Способ определения жизнеспособности некультивируемых форм vibrio cholerae о1/о139 по экспрессии рибулозодифосфаткарбоксилазы

Авторы патента:

G01N33/569 - микроорганизмов, например протозоа, бактерий, вирусов

Владельцы патента RU 2547564:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Южный федеральный университет" (RU)

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для определения жизнеспособности некультивируемых форм (НФ) Vibrio cholerae O1/O139 в водных объектах при мониторинговых исследованиях, в научно-исследовательской работе с НФ в экспериментах по индукции НС, при изучении устойчивости НФ к физическим и химическим воздействиям, в других исследованиях, в которых необходимо подтвердить жизнеспособность культуры, нивелировав отсутствие роста НФ на плотных питательных средах. Способ заключается в том, что проводят предварительную подготовку контрольных вегетативных культур V. cholerae O1 и V. cholerae O139 и исследуемых образцов, определяют во всех образцах концентрацию белка по Лоури, параллельно из всех образцов готовят препараты «раздавленная капля» с акридиновым оранжевым, фиксируя в люминесцентном микроскопе характер флуоресценции (зеленая - жизнеспособные, красная/оранжевая - мертвые), с последующим определением активности рибулозодифосфаткарбоксилазы (РДФК) радиоизотопным методом с меченым бикарбонатом. Результаты учитывают в сцинтилляционном счетчике, выражают в имп.мин/мкг белка. Наличие в исследуемой пробе активности РДФК указывает на жизнеспособность НФ V. cholerae O1/O139. Использование способа позволяет определить жизнеспособность НФ V. cholerae O1/O139 разного возраста в водной среде различного состава. 2 табл., 2 пр.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для определения или подтверждения жизнеспособности некультивируемых форм (НФ) V. cholerae O1/O139 в водных объектах при проведении санитарных мероприятий или в научно-исследовательской работе.

Уровень техники

V. cholerae O1/O139 - возбудитель холеры - особо опасного инфекционного заболевания с диарейным синдромом. В окружающей среде и в экспериментальных условиях холерный вибрион может переходит в некультивируемое состояние (НС), которое характеризуется обратимой утратой способности расти на рутинных питательных средах. Образование некультивируемых форм (НФ) V. cholerae существенно затрудняет выявление возбудителя в различных объектах окружающей среды при проведении мониторинговых мероприятий и в исследовательской практике.

Отсутствие роста НФ на лабораторных питательных средах требует развития методов, исключающих необходимость визуализации выросших колоний. К таким методам относятся световая и люминесцентная микроскопия, иммуноферментный анализ (ИФА), полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако с помощью перечисленных методов не представляется возможным доказать жизнеспособность обнаруженных микробных клеток, а интактность клетки или амплификация специфической ДНК не эквивалентны жизнеспособности культуры.

Известен способ определения жизнеспособности микробных клеток, получивший название «прямого прижизненного подсчета» (DVD-метод от direct viable counts): тестируемую микробную культуру инкубируют с дрожжевым экстрактом в присутствии налидиксовой кислоты, которая подавляет репликацию бактериальной ДНК, блокируя тем самым деление клетки. Жизнеспособные клетки увеличиваются в размере, а визуализация результата ведется с помощью светового микроскопа. Применение данного способа ограничено тем, что из окружающей среды все чаще выделяют культуры V. cholerae O1/O139, устойчивую к налидиксовой кислоте (Mishra A. et al., 2011).

Известен способ определения жизнеспособности микробных клеток витальным окрашиванием акридиновым оранжевым (АО): микробную взвесь инкубируют 1-2 мин с АО в конечной концентрации 0,01% и визуализируют результат с помощью люминесцентного микроскопа. Жизнеспособные клетки флуоресцируют зеленым, а мертвые оранжевым (Hobbie J.E., et al., 1977). Ограничением способа является возможность изменения флуоресценции в зависимости от физиологического состояния культуры, концентрации красителя, времени экспозиции (Иванов В.Б., 1982).

