Диагностика индуцируемых глютеном аутоиммунных заболеваний

Авторы патента:

ШИМОН-ВЕЧЕИ Жофиа (HU)

БАГОШШИ Петер (HU)

МЯКИ Маркку (FI)

КОРПОНАИ-САБО Ильма (HU)

ФЕШЮШ Ласло (HU)

КИРАЙ Роберт (HU)

ЧЁС Эва (HU)

G01N33/573 - ферментов или изоферментов

G01N33/564 - уже имеющихся иммунокомплексов или аутоиммунных болезней

G01N33/53 - иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого (препараты для терапевтических целей, содержащие антигены или антитела,A61K; гептены вообще, см. соответствующие рубрики в классе C07; пептиды, например протеины, вообще C07K)

C07K16/40 - против ферментов

Владельцы патента RU 2548730:

ЮНИСВЕРСИТИ ОФ ДЕБРЕЦЕН (HU)

Группа изобретений относится к медицине, а именно диагностике глютен-чувствительной энтеропатии у генетически предрасположенных пациентов, и может быть использована для уточнения диагноза аутоиммунного заболевания. Для этого измеряют уровень связывания аутоантител в образцах сыворотки крови пациента с неизменным целиакальным эпитопом белков семейства трансглутаминаз по сравнению с уровнем связывания тестового соединения (ТС). ТС представляет собой тестовое антитело либо его фрагмент, вариант или аналог. ТС способно связываться с основным целиакальным эпитопом белков семейства трансглутаминаз. Превышение уровня связывания аутоантител в отсутствие ТС или снижение уровня связывания аутоантител на 50% в присутствие ТС указывают на индуцируемое глютеном аутоиммунное заболевание у указанного индивидуума. Группа изобретений обеспечивает корректировку диагностики индуцируемых глютеном аутоиммунных заболеваний и назначение сопутствующей диеты с устранением источников глютена. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 15 ил., 2 табл. 10 пр.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к селективной диагностике индуцируемых глютеном аутоиммунных заболеваний с помощью анализов связывания с использованием основного целикального эпитопа, присутствующего на белках семейства трансглутаминазы.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Глютеновая болезнь (также известная как целиакальная болезнь, нетропические афты или глютен-чувствительная энтеропатия) представляет собой уникальное аутоиммунное нарушение, для которого известен пусковой фактор из окружающей среды. Это нарушение развивается у генетически предрасположенных индивидуумов с генетическим фоном лейкоцитарного антигена человека (HLA) DQ2 или DQ8, и оно характеризуется хроническим воспалением кишечника, мальабсорбцией и продукцией аутоантител в результате употребления глютена. В дополнение к энтеропатии, глютен также может вызывать зудящую и образующую волдыри кожную сыпь, и в этом случае заболевание называют герпетиформным дерматитом. Заболевание можно успешно лечить путем устранения глютена из диеты пациентов, однако для постоянного ответа это лечение необходимо соблюдать на протяжении всей жизни.

Глютеновая болезнь вызывается употреблением глютеновой фракции пшеницы, ржи и ячменя. Глиадин представляет собой растворимую в спирте часть глютена и он содержит смесь пептидов, которые, как было показано, являются токсичными для пациентов. 33-мерный происходящий из α-глиадина пептид был идентифицирован в качестве наиболее иммуногенной части глиадина, которая устойчива к расщеплению протеазами желудка, поджелудочной железы и мембраной щеточной каемки, и может проникать через эпителий кишечника, стимулируя иммунный ответ в собственной пластинке [Shan L et al, Science. 2002; 297:2275-9]. Характерными признаками заболевания являются инфильтрация воспалительных клеток, атрофия ворсинок и гиперплазия крипт в верхнем отделе тонкого кишечника, в то время как также оно может вызывать внекишечные симптомы, такие как анемия, неврологические нарушения или заболевание кожи, называемое герпетиформным дерматитом. Заболевание, главным образом, встречается в западных популяциях, где пшеница является основным продуктом питания (Европа, США, Австралия), однако недавно оно также появилось на Среднем Востоке, в Южной Америке, Северной Африке и Азии. Это заболевание было выявлено у 1,0% финских детей школьного возраста [Maki M et al, N Engl J Med. 2003; 348(25):2517-24], у 0,75% "не имеющих риска" групп в США [Fasano A et al, Arch Intern Med. 2003; 163(3):286-92] и у 1,4% детей в возрасте 6 лет при скрининге в Венгрии [Korponay-Szabo IR et al, BMJ. 2007; 335(7632):1244-7]. Это заболевание имеет широкий диапазон различных клинических проявлений, таких как диарея, вздутие живота, анемия, снижение массы, задержка роста, кожные или неврологические симптомы, и оно может быть диагностировано в любом возрасте. В результате отсутствия надлежащего всасывания могут возникать дефициты витаминов и минералов: витамина B₁₂, витамина K, фолиевой кислоты, железа и кальция. Многие пациенты могут иметь только мягкие симптомы и в таких случаях надлежащая диагностика часто затягивается. Глютеновая болезнь без лечения имеет тяжелые осложнения, такие как аденокарцинома (практически с двукратным риском по сравнению с общей популяцией), T-клеточная лимфома (приблизительно с пятидесятикратным риском) и остеопороз.

