Новые октапептидные соединения, представляющие собой производные соматостатина

Авторы патента:

АРТЗНЕР Франк (FR)

СЕНТРА Жан-Кристоф (FR)

ШЕРИФ-ШЕЙКХ Ролан (ES)

ПАТЕРНОСТР Мари-Терез (FR)

ЭЙССЕЛСТЕЙН Мартен (NL)

РУССО Бернар (FR)

ВАЛЕРИ Селин (FR)

РУ Стефан (FR)

C07K7/64 - циклические пептиды, содержащие только нормальные пептидные связи

C07K14/655 - соматостатины

A61P5/02 - гормонов гипоталамуса, например TRH, GnRH, CRH, GRH, соматостатина

A61K38/31 - соматостатины

A61K38/08 - пептиды, содержащие 5-11 аминокислот

Владельцы патента RU 2547940:

ИПСЕН ФАРМА С.А.С. (FR)
КОММИССАРИАТ А Л'ЭНЕРЖИ АТОМИК Э О ЭНЕРЖИ АЛЬТЕРНАТИВ (С.Е.А.) (FR)
САНТР НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛЯ РЕШЕРШ СЬЕНТИФИК (С.Н.Р.С.) (FR)

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложено новое октапептидное соединение общей формулы (I): H-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-AA⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂. Соединение (I) имеет сродство к некоторым подтипам рецепторов соматостатина, поэтому может быть использовано в качестве терапевтически активного пептида при разработке составов лекарственных средств для лечения патологических состояний или заболеваний, в которых задействованы один или несколько рецепторов соматостатина. Также соединение (I) может быть использовано в качестве пептида, служащего носителем в рецептурных составах. 19 з.п. ф-лы, 3 табл., 25 пр.

Настоящее изобретение относится к новым октапептидным соединениям. Эти продукты обладают хорошим сродством к некоторым подтипам рецепторов соматостатина, они особенно интересны для лечения патологических состояний или заболеваний, в которых задействован(ы) один (или несколько) рецептор(ов) соматостатина. Кроме того, эти соединения имеют физико-химические свойства, позволяющие их использовать в различных решениях при разработке составов лекарственных средств, например, в качестве фармацевтически приемлемого носителя. Изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим указанные продукты и к их применению для получения лекарственного средства.

Соматостатин (SST) является циклическим тетрадекапептидом, который был впервые выделен из гипоталамуса как вещество, ингибирующее гормон роста (Brazeau P. и др., Science 1973, 179, 77-79). Он выполняет также функцию нейротрансмиттера в головном мозге (Resine T. и др., Neuroscience 1995, 67, 777-790; Resine и др., Endocrinology 1995, 16, 427-442). Гетерогенность биологических функций соматостатина и связь между структурой и активностью его пептидных аналогов привели к открытию 5 подтипов мембранных рецепторов (Yamada и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 251-255, 1992; Raynor, K. и др., Mol. Pharmacol., 44, 385-392, 1993). Молекулярное клонирование позволило доказать, что биологическая активность соматостатина зависит напрямую от этих пяти подтипов рецепторов.

В настоящее время активно изучается функциональная роль этих рецепторов. Преимущественная активация 2-го и 5-го подтипов этих рецепторов связана с супрессией гормона роста GH (акромегалия), гормона TSH и пролактина в аденомах, экспрессирующих эти гормоны; однако точную роль каждого такого подтипа еще предстоит определить.

Среди патологических нарушений, связанных с соматостатином (Moreau J.P. и др., Life Sciences, 1987, 40, 419; Harris A.G. и др., The European Journal of Medicine, 1993, 2, 97-105), можно назвать в качестве примера: акромегалию, гипофизарные аденомы, болезнь Кушинга, гонадотропиномы и пролактиномы, побочные катаболические эффекты глюкокортикоидов, диабет, диабетическую ретинопатию, диабетическую нефропатию, гипертиреоз, гигантизм, гастроэнтеропанкреатические эндокринные опухоли, такие как карциноидный синдром, ВИПома, инсулинома, незидиобластоз, гиперинсулинемия, глюкагонома, гастринома и синдром Золлингера-Эллисона, GRF-ома, а также острые кровотечения из варикозно расширенных вен пищевода, гастроэзофагитный рефлюкс, гастродуоденальный рефлюкс, панкреатит, свищи желудка и поджелудочной железы, а также диареи, стойкие диареи при приобретенном иммунодепрессивном синдроме, хроническую секреторную диарею, диарею, ассоциированную с синдромом раздраженного кишечника, нарушения, связанные с гастрин-высвобождающим пептидом, вторичные патологии кишечных трансплататов, портальную гипертензию и кровотечения из варикозно расширенных вен у пациентов с циррозом, желудочно-кишечное кровотечение, кровотечение при язве двенадцатиперстной кишки, болезнь Крона, системный склероз, демпинг-синдром, синдром короткой кишки, гипотензию, склеродермию и медулярную карциному щитовидной железы, болезни, связанные с гиперпролиферацией клеток, такие как рак, в частности рак грудной железы, рак простаты, рак щитовидной железы, а также рак поджелудочной железы и рак прямой кишки, фиброзы, в частности, фиброз почек, фиброз печени, фиброз легких, фиброз кожи и фиброз центральной нервной системы, а также полипы носа и фиброз, вызванный химиотерапией, а также другие области терапии, такие как цефалии, в том числе, цефалии, связанные с гипофизарными опухолями, боли, приступы паники, химиотерапия, рубцевание ран, почечная недостаточность, вызванная задержкой роста, ожирение и задержка роста, связанная с ожирением, задержка внутриутробного развития, дисплазия скелета, синдром Нунан, синдром апное во сне, болезнь Грейвса, поликистоз яичников, псевдокистоз поджелудочной железы и асциты, лейкоз, менингиома, раковая кахексия, ингибирование Н. pylori, псориаз, а также болезнь Альцгеймера. Можно также назвать остеопороз.

В настоящее время большое внимание уделяется пептидам, обладающим сродством к рецепторам соматостатина. Так, был изучен препарат ланреотид для лечения заболеваний, связанных с гормоном роста (Cendros JM, Peraire C, Trocóniz IF, Obach R. Pharmacokinetics and population pharmacodynamic analysis of lanreotide Autogel. Metabolism. 2005 Oct, 54(10), 1276-81).

Следовательно, главная цель заключается в поисках альтернативных путей существующим решениям. Настоящее изобретение служит достижению этой цели.

Таким образом, предлагаются новые октапептидные соединения, обладающие хорошим сродством с рецепторами соматостатина и/или физикохимическими свойствами, позволяющими их использовать в различных решениях при разработке составов лекарственных средств.

Соединения согласно изобретению имеют многочисленные преимущества, в частности, они имеют по меньшей мере одну из следующих характеристик:

- обладают сродством к рецепторам соматостатина,

- имеют реологические свойства, обеспечивающие диапазон вязкостей, совместимый с инъецированием,

- возможность использования в качестве носителя в составе лекарственного средства,

- обладают способностью к самосборке в форме монодисперсных нанотрубок разного диаметра,

- обладают способностью к самосборке в форме волокон,

- обладают различной степенью растворимости в воде.

Таким образом, изобретение относится к октапептидному соединению общей формулы (I):

H-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-AA⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂ (I)

в которой АА⁴ обозначает аминокислотный остаток, связанный с аминокислотами Tyr³ и Lys⁵согласно формуле:

в которой n4 означает целое число от 0 до 3 и R4 обозначает атом водорода, алкильный, циклоалкильный, арильный или гетероарильный радикал, причем арильный и гетероарильный радикалы необязательно замещены одним или несколькими радикалами, одинаковыми или различными, выбираемыми из арилазо, галогена, нитро, гидроксила, арила, OR41;

R41 обозначает радикал , в котором R42 обозначает алкильный радикал или атом водорода, n обозначает целое число от 2 до 4, m обозначает целое число от 1 до 4;

при условии, что все аминокислоты могут иметь конфигурацию D или L,

за исключением соединений H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(3-пиридил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂, H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂, H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Trp⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂ и их солей,

или к фармацевтически приемлемой соли этого соединения.

Согласно настоящему изобретению под аминокислотным остатком подразумевают остаток, который образует аминокислота, у которой амино- и кислотные группы включены в образование пептидных связей. Таким образом, аминокислотный остаток, содержащий R в качестве боковой цепи, будет остатком формулы -NH-CH(R)-C(O)-.

Согласно настоящему изобретению аминокислоты, представленные в общей формуле трехбуквенным кодом, либо в качестве кислоты как таковой, либо в качестве остатка, могут относиться к конфигурации D или, если указание на нее отсутствует, к конфигурации L.

Кроме того, согласно изобретению и в соответствии с конвенцией, название пептидов, представленных в примерах последовательностью аминокислот, входящих в их состав и обозначаемых трехбуквенным кодом, подразумевает как аминокислоты конфигурации L, если указание на конфигурацию отсутствует, так и аминокислоты конфигурации D, когда конкретно указывается буква D перед трехбуквенным кодом, обозначающим данную аминокислоту.

В рамках настоящего изобретения под алкильным радикалом, если не указано иное, понимают алкильный радикал, линейный или разветвленный, содержащий 1-6 атомов углерода, такой как метильный, этильный, пропильный, изопропильный, бутильный, изобутильный, трет-бутильный, пентильный или гексильный, предпочтительно содержащий 1-4 атома углерода.

Под циклоалкильным радикалом понимают циклический радикал, содержащий 3-7 атомов углерода, соединенных между собой простыми связями, такой как циклопропильный, циклобутильный, циклопентильный, циклогексильный или циклогептильный. Этот радикал необязательно замещен алкильным радикалом, который определен выше. Предпочтительно, циклоалкильный радикал содержит от 4 до 6 метиленовых звеньев, такой как циклобутильный, циклопентильный или циклогексильный радикал. Особенно предпочтительно, когда циклоалкильный радикал означает циклогексильный радикал.

Под арильным радикалом понимают карбоциклическую ненасыщенную систему, включающую по меньшей мере один ароматический цикл, предпочтительно, радикал, выбранный из фенила, нафтила, антрила (или антраценила) и флуоренила.

Под арилазо радикалом понимают в рамках настоящего изобретения радикал формулы арил-N=N-, в котором арильный радикал определен выше. Предпочтительно, радикал арилазо означает радикал фенилазо.

Под гетероарильным радикалом в рамках настоящего изобретения понимают ароматический ненасыщенный цикл, содержащий один или несколько гетероатомов, одинаковых или различных, выбранных из N, O и S, такой как пиридинил, пиримидинил, фурил, тиенил, бензотиенил, оксазолил, бензоксазолил, изоксазолил, тиазолил, пиролил, пиразолил, имидазолил, триазолил, тетразолил, особенно, тиенил, бензотиенил и имидазолил.

Согласно настоящему изобретению термин «фармацевтически приемлемая соль» означает аддитивные соли с неорганическими кислотами, такие как гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, сульфат, фосфат, дифосфат и нитрат, или с органическими кислотами, такие как ацетат, малеат, фумарат, тартрат, сукцинат, цитрат, лактат, метансульфонат, п-толуолсульфонат, памоат и стеарат. Другие примеры фармацевтически приемлемых солей можно найти в документе «Salt selection for basic drugs», Int. J. Pharm. (1986), 33, 201-217.

Согласно настоящему изобретению аминокислоты представляют собой аминокислоты, известные специалисту с конфигурацией D или L, и обозначаемые в данном описании в соответствии с общепринятой номенклатурой, а также синтетические аналоги, модифицированные в боковых цепях указанных аминокислот, среди которых:

- β-(3-бензотиенил)-Ala, β-(2-тиенил)-Ala, β-(1-нафтил)-Ala, β-(2-нафтил)-Ala или 2-Nal, β-(9-антрил)-Ala, β-(2-флуоренил)-Ala означают аланин, замещенный в β положении соответственно бензотиенилом по положению 3 этого цикла, тиенилом по положению 2 этого цикла, нафтилом по положению 1 этого цикла, нафтилом по положению 2 этого цикла, антрилом по положению 9 этого цикла и флуоренилом по положению 2 этого цикла;

- Ph-Gly или Phg означает глицин, замещенный фенильным радикалом;

- Гомо-Phe или Гомо-phe означает фенилаланин, боковая цепь которого удлинена на метиленовое звено; и

- p-Br-Phe, p-F-Phe, p-Нитро-Phe, p-Ph-Phe; p-O-2-(2-метоксиэтокси)этокси-Phe, m-Br-Phe, m-F-Phe, o-Br-Phe, o-F-Phe, 3,5-диF-Phe означают фенилаланин, у которого фенильное кольцо замещено соответственно в пара положении атомом брома, фтора, радикалом нитро, фенилом и О-2-(2-метоксиэтокси)этокси, в мета-положении атомом брома и фтора, в орто-положении атомом брома и фтора, и в положении 3 и 5 двумя атомами фтора.

Предпочтительно, изобретение относится более конкретно к соединению, которое указано выше, в котором n4 означает целое число от 0 до 2, и R4 означает алкильный, циклоалкильный, арильный или гетероарильный радикалы, причем арильный и гетероарильный радикалы необязательно замещены одним или несколькими радикалами, одинаковыми или различными, выбранными из арилазо, галогена, нитро, гидроксила, арила, OR41

R41 означает радикал , в котором R42 означает алкильный радикал, n или m означают 2.

Особенно предпочтительно, изобретение относится к соединению, описанному выше, в котором n4 означает 0 или 1, а R4 означает атом водорода или алкильный радикал.

Также особенно предпочтительно, изобретение относится к соединению, описанному выше, в котором n4 означает 0, а R4 означает алкильный радикал.

Еще более предпочтительно, изобретение относится к соединению, описанному выше, в котором алкильный радикал означает метильный радикал.

Настоящее изобретение относится также к октапептидному соединению общей формулы (I):

H-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-AA⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂ (I)

в которой АА⁴ означает аминокислоту формулы:

в которой n4 означает целое число от 0 до 3, а R4 означает атом водорода, алкильный, арильный или гетероарильный радикал, причем арильный и гетероарильный радикалы необязательно замещены одним или несколькими радикалами, одинаковыми или различными, выбранными из галогена, нитро, гидроксила, арила, OR41;

R41 означает радикал , в котором R42 означает алкильный радикал или атом водорода, n означает целое число от 2 до 4, а m означает целое число от 1 до 4;

при условии, что все аминокислоты могут иметь конфигурацию D или L,

или к фармацевтически приемлемой соли этого соединения.

Предпочтительно, более конкретно изобретение относится к соединению, описанному выше, в котором n4 означает целое число от 0 до 2, а R4 означает алкильный, арильный или гетероарильный радикал, причем арильный и гетероарильный радикалы необязательно замещены одним или несколькими радикалами, одинаковыми или разными, выбранными из галогена, нитро, гидроксила, арила, OR41; и R41 означает радикал , в котором R42 означает алкильный радикал, n и m означают 2.

Изобретение предпочтительно относится к соединению, описанному выше, в котором термин арильный означает радикал, выбранный из фенила, нафтила, антрила и флуоренила.

Изобретение предпочтительно относится также к соединению, описанному выше, в котором термин гетероарильный означает радикал, выбранный из пиридинила, пиримидинила, фурила, тиенила, бензотиенила, оксазолила, бензоксазолила, изоксазолила, тиазолила, пирролила, пиразолила, имидазолила, тиазолила, тетразолила, более конкретно, выбраны из тиенила, бензотиенила и имидазолила.