Учитывая вышеизложенное, для выявления НФ и определения их жизнеспособности чаще всего используют комбинацию микроскопически, молекулярно-генетических, иммуноферментных методов (Luo Z.J. c соавт., 2012, Mishra A. et. al., 2012).

Соответственно, проблема разработки новых способов определения жизнеспособности НФ, которые можно использовать самостоятельно или в комбинации с микроскопическими и/или молекулярно-генетическими методиками, является актуальной.

Одним из перспективных инструментов определения жизнеспособности является регистрация метаболической активности с помощью радиоизотопных методов исследования, которые обладают очень высокой чувствительностью. Показано, что в НС у V. cholerae наблюдается существенная перестройка метаболизма по сапрофитическому типу, поэтому наиболее перспективной мишенью для разработки способа определения жизнеспособности является фермент рибулозодифосфаткарбоксилаза/оксигеназа (РДФК), 3-фосфо-D-глицерат-карбоксилаза, код 4.1.1.39.

За прототип выбран способ определения активности РДФК в инактивных и некультивируемых клетках холерных вибрионов (Бурша с соавт., 1999 г. Соколенко с соавт. 2002). Данный способ не может быть использован для определения жизнеспособности НФ, так как он применяется для исследования метаболических путей вибрионов, но не учитывает изменение активности фермента в процессе некультивируемой трансформации, изменение концентрации белка при переходе в НС, не использует дополнительные способы контроля жизнеспособности.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является разработка способа определения жизнеспособности НФ по активности РДФК с использованием меченого бикарбоната.

Поставленная цель достигается тем, что проводят предварительную подготовку исследуемой микробной взвеси и контрольных штаммов V. cholerae O1 и V. cholerae O139, затем определяют концентрацию белка в пробах под контролем витального окрашивания с АО и определяют активность РДФК с помощью меченого бикарбоната.

Способ осуществляется в соответствии со следующими стадиями:

1. Подготовка микробных взвесей.

2. Определение белка по Лоури и люминесцентная микроскопия препаратов «раздавленная капля», окрашенных АО.

3. Определение жизнеспособности НФ по экспрессии РДФК.

На первой стадии контрольные штаммы в вегетативной форме выращивали 18 часов на агаре Маретна, рН 7,6-7,8, смывали 0,85% раствором натрия хлорида, рН 7,4, дважды отмывали центрифугированием в 50 мМ трис-804 буфере, рН 8,0. В этом же буфере концентрацию клеток доводили до 5×10¹⁰ кл/мл и разрушали их в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в течение 10 мин на холоду. Аналогичным образом готовили переходные и некультивируемые пробы, для чего 50 мл бактериальной взвеси из флаконов центрифугировали для осаждения клеток при 10000 об/мин 10 мин, 2 мл осадка ресуспендировали в 50 мМ трис-804 буфера, еще раз центрифугировали. Полученную микробную взвесь некультивируемых клеток обрабатывали так же, как вегетативные пробы.

НФ и переходные формы получали следующим образом. Культуру V. cholerae O1/O139 выращивали в течение трех часов на 0,3% бульоне Мартена, рН 7,6, пересевали газоном на агар Мартена, рН 7,8, инкубировали 18 часов при 37°С. Микробную массу смывали с поверхности агара средой суспендирования (речная, морская или дистиллированная вода, 0,85% р-р NaCl). Полученные таким образом микробные взвеси вносили в стеклянные флаконы емкостью 100 мл в объеме 50-70 мл и в конечной концентрации 10⁶-10⁹ мк.кл/мл в зависимости от целей эксперимента. Флаконы хранили в холодильнике при температуре 6-8°С без дополнительной аэрации и без освещения. О переходе в НС судили по отсутствию роста на агаре Мартена и наличию в мазках, окрашенных АО, подвижных или неподвижных флуоресцирующих зеленым клеток. Переходными считались культуры, в которых единичные клетки сохраняли способность расти на агаре Мартена в виде изолированных колоний, при окрашивании АО в препарате «раздавленная капля» количество клеток было близко исходному уровню.