Современные диагностические критерии для глютеновой болезни были установлены European Society for Pediatric Gastroenterology and Nutrition и требуют гистологического обследования биоптата из верхней части тонкого кишечника (дуоденальная биопсия), указывающего на внутриэпителиальный лимфоцитоз, гиперплазию крипт и атрофию ворсинок, вместе с тем, также должен наблюдаться благоприятный ответ на диету без глютена. Также в поддержку диагноза глютеновой болезни служит, если пациент обладает определенными аутоантителами в крови, которые могут связываться с нормальными срезами тканей вдоль слоев соединительной ткани, окружающих гладкомышечные клетки (эндомизиальное антитело) или вдоль волокон ретикулина (паттерн связывания антител с R₁-ретикулином) [Green PH, Cellier C, N Engl J Med. 2007; 357(17):1731-43].

Диагностика этого заболевания является в высокой степени недостаточной и только у двух из десяти пациентов это заболевание устанавливают клинически. Основным объяснением является то, что не у всех пациентов развиваются клинические проявления (молчащее заболевание) и некоторые из них могут даже иметь нормальную морфологию слизистой оболочки в течение длительного периода времени [Maki M, Collin P, Lancet. 1997; 349(9067):1755-9]. Однако они часто являются положительными по аутоантителам против ретикулина и эндомизиальной ткани с высокой плотностью внутриэпителиальных лимфоцитов или с положительным паттерном антител кишечника, подобных целиакальным. Эта подгруппа заболевания, называемая латентной или потенциальной глютеновой болезнью, является диагностической проблемой и у этих пациентов может появиться атрофия ворсинок и гиперплазия крипт в последующие годы или может развиться тяжелое - иногда необратимое - повреждение других органов (глютеновая атаксия, кардиомиопатия, сахарный диабет, гипотиреоз). Диагностика у пациентов с латентной фазой является трудной, поскольку они часто не удовлетворяют общепринятым диагностическим критериям, и требуется длительный период их наблюдения. Уровни антител могут колебаться с течением времени, и в настоящее время отсутствуют хорошие инструменты для точного предсказания того, у каких индивидуумов произойдет ухудшение в ближайшем будущем [Simell S et al, Scand J Gastroenterol. 2005; 40(10):1182-91].

Современные диагностические критерии на основе доказанного повреждения ворсинок в тонком кишечнике, таким образом, являются недостаточными и требуют переформулирования [Kaukinen K et al, Dig Dis Sci. 2001; 46:879-87]. Кроме того, биопсия тонкого кишечника является неприятной и инвазивной диагностической процедурой, и замена диагностических критериев на основе биопсии на положительность по антителам имела бы несколько практических преимуществ, а также возможность включать в диагностику индивидуумов с ранним заболеванием и своевременно формулировать показание к лечению. Потребность в менее сложных и лучше переносимых начальных диагностических инструментах давно признана. Все в большей степени применяют серологические тесты на основе детекции циркулирующих антител в крови пациентов против глиадина, ретикулина, эндомизия и трансглутаминазы 2 типа (TG2). Также они пригодны для нахождения пациентов с мягкими симптомами или атипичными клиническими проявлениями и для скрининга ближайших родственников или групп риска. Основные группы риска состоят из пациентов с сахарным диабетом, синдромом Дауна, селективным дефицитом IgA и различными аутоиммунными нарушениями, такими как аутоиммунное заболевание щитовидной железы, синдром Шегрена, красная волчанка, аутоиммунное заболевание печени, алопеция, гломерулярное заболевание и заболевание сердца, которые часто сосуществуют с глютеновой болезнью [Green PH, Cellier C, N Engl J Med. 2007; 357(17):1731-43].