Изобретение предпочтительно относится также к соединению, описанному выше, в котором термин алкильный означает радикал, выбранный из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, изобутила, трет-бутила.

Более предпочтительно, изобретение относится к октапептидному соединению общей формулы (I), в которой АА⁴ означает радикал аминокислоты, выбранной из Trp, Ala, β-(3-бензотиенил)-Ala, β-(2-тиенил)-Ala, β-(9-антрил)-Ala, β-(2-флуоренил)-Ala, His, Val, 1-Nal, 2-Nal, фенил-Gly, Гомо-Phe, p-Br-Phe, p-F-Phe, m-F-Phe, o-F-Phe, m-Br-Phe, o-Br-Phe, p-NO₂-Phe, 3,5-дифтор-Phe, 4-фенил-Phe, Tyr, p-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)-Phe; β-(циклогексил)-Ala, p-фенилазо-Phe.

Также более предпочтительно, изобретение относится к октапептидному соединению общей формулы (I), в которой АА⁴ означает аминокислоту, выбранную из Trp, Ala, β-(3-бензотиенил)-Ala, β-(2-тиенил)-Ala, β-(9-антрил)-Ala, β-(2-флуоренил)-Ala, His, Val, 1-Nal, 2-Nal, фенил-Gly, Гомо-Phe, p-Br-Phe, p-F-Phe, m-F-Phe, o-F-Phe, m-Br-Phe, o-Br-Phe, p-NO₂-Phe, 3,5-дифтор-Phe, 4-фенил-Phe, Tyr, p-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)-Phe.

Еще более предпочтительно изобретение относится к октапептидному соединению общей формулы (I), в которой радикал аминокислоты АА⁴имеет конфигурацию D, и еще более предпочтительно, аминокислоты 2-Nal¹ и АА⁴ имеют конфигурацию D, при этом другие аминокислоты имеют конфигурацию L.

Также особенно предпочтительно изобретение относится к октапептидному соединению общей формулы (I), в которой радикал аминокислоты АА⁴имеет конфигурацию L, еще более предпочтительно, аминокислоты 2-Nal¹ и АА⁴ имеют конфигурацию L, при этом другие аминокислоты имеют конфигурацию D.

Согласно также более предпочтительному варианту изобретение относится к октапептидному соединению общей формулы (I), в которой AA⁴ означает остаток аминокислоты Ala.

Предпочтительно, соединение согласно изобретению выбирают из:

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(3-бензотиенил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-тиенил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-His⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Val⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(1-нафтил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-нафтил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(9-антрил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-флуоренил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-Ph-D-Gly⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-гомо-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-Br-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Tyr⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-m-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-o-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-3,5-диF-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-m-Br-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-o-Br-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-Нитро-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-Ph-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(D-Cys²-D-Tyr³-Trp⁴-D-Lys⁵-D-Val⁶-D-Cys⁷)-D-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(циклогексил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-фенилазо-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

или фармацевтически приемлемой соли этого соединения.

Более предпочтительно, соединение согласно описанному выше изобретению выбирают из:

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(3-бензотиенил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-тиенил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-His⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(1-нафтил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-флуоренил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-Br-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Tyr⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-m-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-o-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-3,5-диF-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-m-Br-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-Нитро-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-фенилазо-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.

Также более предпочтительно, соединение согласно описанному выше изобретению выбирают из:

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-Ph-D-Gly⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(циклогексил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.

Также более предпочтительно, соединение согласно описанному выше изобретению выбирают из:

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Val⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-нафтил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(9-антрил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-Гомо-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-Ph-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

Очень предпочтительное соединение согласно описанному выше изобретению представляет собой:

H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.

Изобретение относится также к лекарственному средству, содержащему соединение согласно изобретению, которое определено выше.

Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей соединение согласно изобретению, которое определено выше, в более конкретном случае, когда соединение использовано в качестве действующего начала.

Изобретение относится также к терапевтической композиции, содержащей соединение общей формулы (I), которое определено выше, в качестве действующего начала в комбинации по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.

Изобретение относится также к терапевтической композиции, содержащей соединение общей формулы (I), которое определено выше, в качестве фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества в комбинации по меньшей мере с одним действующим началом.

Изобретение относится также к терапевтической композиции с быстрым, контролируемым, пролонгированным или замедленным высвобождением, содержащей соединение общей формулы (I), которое определено выше, в качестве фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества в комбинации по меньшей мере с одним действующим началом.

Изобретение относится также к применению октапептидного соединения общей формулы (I), которое определено выше, для получения лекарственного средства.

Изобретение относится также к применению, описанному выше, в котором лекарственное средство предназначено для лечения патологии, выбираемой из заболеваний, связанных с гормоном роста.

И, наконец, изобретение относится к применению соединения, которое определено выше, для получения лекарственного средства; предпочтительно, лекарственное средство предназначено для лечения патологий, в которых задействован(ы) один (или несколько) рецептор(ов) соматостатина, таких как акромегалия, для лечения нейроэндокринных опухолей, диабетической ретинопатии, лечения сосудов, суставов и кожи; предпочтительно, для лечения акромегалии или нейроэндокринных опухолей.

Терапевтическая композиция согласно изобретению может находиться в твердой форме, например в форме порошков, гранул, таблеток, желатиновых капсул, липосом или свечей. Подходящими твердыми носителями могут быть, например, фосфат кальция, стеарат магния, тальк, сахара, лактоза, декстрин, крахмал, желатин, целлюлоза, метилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, поливинилпирролидин и воск.

Терапевтическая композиция согласно изобретению может находиться также в жидкой форме, например в форме растворов, эмульсий, суспензий или сиропов. Подходящими жидкими носителями могут быть, например, вода, органические растворители, такие как глицерин или гликоли, а также их смеси, находящиеся в различных соотношениях с водой.

Введение композиции согласно изобретению может осуществляться топическим, пероральным, парентеральным путем, путем внутримышечной инъекции, подкожно и т.д.

Если не указано иное, то технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют такое же значение, которым широко пользуется средний специалист данной области, к которой относится изобретение.

Следующая ниже экспериментальная часть представлена для иллюстрации описанных выше способов и не должна рассматриваться для ограничения объема изобретения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Описание синтезов

1.1 Используемое оборудование

ВЭЖХ-МС:

Система марки Waters (2525) c линейным дегазатором и системой автоматической инжекции (2767). Элюирование проводят градиентом воды и ацетонитрила, содержащего 0,1% муравьиной кислоты. Детекцию элюируемых веществ осуществляют с использованием диодной матрицы (2996), испарительного детектора светорассеяния (DEDL) и масс-спектрометра (см. ниже). Колонка обращенно-фазного типа с привитыми фазами С18, модель Х-Bridge, 100×4,6 мм с размером частиц 3,5 мкм и размером пор 13,5 нм. Устанавливают скорость элюирования 1 мл/мин с объемом инжекции 20 мкл.

Масс-спектрометром является прибор компании Micromass ZQ, марки Waters. Ионизацию осуществляют электроспреем с температурой источника ионизации 120°С и напряжением на конусе 20 В. Образец вводят непрерывно со скоростью 0,3 мл/мин. Используют масс-анализатор квадрупольного типа (модель ZQ2000). Спектры регистрируют с помощью программного обеспечения Mass Lynx 4.0 в диапазоне масс m/z 100-1000 в случае органических молекул и 100-2000 в случае пептидов.

Препаративная ВЭЖХ:

Используют две системы для очистки пептидов. Систему, описанную выше, снабженную колонкой обращенно-фазного типа с привитыми фазами С18, модель Х-Bridge, 150×19 мм с размером частиц 5 мкм и размером пор 13,5 нм. Скорость элюирования 17 мл/мин. Вторая система компании Waters 2545 аналогична предыдущей системе, но без масс-спектрометра. Колонка Thermo Hypurity обращено-фазного типа (привитая фаза С18) 21,2 х 250 мм. Колонку элюируют смесью воды и ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУ кислоты, со скоростью 20 мл/мин. Две препаративные ВЭЖХ системы используют в изократическом режиме после определения оптимальных условий.

ЯМР-анализы:

Анализы с помощью ядерного магнитного резонанса осуществляют на спектрометре Bruker Advance 400 Ultrashield. Рабочие частоты составляют 400 МГц в случае ЯМР протона, 376,4 МГц в случае ЯМР фтора 19 и 100 МГц в случае ЯМР углерода 13. Спектры ЯМР фтора регистрируют с последовательностью одного 90°-го импульса длительностью 19,5 мкс. Ширина спектрального окна 7,5 кГц, время релаксации 2 сек и время накопления 0,87 сек. Осуществляют шестнадцать сканирований при каждом анализе. Спектры регистрируют при комнатной температуре, химические смещения выражают в м.д., а константы взаимодействия в Гц. Множество сигналов представлены следующим образом: с = синглет, с шир.= синглет широкий, д = дублет, д шир.= дублет широкий, дд = дублет дублетов, ддд = дублет расщепленных дублетов, т = триплет, т шир.= триплет широкий, к = квадруплет, кд = квадруплет расщепленный, м = мультиплет.

Анализы МСВР (МС высокого разрешения):

Определение точной массы осуществляют на время-пролетном масс-спектрометре (LCT фирмы Micromass®, Великобритания), снабженном источником для электроспрея (источник излучения Z-спрей) в режиме положительно заряженных ионов. Внешний стандарт для измерения точной массы вводят непрерывно и параллельно с образцом (конфигурация Lockspray^TM). В качестве внешнего стандарта используют лейцин-энкефалин, который дает ион [M+Na]+ с массой m/z = 578,2591. Прибор имеет разрешение 6500 и дает точность результатов с отклонением менее 5 мДа от теоретической массы иона. Система контролируется программным обеспечением Masslynx 4.0®. Образец, солюбилизированный в воде, инжектируют в поток, состоящий из 50% воды и 50% метанола, системы ВЭЖХ, снабженной автоматическим устройством для подачи образца (Alliance 2795 компании WATERS^®, Великобритания) с расходом 200 мкл/мин. Инжектируемый объем составляет 10 мкл. Напряжение на капилляре 2800 В. Напряжение на конусе 40 В. Температура источника ионизации 120°С. Температура десольвации 250°С. Расход газа для десольвации (азот) 500 л/час. Расход газа на конус (азот) 20 л/час. TDC стоп-сигнала: 100 мВ.

ИК-спектрометрия:

Инфракрасные спектры пептидов регистрируют методом ослабленного полного внутреннего отражения и Фурье-преобразования. Используют прибор Bruker IFS 66, оснащенный модулем 45°N Znse ATR, непрерывно продуваемым азотом. Наносят 10 мкл раствора на кристалл и выполняют 30 сканирований с разрешением 4 см^-1. Сигнал от воды вычитали из спектра с фоновым шумом с помощью устройства с программным обеспечением OPUS 4.2.

Лиофилизатор:

Используют лиофилизатор Christ Alpha 2-4 LD Plus, соединенный с лопастным насосом для создания вакуума 15 мкбар. Водные образцы отверждают жидким азотом перед введением их в этот прибор.

Микроскопия:

ТЭМ (трансмиссионный электронный микроскоп) типа Microscope Phillips CM-20, рабочее напряжение 200 кВ, и СЭМ (сканирующий электронный микроскоп) типа Léo-Gémini (пушка с полевой эмиссией).

1.2. Используемые реактивы

Смола для пептидного синтеза получена от Novabiochem, отделение Merk Bioscience (Schwalbach, Германия). Ионообменная смола приобретена у компании Laboratoires Bio-Rad (Hercules, США).

Используемая вода была дважды деионизована с использованием ионообменной системы Milli-Q Plus от компании Millipore (Billerica, США). Растворители для синтезов и очистки приобретены у фирмы Aldrich и VWR (West Chester, США) и, если не сказано обратного, использовались без очистки.

Аминокислоты приобретены у фирмы Bachem (Well am Rhein, Германия), Fluka (Buchs, Швейцария), Acros Organics (Geel, Бельгия) и NeoMPS (Strasbourg, Франция).

Коммерчески доступные аминокислотные предшественники:

Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-L-Lys(Boc)-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH;

Fmoc-β-(3-бензотиенил)-D-Ala-OH, Fmoc-β-(2-тиенил)-D-Ala-OH, Fmoc-D-His(Boc)-OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-D-Val-OH, Fmoc-β-(1-нафтил)-D-Ala-OH, Fmoc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH, Fmoc-β-(9-антрил)-D-Ala-OH, Fmoc-Ph-D-Gly-OH, Fmoc-гомо-D-Phe-OH, Fmoc-p-Br-D-Phe-OH, Fmoc-p-F-D-Phe-OH, Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-m-F-D-Phe-OH, Fmoc-o-F-D-Phe-OH, Fmoc-3,5-диF-D-Phe-OH, Fmoc-m-Br-D-Phe-OH, Fmoc-o-Br-D-Phe-OH, Fmoc-p-нитро-D-Phe-OH, Fmoc-β-(циклогексил)-D-Ala-OH;

Fmoc-β-(2-нафтил)-L-Ala-OH, Fmoc-D-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-D-Lys(Boc)-OH, Fmoc-D-Thr(tBu)-OH.

Синтез аминокислоты Fmoc-β-(2-флуоренил)-D-Ala-OH

а) метил-2-(бензилоксикарбониламино)-3-(9Н-флуорен-2-ил)-акрилат

К раствору, находящемуся при 0°С, метил-2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил)ацетата (2 г, 6,04 ммол, 1 экв.) в дихлорметане (60 мл) прибавляют 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен (DBU, 1,35 мл, 1,5 экв.). После перемешивания в течение 5 минут прибавляют 9Н-флуорен-2-карбальдегид (1,17 мг, 6,04 ммол, 1 экв.). Смесь оставляют на 2 часа при 0°С для перемешивания, затем ледяную баню убирают и дают температуре подняться до температуры в диапазоне от 20 до 30°С. Реакцию оставляют на 2 часа для перемешивания. К реакционной среде добавляют 40 мл дихлорметана и, после промывки 0,5М HCl, органический слой сушат над сульфатом натрия и затем выпаривают. Остаток растирают с холодным диэтиловым эфиром. Супернатант рекуперируют и операцию повторяют несколько раз. Полученный твердый продукт очищают на силикагеле (элюент: гексан-AcOEt 75:25) и получают 1,75 г чистого продукта (неустановленной конфигурации) с выходом = 74%. Выделяют также другой изомер. Соотношение двух изомеров 95/5.

1Н-ЯМР (CDCl₃): δ 3,84 (м, 2Н, флуорен + 3Н метила); 5,13 (с, 2Н, бензил); 7,25-7,40 (м, 7Н); 7,45 (с, 1Н); 7,55 (д, J=7,6, 2Н); 7,72 (м, 2Н); 7,79 (д, J=7,6, 1Н).

13С-ЯМР (CDCl₃): δ 36,95; 52,76; 67,63; 120,04; 120,44; 123,36; 125,22; 127,04; 127,52; 128,38; 128,59; 129,17; 132,16; 132,73; 136,07; 141,04; 143,31; 143,52; 144,0; 166,02.

МС(ESI): m/z 400,0 [M+H]+

ИК: λ (см-1): 3262, 3034, 2951(СН алкила), 1725(СО), 1699, 1509, 1234, 730.