На второй стадии во всех исследуемых образцах определяли активность белка по Лоури, для чего отбирали 500 мкл подготовленной пробы, исследовали, как описано у Lowry et al., 1951, результаты учитывали на фотоколориметре KF-77 при длине волны 560 нм. Параллельно из всех исследуемых проб готовили препарат «раздавленная капля», витально окрашенный АО. Для этого на предметное стекло наносили каплю исследуемой микробной взвеси, добавляли АО в конечной концентрации 0,01% (рабочий раствор АО Sigma; разведение 1:6000 в дистиллированной воде), инкубировали 3-4 мин при комнатной температуре и изучали в люминесцентный микроскоп с иммерсионным объективом, увеличение ×1250, длина волны 420 нм. Наличие в поле зрения подвижных и/или неподвижных клеток типичной или измененной морфологии, флюоресцирующих зеленым, указывало на жизнеспособность культуры.

На третьей стадии реакционная смесь содержала: 18 mM трис-Cl буфер, рН 8,0, 20 mM MgCl₂×6H₂O; 10 mM дитиотреитола, 4 mM рибозо-5-фосфата и 500 мкл суспензии гомогенизированных клеток. Пробы инкубировали при 30°С 30 минут с целью ферментативного превращения рибозо-5-фосфата в рибулозо-5-фосфат. Затем в реакционную смесь добавляли 0,026 mM NaH¹⁴CO₃, 6 mM АТФ; 0,6 mM NAD-H и инкубировали 5 минут. Останавливали реакцию 0,02 мл 100% ТХУ. Смесь центрифугировали при 8000 об/мин, 200 мкл полученного супернатанта переносили во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-8. Подсчет активности вели в сцинтилляционном счетчике Mark-11. Параллельно контролировали радиационный фон. Активность фермента выражали в импульсах в минуту на мкг/белка (имп.мин/мкг белка).

Осуществление изобретения

Пример 1.

В качестве исследуемых культур использовали контрольные штаммы V. cholerae O1 17551 и V. cholerae O139 17673 в вегетативной форме, переходные и НФ разного возраста этих же культур, полученные во флаконах с морской водой. На первой стадии проводили предварительную подготовку культур: концентрировали центрифугированием, отмывали 50 мМ трис-SO₄ буфере, рН 8,0, гомогенизировали на холоду. На второй стадии определяли в исследуемых пробах концентрацию белка по Лоури и готовили препараты «раздавленная капля» с АО, которые микроскопировали с помощью люминесцентного микроскопа. На третьей стадии в подготовленных пробах определяли активность РДФК.

Из Таблицы 1 видно, что во всех пробах, как вегетативных, так и переходных и некультивируемых, при микроскопировании с флуорохромом фиксировали жизнеспособность культуры. Концентрация белка после небольшого увеличения в переходных популяциях снизилась в НФ, что необходимо учитывать при определении активности исследуемого фермента. Активность РДФК в вегетативных культурах была на уровне фона, что говорит об отсутствии его экспрессии. В переходных пробах обнаружена экспрессия РДФК, радиоактивность образцов превысила значения фона в 1,86-3,17 раз. В НФ активность фермента возросла еще больше, превысив фон в 2,9-3,44 раза. Таким образом, определение активности РДФК позволяет не только подтвердить жизнеспособность НФ, которые не растут на агаре Мартена, но и дифференцировать вегетативные культуры холерных вибрионов от переходных (старвирующих), что должно учитываться при проведении мониторинговых мероприятий.

Таблица 1
Активности РДФК в культурах V. cholerae O1/O139 в вегетативных, переходных и НФ, полученные в микрокосмах с морской водой
Штамм	Форма	Концентрация белка мкг/мл	Жизнеспособные клетки в мазках с АО	Активность РДФК, имп.мин/мкг белка
Контроль (фон)				4,660
V. cholerae O1 17551	вегетативная	80	+	4,688
V.cholerae O139 17673	вегетативная	70	+	4,285
V. cholerae O1 17551	переходная, 20 сут	95	+	10,063

V. cholerae O1 17551	переходная, 45 сут	70	+	14,828
V. cholerae O139 17673	переходная, 45 сут	80	+	7,980
V. cholerae O1 17551	НФ, 30 сут	55	+	16,112
V. cholerae O139 17673	НФ, 30 суток	65	+	12,442

Пример 2.