Антитела против глиадина не демонстрируют достаточной чувствительности или специфичности в отношении глютеновой болезни, несмотря на это, тест на основе дезамидированных пептидов глиадина, которые структурно сходны с TG2, является относительно эффективным [Volta U et al, Dig Dis Sci. 2008; 53(6): 1582-8.; Korponay-Szabo IR et al, J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2008; 46(3):253-61]. Мониторинг эндомизиальных IgA-антител с использованием непрямых иммунофлоресцентных анализов может обеспечить высокую точность, поскольку эти антитела являются высокоспецифическими маркерами этого заболевания. Однако оценка теста эндомизиальных антител в большой степени зависит от исследователя и требует высококвалифицированных и обученных специалистов и, таким образом, он не является широко доступным в любых медицинских условиях. Селективный дефицит IgA является распространенным признаком у пациентов с глютеновой болезнью (1 из 40 случаев), что делает очень трудным распознавание пациентов общепринятым тестом эндомизиальных антител. В этих случаях необходимо проводить детекцию IgG-класса аутоантител против TG2 [Korponay-Szabo I et al, Gut. 2003; 52(11):1567-71]. Кроме того, эндомизиальный тест не может отличать явную и латентную формы заболевания [Green PH, Cellier C, N Engl J Med. 2007; 357(17):1731-43]. Таким образом, в данной области существовала потребность в надежных и более простых для применения тестах.

Было выявлено, что TG2 (также известный как тканевая, эритроцитарная или клеточная трансглутаминаза) является главным собственным аутоантигеном и мишенью для антител против эндомизия и ретикулина при глютеновой болезни. Этот фермент является представителем суперсемейства трансглутаминаз, которые катализируют реакцию переноса ацила между γ-карбоксамидной группой глутамина и ε-аминогруппой остатка лизина - ковалентное сшивание белков - зависимым от Ca²⁺ образом (EC 2.3.2.13). Помимо этого, TG2 может катализировать включение аминов в белки, сайт-специфическую дезамидацию, он обладает изопептидазной активностью и участвует в трансмембранной передаче сигнала через его GTP-азную активность. TG2 может экстернализоваться из клеток, где она образует комплексы с инегринами и фибронектином, стимулирует ремоделирование и сборку внеклеточного матрикса и опосредует взаимодействия клетка-матрикс. Таким образом, TG2 участвует в заживлении ран и ангиогенезе. Этот фермент может транслоцироваться в ядро и, путем сшивания гистонов и ретинобластомных белков, он также может регулировать экспрессию генов. TG2 индуцируется и активируется в процессе апоптоза; более того, нехватка этого фермента нарушает поглощение апоптотических клеток макрофагами [Fesus L, Piacentini M, Trends Biochem Sci. 2002; 27(10):534-9].

TG2 является повсеместно распространенным ферментом, он может быть найден по всему организму внутриклеточно, а также внеклеточно. После идентификации основного аутоантигена TG2, были разработаны многочисленные твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA) с TG2 печени морских свинок или рекомбинантной TG2 человека в качестве антигена [Schuppan D et al, 1998; WO 98/03872.; Powell M et al, 2002; WO 02/068616 A2]. Кроме того, внеклеточный матрикс, богатый TG2, продуцируемой клеточными линиями, также можно использовать в качестве антигена в диагностических тестах. Эти анализы являются менее дорогостоящими, чем тесты эндомизиальных антител, и их чувствительность и специфичность превышает 90% в случае антигена TG2 человека. Более того, была описана эффективная быстрая детекция антител с использованием природной собственной TG2 в эритроцитах образцов крови пациента [Maki M et al, 2002; WO 02/086509].

У некоторых пациентов, и, в частности, у пациентов с герпетиформным дерматитом, также были описаны антитела против гомологичного белка трансглутаминазы кожи (TG3), который также можно использовать для диагностических целей (Paulsson M. et al., 2001, WO 01/001133).