Точка плавления: 109°С

b) (R)-метил-2-(бензилоксикарбониламино)-3-(9Н-флуорен-2-ил)пропаноат

В металлическом закрытом реакторе прибавляют асимметрический родиевый катализатор (35 мг, 2% мол) к раствору метил-2-(бензилоксикарбониламино)-3-(9Н-флуорен-2-ил)акрилата (1 г, 2,51 ммол) в МеОН (150 мл). Среду очищают от содержащегося в реакторе воздуха и устанавливают давление водорода (50 бар). Спустя 24 часа среду концентрируют с количественным получением продукта реакции.

¹H-ЯМР (CDCl₃): δ 3,15 (дд, J=14,0, J=6,4, 1H); 3,22 (дд, J=14,0, J=6,0, 1H); 3,73 (с, 3H метила); 3,85 (с, 2H флуорена); 4,70 (м, 1H); 5,07 (д, J=12,4, 1H бензила); 5,12 (д, J=12,4, 1H, бензила); 5,25 (1H, NH); 7,11 (д, J=7,6, 1H); 7,27-7,38 (м, 8H); 7,53 (д, J=7,6, 2H); 7,58 (д, J=7,8, 1H); 7,75 (д, J=7,6, 1H).

¹³C-ЯМР (CDCl₃): δ 36,74; 38,38; 52,27; 54,95; 66,91; 119,76; 119,85; 124,96; 125,87; 126,64, 126,70, 127,79, 128,04; 128,11, 128,45, 134,14; 136,17; 140,74; 141,27; 143,12; 143,64; 155,58, 172,01.

МС (ESI) m/z: 402,0 [M+H]+

ИК: λ, (см-1): 3347, 3025, 2949 (CH алкила), 1741 (CO), 1689, 1523, 1256, 1024, 740

Точка плавления: 125°С

Избыток энантиомера определен с помощью хиральной ВЭЖХ: 93,4%

с) (R)-2-(бензилоксикарбониламино)-3-(9Н-флуорен-2-ил)пропановая кислота

К раствору (R)-метил-2-(бензилоксикарбониламино)-3-(9Н-флуорен-2-ил)пропаноата (800 мг, 1,99 ммол) в диоксане (35 мл) при 0°С прибавляют раствор LiOH (96 мг) в воде (15 мл). Реакцию контролируют с помощью ТСХ (гексан-AcOEt 1:1) (полученная кислота не мигрирует). Реакция заканчивается в течение часа. Среду подкисляют с помощью 2М HCl и продукт экстрагируют этилацетатом. После сушки продукта над сульфатом натрия, выпаривания в вакууме и кристаллизации в эфире продукт получают с количественным выходом (735 мг).

¹H-ЯМР ((CD₃)₂SO): δ 2,90 (дд, J=14,0, J=9,6, 1H); 3,20 (дд, J=13,6, J=4,8, 1H); 3,71 (с, 2H, флуорена); 4,40 (дд, J=9,6, J=4,8, 1H); 4,87 (д, J=12,6, 1H бензила); 4,96 (д, J=12,6, 1H, бензила); 7,12 (м, 6H); 7,18 (т, J=7,6, 1H); 7,26 (т, J=7,6, 1H); 7,32 (с, 1H); 7,43 (д, J=7,6, 1H); 7,60 (д, J=7,6, 1H); 7,68 (д, J=7,8, 1H).

¹³C-ЯМР ((CD₃)₂SO): δ 36,17; 36,60; 55,68; 65,14; 119,59; 119,71; 125,01 ; 125,77; 126,43; 126,63; 127,40; 127,59; 127,70; 128,45; 128,15; 136,57; 136,89; 139,39; 140,90; 142,82; 142,88; 155,92; 173,27.

МС (ESI) m/z: 388 [M+H]+

ИК: λ, (см-1): 3333; 3035; 2902 (CH алкила); 1724 (CO); 1705; 1689; 1531 ; 1245; 1062; 734.

Точка плавления: 141°С

d) (R)-2-амино-3-(9Н-флуорен-2-ил)пропановая кислота

К раствору (R)-2-(бензилоксикарбониламино)-3-(9Н-флуорен-2-ил)пропановой кислоты (650 мг, 1,68 ммол) в метаноле (80 мл) прибавляют Pd/C (65 мг). Среду продувают азотом, затем водородом. Реакцию оставляют на 6 часов при интенсивном перемешивании: происходит выделение осадка. Среду отфильтровывают: смесь целевого продукта и Pd/C выделяют, затем солюбилизируют в смеси диоксана и воды (1:1), затем подкисляют 2М HCl до растворения аминокислоты. Полученный раствор фильтруют, диоксан выпаривают в вакууме, затем водный слой нейтрализуют добавлением 2М NaOH. После выпаривания полученный белый порошок промывают водой до удаления избытка солей. Получают 500 мг аминокислоты. Выход составляет 85%.

МС(ESI) m/z: 254 [M+H]+

ИК: λ (см-1): 3425; 3019; 2960 (CH алкила); 1567; 1402; 1316; 737.

Точка плавления: 225°С

УФ: λ (нм): 206 (abs=0,868), 267 (abs=0,446), 303 (abs=0,203)

Флуоресценция: (возбуждение при 267 нм) максимум при 312 нм.

Избыток энантиомеров определяют с помощью хиральной ВЭЖХ: 93,4%

е) (R)-2-(((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-амино)-3-(9Н-флуорен-2-ил)пропановая кислота или Fmoc-β-(2-флуоренил)-D-Ala-OH

К раствору аминокислоты, т.е. (R)-2-амино-3-(9Н-флуорен-2-ил)пропановой кислоты (560 мг, 221 ммол, 1 экв.), в смеси диоксана (50 мл) и 10%-го карбоната натрия в воде (30 мл) прибавляют по каплям раствор FmocOSu (820 мг, 2,43 ммол, 1,1 экв.) в 20 мл диоксана. За исчезновением FmocOSu наблюдают с помощью ТСХ при элюировании гексаном-AcOEt (1:1). Реакцию перемешивают в течение 3 часов. Реакционную смесь экстрагируют этилацетатом и органический слой рекуперируют и выпаривают. Полученный твердый продукт кристаллизуют в AcOEt, затем фильтруют. Получают 860 мг целевого продукта. Выход=82%.

¹H ЯМР ((CD₃)₂SO): δ 3,00 (дд, J=13,2, J=5,8, 1H); 3,13 (дд, J=13,2, J=4,9, 1H); 3,76 (с, 2H, флуорена); 3,81 (дд, J=6,4, J=4,8, 1H), 4,12 (дд, J=9,8, J=6,4, 1H, CHβ Fmoc); 4,19 (т, J=6,4, 1H, Fmoc); 4,30 (дд, J=9,8, J=6,4, 1H, CH'β Fmoc); 6,35 (с, 1H, NH); 7,12 (д, J=7,6, 1H); 7,20-7,40 (м, 7H); 7,53 (д, J=7,4, 1H); 7,62 (т, J=7,2, 2H); 7,67 (д, J=7,8, 1H); 7,81 (д, J=7,6, 1H); 7,7 (д, J=7,6, 2H).

13С-ЯМР (CD₃SO): разложение молекулы

МС(ESI)m/z: 476,0 [M+H]+

ИК: λ (см-1): 3382; 3051; 2958 (СН алкила); 1678; 1605; 1528; 1411; 1254; 1037; 735.

Синтез N-флуоренилметоксикарбонил-4-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)-D-Phe или Fmoc-p-O-2-(2-метоксиэтокси)этокси-D-Phe

а) N-трет-бутилоксикарбонил-4-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)-D-Phe

100 мг (0,35 ммол) Boc-D-тирозина-ОН и 155 мг (1,12 ммол, 3,1 экв.) вводят в 1 мл ДМФ и 100 мкл Н₂О. При 0°С прибавляют 180 мкл (1,43 ммол, 4,1 экв.) 1-бром-2-(2-метоксиэтокси)этана и реакцию нагревают при 50°С в течение 7 часов. Затем реакционную среду растворяют в этилацетате и прибавляют разбавленную соляную кислоту для доведения рН водного слоя до 2. Органический слой промывают разбавленной соляной кислотой, затем сушат над сульфатом магния. После выпаривания получают 218,9 мг аморфного твердого продукта. Этот твердый продукт растворяют в 2 мл 1М едкого натра и 2 мл диоксана и оставляют при перемешивании на 1 час 30 минут. Значение рН доводят до 2 с помощью разбавленной соляной кислоты, затем продукт экстрагируют этилацетатом. Получают 137,7 мг неочищенного продукта. Очистку осуществляют в колонке с диоксидом кремния, элюируя этилацетатом-циклогексаном-уксусной кислотой 60:40:1%. После выпаривания получают 94,6 мг чистого продукта, т.е. с выходом 68%.

ЯМР ¹Н (400 МГц, CDCl₃): δ 1,41 (с, 9H, трет-бутил); 3,01 (дд, J=13,7, J=5,7, 1H, CHβ); 3,11 (дд, J=13,7, J=4,8, 1H, CHβ); 3,39 (с, 3H, OCH₃); 3,55-3,60 (м, 2H, CH₂ этокси); 3,69-3,74 (м, 2H, CH₂ этокси); 3,81-3,87 (м, 2H, CH₂ этокси); 4,07-4,16 (м, 2H, CH₂ этокси); 4,50-4,59 (м, 1H CHα); 4,97 (д, J=7,7, 1H, NH); 6,84 (д, J=8,3, 2H, CH аром.); 7,07 (д, J=8,3, 2H, CH аром.).

МС (ESI) m/z: 384,2 [M+H]⁺

b) 4-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)-D-Phe

1,89 г N-трет-бутилоксикарбонил-4-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)-D-Phe вводят в 26 мл 35% HCl и 74 мл этилацетата. Реакцию оставляют на 3 часа при перемешивании. После выпаривания твердый продукт растирают три раза в диэтиловом эфире с получением 1,12 г твердого белого вещества или с выходом 66%.

ЯМР ¹H ((CD₃)₂SO): δ 3,04 (д, J=6,3, 2H, CHHβ); 3,23 (с, 3H, OCH₃); 3,41-3,46 (м, 2H, CH₂ этокси); 3,53-3,59 (м, 2H, CH₂ этокси); 3,68-3,73 (м, 2H, CH₂ этокси); 4,01-4,06 (м, 2H, CH₂ этокси); 4,09-4,12 (м, 1H CHα); 6,89 (д, J=8,8, 1H, CH аром.); 7,16 (д, J=8,8, 1H, CH аром.).

ЯМР ¹³C ((CD₃)₂SO): δ 34,84 (Cβ); 53,17 (Cα); 58,11 (CH₃O); 67,16 (CH₂ этокси); 68,97 (CH₂ этокси); 68,77 (CH₂ этокси); 71,34 (CH₂ этокси); 114,57 (C мета аром.); 126,61 (C орто аром.); 130,65 (CH₂-C аром.); 157,84 (O-C аром.); 170,30 (CO).

МС (ESI) m/z: 284, 1 [M+H]⁺

с) N-флуоренилметоксикарбонил-4-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)-D-Phe

812 мг (2,87 ммол) 4-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)-D-Phe вводят в 4 мл дистиллированной воды и 4 мл ацетона. К ним добавляют 300 мг (2,83 ммол, 0,98 экв.) Na₂CO₃ и 954,6 мг (2,83 ммол, 0,98 экв.) FmocOSu. Полученную белую суспензию перемешивают 5 часов 30 минут при температуре между 20 и 30°С. Ацетон выпаривают, среду доводят до рН = 2 с помощью соляной кислоты и продукт экстрагируют этилацетатом. Органические слои объединяют, промывают насыщенным раствором NaCl, затем сушат над безводным MgSO₄. После выпаривания получают 1,5 г неочищенного продукта. Этот продукт очищают приблизительно на 120 г диоксида кремния, элюируя дихлорметаном-метанолом-уксусной кислотой 98:2:5, и получают 939 мг белого твердого вещества или с выходом 65%.

ЯМР ¹H (CDCl₃): δ 3,05 (дд, J=14,0, J=5,7, 1H, CHβ); 3,13 (дд, J=14,0, J=5,4, 1H, CH'β); 3,38 (с, 3H, OCH₃); 3,55-3,59 (м, 2H, CH₂ этокси); 3,67-3,72 (м, 2H, CH₂ этокси); 3,80-3,85 (м, 2H, CH₂ этокси); 4,04-4,10 (м, 2H, CH₂ этокси); 4,20 (т, J=6,8, 1H, CH); 4,34 (дд, J=10,8, J=6,8, 1H, CHβ Fmoc); 4,44 (дд, J=10,8, J=6,8, 1H, CH'β Fmoc); 4,63 (дд, J=14,0, J=5,7, 1H, CHα); 5,30 (с, 1H, NH); 6,81 (д, J=8,1, 2H, CH аром.); 7,03 (д, J=8,1, 2H, CH аром.); 7,30 (т, J=7,4, 2H, флуоренил); 7,40 (т, J=7,4, 2H, флуоренил); 7,56 (т, J=5,8, 2H, флуоренил); 7,76 (д, J=7,4, флуоренил).

ЯМР ¹³C (CDCl₃): δ 36,89 (CH₂β); 47,08 (CH Fmoc); 54,66 (CHα); 58,96 (CH₃O); 66,,96 (CH₂ Fmoc); 67,22 (CH₂ этокси); 69,68 (CH₂ этокси); 70,55 (CH₂ этокси); 71,83 (CH₂ этокси); 114,65 (C мета Phe,); 119,92 (CH флуоренил); 125,01 (CH флуоренил); 127,02 (C орто аром.); 127,67 (CH флуоренил); 127,77 (CH флуоренил); 130,34 (CH₂-C Phe,); 141,24 (C флуоренил); 143,64 (C флуоренил); 155,70 (CO Fmoc); 157,84 (O-C аром.); 170,30 (CO).

МС (ESI) m/z: 506,0 [M+H]⁺

Синтез аминокислоты Fmoc-β-(p-фенилазо)-D-Phe-OH

400 мг (1 ммол) Fmoc-pNH2-D-Phe-OH и 150 мг (1,4 ммол) нитрозобензола помещают в 20 мл ледяной уксусной кислоты, затем смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем снова добавляют 150 мг нитрозобензола и перемешивание продолжают 24 часа. Затем растворитель выпаривают и остаток кристаллизуют в горячем метаноле. Смесь выдерживают при +4°С в течение всей ночи и образовавшиеся кристаллы отделяют фильтрацией, промывают холодным метанолом (2 х 20 мл), затем сушат в эксикаторе под вакуумом. Получают 300 мг аминокислоты. Выход составляет 61%.

ЯМР 1H (400 МГц, CD₃OD): δ 3,04 (дд, J=9,6, J=13,6, 1H); 3,22-3,28 (м, 1H); 4,15 (т, J=6,8, 1H); 4,24 (дд, J=6,8, J=10,4, 1H); 4,33 (дд, J=7,2, J=10,4, 1H); 4,50 (дд, J=4,4, J=9,6, 1H); 7,27 (т, J=8,2 H); 7,36 (м, 2H); 7,42 (д, J=8,4, 2H); 7,49-7,59 (м, 5H), 7,76 (д, J=7,6, 2H); 7,83 (д, J=8,4, 2H); 7,88 (дд, J=6,8, 2H).

