Способ получения биологического препарата для защиты озимых зерновых культур от розовой снежной плесени microdochium nivale
Владельцы патента RU 2548199:
Государственное научное учреждение (ГНУ) Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина (ВИГИС) Россельхозакадемии (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки (ФГБУН) Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук (RU)
Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии. В способе готовят картофельно-декстрозный агар (PDA), выделяют гриб в чистую культуру, подготавливают инокулюм для инфекционного фона, выделяют нематоды (A. saprophillus) из пораженных растений. Массово размножают микогельминты (A. saprophillus) на грибе М. nivale при температуре +5˚C. Подготавливают суспензию микогельминта A. saprophillus и вносят осенью на поля, пораженные розовой снежной плесенью озимых зерновых культур, суспензию с микогельминтами (A. saprophillus) в дозе 160 тыс. шт./м2. Способ позволяет снизить количество используемых фунгицидов, уничтожает мицелий гриба М. nivale возбудителя РСП, помогает растениям противостоять поражению РСП в осенне-зимне-весенний период, обеспечивает получение экологически чистого зерна и повышает его качество. 3 табл.
Способ получения биологического препарата для защиты озимых зерновых культур от розовой снежной плесени относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в биотехнологии для биологической защиты зерновых злаковых культур.
Розовую снежную плесень (РСП) вызывает фитопатогенный низкотемпературный гриб Microdochium (Fusarium) nivale (Fr.) Samuels & I.C. Hallet. Заражение растений происходит, прежде всего, через почву, так как возбудитель может сохраняться на пожнивных остатках, но возможно также и заражение с посевным материалом. В сильно раскустившихся посевах распространению инфекции особенно способствуют высокая влажность воздуха и низкие температуры, близкие к нулю. Если посевы на незамерзшей почве долгое время покрыты снегом, создаются особенно благоприятные условия для развития этого гриба. Болезнь становится заметна лишь весной после таяния снега. Сразу после схода снега больные растения обычно покрыты мицелием, имеющим окраску, от грязно-белой до светло-розовой, которая исчезает при солнечной и ветреной погоде. Обильное образование налета ведет к склеиванию листьев; вследствие чего пораженные листья отмирают. При сильном поражении наблюдается отмирание узла кущения, листовых влагалищ, корней и гибель всего растения. Выжившие растения могут отставать в своем развитии, а в их колосьях часто формируется неполноценное зерно. Вредоносность РСП заключается в изреживании посевов, а нередко частичной или полной их гибели. При сильном поражении растений иногда приходится прибегать к пересеву яровыми. Потери урожая при этом могут быть 20-50%. Для подавления РСП используют химические фунгициды при предпосадочном протравливании зерна и опрыскивании как можно ближе к установлению снегового покрова, сроки установления которого трудно предсказать. К тому же применение фунгицидов имеет много отрицательных сторон (загрязнение пестицидами почвы и природных вод, накопление токсичных веществ в продуктах питания, нарушение экологической целостности почвенной биоты и т.д.). В настоящее время во многих странах мира ведутся работы, направленные на экологизацию выращивания сельскохозяйственных культур, для которой биологический метод имеет большое значение.
Разработанный биологический препарат для защиты озимой пшеницы от РСП заключается в использовании в качестве биологического агента низкотемпературных микогельминтов. Это специфичные к РСП нематоды вооруженные стилетом, с помощью которого прокалывают стенки гиф мицелия и высасывают его содержимое. В результате мицелий гриба М. nivale погибает.
Аналога использования этих микогельминтов в борьбе с розовой снежной плесенью озимой пшеницы нам не известны.
Цель патента заключается в разработке технологии биологической защиты зерновых злаковых культур от розовой снежной плесени с помощью специально выделенных высокоэффективных низкотемпературных микогельминтов, а также разработке оптимальных условий их применения.
Примеры конкретного исполнения
Для получения биологического препарата были разработаны специальные методики:
1. Методика приготовления картофельно-декстрозного агара (PDA)
Для приготовления питательной среды для грибов, использовали готовый PDA фирмы HIMEDIA (Индия).