Hadjivassiliou et al. [Hadjivassiliou et al, Ann Neurol. 2008; 64:332-43] предположили, что антитела против трансглутаминазы 6 (TG6) могут служить в качестве маркера, индуцируемого глютеном аутоиммунного заболевания, в дополнение к типу лейкоцитарного антигена человека и детекции антител против глиадина и против трансглутаминазы 2, для идентификации подгруппы пациентов с чувствительностью к глютену, которые могут иметь риск развития неврологического заболевания. Они выявили, что ответ IgG и IgA на TG6 преобладает при глютеновой атаксии независимо от вовлечения кишечника.

В действительности в нескольких исследованиях на основе тестов уровня техники, основанных на TG2, описаны ложноотрицательные результаты в отношении IgA против TG2 с положительностью по IgA-антителам против эндомизия и ложноположительные результаты в отношении IgA против TG2 в отсутствие положительности по IgA против эндомизия [Wong RC et al, J Clin Pathol. 2002; 55(7):488-94]. Ложноположительные результаты по антителам против TG2 являются относительно частыми в клинических условиях [Lock RJ et al, Eur J Gastroenterol Hepatol. 2004; 16(5):467-70.; Green PH, Cellier C, N Engl J Med. 2007; 357(17):1731-43] и это значительно ограничивает применение положительности по антителам против TG2 в качестве единственного диагностического теста. В частности, пациенты с другими аутоиммунными заболеваниями, опухолями, сердечной недостаточностью, неврологическими нарушениями, псориазом и заболеваниями печени, могут обладать низкими уровнями антител, реагирующих с TG2. Это неудивительно, поскольку эти ткани содержат относительно высокие количества TG2, которая может высвобождаться при любом типе повреждения ткани, которое может индуцировать неспецифические аутоантитела против TG2, и эта положительность по антителам может не иметь отношения к глютеновой болезни.

Напротив, специфические для глютеновой болезни антитела индуцируются в ответ на глютен, возможно с помощью механизма гаптена-носителя [Sollid LM et al, Gut. 1997; 41(6):851-2], и они распознают TG2 в той форме, в какой она связана с поверхностью фибронектина в подслоях срезов мышечной ткани, используемых для детекции эндомизиальных антител с помощью иммунофлуоресценции. Однако даже тест на эндомизиальные антитела не может отличить антитела против TG2 у пациентов с глютеновой болезнью и другие антитела против TG2, экспериментально индуцированные у мышей [Korponay-Szabo IR et al, J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2008; 46(3):253-61]. Кроме того, в попытках получить более специфические к глютеновой болезни диагностические тесты, также в качестве антигена использовали TG2 в комплексе с пептидами глиадина, но это дало менее надежные результаты, чем в случае TG2 отдельно [Rajadhyaksha M et al, WO 01/29090 A1]. Таким образом, подтверждающий иммуноанализ, по-разному распознающий антитела, направленные против целиакальных эпитопов и других TG2-эпитопов, мог бы быть исключительно важен для упрощения процесса диагностики в будущем.

Таким образом, все еще существует потребность в разработке надежного и относительно удобного диагностического способа, который является специфичным для индуцируемого глютеном аутоиммунного заболевания или предпочтительно глютеновой болезни. В частности, в данной области остается потребность в разработке диагностического анализа, который мог бы идентифицировать латентную форму заболевания, и/или который применим у детей или в случаях, когда симптомы не дают окончательного ответа. Более того, замена диагностики на основе биопсии тощей кишки также была бы желательна с точки зрения стоимости и комфорта для пациентов.