МС (ESI) m/z: 492,1 [M+H]⁺

1.3 Получение октапептидных соединений

1.3.1 Общая методика синтеза пептидов

Синтез включает 4 основных стадии как показано на схеме 1:

Схема 1

1) Смачивание смолы

Смолу 4-(2',4'-диметоксифенилфлуоренилметоксикарбониламинометил)-феноксиацетамидонорлейцил-(4-метил)-бензгидриламин на основе полистирол-дивинилбензола (MBHA-смола от Rink Amide) вводят в шприц, оснащенный фриттированным стеклом, краном на одном конце и пробкой на другом. Шприц наполняют растворителем NMP и смесь осторожно встряхивают в течение 1 часа. Затем растворитель удаляют фильтрацией.

2) Связывание аминокислот:

Аминокислоты связываются друг с другом в заданном порядке с помощью реакции конденсации. Аминокислоту (2 экв.) вводят вместе с 1-гидроксибензотриазолом (HOBt, 2,2 экв.) и N,N'-диизопропилкарбодиимидом (DIC, 2,2 экв.) в N-метилпирролидиноне (NMP, 5мг/г смолы) в пробирку и встряхивают несколько минут. Затем содержимое пробирки вводят в емкость со смолой. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 часа 30 минут, затем фильтруют. Используют метод двойного связывания: реакционную смесь фильтруют, когда реакция проведена примерно на 50%, и вводят новую порцию реагентов для оптимизации скорости реакции и чистоты конечного продукта. Второй этап заключается в удалении защитных групп у вновь введенной аминокислоты для проведения нового этапа реакции конденсации. Снятие защитных групп осуществляют путем трех обработок пиперидином в NMP (20% об./об., 5 мл/г смолы) с последующими тремя промывками с помощью NMP (10 мл/г смолы). Для продолжения реакции 5 мкл фильтрата, соответствующего первой обработке, затем 10 мкл от двух следующих обработок, а также первую промывку, т.е. 4 пробы, вводят в 2 мл пиперидина, и затем измеряют УФ-поглощение на волне 290 нм. Между каждым этапом осуществляют три промывки смолы с помощью NMP (10 мл/г смолы). Следовательно, этап сборки заключается в проведении двух реакций: реакции конденсации аминокислот и реакции удаления защитной группы Fmoc, повторяя эти операции до завершения пептидной последовательности.

3) Образование дисульфидного мостика

После того как последовательность собрана, пептид циклизуют путем образования дисульфидного мостика. Дисульфидный мостик образуется в результате трех обработок 1 экв. дииода в NMP (5 мл/г смолы) соответственно в течение 2 мин, 3 мин и 5 мин. Затем смолу промывают 5 раз ДХМ и 5 раз NMP для удаления избыточного иода, удержанного смолой (10 мл/г смолы).

4) Отщепление

Перед отщеплением смолу следует обработать путем двух промывок с помощью NMP, двух промывок метанолом (МеОН), двух промывок дихлорметаном (ДХМ) и двух промывок диэтиловым эфиром (DEE) (10 мл на грамм смолы). Затем смолу помещают под вакуум на сутки. Отщепление проводят в стеклянной емкости, снабженной магнитной мешалкой. Реакционную смесь получают из трифторуксусной кислоты (TFA, 10 мл/г смолы), триизопропилсилана (TIS) и воды (3% и 2% об./об.). Реакцию перемешивают 4 часа при комнатной температуре. Затем реакционную среду фильтруют на фриттированном стекле и твердый продукт промывают два раза TFA. Фильтрат затем выпаривают для получения очень густой жидкости белого цвета. Эту жидкость растворяют в смеси вода-ацетонитрил 1:1 и затем лиофилизируют. После этой стадии пептид получают в виде трифторацетатной соли.

1.3.2 Очистка

Очистку осуществляют путем препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Стационарную фазу называют «обращенной», потому что к ней привиты С₁₈-алкильные цепи. Подвижная фаза состоит из одной и той же (изократической) смеси воды и ацетонитрила с 0,1% TFA и 1% муравьиной кислоты, предназначенной для нейтрализации остаточных непривитых групп, которые могут находиться на стационарной фазе.

Пептид растворяют в смеси вода-ацетонитрил и инжектируют в колонку препаративной ВЭЖХ. Предварительно осуществляют пробу на растворимость небольшого количества пептида. Эта проба позволяет установить оптимальное процентное содержание ацетонитрила и макимальное количество пептида. Наиболее низкое процентное содержание ацетонитрила при очень высокой концентрации пептида и образование прозрачного раствора означают идеальные условия растворения. Например, растворимость 4-пара-фторфенилаланинового производного (пример 13, см. ниже) установлена при 49 г/л в растворе вода-ацетонитрил 58:42.

После очистки, фракции, содержащие очищенный пептид, объединяют и выпаривают в вакууме. Затем чистый пептид выделяют из больших количеств выпариваемого растворителя перед осуществлением лиофилизации. Пептид обычно получают в виде трифторацетатной соли, а затем ее превращают в ацетатную соль ионообменным способом перед физико-химическим анализом.

1.3.3 Ионный обмен

Ионообмен осуществляют на смоле типа сильной анионообменной смолы (AG1-X8 Biorad). Сначала 245 мг этой смолы промывают три раза с помощью 10 мл 1,6 н. уксусной кислоты, затем три раза 10 мл 0,16 М уксусной кислоты. Затем 20 мг пептида в виде соли TFA вводят в 4 мл воды и сосуд перемешивают путем вращения в течение 1 часа. Затем жидкость фильтруют и смолу промывают два раза с помощью 1 мл дистиллированной воды. Фракции соединяют и затем лиофилизируют.

1.4 Примеры

Продукты охарактеризованы согласно классическим методам, известным специалисту, описанным выше.

Пример 1 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(3-бензотиенил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂. 2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя реакцию конденсации, снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-β-(3-бензотиенил)-D-Ala-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-DAla-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и получают его окончательно в виде ацетатной соли согласно операциям, описанным выше, и получают соединение: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(3-бензотиенил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH.

ВЭЖХ: время удерживания = 9,8 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,28-0,40 (м, 1H); 0,42-0,54 (м, 1H); 0,90 (д, J=6,6, 3H); 0,92 (д, J=6,6, 3H); 1,20 (д, J=6,4, 3H); 1,28-1,34 (м, 1H); 1,48-1,62 (м, 1H); 1,90 (с, 6H); 1,90-2,20 (м, 1H); 2,44 (дд, J=14,6, J=4,2, 1H); 2,57 (дд, J=14,8, J=9,3, 1H); 2,65-2,82 (м, 4H); 2,92 (д, J=7,4, 2H); 3,06 (дд, J=13,9, J=5,5, 1H); 3,12-3,22 (м, 1H); 3,29 (дд, J=13,3, J=9,5, 1H); 3,43 (дд, J=13,5, J=5,5, 1H); 3,81 (дд, J=10,3, J=3,7, 1H); 4,24 (дд, J=6,4, J=4,1, 1H); 4,26-4,38 (м, 3H); 4,64 (т, J=7,5, 2H); 6,84 (д, J=8,2, 2H); 7,12 (д, J=8,2, 2H); 7,31 (с, 1H); 7,38-7,50 (м, 3H); 7,54 (дд, J=9,4, J=3,8, 1H); 7,55 (дд, J=9,4, J=3,8, 1H); 7,71 (д, J=7,7, 1H); 7,78 (с, 1H); 7,85-7,90 (м, 1H); 7,90-7,95 (м, 2H); 7,98 (д, J=7,5, 1H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1113,4368[M+H]+ (рассчитано: 1113,4360) С54 Н69 N10 О10 S3

Пример 2 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-тиенил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-β-(2-тиенил)-D-Ala-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-DAla-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и получают соединение окончательно в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-тиенил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH.

ВЭЖХ: время удерживания = 9,7 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,76-0,88 (м, 1H); 0,92 (д, J=6,6, 3H); 0,95 (д, J=6,6, 3H); 1,19 (д, J=6,4, 3H); 1,40-1,54 (м, 3H); 1,76-1,88 (м, 1H); 1,93 (с, 6H); 2,14-2,26 (м, 1H); 2,41 (дд, J=14,8, J=3,8, 1H); 2,63 (дд, J=15,4, J=9,7, 1H); 2,68 (дд, J=15,0, J=3,6, 1H); 2,74-2,82 (м, 1H); 2,83-2,95 (м, 4H); 3,10 (д, J=8,0, 1H); 3,37 (дд, J=13,6, J=8,6, 1H); 3,47 (дд, J=13,8, J=5,6, 1H); 4,02 (д, J=9,7, 1H); 4,07 (дд, J=10,8, J=3,5, 1H); 4,21 (кв.д, J=10,4, J=6,4, 1H); 4,28 (т, J=8,1, 1H); 4,31 (д, J=4,0, 1H); 4,42 (дд, J=8,6, J=6,2, 1H); 4,62 (т, J=7,4, 1H); 4,89 (дд, J=10,5, J=3,6, 1H); 4,93 (дд, J=10,5, J=3,6, 1H); 6,82 (м, 3H); 6,98 (м, 2H); 7,11 (д, J=8,4, 2H); 7,31 (д, J=5,1, 1H); 7,47 (д, J=8,2, 1H); 7,54 (дд, J=9,5, J=3,3, 1H); 7,55 (дд, J=9,5, J=3,3, 1H); 7,8 (с, 1H); 7,82-7,88 (м, 3H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1063,4330[M+H]+ (рассчитано: 1063,4204) С50 Н67 N10 О10 S3

Пример 3 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-His⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₂СООН

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-D-His-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и получают его окончательно в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-His⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH.

ВЭЖХ: время удерживания = 6,3 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,90 (д, J=6,6, 3H); 0,94 (д, J=6,6, 3H); 1,02-1,14 (м, 2H); 1,17 (д, J=6,6, 3H); 1,51-1,64 (м, 3H); 1,83-1,90 (м, 1H); 1,91 (с, 6H); 2,10-2,18 (м, 1H); 2,53 (дд, J=14,6, J=4,4, 1H); 2,60 (дд, J=14,8, J=9,5, 1H); 2,70 (дд, J=14,6, J=4,4, 1H); 2,75 (дд, J=14,4, J=4,2, 1H); 2,84-2,94 (м, 5H); 2,99 (дд, J=15,2, J=7,2, 1H); 3,36 (дд, J=13,9, J=8,6, 1H); 3,46 (дд, J=13,8, J=5,7, 1H); 4,04 (д, J=9,7, 1H); 4,13-4,23 (м, 2H); 4,26-4,32 (м, 2H); 4,40 (дд, J=8,7, J=5,9, 1H); 4,55 (т, J=7,7, 1H); 4,86 (дд, J=9,6, J=4,4, 1H); 4,92 (дд, J=10,4, J=4,6, 1H); 6,74 (д, J=8,6, 2H); 7,01 (д, J=1,3, 1H); 7,04 (д, J=8,6, 2H); 7,46 (дд, J=8,5, J=1,7, 1H); 7,52 (ддд, J=6,7, J=4,4, J=1,6, 1H); 7,53 (ддд, J=6,7, J=4,4, J=1,6, 1H); 7,80 (с, 1H); 7,93-7,93 (м, 3H); 8,29 (д, J=1,1, 1H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1047,4507[M+H]+ (рассчитано: 1047,4545) С49 Н66 N12 О10 S2

Пример 4 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₂СООН

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-D-Ala-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH.

ВЭЖХ: время удерживания = 9,8 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,93 (д, J=6,6, 3H); 0,96 (д, J=6,6, 3H); 1,18 (д, J=7,8, 3H); 1,20 (д, J=6,6, 3H); 1,34-1,44 (м, 2H); 1,60-1,68 (м, 2H); 1,68-1,80 (м, 2H); 1,90 (с, 6H); 1,92-2,20 (м, 1H); 2,12-2,22 (м, 1H); 2,45 (дд, J=14,6, J=4,9, 1H); 2,55 (дд, J=14,7, J=8,7, 1H); 2,74 (д, J=1,3, 1H); 2,76 (с, 1H); 2,90-3,00 (м, 4H); 3,3 (дд, J=13,5, J=9,1, 1H); 3,44 (дд, J=13,7, J=5,6, 1H); 4,04 (д, J=9,5, 1H); 4,07 (д, J=7,3, 1H); 4,2 (дд, J=9,9, J=4,1, 1H); 4,24 (дд, J=6,5, J=3,9, 1H); 4,28-4,32 (м, 1H); 4,33 (д, J=4,0, 1H); 4,55 (дд, J=7,8, J=7,3, 1H); 4,82-4,88 (м, 1H); 6,82 (д, J=8,6, 2H); 7,11 (д, J=8,6, 2H); 7,47 (дд, J=8,5, J=1,7, 1H); 7,54 (ддд, J=5,7, J=4,7, J=2,0, 1H); 7,55 (ддд, J=5,7, J=4,7, J=2,0, 1H); 7,79 (д, J=0,9, 1H); 7,86-7,96 (м, 3H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1003,4161[M+H]+ (рассчитано: 1003,4146) С46 Н64 Na N10 О10 S2

Пример 5 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Val⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-D-Val-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Val⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH.

ВЭЖХ: время удерживания = 10,7 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,73 (д, J=6,6, 3H); 0,80 (д, J=6,8, 3H); 0,93 (д, J=6,8, 3H); 0,98 (д, J=6,6, 3H); 1,19 (д, J=6,6, 3H); 1,30-1,50 (м, 2H); 1,58-1,82 (м, 4H); 1,60-2,08 (м, 4H); 1,92 (с, 6H); 1,96-2,06 (м, 1H); 2,14-2,24 (м, 1H); 2,51 (дд, J=14,8, J=3,8, 1H); 2,62 (дд, J=14,8, J=10,0, 1H); 2,69 (дд, J=14,5, J=3,5, 1H); 2,79 (дд, J=14,9, J=11,2, 1H); 2,88-3,00 (м, 3H); 3,37 (дд, J=13,9, J=8,6, 1H); 3,57 (дд, J=13,9, J=5,8, 1H); 3,60 (д, J=9,7, 1H); 4,05 (д, J=9,7, 1H); 4,21 (дд, J=6,3, J=3,9, 1H); 4,25 (дд, J=10,7, J=3,7, 1H); 4,30 (д, J=3,8, 1H); 4,42 (дд, J=8,6, J=5,8, 1H); 4,61 (дд, J=8,4, J=6,9, 1H); 4,95 (дд, J=9,3, J=3,6, 1H); 4,96 (дд, J=11,8, J=2,9, 1H); 6,81 (д, J=8,6, 2H); 7,12 (д, J=8,4, 2H); 7,47 (дд, J=8,4, J=1,5, 1H); 7,54 (дд, J=10,2, J=3,8, 1H); 7,55 (дд, J=10,2, J=3,8, 1H); 7,80 (с, 1H); 7,84-7,94 (м, 3H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1009,4627[M+H]+ (рассчитано: 1009,4640) С48 Н69 N10 О10 S2

Пример 6 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(1-нафтил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-β-(1-нафтил)-D-Ala-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(1-нафтил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