В качестве исследуемых использовали культуры контрольных штаммов V. cholerae O1 17551 и V. cholerae O139 17673 в вегетативной форме и их некультивируемые варианты возраста 7, 30 и 60 суток, полученные в микрокосмах с различными органическими добавками, которые встречаются в поверхностных водоемах.

Таблица 2
Активность РДФК V. cholerae O1/O139 в НФ разного возраста, полученных в микрокосмах разного состава
Штамм	Среда	Форма/возраст	Конц-ия белка мкг/мл	Жизнеспособные кл. в мазках с АО	Акт-ть РДФК Имп/мкг. белка
Контроль					2,000
V. cholerae O139 17673	физ. р-р	вегетативная	70	+	2,311
V. cholerae O1 17551	физ. р-р	вегетативная	70	+	1,833
V. cholerae O139 17673	Дис. вода	НФ, 7 сут	85	+	4,073
V. cholerae O1 17551	Дист. вода	НФ, 7 сут	100	+	4,118
V. cholerae O139 17673	Дист. вода	НФ, 30 сут	20	+	22,418
V. cholerae O1 17551	Дист. вода	НФ, 30 сут	20	+	30,685
V. cholerae O139 17673	Дист. вода	НФ, 60 сут	<20	+	3,634
V. cholerae O1 17551	Дист. вода	НФ, 60 сут	<20	+	7,716
V. cholerae O139 17673	NH₄Cl	НФ, 7 сут	90	+	4,073
V. cholerae O1 17551	NH₄Cl	НФ, 7 сут	57	+	4,505

V. cholerae O139 17673	KNO₃	НФ, 30 сут	35	+	13,531
V. cholerae O139 17673	Янт. к-та	НФ, 30 сут	<20	+	37,333
V. cholerae O1 17551	Янт. к-та	НФ, 60 сут	20	+	12,075
V. cholerae O139 17673	Янт. к-та	НФ, 60 сут	<20	+	11,201
V. cholerae O139 17673	Каталаза	НФ, 30 сут	30	+	13,531
V. cholerae O1 17551	Каталаза	НФ, 30 сут	30	+	27,930
V. cholerae O139 17673	Каталаза	НФ, 60 сут	20	+	8,606
V. cholerae O1 17551	Каталаза	НФ, 60 сут	25	+	3,969

На этапе индукции НС в микрокосмы добавляли по одному из следующих компонентов: 1 или 10 мМ NH₄Cl и 1 или 10 мМ KNO₃, витамин Е 1 или 10 мМ, 1 или 10 мМ янтарной кислоты. Для определения жизнеспособности вегетативные и НФ проводили согласно трем стадиям, описанным выше.

Из таблицы 2 видно, что в вегетативных культурах активность РДФК отсутствует. Витальное окрашивание АО показало, что все НФ, взятые в эксперимент, независимо от возраста и среды суспендирования, жизнеспособны. Концентрация белка после небольшого увеличения в 7-суточных НФ, снижалась в более старых культурах, достигая к 60-суткам порога чувствительности метода. Активность РДФК обнаружена как в самых молодых НФ (7-суточных), так и в 60-суточных. Максимальная экспрессия фермента зафиксирована в 30-суточных некультивируемых популяциях. В среднем радиоактивность образцов в 7-суточных НФ превышала уровень фона в 4,19 раз, в 30-суточных - в 26, 38 раз, в 60-суточных - в 7,87 раз.

Таким образом, из вышеизложенного следует, что определение активности фермента РДФК в некультивируемых популяциях позволяет выявить жизнеспособные культуры, не зависимо от состава среды инкубирования и возраста НФ с учетом депротеинизации культуры.

