототип.

3. Guinot P., Gargadennec A., Valette G., Fruchier A., Andary C. Primary flavonoids in marigold dye: extraction, structure and involvement in the dyeing process // Phytochemical Analysis. 2008. Vol.19. P.46-51. - прототип.

4. Faizi S., Siddiqi H., Naz A., Bano S., Lubna Specific deuteration in patuletin and related flavonoids via keto-enol tautomerism: Solvent- and temperature-dependent 'H-NMR studies // Helvetica Chimica Acta. 2010. Vol.93. P. 466-481.- прототип.

5. Кащенко Н.И., Танхаева Л.М., Олейников Д.Н. Фенольные соединения и полисахариды соцветий Tagetes patula II. Материалы V Всероссийской конференции с международным участием "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья". 24-26 апреля 2012 г. Барнаул: Издательство Алтайского университета, 2012. С.262-263.

Способ одновременного получения двух флавоноидов - патулетина и его 7-O-β-D-глюкопиранозида - патулитрина путем экстрагирования цветков бархатцев распростертых, отличающийся тем, что измельченные краевые лепестки цветков высокофлавоноидных сортов бархатцев распростертых помещают в аппарат Сокслета, приливают гексан в соотношении сырье : экстрагент 1:3 и проводят экстрагирование при 60°C в течение 36 ч, после экстракции гексаном высушивают и повторяют экстракцию сырья хлороформом в соотношении сырье : экстрагент 1:(3.5-4.5) в аналогичных условиях, полученное хлороформное извлечение концентрируют в вакууме при 60°C до полного удаления растворителя, затем сухой остаток растворяют в смеси петролейный эфир - хлороформ 1:1 при нагревании до 40°C и оставляют при температуре 4°C в течение 36-40 часов, далее выпавший осадок отфильтровывают, промывают петролейным эфиром и высушивают в вакууме, полученный сухой порошок растворяют в смеси хлороформ - этанол 5:1 и оставляют при температуре 4°C в течение 24-30 часов, затем выпавший осадок отфильтровывают, промывают петролейным эфиром и высушивают в вакууме, получая патулетин; далее экстракции подвергается сырье, оставшееся после обработки хлороформом, причем экстракцию проводят 90% этанолом в соотношении сырье : экстрагент 1:(15-20) трехкратно при температуре 85-90°C в течение 90 мин, полученное спиртовое извлечение отфильтровывают, объединяют и концентрируют в вакууме до 1/50 первоначального объема, после чего водный остаток подвергают жидкофазной экстракции этилацетатом в соотношении остаток : этилацетат 1:(0.3-0.5), затем органический слой отбирают и еще 3 раза повторяют жидкофазную экстракцию водного слоя, далее объединенный органический слой концентрируют в вакууме до полного удаления растворителя, полученный сухой остаток растворяют в смеси хлороформ - этилацетат 1:2 в соотношении 1:1 при нагревании до 50°C и оставляют при температуре 48°C в течение 36-40 часов, после чего выпавший осадок отфильтровывают, промывают охлажденным до 1-2°C этилацетатом, 0,1% раствором кислоты хлористоводородной в 96% этаноле, 96% этанолом и этилацетатом и высушивают в вакууме, сухой порошок растворяют в смеси этилацетат - этанол 3:1 и оставляют при температуре 4°C в течение 24-30 часов, выпавший осадок отфильтровывают, промывают этилацетатом и высушивают, получая патулитрин.