ВЭЖХ: время удерживания = 8,9 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ -0,10-0,04 (м, 1H); 0,22-0,34 (м, 1H); 0,87 (д, J=4,6, 3H); 0,89 (д, J=4,6, 3H); 0,98-1,10 (м, 1H); 1,18 (д, J=6,4, 3H); 1,20-1,30 (м, 1H); 1,40-1,52 (м, 1H); 1,95 (с, 6H); 2,06-2,18 (м, 1H); 2,42 (дд, J=14,9, J=3,9, 1H); 2,57 (дд, J=14,9, J=8,8, 1H); 2,64 (т, J=8,0, 2H); 2,72 (дд, J=14,8, J=4,8, 1H); 2,78 (дд, J=10,8, J=4,8, 1H); 2,89 (дд, J=13,3, J=8,3, 1H); 2,89 (дд, J=13,6, J=6,8, 1H); 3,26 (д, J=8,4, 2H); 3,34 (дд, J=13,4, J=9,0, 1H); 3,48 (дд, J=13,7, J=6,0, 1H); 3,68 (дд, J=10,8, J=3,7, 1H); 3,90 (д, J=9,7, 1H); 4,21 (ддд, J=12,7, J=6,4, J=4,0, 1H); 4,29 (д, J=3,8, 1H); 4,31 (т, J=8,6, 1H); 4,42 (дд, J=8,7, J=5,8, 1H); 4,66 (дд, J=8,5, J=6,8, 1H); 4,82-4,87 (м, 1H); 6,86 (д, J=8,6, 2H); 7,14 (д, J=8,6, 2H); 7,28 (д, J=7,3, 1H); 7,45 (т, J=7,7, 1H); 7,46 (д, J=9,7, 1H); 7,53 (дд, J=6,4, J=3,5, 1H); 7,54 (дд, J=6,4, J=3,5, 1H); 7,57-7,65 (м, 2H); 7,78 (с, 1H); 7,84-7,97 (м, 6H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1129,4578[M+Na]+ (рассчитано: 1129,4516) С56 Н70 Na N10 О10 S2

Пример 7 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-нафтил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-нафтил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

ВЭЖХ: время удерживания = 14,5 мин

МСВР (Н₂О) m/z: 1129,4651[M+Н]+ С56 Н69 N10 О10 S2

Пример 8 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(9-антрил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-β-(9-антрил)-D-Ala-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(9-антрил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

ВЭЖХ: время удерживания = 10,1 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ -0,68- -0,58 (м, 1H); -0,36- -0,24 (м, 1H); 0,68-0,72 (м, 1H); 0,83 (д, J=4,6, 3H); 0,84 (д, J=4,7, 0,92-1,04 (м, 2H); 1,06-1,12 (м, 1H); 1,18 (д, J=6,4, 3H); 2,0 (с, 6H); 2,0-2,08 (м, 1H); 2,4 (дд, J=14,7, J=4,3, 1H); 2,44-2,54 (м, 3H); 2,78 (д, J=7,8, 2H); 2,90 (дд, J=13,2, J=9,6, 1H); 3,01 (дд, J=13,3, J=6,2, 1H); 3,26 (дд, J=10,4, J=4,2, 1H); 3,30-3,36 (м, 1H); 3,38-3,52 (м, 2H); 3,84 (д, J=9,3, 1H); 3,89 (д, J=13,5, 1H); 4,20-4,30 (м, 2H); 4,32 (д, J=3,8, 1H); 4,42 (дд, J=9,1, J=5,8, 1H); 4,66-4,76 (м, 2H); 6,97 (д, J=8,6, 2H); 7,23 (д, J=8,4, 2H); 7,44 (д, J=8,6, 1H); 7,48-7,60 (м, 5H); 7,75 (с, 1H); 7,82-7,94 (м, 5H); 8,05 (д, J=8,0, 2H); 8,4 (с, 1H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1157,4919[M+Н]+ (рассчитано: 1157,4953) С60 Н73 N10 О10 S2

Пример 9 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-флуоренил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-β-(2-флуоренил)-D-Ala-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-флуоренил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

ВЭЖХ: время удерживания = 9,8 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,08-0,20 (м, 1H); 0,32-0,44 (м, 1H); 0,88 (д, J=6,7, 3H); 0,91 (д, J=6,6, 3H); 0,96 (т, J=7,8, 2H); 1,17 (д, J=6,4, 3H); 1,48-1,60 (м, 1H); 1,96 (с, 6H); 1,80-2,08 (м, 2H); 2,10-2,20 (м, 1H); 2,45 (дд, J=14,7, J=3,7, 1H); 2,61 (дд, J=14,8, J=9,7, 1H); 2,68 (дд, J=14,8, J=3,7, 1H); 2,76 (д, J=11,0, 1H); 2,81 (дд, J=11,9, J=9,2, 1H); 2,88-3,00 (м, 3H); 3,35 (дд, J=13,7, J=8,8, 1H); 3,46 (дд, J=13,7, J=5,8, 1H); 3,80 (дд, J=11,0, J=3,2, 1H); 3,88 (с, 2H); 3,92 (д, J=9,8, 1H); 4,19 (дд, J=6,5, J=3,7, 1H); 4,21 (дд, J=11,8, J=5,4, 1H); 4,29 (д, J=3,8, 1H); 4,41 (дд, J=8,8, J=5,8, 1H); 4,63 (т, J=7,5, 1H); 4,86 (дд, J=11,7, J=5,8, 1H); 4,90 (дд, J=11,7, J=5,8, 1H); 6,81 (д, J=8,6, 2H); 7,11 (д, J=8,6, 2H); 7,17 (д, J=8,0, 1H); 7,43 (д, J=1,0, 1H); 7,7 (дд, J=7,4, J=1,1, 1H); 7,40-7,48 (м, 2H); 7,52 (дд, J=9,9, J=3,5, 1H); 7,52 (дд, J=9,9, J=3,1, 1H); 7,62 (д, J=7,3, 1H); 7,78 (с, 1H); 7,79 (д, J=7,8, 1H); 7,82-7,92 (м, 4H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1167,4774[M+Na]+ (рассчитано: 1167,4772) С59 Н72 Na N10 О10 S2

Пример 10 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Phg⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-D-Phg-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Phg⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

ВЭЖХ: время удерживания = 8,9 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,93 (д, J=7,0, 3H); 0,96 (д, J=6,8, 3H); 1,10-1,20 (м, 2H); 1,20 (д, J=6,4, 3H); 1,47 (кв., J=7,8, 2H); 1,61-1,72 (м, 1H); 1,82-1,92 (м, 1H); 1,97 (с, 6H); 2,12-2,20 (м, 1H); 2,40 (т, J=8,3, 1H); 2,48 (д, J=6,5, 2H); 2,68-2,89 (м, 6H); 2,95 (дд, J=13,3, J=6,0, 1H); 3,31 (дд, J=13,0, J=9,1, 1H); 3,42-3,51 (м, 1H); 4,11 (д, J=8,4, 1H); 4,14 (дд, J=10,0, J=4,2, 1H); 4,39 (дд, J=9,1, J=6,0, 1H); 4,60 (дд, J=9,2, J=6,5, 1H); 4,66 (т, J=6,6, 1H); 4,70-4,78 (м, 2H); 6,69 (д, J=8,1, 2H); 7,03 (д, J=8,4, 2H); 7,15 (д, J=6,4, 2H); 7,32-7,42 (м, 3H); 7,46 (дд, J=8,7, J=0,5, 1H); 7,52-7,60 (м, 2H); 7,78 (шир.с, 1H); 7,88-7,98 (м, 3H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1065,4276[M+Na]+ (рассчитано: 1065,4303) С51 Н66 Na N10 О10 S2

Пример 11 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Гомо-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-D-Гомо-Phе-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Гомо-Phе⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

ВЭЖХ: время удерживания = 8,87 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,89 (д, J=6,7, 3H); 0,92 (д, J=6,7, 3H); 1,17 (д, J=6,4, 3H); 1,26-1,36 (м, 2H); 1,54-1,68 (м, 3H); 1,76-1,84 (м, 2H); 1,86-1,92 (м, 1H); 2,08-2,18 (м, 1H); 1,94 (с, 6H); 2,27 (ддд, J=14,0, J=7,9, J=5,9, 1H); 2,36 (ддд, J=14,2, J=6,4, J=5,6, 1H); 2,48 (дд, J=14,7, J=4,8, 1H); 2,56 (дд, J=14,8, J=8,8, 1H); 2,72 (д, J=3,7, 1H); 2,74 (с, 1H); 2,84-2,82 (м, 3H); 2,96 (дд, J=13,4, J=5,9, 1H); 3,34 (дд, J=13,8, J=8,9, 1H); 3,47 (J=13,7, J=5,8, 1H); 3,88 (дд, J=8,5, J=6,3, 1H); 4,02 (д, J=9,5, 1H); 4,14 (дд, J=9,9, J=4,3, 1H); 4,21 (дд, J=6,5, J=3,9, 1H); 4,30 (д, J=3,9, 1H); 4,40 ( dd, J=8,9, J=6,0, 1H); 4,61 (дд, J=9,9, J=6,1, 1H); 4,80-4,88 (м, 2H); 6,82 (д, J=8,6, 2H); 7,03 (дд, J=6,9, J=1,4, 1H); 7,14 (д, J=8,6, 2H); 7,22-7,28 (м, 1H); 7,28-7,34 (м, 2H); 7,45 (дд, J=8,5, J=1,7, 1H); 7,52 (ддд, J=6,9, J=5,1, J=2,0, 1H); 7,53 (ддд, J=6,9, J=5,1, J=2,0, 1H), 7,78 (с, 1H); 7,86-7,93 (м, 3H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1129,4609[M+Na]+ (рассчитано: 1093,4616) С53 Н70 Na N10 О10 S2

Пример 12 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-р-Br-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-p-Br-D-Phe-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-Br-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

ВЭЖХ: время удерживания = 9,5 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,50-0,62 (м, 1H); 0,70-0,82 (м, 1H); 0,91 (д, J=6,8, 3H); 0,99 (д, J=6,6, 3H); 1,18 (д, J=6,6, 3H); 1,30-1,42 (м, 1H); 1,42-1,52 (м, 2H); 1,70-1,80 (м, 1H) ; 1,96 (с, 6H); 2,12-2,28 (м, 1H); 2,47 (дд, J=14,8, J=3,6, 1H); 2,63 (дд, J=14,6, J=9,8, 1H); 2,68 (дд, J=14,7, J=3,7, 1H); 2,80-2,82 (м, 2H); 2,84-2,96 (м, 4H); 3,36 (дд, J=13,7, J=8,7, 1H); 3,48 (дд, J=13,5, J=6,2, 1H); 3,95 (дд, J=11,1, J=3,5, 1H); 3,98 (д, J=10,0, 1H); 4,18-4,24 (м, 2H); 4,30 (д, J=3,8, 1H); 4,42 (дд, J=8,6, J=6,0, 1H); 4,62 (т, J=7,1, 1H); 4,88-4,94 (м, 2H); 6,82 (д, J=8,6, 2H); 7,07 (д, J=8,4, 2H); 7,10 (д, J=8,6, 2H); 7,48-7,52 (м, 3H); 7,53 (дд, J=9,5, J=3,3, 1H); 7,55 (дд, J=9,5, J=3,7, 1H); 7,80 (с, 1H); 7,84-7,94 (м, 3H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1157,3549 и 1159,3585[M+Na]+ (рассчитано: 1157,3564 и 1159,3544) С52 Н67 Br Na N10 О10 S2

Пример 13 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-р-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-p-F-D-Phe-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

ВЭЖХ: время удерживания = 8,7 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,50-0,62 (м, 1H); 0,72-0,84 (м, 1H); 0,91 (д, J=6,8, 3H); 0,93 (д, J=6,6, 3H); 1,18 (д, J=6,4, 3H); 1,30-1,50 (м, 4H); 1,70-1,80 (м, 1H); 2,02 (с, 6H); 2,14-2,26 (м, 1H); 2,47 (дд, J=15,0, J=3,8, 1H); 2,63 (дд, J=14,8, J=9,9, 1H); 2,68 (дд, J=14,8, J=3,4, 1H); 2,74-2,98 (м, 6H); 3,37 (дд, J=13,8, J=8,8, 1H); 3,48 (дд, J=13,7, J=6,0, 1H); 3,92-4,02 (м, 2H); 4,18-4,24 (м, 2H); 4,30 (д, J=3,8, 1H); 4,43 (дд, J=8,7, J=5,9, 1H); 4,62 (т, J=7,5, 1H); 4,88-4,96 (м, 2H); 6,81 (д, J=8,4, 2H); 7,04-7,18 (м, 6H); 7,47 (дд, J=8,5, J=1,5, IH); 7,54 (дд, J=9,7, J=3,4, 1H); 7,54 (дд, J=9,6, J=3,4, 1H); 7,80 (с, 1H); 7,84-7,96 (м, 3H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1097,4332[M+Na]+ (рассчитано: 1097,4365) С52 Н67 F N10 О10 S2

Пример 14 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Tyr⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-D-Tyr-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Tyr⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

ВЭЖХ: время удерживания = 7,7 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,50-0,64 (м, 1H); 0,66-0,80 (м, 1H); 0,91 (д, J=6,6, 3H); 0,93 (д, J=6,6, 3H); 1,20 (д, J=6,4, 3H); 1,28-1,48 (м, 3H); 1,66-1,78 (м, 1H); 1,89 (с, 6H); 2,12-2,24 (м, 1H); 2,41 (дд, J=14,8, J=3,7, 1H); 2,55 (дд, J=14,8, J=9,5, 1H); 2,64-2,96 (м, 7H); 3,20 (дд, J=13,4, J=9,1, 1H); 3,33 (дд, J=13,2, J=5,7, 1H); 3,92 (дд, J=11,0, J=3,2, 1H); 3,97 (д, J=9,7, 1H); 4,10-4,20 (м, 2H); 4,24 (кв.д, J=10,5, J=6,4, 1H); 4,32 (д, J=3,8, 1H); 4,60 (т, J=7,3, 1H); 6,80 (т, J=8,3, 4H); 7,02 (д, J=8,2, 2H); 7,09 (д, J=8,4, 2H); 7,43 (д, J=8,4, 1H); 7,48-7,56 (м, 2H); 7,73 (с, 1H); 7,80-7,92 (м, 4H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1073,4578[M+H]+ (рассчитано: 1073,4589) С52 Н69 N10 О11 S2

Пример 15 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-m-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-m-F-D-Phe-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-m-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

ВЭЖХ: время удерживания = 8,1 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,60-0,72 (м, 1H); 0,74-0,88 (м, 1H); 0,92 (д, J=6,7, 3H); 0,95 (д, J=6,4, 3H); 1,20 (д, J=6,7, 3H); 1,34-1,51 (м, 3H); 1,72-1,82 (м, 1H); 1,90 (с, 1H); 2,15-2,24 (м, 1H); 2,47 (дд, J=14,7, J=3,9, 1H); 2,61 (дд, J=14,8, J=9,8, 1H); 2,70 (дд, J=14,5, J=3,6, 1H); 2,74-2,84 (м, 4H); 2,86-2,94 (м, 3H); 3,32 (дд, J=13,8, J=8,8, 1H); 3,44 (дд, J=13,7, J=5,7, 1H); 4,00 (д, J=9,9, 1H); 4,01 (д, J=10,8, 1H); 4,23 (дд, J=6,4, J=3,8, 1H); 4,25 (дд, J=10,4, J=6,4, 1H); 4,32-4,36 (м, 2H); 4,61 (дд, J=7,1, J=7,9, 1H); 4,88 (дд, J=10,0, J=3,9, 1H); 4,91 (дд, J=11,5, J=3,5, 1H); 6,82 (д, J=8,5, 2H); 6,93 (шир.д, J=9,7, 1H); 6,98 (д, J=7,7, 1H); 7,01-7,08 (м, 1H); 7,10 (д, J=8,5, 2H); 7,35 (дд, J=14,7, J=7,9, 1H); 7,47 (дд, J=8,6, J=1,3, 1H); 7,52-7,57 (м, 2H); 7,80 (шир.с, 1H); 7,86-7,89 (м, 1H); 7,90-7,94 (м, 2H).