Использование предлагаемого изобретения позволяет с высокой степенью чувствительности (≥20 мкг белка/мл) с помощью меченого бикарбоната определить жизнеспособность некультивируемых холерных вибрионов в водной среде разного состава, преодолевая тем самым главную проблему работы с НФ - отсутствие роста на плотных питательных средах. Обнаружение активности РДФК в некультивируемых или переходных пробах - показатель жизнеспособности возбудителя, трансформации его ферментативного профиля, свидетельство возможности переживания неблагоприятных условий в НС в окружающей среде, что должно учитываться при проведении мониторинговых мероприятий.

Кроме того, способ может использоваться в научно-исследовательской работе с НФ как высокочувствительный инструмент определения жизнеспособности полученных культур в условиях индукции НС, изучения устойчивости НФ к различным воздействиям (антибиотикам, дезинфицирующим средствам, физическим воздействиям и т.д.) или как подтверждающий жизнеспособность тест при проведении витальной микроскопии или молекулярно-генетических исследований.

Список использованной литературы

1. Бурша О.С., Каграманов B.C., Соколенко А.В. Определение активности рибулозодифосфаткарбоксилазы у инактивных вариантов V. cholerae eltor. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1999. №6, с.90-91.

2. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней. МУ. М: 2011 г., 63 с.

3. Соколенко А.В., Ломов Ю.М., Асеева Л.Е., Каграманов B.C., Бурша Л.Е. Особенности обмена некультивируемых форм холерных вибрионов. // Успехи современного естествознания. 2002. №2, с.22-30.

4. Luo Z.J., Zhou Z.S., Hao C.H., Guo Y.S., Liu H.Y., Zheng H.Y., Huang Z. Detection of the viable but nonculturable Escherichia coli 0157:H7 in aquatic microcosm. // Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. 2012. Feb; 46(2): 129-32.

5. Mishra A, Taneja N, Sharma М. Demonstration of viable but nonculturable Vibrio cholerae O1 in fresh water environment of India using ciprofloxacin DFA-DVC method. // Lett. Appl. MicrobioL 2011 Jul; 53(1):124-6.

6. Mishra A, Taneja N, Sharma М. Viability kinetics, induction, resuscitation and quantitative real-time polymerase chain reaction analyses of viable but nonculturable Vibrio cholerae O1 in freshwater microcosm. // J. Appl. Microbiol. 2012 May; 112(5):945-5

7. Иванов В.Б. Активные красители в биологии. М., «Наука», 1982. - 214 с.

8. Hobbie J.E., Daley R.J., Jasper S. Use of nucleopore filters for counting bacteria by fluorescence microscopy. // Appl. Environ. Microbiol. 1977, 33(5): 1225-1228.

Способ обнаружения жизнеспособности некультивируемых форм V. cholerae O1/O139, отличающийся тем, что проводят предварительную подготовку контрольных вегетативных культур и исследуемых некультивируемых образцов, концентрируя микробные взвеси центрифугированием и гомогенизируя клетки на холоду, определяют в них концентрацию белка по Лоури, параллельно готовят мазки «раздавленная капля» с акридиновым оранжевым, оценивают жизнеспособность культур по цвету флуоресценции, с последующим определением экспрессии РДФК с помощью меченого бикарбоната натрия, результат считывают в сцинтилляционном счетчике, при этом наличие в исследуемой пробе активности фермента РДФК свидетельствует о жизнеспособности некультивируемых форм возбудителя.

Группа изобретений относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, иммунохимии, и касается диагностики цитомегаловирусной инфекции методом иммунного блоттинга, который является референтным, наиболее высокочувствительным, высокоспецифичным, подтверждающим (или исключающим) диагноз при подозрении на инфицирование в случае получения положительных или сомнительных (неопределенных) результатов.

Средства и способы определения количества полипептида нейротоксина и его каталитической и протеолитической активностей // 2545783

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способы и устройства для определения количества процессированного полипептида нейротоксина в растворе путем вычитания количества частично процессированного и непроцессированного нейротоксина из количества общего нейротоксина.