В действительности в данной области было предпринято несколько попыток идентифицировать основные эпитопы, связываемые целиакальными аутоантителами. Однако до настоящего времени такой эпитоп не был выявлен, и также неясно, существует ли только один или несколько таких эпитопов. В предшествующих исследованиях [Seissler J et al, Clin Exp Immunol. 2001; 125(2):216-21.; Sblattero D et al, Eur J Biochem. 2002; 269(21):5175-81; Nakachi K et al, J Autoimmun. 2004; 22(1):53-63], в которых использовали фрагменты TG2, было показано, что C-концевой домен может нести важные участки связывания. Однако в некоторых образцах пациентов также распознавался N-концевой или центральный домен, так что было сделано заключение, что антительный ответ может быть рассредоточенным и варьирующим, в зависимости от индивидуумов. Кроме того, было отмечено различие между молодыми пациентками с глютеновой болезнью и с другими клиническими проявлениями [Tiberti C et al, Clin Immunol. 2003; 109(3):318-24]. В другом исследовании [Byrne G et al, Gut. 2007; 56(3):336-41] в качестве основного участка связывания была предложена каталитическая триада, поскольку мутация этих трех аминокислот приводила к белку, с которым антитела пациента связывались плохо. Вновь в этом исследовании специфичность целиакальных антител классов IgA и IgG оказалась различной. Однако в этих исследованиях не учитывали трехмерную структуру белка, которая может значительно нарушаться крупными делециями, в частности делециями, влияющими на центральный домен или каталитическую триаду. Следующие исследования, проведенные с помощью фрагментов TG2, экспонированных на поверхности фагов, также показали, что конформация белка может иметь высокое значение для образования функционального участка связывания для целиакальных антител, поскольку с помощью этих способов также не было возможно идентифицировать эпитопы моноклональных антител, образовавшихся у пациентов с глютеновой болезнью [Di Niro R et al, Biochem J. 2005; 388(3):889-94].

TG2 не только является основным аутоантигеном при глютеновой болезни и, таким образом, важной молекулой-мишенью для диагностики, но также она вовлечена в патогенез заболевания. Увеличенная экспрессия и активность TG2 были выявлены в биоптатах двенадцатиперстной кишки у пациентов с глютеновой болезнью по сравнению со здоровыми донорами, и было выявлено, что пептиды глиадина являются хорошими субстратами для TG2. Согласно современной гипотизе комплексы глиадин-TG2 могут связываться со специфичными к TG2 B-клетками, где фрагменты как глиадина, так и TG2, могут быть презентированы на DQ2. Презентированные комплексы глиадин-DQ2 могут активировать глиадин-специфические T-клетки, которые могут помочь TG2-специфическим B-клеткам продуцировать антитела против TG2 посредством механизма гаптен-носитель [Sollid LM et al, Gut. 1997; 41(6):851-2]. Глютеновая болезнь традиционно считается, главным образом, опосредуемым T-клетками нарушением, при котором роль целиакальных антител является спорной.

Интересно, целиакальные антитела не блокируют сшивающую активность TG2 [Dieterich W et al, Gut. 2003; 52(11):1562-6; Roth EB et al, Clin Exp Rheumatol. 2006; 24(1): 12-8], вместо этого они могут даже усиливать процессы трансамидации и дезамидации, предположительно путем стабилизации конформации фермента [Kiraly R et al, J Autoimmun. 2006; 26(4):278-87]. Таким образом, TG2 может процессировать больше глиадина, что может усилить иммунный ответ, заканчивающийся продукцией одного или нескольких антител и далее направляющий процесс заболевания.

Предположения, существующие в данной области, что эпитоп является конформационным и в него вовлечено множество доменов, по-видимому, противоречат этим данным. Несколько направлений новых данных указывают на то, что аутоантитела против TG2 также обладают патогенной ролью при развитии заболевания. Присутствие этих антител является постоянным признаком у всех пациентов и, если они не поддаются детекции в кровотоке, эти антитела могут быть найдены депонированными в различных тканях. Была показана связь повреждения тканей со связыванием антител in vivo и было выявлено, что антитела связывались с внеклеточной TG2 in situ в поражаемых заболеванием органах, таких как тонкий кишечник, печень, мышцы, почка, головной мозг и т.д. также в отсутствие положительности по антителам в образцах сыворотки [Korponay-Szabo IR et al, Gut. 2004; 53(5):641-8]. Эти антитела являются функциональными, поскольку они могут связывать добавленную извне рекомбинантную TG2 и они появляются в тканях уже до развития атрофии ворсинок [Salmi TT et al, Gut. 2006; 55(12): 1746-53; Salmi TT et al, Aliment Pharmacol Ther. 2006; 24(3):541-52].

Кроме того, было показано, что целиакальные антитела нарушают дифференцировку эпителиальных клеток и ангиогенез в клеточных моделях [Myrsky E et al, Clin Exp Immunol. 2008; 152(1): 111-9], а также индуцируемый апоптоз через митохондриальные каскады [Cervio E et al, Gastroenterology. 2007; 133(1): 195-206]. Антитела, очищенные с помощью пептида-гомолога TG2 увеличивали проницаемость эпителиальных клеток и индуцировали активацию моноцитов [Zanoni G et al, PLoS Med. 2006; 3(9):e358].