Размешать 39 г порошка в 1000 мл дистилированной воды. Колбу с раствором нагревали на водяной бане до полного растворения частиц. Стерилизовали в автоклаве при 1,1 атм (121°C) в течение 15 минут.
2. Методика выделения гриба в чистую культуру
Взятые из пораженных растений изоляты мицелия гриба М. nivale ополаскивали в стерильной воде и высевали на PDA в чашки Петри и выращивали при комнатной температуре. Через 5 дней мицелий гриба полностью распространялся по поверхности питательной среды.
3. Методика подготовки иннокулюма для инфекционного фона
Простерелизованное в автоклаве (при давлении 1,5 атмосфер, 60 мин) и затем остывшее зерно пшеницы засевали грибом М nivale. Соотношение пшеницы и воды 1:1 (по весу). Затем колбы помещали в климакамеру (SanyoMPR-311D(H), Япония) на 30 дней, поддерживая t=10°C.
4. Методика выделения нематод из пораженных растений
Материалами для исследований служили сборы внешне здоровых и пораженных РСП растений озимой пшеницы и прикорневой почвы. Для извлечения нематод из разных частей растений и почвы применяли модифицированный метод Бермана. Навески, очищенные от лишних примесей, раскладывали слоем 3-5 мм на ватном фильтре, в сите. Сито вставляли в воронку диаметром 12-15 см, на раструб которой надевали кусок резинового шланга длиной 10-15 см. В нижний конец трубки вставляли энтомологическую пробирку для сбора выделенных нематод. Воронку с резиновой трубкой и с пробиркой устанавливали в деревянном штативе со специально изготовленными отверстиями для воронок. Воронку заливали свежей водопроводной водой так, чтобы жидкость покрыла насыпанную на сито массу.
Продолжительность растительной экспозиции составляет 24 часа, для почвы - 48 часов. При определении нематод учитывают количество самок, самцов и личинок. При анализе материала под микроскопом, наносили суспензию нематод из энтомологической пробирки на предметное стекло, просматривали и определяли вид. При определении видового состава нематод использовались работы по систематике нематод (Парамонов, 1962).
5. Методика массового размножения микогельминта A. saprophillus на грибе Alternaria tenius Nees
Культивирование и размножение нематод проводилось по методу Шестеперова А.А. (1995). Результаты исследований Шестеперова показывают, что микотрофные нематоды лучше всего размножаются на грибе Alternaria tenius.
При размножении грибов использовали PDA. Его наливали в двухлитровые матрацы по 200 мл и закрывали ватно-марлевыми пробками. Затем автоклавировали при атмосфере 0,5 в течение 0,5 часа. После стириллизации матрацы были сложены на ровную поверхность до остывания и затвердевания питательной среды. Гриб высевали на полностью остывший питательный субстрат и выращивали 3-10 дней в термостате при температуре 26-27°C. Заселенные грибом двухлитровые матрацы заражали водной суспензией нематод в количестве 500 экз. и оставляли при комнатной температуре. Через 30-40 дней количество нематод увеличивалось в 80-100 раз. Матрацы хранили в климакамере при температуре +5°C.
6. Методика внесения инокулюма на опытные делянки
Из колб с наработанным инокулюмом гриба М. nivale извлекали заросшее мицелием гриба зерно, которое было взвешено на торзионных весах (100 г) и распределены по пакетам. Развешенный и распределенный инокулем гриба равномерно рассыпали по поверхности опытной делянки (1×1 м2).
7. Методика подготовки водной суспензии микогельминта A. saprophillus
A. saprophillus культивировали в лаборатории на грибе М. nivale при t +5°C. Микогельминта размножали в двухлитровых колбах. Когда в большинстве колб мицелий гриба был съеден, нематод смывали со стенок колб. Полученную суспензию (в объеме 800 мл), довели до объема 1 л (для удобства подсчета). Полученный раствор тщательно перемешали (с помощью магнитной мешалки) и подсчитали число нематод в 1 мл (1 мл = 100 экз).
Полученную суспензию взбалтывали и заливали в опрыскиватель. Нематод распыляли на пораженные РСП растения осенью. Весной определяли биологическую эффективность применения микогельминта A. saprophillus в борьбе с РСП, а осенью - хозяйственную эффективность.