Способ предпосевной обработки патологического материала для выделения микобактерий // 2542460

Изобретение относится к медицине и описывает способ предпосевной обработки патологического материала для выделения микобактерий, включающий воздействие дезинфекционным средством, где в качестве дезинфекционного средства используют «Септустин», причем обработку проводят смешиванием водного раствора «Септустина» в концентрации 0,5% и патологического материала в объемном соотношении 1:2 в течение 30 минут при комнатной температуре с последующей двукратной в течение 15 минут отмывкой физиологическим раствором.

Способ и набор для ускоренной лабораторной диагностики коклюшной инфекции // 2542396

Группа изобретений относится к области медицинской микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний. Заявлен унифицированный, ускоренный, высокочувствительный, высокоспецифичный, малотрудоемкий способ для ускоренной лабораторной диагностики коклюшной инфекции, включающий проведение следующих этапов: взятие патологического материала с задней стенки глотки больного, пробоподготовка клинического образца, выделение ДНК из клинического материала сорбционным методом, проведение амплификации при изотермальных условиях и электрофореза в агарозном геле, а также диагностический набор.

Способ прогнозирования развития симптоматической эпилепсии при нейроинфекциях у детей // 2537886

Изобретение относится к области медицины, а именно к неврологии, и может быть использовано в клинической практике инфекционистов и неврологов. Определяют наличие коматозного состояния в днях; на МРТ - очаги структурных изменений головного мозга; на ЭЭГ - эпилептиформную активность, диффузные острые волны, острые волны, спайки, редуцированные комплексы, высокоамплитудные пароксизмы медленной активности, частые пароксизмы комплексов «пик-медленная волна», «спайк-медленная волна».

Способ и устройство для выявления бактериального заражения образца крови и ткани // 2536209

Группа изобретений относится к области медицины и может быть использована для определения присутствия клинически релевантного количества бактерий в донорской крови или ткани.

Способ элюции патогена с иммобилизованной магнитной матрицы // 2535070

Изобретение относится к медицине, в частности к элюированию сконцентрированного на магнитной матрице патогена. Способ элюции осуществляется следующим образом: 0,1 мл 10% взвеси магнитно-иммунного сорбента (МИС) туляремийного, чумного или бруцеллезного инкубируют с микробными взвесями возбудителей туляремии, бруцеллеза или чумы в течение 30 мин, удаляют надосадок, далее МИС инкубируют с 0,5 мл элюирующего раствора в течение 10 мин, pH элюата возвращают к физиологическому значению, проводят постановку реакции непрямой гемагглютинации или реакции агглютинации латекса.

Способ оценки напряженности поствакционального иммунитета к вирусу гриппа // 2533272

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционной иммунологии. Способ предусматривает использование для сенсибилизации твердой фазы противогриппозной вакцины, при том что визуализацию сформировавшихся в ходе инкубации сенсибилизированной поверхности иммуносорбента с тестируемой сывороткой, содержащей антитела к вирусу гриппа, комплексов антиген-антитело проводят при помощи оптически контрастного конъюгата G белок-углерод в течение 10-15 минут.

Способ прогнозирования риска развития инфекционно-воспалительных осложнений у женщин с внутриматочной патологией после гистероскопии // 2526163

Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития инфекционно-воспалительных осложнений у женщин с внутриматочной патологией после гистероскопии.

Штамм вируса гриппа a/pochard/siberia/249/08-ma h10n7-субтипа для получения антиген-содержащего диагностического препарата и диагностической поликлональной сыворотки, применения в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе пцр и для изучения противовирусных препаратов in vitro и in vivo // 2522813

Изобретение относится к области вирусологии и касается штамма вируса гриппа H10N7-cyбтипа. Охарактеризованный штамм вируса гриппа A/pochard/Siberia/249/08-МА H10N7-субтипа выделен из клоакального смыва красноголового нырка и адаптирован к линии BALB/c мышей.