Авторы настоящего изобретения неожиданно открыли, что можно определить локализацию основного целиакального эпитопа на трансглутаминазах, которые функционируют в качестве аутоантигенов в индуцируемых глютеном аутоиммунных заболеваниях. Неожиданно могут быть предоставлены улучшенные диагностические способы на основе сконструированных трансглутаминаз, имеющих свернутые бета-сэндвич и центральный домены, с использованием паттерна связывания целиакальных аутоантител и тем самым устраняющие ложноположительные результаты. Более того, следующий усовершенствованный диагностический способ может быть предоставлен с использованием соединений, специфично связывающихся с основным целиакальным эпитопом и способных вытеснять аутоантитела пациентов с глютеновой болезнью или быть вытесненными ими.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно первому аспекту изобретение относится к диагностическому способу для диагностики индуцируемого глютеном аутоиммунного заболевания у индивидуума, включающему стадии:

i) взятие биологического образца от индивидуума или предоставление биологического образца, взятого от индивидуума, где указанный образец содержит аутоантитела указанного индивидуума, и необязательно выделение аутоантител из указанного образца,

ii) контактирование аутоантител указанного образца с

- эталонным белком, принадлежащим семейству трансглутаминаз (белок семейства TG) и имеющим целостный основной целиакальный эпитоп,

- по меньшей мере одним тестовым белком, относящимся к семейству трансглутаминаз, в котором положение боковой цепи и/или пространственное положение по меньшей мере одного поверхностного аминокислотного остатка, являющегося частью основного целиакального эпитопа, изменены по сравнению с эталонным белком, в котором основной целиакальный эпитоп является целостным, так чтобы уровень связывания антитела, известного тем, что оно способно связываться с указанным основным целиакальным эпитопом, снижался в отношении указанного тестового белка,

где указанный по меньшей мере один поверхностный аминокислотный остаток основного целиакального эпитопа содержит или выбран из

одного или нескольких поверхностных аминокислотных остатков первой альфа-спирали центрального домена, предпочтительно поверхностный аминокислотный остаток выбран из первых четырех, трех или двух аминокислотных остатков указанной альфа-спирали, более предпочтительно первого аминокислотного остатка указанной альфа-спирали, и/или

одного или нескольких поверхностных аминокислотных остатков первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена и одного или нескольких поверхностных аминокислотных остатков консервативного мотива HisHisThr бета-сэндвич-домена, предпочтительно поверхностного аминокислотного остатка, выбранного из последних шести, пяти, четырех или трех аминокислотных остатков указанной первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена и аминокислотных остатков мотива HisHisThr, более предпочтительно шестого аминокислотного остатка указанной спирали и/или первой аминокислоты указанного мотива HisHisThr,

и где центральный домен имеет свернутую трехмерную структуру, предпочтительно нативную свернутую трехмерную структуру, и бета-сэндвич-домен имеет свернутую трехмерную структуру, предпочтительно нативную свернутую трехмерную структуру, предпочтительно укладка этих доменов является по существу целостной или сохранена,

iii) оценка связывающих свойств аутоантител в отношении эталонного белка и по меньшей мере одного тестового белка,

где, если связывание аутоантител с тестовым белком ухудшено по сравнению с эталонным белком, этот факт считается указывающим на индуцируемое глютеном аутоиммунное заболевание у указанного индивидуума.

Предпочтительно, когда боковая цепь изменена, изменяется геометрия боковой цепи, размер боковой цепи, функциональная группа боковой цепи или ее заряд.

Предпочтительно свойство связывания оценивают путем оценки уровня связывания или путем оценки кинетических величин или параметров связывания, например параметров ассоциации и/или диссоциации.