В проведенных лабораторных опытах микогельминты Aphelenchoides saprophillus Franklin, Paraphelenchus tritici Baranovskaja, Aphelenchus avenae Bastian, были внесены в количестве ±100-200 экз. / пробирку (20×200 мм) на мицелий гриба M. nivale при температурах +5°C, +15°C и +27°C. Температура +5°C оказалась наиболее благоприятной для культивирования микогельминтов Р. tritici, A. avenae и A. saprophillus на мицелии гриба М. nivale. Коэффициент размножения при этой температуре у всех видов колебался от 4,8 до 7,1, при этом нематоды использовали все представленные пищевые ресурсы (мицелий гриба М. nivale) за 50-75 дней. Однако при температуре +15°C скорость размножения у микогельминтов уменьшилась (коэффициент размножения - 4,65-6,09), что естественным образом сказалось на численности популяции (табл.1). В конце эксперимента в пробирках, хранившихся при температуре +15°C, были отмечены единичные погибшие особи, что не наблюдалось в пробирках при температуре +5°C. В тоже время, у видов Р. tritici, A.avenae и A. saprophillus при температуре +27°C не зарегистрировано размножения (коэффициент размножения - 1,14-1,48).
| Таблица 1 | ||||
| Влияние температуры на численность микогельминтов на мицелий гриба Microdochium nivale при культивировании | ||||
| Виды микогельминтов | t=+5°C | t=+15°C | t=+27°C | HCP01 |
| Aphelenchoides saprophillus | 661 | 570 | 146 | 23 |
| Aphelenchus avenae | 627 | 536 | 116 | 95 |
| Paraphelenchus tritici | 536 | 444 | 93 | 31 |
| HCP01 | 7 | 16 | 91 |
Анализ полученных данных по культивированию трех видов микогельминтов на грибе М. nivale показал, что температура влияла на размножение нематод и на сроки использования представленных пищевых ресурсов. Установлено, что температура +5°C (близкая к температуре под снеговым покровом) является благоприятной для размножения трех видов нематод, а общая численность нематод при данной температуре была достаточно высокая. Так как, A. saprophillus проявил наиболее агрессивные качества к грибу М. nivale (полное подавление роста популяции гриба в опытных пробирках, тогда как с другими видами микогельминтов сохранился мицелий гриба) и лучше размножался при трех исследуемых температурах, в сравнении с другими видами микогельминтов наименьшее существенная разница (HCP01-23). Дальнейшие исследования проводились именно с этим видом микогельминта (Щуковская, А.Г. 2012 г.).
Проведенные мелкоделяночные полевые опыты показали, что внесение осенью микогельминтов на посевы озимой пшеницы, пораженной РСП, уменьшило степень поражения болезни весной следующего года.
| Таблица 2 | ||||||||
| Влияние численности микогельминтов на развитие РСП озимой пшеницы | ||||||||
| Варианты опыта | Кол-во. Растений, шт./м2 | Кол-во продуктивных стеблей, шт./м2 | Высота растений, см | Длина Колоса, см | К-во зерен в Колосе, шт. | Масса зерна в колосе, г | Масса 1000 зерен, г | Урожайность, ц/га |
| Контроль (гриб М nivale без внесения нематод) | ||||||||
| 273,5 | 270,2 | 74,5 | 7,95 | 23,7 | 2,7 | 47,45 | 68 | |
| Гриб М nivale + A. saprophillus (38000 тыс. экз.) | ||||||||
| 321 | 326 | 100,7 | 7,87 | 23,75 | 2,2 | 47,7 | 71,1 | |
| Гриб М nivale + A. saprophillus (80000 тыс. экз.) | ||||||||
| 338,75 | 333,75 | 101,7 | 8,5 | 25,5 | 2,19 | 44,75 | 78,2 | |
| Гриб М nivale + A. saprophillus (160000 тыс. экз.) | ||||||||
| 345,2 | 344,5 | 104 | 8,37 | 23,75 | 2,28 | 48,8 | 79,4 | |
| HCP05 | 10,1 |
В экспериментах внесенные нематоды существенно снижали степень развития заболевания и улучшали показатели продуктивных качеств растений озимой пшеницы, что, в свою очередь, влияло на повышение урожая.