Способ получения обработанного виртуального изображения анализа // 2548399

Изобретение относится к способам цитологического или гистологического анализа. Согласно способу производят обработку пробы для выделения патологических клеток среди здоровых. Получают множество изображений пробы, каждое из которых характеризует одну зону пластинки для анализа. Множество изображений, расположенных рядом друг с другом, образуют изображение всей пробы, в результате чего получают виртуальную пластинку для анализа. На полученной виртуальной пластинке выполняют компьютерную обработку по окрашиванию изображений. Указанное окрашивание соответствует виртуальному окрашиванию типа окрашивания по Папаниколау, Шорру, Маю-Грюнвальду-Гимзе или Гимзе. При этом обработка обеспечивает возможность менять указанные цвета и интенсивность цвета по усмотрению лица, производящего анализ. Технический результат - повышение достоверности и качества анализа. 7 з.п. ф-лы, 6 ил.

Способ диагностики токсигенных штаммов clostridium difficile // 2548719

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способу диагностики токсигенных штаммов Clostridium difficile. Сущность способа состоит в том, что пробу кала пациента выдерживают в абсолютном 96% спирте 30-60 мин при соотношении спирта и кала 1:1, центрифугируют 15-20 минут, далее обрабатывают пробу кала 1% раствором дезоксихолата натрия при соотношении 1:1 30-60 минут, центрифугируют, удаляют надосадочную жидкость, затем проводят первичный посев осадка на среде с добавлением 1% лактозы и 0,5-1,0 мМ арабинозы, инкубируют в анаэростате в течение 24-48 ч, выросшие колонии наносят на стандартные диски, пропитанные хромогенным субстратом - орто-нитрофенил-β-D-галактозидазой. При появлении ярко-желтой окраски диска диагностируют токсигенные штаммы Clostridium difficile. Использование заявленного способа позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью, простотой и доступностью диагностировать токсигенные штаммы Clostridium difficile. 3 пр.

Диагностика паразитарного заболевания, такого как лейшманиоз, с использованием экстракта рибосомальных белков (rpe) // 2558233

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Применяют экстракт рибосомального белка (RPE) вида Leishmania для диагностики лейшманиоза у индивидуума, причем RPE содержит, по меньшей мере, два рибосомальных белка. Применение экстракта рибосомальных белков позволяет проводить досимптоматическую диагностику лейшманиоза. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

Диагностические и терапевтические способы // 2559584

Группа изобретений относится к медицине и касается способа лечения или профилактики RHD, связанного с инфекцией GAS, включающего введение пациенту по меньшей мере одного антигена GAS, выбранного из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их функциональные эквиваленты. Группа изобретений также касается способа диагностики RHD, связанного с инфекцией GAS, у пациента; белкового чипа для диагностики RHD, связанного с инфекцией GAS, у пациента; набора, содержащего указанный белковый чип и инструкции для применения в диагностике пациентов с наличием или с риском развития ревматического порока сердца, связанного с инфекцией GAS. Группа изобретений обеспечивает лечение RHD, связанного с инфекцией GAS; точную диагностику RHD. 6 н. и 7 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 1 пр.

Антитела или их фрагменты, направленные против эпитопа стафилококка золотистого (staphylococcus aureus) // 2560415

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его функциональному фрагменту, направленным против эпитопа стафилококка золотистого, а также к их применению для обнаружения стафилококка золотистого. Раскрыта линия клеток гибридомы, которая продуцирует вышеуказанное антитело, где линия клеток гибридомы является клеточной линией, хранящейся в DSMZ под инвентарным номером DSM АСС2987. Также изобретение относится к способу лечения или профилактики, который содержит введение вышеуказанного антитела или его функционального фрагмента человеку или животному, где лечение является лечением инфекции человека или животного, где инфекция вызвана стафилококком золотистым, и где профилактика является профилактикой такой инфекции, вызванной стафилококком золотистым. Изобретение позволяет эффективно лечить инфекцию человека, вызванную стафилококком золотистым. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл.