МСВР (Н₂О + ACN) m/z: 1075,4492[M+H]+ (рассчитано: 1075,4545) С52 Н68 F N10 О10 S2

Пример 16 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-o-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и сочетание следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-o-F-D-Phe-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-o-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

ВЭЖХ: время удерживания = 8,1 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,58-0,70 (м, 1H); 0,74-0,86 (м, 1H); 0,91 (д, J=6,6, 3H); 0,94 (д, J=6,7, 3H); 1,19 (д, J=6,4, 3H); 1,33-1,51 (м, 4H); 1,70-1,80 (м, 1H); 1,97 (с, 6H); 2,12-2,25 (м, 1H); 2,47 (шир.д, J=13,3, 1H); 2,61 (дд, J=14,6, J=9,3, 1H); 2,64-2,86 (м, 4H); 2,86-2,96 (м, 3H); 3,31-3,41 (м, 1H); 3,42-3,52 (м, 1H); 3,99 (д, J=10,0, 2H); 4,18-4,22 (м, 1H); 4,28 (дд, J=10,3, J=6,1, 1H); 4,31 (д, J=4,3, 1H); 4,42 (шир.с, 1H); 4,62 (дд, J=7,5, J=7,0, 1H); 4,83-4,93 (м, 2H); 6,82 (д, J=7,9, 2H); 7,06-7,18 (м, 5H); 7,28-7,36 (м, 1H); 7,48 (шир.д, J=7,3, 1H); 7,56 (шир.с, 2H); 7,80 (шир.с, 1H); 7,84-7,98 (м, 3H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1075,4514[M+H]+ (рассчитано: 1075,4545) С52 Н68 N10 О10 S2

Пример 17 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-3,5-диF-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-3,5-диF-D-Phe-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-3,5-диF-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

ВЭЖХ: время удерживания = 8,8 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,75-0,85 (м, 1H); 0,92 (д, J=6,6, 3H); 0,96 (д, J=6,6, 3H); 1,20 (д, J=6,6, 3H); 1,40-1,55 (м, 3H); 1,77-1,87 (м, 1H); 1,90 (с, 6H); 2,20 (дд, J=13,2, J=6,6, 1H); 2,49 (дд, J=14,8, J=4,0, 1H); 2,62 (дд, J=14,7, J=9,8, 1H); 2,70 (дд, J=14,7, J=3,8, 1H); 2,79 (дд, J=14,7, J=11,4, 1H); 2,81-2,95 (м, 6H); 3,34 (дд, J=13,6, J=9,0, 1H); 3,45 (дд, J=13,6, J=5,8, 1H); 4,01 (д, J=9,9, 1H); 4,06 (дд, J=10,8, J=3,6, 1H); 4,20-4,28 (м, 2H); 4,33 (д, J=3,8, 1H); 4,35 (дд, J=8,8, J=6,0, 1H); 4,61 (д, J=7,7, 1H); 4,89 (дд, J=9,8, J=4,1, 1H); 4,92 (дд, J=11,3, J=3,6, 1H); 6,75-6,84 (м, 4H); 6,86-6,92 (м, 1H); 7,09 (д, J=8,6, 2H); 7,48 (дд, J=8,2, J=1,1, 1H); 7,52-7,59 (м, 2H); 7,80 (с, 1H); 7,85-7,95 (м, 3H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1093,4406[M+H]+ (рассчитано: 1093,4451) С52 Н67 N10 О10 S2

Пример 18 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-m-Br-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-m-Br-D-Phe-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-m-Br-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

ВЭЖХ: время удерживания = 9,0 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,52-0,68 (м, 1H); 0,76-0,90 (м, 1H); 0,92 (д, J=6,8, 3H); 0,95 (д, J=6,6, 3H); 1,21 (д, J=6,4, 3H); 1,30-1,54 (м, 3H); 1,70-1,82 (м, 1H); 1,93 (с, 6H); 2,12-2,27 (м, 1H); 2,48 (дд, J=14,8, J=3,7, 1H); 2,63 (дд, J=14,8, J=9,7, 1H); 2,70 (дд, J=14,5, J=3,5, 1H); 2,74-2,99 (м, 7H); 2,28 (дд, J=14,0, J=9,1, 1H); 3,49 (дд, J=13,7, J=5,7, 1H); 3,95-4,05 (м, 2H); 4,19-4,27 (м, 2H); 4,32 (д, J=3,8, 1H); 4,43 (дд, J=8,7, J=5,7, 1H); 4,63 (дд, J=7,7, J=7,2, 1H); 4,87-4,95 (м, 1H); 6,83 (д, J=8,1, 2H); 7,11 (д, J=8,4, 2H); 7,16 (д, J=7,5, 1H); 7,27 (т, J=7,8, 1H); 7,36 (с, 1H); 7,48 (с, 1H); 7,50 (с, 1H); 7,53-7,60 (м, 2H); 7,81 (с, 1H); 7,86-7,96 (м, 3H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1135,3741 и 1137,3704[M+H]+ (рассчитано: 1135,3745 и 1137,3724) С52 Н68 Br N10 О10 S2

Пример 19 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-o-Br-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-o-Br-D-Phe-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-o-Br-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

ВЭЖХ: время удерживания = 9,3 мин

МСВР (Н₂О) m/z: 1135,3749 и 1137,3723 [M+H]+ (рассчитано: 1135,3745 и 1137,3724) С52 Н68 Br N10 О10 S2

Пример 20 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-нитро-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-р-нитро-D-Phe-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-р-нитро-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

ВЭЖХ: время удерживания = 9,6 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,64-0,76 (м, 1H); 0,78-0,90 (м, 1H); 0,91 (д, J=6,7, 3H); 0,94 (д, J=6,6, 3H); 1,19 (д, J=6,5, 3H); 1,35-1,47 (м, 3H); 1,72-1,82 (м, 1H); 1,89 (с, 6H); 2,11-2,21 (м, 1H); 2,47 (дд, J=14,6, J=4,0, 1H); 2,59 (дд, J=14,7, J=9,8, 1H); 2,69 (дд, J=14,7, J=3,9, 1H); 2,72-2,81 (м, 3H); 2,84 (д, J=8,0, 2H); 2,94 (д, J=2,9, 1H); 3,00 (с, 1H); 3,30 (дд, J=13,6, J=9,0, 1H); 3,42 (дд, J=13,7, J=5,7, 1H); 3,99 (м, 2H); 4,21 (дд, J=6,6, J=4,0, 1H); 4,26-4,34 (м, 3H); 4,59 (т, J=7,6, 1H); 4,82-4,92 (м, 3H); 6,75 (д, J=8,5, 2H); 7,05 (д, J=8,5, 2H); 7,35 (д, J=8,7, 2H); 7,46 (дд, J=8,6, J=1,2, 1H); 7,50-7,56 (м, 2H); 7,78 (шир.с, 1H); 7,84-7,88 (м, 1H); 7,88-7,94 (м, 2H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1102,4476 [M+H]+ (рассчитано: 1102,4490) С52 Н68 N11 О12 S2

Пример 21 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-р-Ph-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-p-Ph-D-Phe-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-р-Ph-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2СН₃СООН

ВЭЖХ: время удерживания = 9,9 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,51-0,62 (м, 1H); 0,62-0,72 (м, 1H); 0,90 (д, J=6,6, 3H); 0,93 (д, J=6,6, 3H); 1,20 (д, J=6,3, 3H); 1,23-1,28 (м, 1H); 1,28-1,36 (м, 1H); 1,62-1,73 (м, 1H); 1,89 (с, 6H); 2,12-2,24 (м, 1H); 2,35-2,46 (м, 3H); 2,54 (дд, J=14,6, J=9,5, 1H); 2,67-2,82 (м, 2H); 2,82-2,98 (м, 4H); 3,20 (дд, J=13,3, J=9,2, 1H); 3,36 (дд, J=13,4, J=5,6, 1H); 3,91 (дд, J=10,9, J=3,4, 1H); 3,96 (д, J=9,8, 1H); 4,15 (дд, J=8,2, J=6,2, 1H); 4,20-4,30 (м, 2H); 4,32 (д, J=3,9, 1H); 4,31 (дд, J=7,7, J=7,2, 1H); 4,84-4,90 (м, 2H); 6,81 (д, J=6,8, 2H); 7,09 (д, J=8,4, 2H); 7,25 (д, J=7,9, 2H); 7,41-7,46 (м, 2H); 7,48-7,58 (м, 4H); 7,66 (д, J=8,0, 2H); 7,71 (д, J=7,4, 2H); 7,75 (шир.с, 1H); 7,83-7,87 (м, 1H); 7,87-7,92 (м, 2H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1133,5002 [M+H]+ (рассчитано: 1133,4953) С58 Н73 N10 О10 S2

Пример 22 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-р-2-(2-метоксиэтокси)этокси)-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-p-2-(2-метоксиэтокси)этокси-D-Phe-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-р-2-(2-метоксиэтокси)этокси)-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,64-0,76 (м, 1H); 0,76-0,88 (м, 1H); 0,93 (д, J=6,9, 3H); 0,96 (д, J=6,9, 3H); 1,23 (д, J=6,3, 3H); 1,35-1,52 (м, 2H); 1,72-1,82 (м, 1H); 1,91 (с, 6H); 2,13-2,24 (м, 1H); 2,43 (дд, J=14,6, J=4,8, 1H); 2,54 (дд, J=14,5, J=9,3, 1H); 2,70-2,95 (м, 4H); 3,19 (дд, J=13,1, J=9,6, 1H); 3,36 (с, 3H); 3,60 (т, J=3,4, 1H); 3,61 (т, J=4,4, 1H); 3,71 (т, J=4,4, 1H); 3,72 (т, J=3,4, 1H); 3,84-3,89 (м, 2H); 3,99 (д, J=10,8, 1H); 4,00 (д, J=4,01, 1H); 4,07-4,14 (м, 1H); 4,16-4,20 (м, 2H); 4,23-4,30 (м, 2H); 4,35 (д, J=3,9, 1H); 4,60 (дд, J=7,6, J=6,8, 1H); 4,83-4,88 (м, 2H); 6,82 (д, J=8,4, 2H); 6,96 (д, J=8,6, 2H); 7,07 (д, J=8,4, 2H); 7,13 (д, J=8,6, 2H); 7,46 (дд, J=8,5, J=1,3, 1H); 7,51-7,56 (м, 2H); 7,76 (шир.с, 1H); 7,85-7,94 (м, 3H).

Пример 23 : H-Nal¹-цикло(D-Cys²-D-Tyr³-Trp⁴-D-Lys⁵-D-Val⁶-D-Cys⁷)-D-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-D-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-D-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-D-Val-OH, затем Fmoc-D-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-L-Trp-OH, затем Fmoc-D-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-D-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-L-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-Nal¹-цикло(D-Cys²-D-Tyr³-Trp⁴-D-Lys⁵-D-Val⁶-D-Cys⁷)-D-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

ВЭЖХ: время удерживания = 9,87 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,10-0,22 (м, 1H), 0,32-0,46 (м, 1H), 0,90 (д, J=7,6, 3H), 0,91 (д, J=7,3, 3H), 1,10-1,30 (м, 4H) 1,19 (д, J=6,2, 3H), 1,50-1,62 (м, 1H), 1,95 (с, 6H), 2,10-2,20 (м, 1H), 2,45 (дд, J=14,5, J=3,9, 1H), 2,52-2,64 (м, 3H), 2,70 (дд, J=14,8, J=3,8, 1H), 2,78 (дд, J=14,3, J=11,7, 1H), 2,90-3,60 (м, 4H), 3,35 (дд, J=13,5, J=9,0, 1H), 3,46 (дд, J=14,0, J=6,0, 1H), 3,81 (дд, J=10,9, J=3,4, 1H), 3,95 (д, J=9,4, 1H), 4,18-4,27 (м, 2H), 4,31 (д, J=3,6, 1H), 4,42 (дд, J=8,5, J=5,9, 1H), 4,64 (т, J=7,4, 1H), 4,83-4,92 (м, 2H), 6,84 (д, J=8,6, 2H), 7,12 (д, J=8,6, 2H), 7,16 (т, J=7,1, 1H), 7,22 (т, J=7,1, 1H), 7,43-7,49 (м, 2H), 7,50-7,57 (м, 3H), 7,77 (шир.с, 1H), 7,83-7,88 (м, 1H), 7,90 (шир.д, J=8,9, 2H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1096,4749 [M+H]+

Пример 24 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-циклогексил-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-циклогексил-D-Ala-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-циклогексил-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

ВЭЖХ: время удерживания = 5,13 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,6-0,8 (м, 1H), 0,8 (д, J=7,5, 3H), 0,84 (д, J=7,3, 3H), 0,95 (Is), 1,1 (д, J=7,3, 3H), 1,14-1,35 (м, 4H), 1,35-1,65 (м, 6H), 1,7-1,94 (м, 5H), 1,98-2,1 (м, 1H), 2,32-2,5 (м, 2H), 2,6 (д, J=7,4, 1H), 2,72-2,92 (м, 4H), 3,18 (дд, J=9,2, J=13,4, 1H), 3,3 (дд, J=8, J=13,4, 1H), 3,85 (т, J=7,4, 1H), 3,9 (д, J=9,5, 1H), 4-4,1 (м, 2H), 4,18 (м, 2H), 4,4 (дд, J=6,2, J=9,5, 1H), 6,65 (д, J=8,3, 2H), 6,97 (д, J=8,4, 2H), 7,35 (д, J=8,3, 1H), 7,37-7,42 (м, 2H), 7,62 (с, 1H), 7,7-7,8 (м, 2H), 8,28 (с, 1H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1063,51245 [M+H]+ (рассчитано: 1063,510909) С52 Н75 N10 О10 S2

Пример 25 : H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-фенилазо-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

Открытый пептид получают согласно протоколу, описанному выше, последовательно осуществляя снятие защитной группы Fmoc-(9-флуоренилметилоксикарбонил) и присоединение следующей аминокислоты на твердом носителе в следующем порядке: Fmoc-L-Thr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, затем Fmoc-L-Val-OH, затем Fmoc-L-Lys(Boc)-ОН, затем Fmoc-4-фенилазо-D-Phe-OH, затем Fmoc-L-Tyr(трет-бутил)-ОН, затем Fmoc-L-Cys(Trt)-OH и наконец Boc-β-(2-нафтил)-D-Ala-OH.