В варианте, где было внесено 160000 тыс. экз. нематод процент развития РСП составил всего 20,5%, тогда как в контроле развитие болезни было в 2,5 раза больше (табл.3). В вариантах с численностью внесения 80000 тыс. экз. и 38000 тыс. экз. нематод развитие болезни было (26% и 31,25% соответственно).
В контроле пораженные растения имели меньшее количество продуктивных стеблей (270,2) по сравнению с вариантом М nivale + А. saprophillus (160000 тыс. экз.) - 344,5 шт. Отмечалось снижение массы зерна в колосе, 1000 зерен (47,45 г - контроль и 48,8 г в варианте М. nivale + А. saprophillus 160000 тыс. экз.).
Расчет биологической эффективности показал (табл.3), что в варианте, где была внесена максимальная концентрация микогельминтов 160000 шт./м2 биологическая эффективность - 62,7%, в варианте с концентрацией 80000 шт./м2 - 52,7%, а с концентрацией 38000 шт./м2 - 43,1%. В варианте, где вносили нематод в максимальной концентрации, хозяйственная эффективность выше на 6,7%, в сравнении с вариантом, где вносили среднюю концентрацию и 45,3%, где вносили минимальную концентрацию микогельминтов.
| Таблица 3 | ||||
| Биологическая и хозяйственная эффективности применения суспензии микогельминта A. saprophillus на растениях озимой пшеницы, пораженной РСП | ||||
| Вариант | Биологическая эффективность, % | Поражение РСП, % | Хозяйственная эффективность, % | Урожайность, ц /га |
| М. nivale (контроль - без внесения нематод) | 0 | 55 | 0 | 68 |
| М. nivale + мин. | 43,1 | 31,25 | 4.3 | 71,1 |
| концентрация (38000 экз/делянка) | ||||
| М. nivale + сред. концентрация (60000 экз/делянка) | 52,7 | 26 | 13,04 | 78,2 |
| М. nivale + мах. концентрация (160000 экз/делянка) | 62,7 | 20,5 | 14,45 | 79,4 |
| 19 | 19,6 | 10,5 | 10 |
Представленные результаты исследований статистически обработаны в программе Microsoft Excel (Statstica).
Перечень существенных признаков изобретения
При использовании суспензии микогельминта A. saprophillus в борьбе мицелием РСП отмечены следующие существенные признаки:
- Снижает степень развития РСП в осенне-зимне-весенний период.
- Помогает растениям противостоять поражению РСП в зимний период.
- Обеспечивает получение экологически чистого зерна и повышает его качество.
- Не заносит на посевы фитопатогенных организмов.
Литература
1. Шестеперов А.А., Савотиков Ю.Ф. «Карантинные фитогельминтозы» // Кн.1. - М.: Колос, 1995. - 463 с.
2. Щуковская А.Г., Шестеперов А.А., Ткаченко О.Б. «Микогельминты озимой пшеницы - потенциальные биоагенты гриба Microdochium nivale» // Мат. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». М. 2012. Вып.13. С.466-468.
3. Hoshino Т., Xiao N., Yajima Yu., Tkachenko O.B. Fungi in Cryosphere: Their Adaptations to Environments. Part 1. Biodiversity in Cold Ecosystems. Chapter.
4. Cold-adapted Microorganisms. Edited by Isao Yumoto. Norfolk, UK: Caister Academic Press, 2013. - P.51-68.
Способ внесения биологического препарата для защиты озимых зерновых культур от розовой снежной плесени (Microdochium nivale), который заключается в приготовлении картофельно-декстрозного агара (PDA), выделении гриба в чистую культуру, подготовке инокулюма для инфекционного фона, выделении нематод (A. saprophillus) из пораженных растений, массовом размножении микогельминта (A. saprophillus) на грибе М. nivale при температуре +5°C, подготовке суспензии микогельминта A. saprophillus и внесении осенью на поля, пораженные розовой снежной плесенью озимых зерновых культур, суспензии с микогельминтами (A. saprophillus) в дозе 160 тыс. шт./м2.