Способ диагностики туберкулезной инфекции // 2560679

Изобретение относится к области медицины и предназначено для диагностики туберкулезной инфекции. Осуществляют взятие периферической венозной крови, определение в гепаринизированной крови уровня стимулированного ИФН-γ иммуноферментным методом. В гепаринизированной цельной крови определяют уровень CD4+CD27- - лимфоцитов методом лазерной проточной цитофлюориметрии. У людей с отрицательными кожными пробами на препарат Диаскинтест при совокупном повышении уровня стимулированного ИФН-γ более 18,0 пг/мл и CD4+CD27- - лимфоцитов более 15,0% подтверждают наличие туберкулезной инфекции. Изобретение позволяет диагностировать туберкулезную инфекцию у лиц с подозрением на туберкулез при отрицательных результатах кожной пробы с препаратом Диаскинтест путем определения иммунного ответа на антигены препарата Диаскинтест in vitro. 4 пр.

Способ определения антител к бактериальным антигенам // 2563885

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к определению наличия антител к бактериальным антигенам в сыворотке крови животных. Для этого антиген смешивают с тестируемой сывороткой крови в различных разведениях в лунках микропланшета с V-образным дном с последующей визуализацией результатов реакции агглютинации с использованием источника ультрафиолетового излучения, преимущественно трансиллюминатора. В качестве антигена используют флюоресцентно-меченую суспензию инактивированных бактериальных клеток, которую получают при обработке бактериальных клеток 1,0% водным раствором флюоресцентного красителя, выбранного из группы: бромистый этидий, пропидия иодид, акридиновый оранжевый. Изобретение позволяет упростить проведение иммуноферментного анализа для определения наличия различных патогенных микроорганизмов и автоматизировать учет результатов. 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 4 пр.

Способ связывания mycobacteria // 2573921

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ связывания Mycobacteria и/или фрагментов Mycobacteria, присутствующих в водной жидкости, с твердой поверхностью. Добавляют к указанной жидкости достаточное количество водорастворимого полимера в присутствии твердой поверхности для вытеснения Mycobacteria и/или их фрагментов из указанной жидкости на твердую поверхность. Поверхность может быть представлена в виде микросферы. В качестве водорастворимого полимера может быть выбран, например, декстран, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон. Изобретение позволяет осуществлять связывание с твердой поверхностью бактерий Mycobacteria и их фрагментов, которые не осаждаются в условиях центрифугирования. 18 з.п. ф-лы, 11 пр.

Бактериофаг, обладающий активностью против pseudomonas aeruginosa, белки бактериофага и способы их применения // 2580248

Настоящее изобретение относится к области бактериофаговой терапии для лечения и регулирования бактериальных инфекций. Представленная группа изобретений касается выделенного бактериофага, обладающего активностью против Pseudomonas aeruginosa, белков, кодируемых геномом такого бактериофага, фармацевтической композиции, содержащей такие белки, применяющейся для изготовления лекарственного средства для лечения инфекции, обусловленной Pseudomonas aeruginosa, способа диагностики бактериальной инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa, и способа уменьшения или ингибирования колонизации или роста Pseudomonas aeruginosa на твердой поверхности. Представленная группа может быть использована в больницах для избирательного лечения инфекций, обусловленных Pseudomonas aeruginosa, не оказывая при этом влияния на нормальную окружающую флору. 12 н. и 18 з.п. ф-лы, 228 ил., 1 табл., 8 пр.

Способ определения чувствительности helicobacter pylori к антибиотикам // 2588469

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в гастроэнтерологии. Предложен способ определения чувствительности Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам. Проводят серию двукратных разведений антибактериальных препаратов в бульоне Шедлера с рН 7,6±0,2 в горизонтальных лунках 96-луночного планшета. Приготовленную взвесь бактерий вносят в лунки, культуру инкубируют в микроаэрофильных условиях в течение 24 часов при температуре 37°С. Добавляют реагент, используемый при постановке уреазного теста идентификации Helicobacter pylori. Измеряют оптическую плотность содержимого лунок планшета с помощью спектрофотометра, используя длину волны 630 нм. Минимальная подавляющая концентрация антибиотика определяется при построении графика соотношения концентрации антибиотика и оптической плотности и находится в точке выхода кривой на нулевой уровень значения оптической плотности. Способ обеспечивает повышение точности определения чувствительности культур Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам. 2 ил., 6 табл., 2 пр.