Соединение циклизуют путем образования дисульфидного мостика, затем отщепляют смолу, очищают и, наконец, получают его в виде ацетата согласно методике, описанной выше, с получением соединения: H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-4-фенилазо-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.2CH₃COOH

ВЭЖХ: время удерживания = 6,0 мин

¹H ЯМР (400 МГц, D₂O): δ 0,6-0,85 (м, 1H), 0,9 (д, J=7,4, 3H), 0,93 (д, J=7,3, 3H), 1,2 (д, J=7,4, 3H), 1,27-1,56 (м, 2H),1,68-2,07 (м, 10H), 2,1-2,5 (м, 1H), 2,55-3,07 (м, 8H), 3,35 (дд, J=8,9, J=13, 1H), 3,47 (дд, J=5,6, J=13, 1H), 3,99 (д, J=9,9, 1H), 4,21-4,25 (м, 1H), 4,32 (д, J=3,8, 2H), 4,33-4,4 (м, 1H), 4,57-4,98 (м, 4H), 6,81 (д, J=8,4, 2H), 6,91 (м, 1H), 7,1 (т, J=8,8, 2H), 7,21-7,35 (м, 1H), 7,37 (д, J=8,3, 2H), 7,48 (д, J=8,4, 1H), 7,55 (м, 2H), 7,63 (м, 2H), 7,78-7,94 (м, 8H).

МСВР (Н₂О) m/z: 1161,50281 [M+H]+ (рассчитано: 1161,501407) С58 Н73 N12 О10 S2

2. Исследование соединения согласно изобретению

2.1 Активность октапептидных соединений в отношении рецепторов соматостатина

2.1.1 Протокол измерения сродства пептидов к рецепторам соматостатина

Сродство соединений согласно изобретению к рецепторам соматостатина определяли путем измерения ингибирования связывания [125I-Tyr11]SRIF-14 с мембранными препаратами трансфецированных клеток СНО-К1.

Клетки СНО-К1, стабильно экспрессирующие каждый из подтипов рецепторов соматостатина, собирали с помощью 0,5 мМ EDTA и центрифугировали при 500 g в течение 5 минут при 4°С. Осадок ресуспензировали в фосфатном буфере (PBS) и центрифугировали при 500 g в течение 5 минут при 4°С. Осадок ресуспензировали в буфере 50 мМ Tris с рН 7,4 и центрирфугировали при 500 g в течение 5 минут при 4°С. Клетки лизировали ультразвуком и центрифугировали при 39000 g в течение 10 минут. Осадок ресуспензировали в буфере 50 мМ Tris с рН 7,4, аликвотную часть отбирали для анализа белков, а остальную часть центрифугировали при 50000 g в течение 10 минут. Мембраны, полученные в последнем осадке, хранили при -80°С.

Измерение конкурентного ингибирования связывания [125I-Tyr11]SRIF-14 (от Perkin Elmer) с каждым из подтипов соматостатиновых рецепторов осуществляли в двух параллельных опытах на 96-луночных полипропиленовых планшетах. Клеточные мембраны (5-20 мкг белков/лунку) инкубировали с [125I-Tyr11]SRIF-14 (0,05-0,1 нМ) в течение 50-90 минут при 37°С (условия зависят от подтипа рецептора) в среде буфера 50 мМ HEPES с рН 7,4, содержащего 0,2% сывороточного бычьего альбумина (BSA), 5 мМ MgCl₂, Trasylol 200 KIU/мл, 0,02 мг/мл Bacitracine, фенилметилсульфонилфторид 0,02 мг/мл.

Связанный [125I-Tyr11]SRIF-14 отделяли от свободного [125I-Tyr11]SRIF-14 путем фильтрации через пластины фильтра из стекловолокна GF/C (Unifilter, Perkin Elmer), предварительно обработанные 0,1% раствором полиэтиленимина (P.E.I.), используя Filtermate 96 (Perkin Elmer). Фильтры промывали буфером Tris-HCl 50 мМ, рН 7,4 при 4°С и их радиоактивность определяли с помощью счетчика (TopCount, Perkin Elmer).

Данные анализировали путем нелинейной регрессии с помощью программного обеспечения XLfit 4.2 (IDBS).

2.1.2 Результаты

Примеры 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 и 25 имели сродство к подтипу 2 рецепторов соматостатина ниже или равное 5 мкМ.

Примеры 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 и 25 имели сродство к подтипу 2 рецепторов соматостатина ниже или равное 700 нМ.

Примеры 1, 2, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 и 25 имели сродство к подтипу 2 рецепторов соматостатина ниже или равное 50 нМ.

Примеры 1, 6, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 24 имели сродство к подтипу 2 рецепторов соматостатина ниже или равное 5 нМ.

Примеры 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 и 25 имели сродство к подтипу 5 рецепторов соматостатина ниже или равное 5 мкМ.

Примеры 1, 2, 6, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 и 25 имели сродство к подтипу 5 рецепторов соматостатина ниже или равное 1 мкМ.

Примеры 1, 6, 8, 9, 12, 15, 17, 18, 19, 21 и 24 имели сродство к подтипу 5 рецепторов соматостатина ниже или равное 100 нМ.

2.2 Физико-химические свойства октапептидных соединений

Полученные пептиды были исследованы в отношении способности этих соединений к самосборке.

Используемая процедура включала три этапа: растворение пептидов и макроскопический анализ; спектроскопический и микроскопический анализы образовавшихся структур и анализ путем малоугловой дифракции рентгеновских лучей (SAXS).

2.2.1 Растворение пептидов и макроскопический анализ

Первый этап характеризации производных состоял в получении растворов с концентрациями в диапазоне от 3 до 15% масс. пептида в воде. Образование геля указывало на наличие самособраннах структур, которые могут иметь конфигурацию нанотрубок или волокон или других самоорганизующихся структур.

2.2.2 Спектроскопический и микроскопический анализы образовавшихся структур

Этот этап ставит целью выявить наличие самособранных структур, охарактеризовать их самосборку и оценить ее визуально с помощью микроскопа.

Инфракрасная спектроскопия позволяет получить информацию о способе упаковки пептидов в процессе самосборки. Спектральная характеристика полосы амидной группы, отражающая спектральные характеристики полос поглощения карбонильных групп пептидного скелета, дает информацию о типе водородной связи, при которой эти группы задействованы (Н связь приводит к образованию конфигурации β листа, α спирали, петли или случайной конфигурации) и, следовательно, о вторичной или третичной структуре растворенных и самособранных пептидов. Для использования метода ослабленного полного внутреннего отражения (ATR-FTIR) берут кристалл, на который наносят жидкий или твердый образец. Инфракрасный свет направляют через кристалл под углом, при котором свет несколько раз отражается внутри кристалла, что повышает чувствительность метода. Благодаря таким характеристикам этот прибор может проводить измерения с использованием относительно разбавленных растворов. Проникновение пучка света в образец, нанесенный на кристалл, происходит на глубину в несколько микрон, поэтому анализируются только молекулы/структуры, которые нанесены на поверхность кристалла. Кроме того, этот метод не оказывает никакого деструктивного действия.

Структуры, полученные путем самосборки, визуально оценивают с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (МЕТ). Это очень мощный метод, позволяющий достичь увеличения в 500000 раз, поэтому он является одним из немногих методов, способных обеспечить визуализацию структур нанометрического размера. Образец подвергают воздействию электронного пучка. Визуализация направляемого пучка происходит либо с помощью фотолюминесцентного экрана, либо камеры CCD. Образец в микроскопе находится в вакууме, поэтому наблюдают только высушенные образцы после окрашивания солями уранила для увеличения контрастности изображения.

Растворенный пептид сначала наносят на медную сеточку, покрытую углеродной пленкой. После нанесения материала избыток жидкости удаляют. Также наносят на сеточку раствор красителя, в данном случае ацетата уранила, избыток его удаляют, а сеточку сушат на открытом воздухе. Затем сеточка может быть введена в микроскоп.

2.2.3 Анализы путем малоугловой дифракции рентгеновских лучей (SAXS).

Жидкие или гелеобразные образцы вводят в капилляр и подвергают воздействию потока монохроматических рентгеновских лучей. Измеряемая интенсивность рассеяния является функцией угла рассеяния относительно угла падения.

Полученную диаграмму рассеяния следует скоррелировать с теоретической моделью, близкой по структуре к исследуемому образцу. В случае, если самосборка пептидов происходит в форме полых нанотрубок, то моделирование экспериментальных данных при теоретическом рассеянии, производимом полыми колонками бесконечной длины, позволяет точно установить диаметр колонок и определить толщину их стенок (Valéry и сотр. в Biophysical journal, 2004, 86(4), 2484-2501 и в Proc. Natl. Acad. Sci., 2003, 100(18) 10258-10262). Если формы самосборки являются полидисперсными: нанотрубки, фибриллы, формы мицелия или ламели, то только корреляция спектроскопических и микроскопических данных, а также данных рассеяния рентгеновских лучей позволят определить диапазон размеров рассматриваемых объектов.

2.2.4 Результаты

Результаты анализа физико-химических свойств соединений представлены ниже в таблице 1:

Таблица 1
Пример	Сборка
1	Нанотрубка 20 нм, монодисперсная
2	Нанотрубка 12 нм, монодисперсная
3	Нанотрубка 9,3 нм, монодисперсная
4	Волокна
5	Раствор
6	Нанотрубка 35 нм, монодисперсная
7	Раствор
8	Раствор
9	Нанотрубка 22 нм, монодисперсная
10	Волокна
11	Раствор
12	Нанотрубка 17 нм, монодисперсная
13	Нанотрубка 17 нм, монодисперсная
14	Нанотрубка 18 нм, монодисперсная
15	Нанотрубка 15,6 нм, монодисперсная
16	Нанотрубка 17 нм, монодисперсная
17	Нанотрубка 15,3 нм, монодисперсная
18	Нанотрубка 18,4-18,8 нм, монодисперсная
19	Нанотрубка около 29 нм, полидисперсная

20	Нанотрубка 17,6 нм, монодисперсная
21	Раствор
22	Нанотрубка 17,4 нм, монодисперсная
23	Нанотрубка 24,4 нм, монодисперсная
24	Волокна
25	Нанотрубка 10 нм, монодисперсная

Некоторые пептиды могут образовывать монодисперсные нанотрубки, другие организуются в волокна или полидисперсные нанотрубки. Кроме того, некоторые являются растворимыми или, наоборот, нерастворимыми в рабочих условиях, описанных выше.

Самособирающимися в монодисперсные нанотрубки производными пептидов являются следующие соединения: примеры 1, 2, 3, 6, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 и 20. Получен диапазон значений диаметра в интервале от 9,3 до 35 нм.

Производное примера 19 осуществляет самосборку в форме нанотрубок с полидисперсными значениями диаметров.

Производными, которые осуществляют самосборку в форме волокон, являются соединения согласно примерам 4 и 10.

Растворимыми производными при исследуемых концентрациях являются соединения согласно примерам 7, 8 и 21.

Изучение соединений в другом интервале концентраций может привести к изменению указанного поведения.

2.3 Реология октапептидных соединений

Вязкие и вязкоэластичные свойства растворов/гелей соединений согласно изобретению могут быть изучены с помощью реологических исследований согласно рабочим методикам, описанным ниже.

2.3.1 Приборы и условия измерения

Как правило, измерения проводят с использованием реометра, типа “Control Stress Haake 600” (Haake, Германия), оснащенного измерительной геометрической системой конус/плоскость, где конус имеет диаметр 20 мм, угол 1 градус и зазор 52 микрона. Температуру измерения поддерживают на уровне 25°С +/-0,2°С с помощью термостатированной бани, но с возможностью при необходимости ее регулирования.

2.3.2 Типы измерений и условия их осуществления

Были проведены два дополнительных эксперимента, с одной стороны, измерения в статических условиях и, с другой стороны, измерения в динамических условиях (вибрационная реология), причем оба эксперимента кратко описаны ниже.

Статический режим

Кривую течения регистрируют в статическом режиме (кривая зависимости напряжения сдвига τ (Па) от скорости сдвига γ (сек^-1)). Эта кривая позволяет получить информацию относительно поведения потока, вязкости, предельного напряжения при сдвиговом усилии и возможной тиксотропности образцов. Растворы/гели, имеющие пептидную наноструктуру типа нанотрубок или волокон, ведут себя обычно как неньютоновские жидкости. Сопоставляя теоретические модели, такие как модель Кросса (Cross MM. J Colloid Sci 1965 20; 417-37) или Кассона (Casson, N. In Rheology of Disperse Systems, C.C. Mill ed, 1959, с. 82, Pergamon Press, New York, NY.),с экспериментальной кривой потока можно путем экстраполяции определить значения бесконечной вязкости (η^∞) и нулевой вязкости η₀ (Па.с), которые служат сравнительным и референсным показателем для определения вязкости упомянутых растворов/гелей.

Динамический режим (вибрационная реология)

Для измерений в динамическом режиме к образцу прикладывают синусоидальную деформацию сдвига (strain)(γ₀)(Па) с известной амплитудой и частотой. Измеряют результирующее синусоидальное напряжение сдвига (амплитуда τ₀). Растворы/гели, имеющие пептидные наноструктуры типа нанотрубок или волокон, обычно являются вязкоэластичными системами. В этом случае синусоидальные кривые, полученные при деформации сдвига (strain) и напряжении сдвига (stress), имеют сдвиг по фазе на угол δ. Значения τ₀, γ₀ и δ позволяют определить вязкоэластичные параметры:

комплексный модуль	\|G ^*\|=	τ ₀
γ ₀

модуль накопления G'=	\|G*\|cosδ
модуль потерь G”=	\|G*\|sinδ

Модуль накопления (называемый также модулем эластичности) характеризует величину упругой энергии, накопленной (или восстановленной) в единице объема, а модуль потерь характеризует величину энергии, рассеянной единицей объема. Эти модули должны рассчитываться в области линейной вязкоупругости (т.е. в экспериментальных условиях, при которых эти модули не зависят от амплитуды напряжения сдвига (strain)). Эти экспериментальные

условия обычно определяются с помощью эксперимента, называемого «диапазоном сдвиговых напряжений» “stress sweep”, который заключается в измерении модуля упругости и модуля потерь в зависимости от амплитуды наложенной деформации (обычно на частоте 1 Гц). Общая скорость деформации такова, что при слабых деформациях модули G' и G” меняются очень незначительно с изменением деформации. Затем при переходе к пределу текучести наблюдается резкое снижение G' и максимальное увеличение G”. Этот переход определяет область линейной вязкоупругости. Когда область линейной зависимости вязкоупругости определена, то можно осуществлять другие эксперименты, такие как измерение «диапазона частот» (“frequency sweep”), состоящее в измерении G' и G” как функции частоты сдвиговых деформаций с фиксированной амплитудой деформации, входящей в область линейной вязкоупругости.

Критическая деформация является деформацией, начиная с которой модуль упругости становится зависимым от деформации, накладываемой с постоянной частотой. При высоких деформациях материал теряет свои вязкоупругие свойства и становится скорее вязким, нежели упругим.

Можно также осуществить тесты на ползучесть-восстановление для характеризации растворов/гелей соединений. В тесте такого рода к образцу прикладывают усилие с постоянной амплитудой в первоначальный момент t=0, причем усилие поддерживается постоянным во времени. В этом случае нулевая вязкость η₀равна обратной величине наклона кривой эластичности (J) в зависимости от времени.

2.3.3 Результаты

Таблица 2
Пример	Реологические характеристики, модуль накопления (Па)	Реологические характеристики, критическая деформация (Па)
75 мМ	226 мМ	75 мМ	226 мМ
3	слишком низкая вязкость	150000	слишком низкая вязкость	360

4	184000	>2700000	800	18600
6	643500	>2700000	5000	8500

2.4 Изучение высвобождения октапептидных соединений

Изучение высвобождения может быть проведено с олигопептидными соединениями согласно изобретению в виде геля, твердого вещества или суспензии. Предусмотрены для этого два вида тестов: статические и/или динамические тесты, оба теста в общих чертах описаны ниже.