В предпочтительном варианте осуществления на стадии iii) диагностического способа связывание оценивают путем измерения уровня связывания аутоантител с тестовым белком и с эталонным белком, где, если уровень связывания аутоантител с эталонным белком превышает заданную пороговую величину и если уровень связывания аутоантител с тестовым белком значительно ниже, чем с эталонным белком или предпочтительно снижен по меньшей мере на заданную величину, предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 50% по сравнению с эталонным белком, этот факт считается указывающим на индуцируемое глютеном аутоиммунное заболевание у указанного индивидуума. Установка заданного порога (или предела) является стандартным процессом оптимизации и лежит в пределах квалификации специалиста в области установки условий анализа. Пригодный предел для утверждения, что связывающие молекулы, например антитела, являются реакционно-способными в отношении белка семейства TG, например эталонного белка семейства TG, может быть установлен, например, посредством рабочей характеристической кривой (ROC), полученной с помощью известных образцов от индивидуумов с глютеновой болезнью и без глютеновой болезни, как известно в данной области.

В одном варианте осуществления заданный порог установлен на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% от максимальной эталонной величины, например от уровня связывания 100%.

Предпочтительно, первая альфа-спираль бета-сэндвич-домена располагается от аминокислотного остатка, который находится на расстоянии восьми аминокислот в N-концевом направлении от первого His мотива HisHisThr бета-сэндвич-домена до указанного первого His мотива HisHisThr бета-сэндвич-домена. Предпочтительно, последние пять аминокислот первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена располагаются от консервативного Asn первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена до первого His консервативного мотива HisHisThr бета-сэндвич-домена и предпочтительно остальные шесть, пять, четыре или три аминокислотных остатков указанной спирали вычисляют соответствующим образом.

Таким образом, предпочтительно шестой аминокислотный остаток указанной спирали представляет собой вторую аминокислоту в N-концевом направлении от консервативного мотива HisHisThr бета-сэндвич-домена, или вторую аминокислоту в C-концевом направлении от консервативного Asn первой альфа-спирали b-сэндвич-домена.

Предпочтительно, шестая аминокислота первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена представляет собой Arg19 в TG2 человека или соответствующую аминокислоту в последовательности белка семейства трансглутаминаз, имеющего свернутый бета-сэндвич-домен и свернутый центральный домен; и первый His в мотиве HisHisThr представляет собой His22 в TG2 человека или соответствующую аминокислоту в последовательности белка семейства трансглутаминаз, имеющего свернутый бета-сэндвич-домен и свернутый центральный домен.

Предпочтительно первая альфа-спираль центрального домена располагается:

- от пятой аминокислоты в N-концевом направлении от консервативного мотива GluTyrXxx (где Xxx представляет собой неполярный аминокислотный остаток, предпочтительно Val или Ile или Leu) первой альфа-спирали центрального домена, или

- от третьей аминокислоты в N-концевом направлении от консервативного Arg первой альфа-спирали центрального домена трансглутаминаз человека

- до по меньшей мере Glu или Tyr указанного мотива GluTyrXxx.

Таким образом, первый или первые два, три или четыре аминокислотных остатка первой альфа-спирали центрального домена вычисляют соответствующим образом.

Более предпочтительно, первый аминокислотный остаток указанной альфа-спирали представляет собой пятую аминокислоту в N-концевом направлении от консервативного мотива GluTyrXxx первой альфа-спирали центрального домена или третью аминокислоту в N-концевом направлении от консервативного Arg первой альфа-спирали центрального домена большинства трансглутаминаз человека.

В предпочтительном варианте осуществления пространственное положение или геометрия боковой цепи

a) по меньшей мере поверхностного аминокислотного остатка первой альфа-спирали центрального домена, предпочтительно поверхностного аминокислотного остатка, выбранного из первых четырех, трех или двух аминокислотных остатков указанной альфа-спирали, более предпочтительно первого аминокислотного остатка указанной альфа-спирали, и

b) по меньшей мере поверхностного аминокислотного остатка первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена и консервативного мотива HisHisThr бета-сэндвич-домена, предпочтительно поверхностного аминокислотного остатка, выбранного из последних шести, пяти, четырех или трех аминокислотных остатков и мотива HisHisThr, более предпочтительно шестого аминокислотного остатка в указанной спирали,

изменены друг относительно друга.

В следующем варианте осуществления в часть белка семейства трансглутаминаз вносят мутацию, которая приводит к вытеснению или измененному пространственному положению любой из аминокислот, определенных в настоящем документе в качестве аминокислоты, являющейся частью основного целиакального эпитопа или SSE, несущего указанный белок. В определенных вариантах осуществления более крупные части альфа-спиралей вытесняются, например альфа-спирали прерываются или поворачиваются.