Параметры проведения эксперимента являются общими для обоих тестов. Средой высвобождения является жидкая среда с регулируемыми физико-химическими параметрами, предпочтительно, этой средой является буфер PBS (фосфатно-солевой буфер) с рН 7,4 и температурой, поддерживаемой на уровне 37°С. Кривая высвобождения отображает изменение концентрации изучаемого соединения в среде растворения (выражена в % высвобожденного соединения) в зависимости от времени (в минутах, часах, днях). Для начала проведения тестов известное количество образца помещают в среду растворения в момент времени 0 (t=0 мин/час/день), причем образец необязательно кондиционируют в устройстве, соответствующем его исходному физическому состоянию (гель, твердое вещество, суспензия). Измерения концентраций соединения в среде высвобождения осуществляют с помощью одного или нескольких аналитических методов, хорошо известных специалисту, таких как спектрофотометрия в УФ- и видимой областях спектра или ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). Параметры проведения аналитических методов выбирают в зависимости от физико-химических характеристик соединений. Тесты могут быть осуществлены при разных исходных концентрациях, таких как 75 мМ и 226 мМ согласно примерам, описанным ниже.

2.4.1 Статические тесты

Изучение высвобождения в статическом режиме проводят, не подвергая образец контролируемому перемешиванию или действию потока среды высвобождения. Отбор проб из среды высвобождения и/или определение концентраций, как правило, не являются автоматизированными операциями и осуществляются вручную. Например, некоторые статические исследования высвобождения могут проводиться на образцах, содержащих около 2-5 мг чистого соединения в 20 мг PBS (обычно в химических стаканах объемом 50 мл), которые выдерживают в сушильной печи при 37°С. Измерение концентраций осуществляют в представительных пробах, отобранных из среды высвобождения в заданные моменты времени.

2.4.2 Динамические тесты

Для динамических исследований высвобождения образец подвергают контролируемому перемешиванию или действию потока среды высвобождения. В этом случае отбор проб и/или определение концентраций являются, как правило, автоматизированными операциями и исследования могут проводиться в стандартизированных системах/приборах, хорошо известных из уровня техники (см. системы, включенные в Европейскую фармакопею). Например, некоторые исследования в динамическом режиме могут проводиться с образцами, содержащими около 10 мг чистого соединения, введенных в 100 мл буфера PBS, предварительно помещенного в стандартные химические стаканы и находящегося при 37°С. Перемешивание и отборы проб/измерения регулируются тестером контроля растворимости типа прибора 1 или 2, описанного в Европейской Фармакопее.

2.4.3 Результаты

Таблица 3
Пример	Статическое высвобождение спустя 48 час	Динамическое высвобождение спустя 44 часа
75 мМ	75 мМ	226 мМ
3	/	100%	93%
4	85%	94%	75%
6	25%	37%	17%

2.5 Анализ экспериментальных результатов

Таким образом, биологические и/или физико-химические свойства соединений согласно изобретению позволяют рекомендовать их для различных применений, таких как: пептиды с терапевтической активностью с быстрым или пролонгированным эффектом, или пептиды, не обладающие терапевтическим эффектом, но служащие носителем в рецептурных составах, например, для пролонгированного высвобождения активного начала.

1. Октапептидное соединение общей формулы (I):

в которой АА⁴ обозначает аминокислотный остаток, связанный с аминокислотами Tyr³ и Lys⁵согласно формуле:

в которой n4 означает целое число от 0 до 3 и R4 обозначает атом водорода, алкильный, циклоалкильный, арильный или гетероарильный радикал, причем алкильный радикал является линейным или разветвленным и содержит 1-6 атомов углерода, причем циклоакильный радикал представляет собой циклический радикал, содержащий 3-7 атомов углерода, соединенных между собой простыми связями, причем арильный и гетероарильный радикалы необязательно замещены одним или несколькими радикалами, одинаковыми или разными, выбираемыми из арилазо, галогена, нитро, гидроксила, арила, OR41;
R41 обозначает радикал , в котором R42 обозначает алкильный радикал или атом водорода, причем алкильный радикал является линейным или разветвленным и содержит 1-6 атомов углерода, n обозначает целое число от 2 до 4, m обозначает целое число от 1 до 4;
при условии, что все аминокислоты могут иметь конфигурацию D или L,
за исключением соединений H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(3-пиридил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂, H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂, H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Trp⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂ и их солей,
или фармацевтически приемлемая соль этого соединения.

2. Октапептидное соединение по п.1, отличающееся тем, что n4 означает целое число от 0 до 2, и R4 означает алкильный, циклоалкильный, арильный или гетероарильный радикалы, причем алкильный радикал является линейным или разветвленным и содержит 1-6 атомов углерода, причем циклоакильный радикал представляет собой циклический радикал, содержащий 3-7 атомов углерода, соединенных между собой простыми связями, причем арильный и гетероарильный радикалы необязательно замещены одним или несколькими радикалами, одинаковыми или разными, выбранными из арилазо, галогена, нитро, гидроксила, арила, OR41;
R41 означает радикал , в котором R42 означает алкильный радикал, который является линейным или разветвленным и содержит 1-6 атомов углерода, n или m означают 2.

3. Октапептидное соединение по п.1, в котором n4 означает 0 или 1, а R4 означает атом водорода или алкильный радикал, который является линейным или разветвленным и содержит 1-6 атомов углерода.

4. Октапептидное соединение по п.3, в котором n4 означает 0, а R4 означает алкильный радикал, который является линейным или разветвленным и содержит 1-6 атомов углерода.

5. Октапептидное соединение по п.3, отличающееся тем, что алкильный радикал означает метильный радикал.

6. Октапептидное соединение по одному из пп.1 или 2, в котором арильный радикал выбран из фенила, нафтила, антрила и флуоренила.

7. Октапептидное соединение по п.1, в котором гетероарильный радикал выбран из пиридинила, пиримидинила, фурила, тиенила, бензотиенила, оксазолила, бензоксазолила, изоксазолила, тиазолила, пиролила, пиразолила, имидазолила, тиазолила, тетразолила.

8. Октапептидное соединение по п.1, в котором гетероарильный радикал выбран из тиенила, бензотиенила и имидазолила.

9. Октапептидное соединение по одному из пп.1 или 2, в котором алкильный радикал выбран из метила, этила, пропила, изопропила, бутила, изобутила, третбутила, а циклоалкильный радикал представляет собой циклогексильный радикал.

10. Октапептидное соединение по п.1, в котором АА⁴ означает аминокислотный остаток, выбранный из L-Trp, Ala, β-(3-бензотиенил)-Ala, β-(2-тиенил)-Ala, β-(9-антрил)-Ala, β-(2-флуоренил)-Ala, His, Val, 1-Nal, 2-Nal, фенил-Gly, гомо-Phe, p-Br-Phe, p-F-Phe, m-F-Phe, o-F-Phe, m-Br-Phe, o-Br-Phe, p-NO₂-Phe, 3,5-дифтор-Phe, 4-фенил-Phe, Tyr, p-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)-Phe, β-(циклогексил)-Ala, р-фенилазо-Phe.

11. Октапептидное соединение по п.1, отличающееся тем, что аминокислотный остаток АА⁴ имеет конфигурацию D.

12. Октапептидное соединение по п.11, отличающееся тем, что аминокислоты 2-Nal⁴ и AA⁴ имеют конфигурацию D, при этом другие аминокислоты имеют конфигурацию L.

13. Октапептидное соединение по п.1, отличающееся тем, что аминокислотный остаток АА⁴ имеет конфигурацию L.

14. Октапептидное соединение по п.13, отличающееся тем, что аминокислоты 2-Nal⁴ и AA⁴ имеют конфигурацию L, при этом другие аминокислоты имеют конфигурацию D.

15. Октапептидное соединение по п.10, отличающееся тем, что АА⁴ означает остаток аминокислоты Ala.

16. Октапептидное соединение по п.1, отличающееся тем, что оно выбрано из:
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(3-бензотиенил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-тиенил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-His⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Val⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(1-нафтил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-нафтил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(9-антрил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-флуоренил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-Ph-D-Gly⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-гомо-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-Br-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Tyr⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-m-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-o-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-3,5-диF-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-m-Br-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-o-Br-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-Нитро-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-Ph-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(D-Cys²-D-Tyr³-L-Trp⁴-D-Lys⁵-D-Val⁶-D-Cys⁷)-D-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(циклогексил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-фенилазо-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
или фармацевтически приемлемой соли этого соединения.

17. Октапептидное соединение по п.16, отличающееся тем, что оно выбрано из:
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(3-бензотиенил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-тиенил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-His⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(1-нафтил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-флуоренил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-Br-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Tyr⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-m-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-o-F-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-3,5-диF-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-m-Br-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-Нитро-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-фенилазо-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.

18. Октапептидное соединение по п.16, отличающееся тем, что оно выбрано из:
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-Ph-D-Gly⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(циклогексил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.

19. Октапептидное соединение по п.16, отличающееся тем, что оно выбрано из:
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Val⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(2-нафтил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-β-(9-антрил)-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-гомо-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-p-Ph-D-Phe⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂

20. Октапептидное соединение по п.16, отличающееся тем, что оно представляет собой:
H-D-2-Nal¹-цикло(Cys²-Tyr³-D-Ala⁴-Lys⁵-Val⁶-Cys⁷)-Thr⁸-NH₂.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к цикличным пептидам из TNF, и может быть использовано в медицине. Цикличный пептид, состоящий из последовательности CGQRETPEGAEAKPWYC, используют для получения лекарственного средства для профилактики или лечения сосудистых осложнений у пациентов с диабетом, в том числе в составе фармацевтической композиции.

Производные циклоспорина для лечения глазных и кожных заболеваний и состояний // 2521358

Изобретение относится к соединению, выбранному из группы, состоящей из соединений, представленных формулой В указанной формуле R1 представляет собой S-Alk-R, где Alk представляет собой метилен, C2-C6 полиметиленовую связь или C3-C6 алкениленильную связь, R представляет собой -N=C(NR3R4)(NR5R6) или -NR7[(NR3R4)C=NR5], или -N=C(R8)(NR9R10), где R3-R10 представляет собой H, Alk, Ar или (CH2)nAr, где Ar представляет собой арильную группу, и n представляет собой целое число от 1 до 13, или R3 и R4, или R4 и R5, или R5 и R7, или R3 и R7, или R9 и R10, или R8 и R9 вместе могут представлять собой -(CH2)x-, где x представляет собой целое число от 2 до 5, и R2 выбран из группы, состоящей из гидроксила, алкила, имеющего от 1 до 7 атомов углерода, и замещенного гидроксилом алкила, имеющего от 1 до 7 атомов углерода.

Аналоги циклоспорина для предупреждения или лечения инфекции гепатита с // 2492181

Изобретение относится к аналогам циклоспорина, обладающим противовирусной активностью в отношении ВГС, их фармацевтическим композициям и способу лечения вирусной инфекции у субъекта.

Циклическое соединение и его соль // 2482130

Изобретение относится к соединению и его фармацевтически приемлемой соли, предназначенному для использования в качестве противогрибкового средства, в частности терапевтического средства против глубокого микоза.

Циклические противомикробные пептиды // 2463308

Циклический нонапептид, обладающий способностью ингибировать киназу легких цепей миозина // 2443710

Изобретение относится к биологически активным пептидам, способным ингибировать киназу легких цепей миозина и тем самым регулировать изменение проницаемости сосудистого эндотелия.

Новые циклические пептидные соединения // 2436795

Новые циклические пептидные соединения // 2423377

Производные циклоспорина, замещенные 3-эфиром и 3-тиоэфиром, для лечения и профилактики инфекционного гепатита с // 2399628

Производные кахалалида f // 2395520

Изобретение относится к новым противоопухолевым соединениям, представляющим собой производные кахалалида F, содержащим их фармацевтическим композициям и их применению для приготовления противоопухолевого лекарственного средства.

Циклический октапептид, радиофармацевтическое средство на его основе и способ применения радиофармацевтического средства для получения лекарственных (фармацевтических) средств для лечения новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы // 2528414

Изобретение относится к радиофармацевтическому средству формулы (Iа) или (Iв), представляющему собой комплекс циклического октапептида, содержащего хелатирующую группу, с радионуклидами 111In, 90Y, 177Lu.

Пептидные лиганды соматостатиновых рецепторов // 2525468

Изобретение относится к пептидным производным общей формулы (I), их стереоизомерам, их смесям и/или их фармацевтически приемлемым солям, к способам их получения, к фармацевтическим композициям, содержащим их, и к применению их для лечения, предупреждения и/или диагностики тех состояний, расстройств и/патологий, при которых экспрессируются соматостатиновые рецепторы sstr1, sstr2, sstr3, sstr4 и/или sstr5.

Способ получения циклического пептида // 2494105

Предложен способ получения октреотида или его фармацевтически приемлемых солей, таких как октреотида диацетат, в котором линейная пептидная последовательность синтезируется в автоматическом режиме на полимере Ринка, модифицированном N-Fmoc-треонинол-п-карбоксибензацетальным линкером, Fmoc-аминокислоты активируют действием гидроксибензотриазола/O-(бензотриазолN,N,N,N-тетраметилуроний гексафторфосфат)/диизопропил-этиламина (HOBVHBTU/DIEA) в среде диметилформамида, отщепление с полимера с одновременным удалением всех защитных групп проводят действием кислотной смеси, и полностью деблокированный линейный октапептид окисляют с использованием йода.

Конъюгаты дисоразолов, фармацевтическая композиция на их основе, названные конъюгаты для изготовления лекарственного средства, набор и способ их получения // 2473562

Изобретение относится к конъюгатам дисоразолов и их производных с молекулами, связывающими клетки, такими как пептиды и белки, а также к новым дисоразоловым производным и способам их получения.

Конъюгаты цитотоксических средств с пептидами // 2457218

Октапептид для получения радиофармацевтических средств, радиофармацевтическое средство на его основе и способ диагностики опухолей, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы // 2457215

Изобретение относится к октапептидам формулы (I), где Х и Y - H или хелатирующая группа, в частности ДОТА, ковалентно связанная с - или -аминогруппами N-концевого лизина, являющимися производными октреотида, а также радиофармацевтическим средствам на его основе, используемым при диагностике опухолей.

Способ хроматографической очистки октреотида // 2441018

Изобретение относится к области фармацевтической химии, конкретно к способу хроматографической очистки циклического пептида октреотида I, и имеет своей целью разработку полупромышленного процесса очистки октреотида-сырца.

Твердофазный синтез пептидов с защитными группами вос и fmoc // 2439075

Изобретение относится к твердофазному способу синтеза пептида формулы H-D- -Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2, в котором используются и Вос-защищенные, и Fmoc-защищенные аминокислоты и смола из хлорметилированного полистирола.

Способ получения циклического пептида - октреотида // 2435780

Изобретение относится к области фармацевтической химии, конкретно к способу получения октреотида жидкофазным методом путем окислительной циклизации с использованием в качестве окислительного и деблокирующего реагента трииодида калия в водно-метанольном растворе.

Получение пептидов соматостатина // 2360921

Изобретение относится к способу получения циклических аналогов соматостатина формулы I и промежуточным продуктам, применяемым в способе. .

Модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения // 2529034

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и может быть использовано как эффективное средство адресной доставки комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами в определенные органы и ткани млекопитающих.