В диагностическом способе по настоящему изобретению предпочтительно

первый аминокислотный остаток указанной первой альфа-спирали центрального домена представляет собой аминокислотный остаток, соответствующий или эквивалентный Glu153, пронумерованному в соответствии с нумерацией аминокислот полноразмерной TG2 человека на основе выравнивания аминокислотных последовательностей, и/или

шестой аминокислотный остаток(остатки) указанной первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена представляет собой аминокислотный остаток, соответствующий или эквивалентный Arg19, пронумерованному согласно нумерации аминокислот полноразмерной TG2 человека на основе выравнивания аминокислотных последовательностей, и/или

первую аминокислоту мотива HisHisThr, причем указанная первая альфа-спираль бета-сэндвич-домена представляет собой аминокислотный остаток, соответствующий или эквивалентный His22, пронумерованному согласно нумерации аминокислот в полноразмерной TG2 человека на основе выравнивания аминокислотных последовательностей.

В предпочтительном варианте осуществления диагностического способа в соответствии с настоящим изобретением в указанном тестовом белке семейства TG изменены боковая цепь или пространственное положение по меньшей мере одной дополнительной аминокислоты, например одна или несколько дополнительных аминокислот подвергнуты мутации, по сравнению с эталонным белком, в которым основной целиакальный эпитоп является целостным, где предпочтительно указанная дополнительная аминокислота выбрана из группы из аминокислотных остатков, соответствующих или эквивалентных Arg151, Glu153, Glu154, Arg156, Arg19, His22, Val431, Arg433, Glu435, Met659, Leu661, пронумерованным согласно нумерации аминокислот полноразмерной TG2 человека на основе множественного выравнивания последовательностей, и где предпочтительно указанное изменение влияет на связывание целиакального антитела.

В следующем предпочтительном варианте осуществления пространственное положение любого из следующих аминокислотных остатков изменено вследствие изменения одной или нескольких дополнительных аминокислот по сравнению с эталонным белком: поверхностный аминокислотный остаток, выбранный из первых четырех, трех или двух аминокислотных остатков указанной альфа-спирали, более предпочтительно первый аминокислотный остаток указанной альфа-спирали, и/или поверхностный аминокислотный остаток, выбранный из последних шести, пяти, четырех или трех аминокислотных остатков указанной первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена и аминокислотных остатков мотива HisHisThr, более предпочтительно шестого аминокислотного остатка указанной спирали и/или первой аминокислоты указанного мотива HisHisThr.

В предпочтительном варианте этого варианта осуществления указанное дополнительное изменение представляет собой мутацию по сравнению с эталонным белком в одном или нескольких аминокислотных остатках, выбранных из группы аминокислотных остатков, соответствующих или эквивалентных следующим аминокислотам полноразмерной TG2 человека на основе множественного выравнивания последовательностей: Glu158, Tyr160, Val161, His23, Thr24, или изменение N-концевой части бета-сэндвич-домена, например делецию или замену по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, аминокислотных остатков, вычисленных от шестого остатка первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена.

Предпочтительно, тестовый белок представляет собой мутантную TG2 и изменение указанных одной или нескольких аминокислот представляет собой мутацию, выбранную из следующей группы:

мутация Glu153, например E153S, E153T, E153Y, E153K, E153R, E153Q, E153N;

Arg19, например R19S, R19K, R19Q;

Glu154, например E154S, E154T, E154Y, E154K, E154R, E154Q, E154N;

Glu158, например E158S, E158Q, E158L;

His22, например H22S;

и в качестве дополнительных мутаций: Ala24, Arg151, Arg156, Val431, Val432, Arg433, Glu435, Met659, Leu661.

Квалифицированному специалисту понятно, что если эффект мутации или изменения в боковой цепи является небольшим, например если вносят консервативную замену, может быть целесообразным наличие более одного мутантного аминокислотного остатка.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения аутоантитела или панель аутоантител выделяют перед контактированием их с тестовым белком и, если желательно, с эталонным белком.

В следующем аспекте изобретение относится к диагностическому набору для диагностики индуцируемого глютеном аутоиммунного заболевания у индивидуума, включающему

a) тестовый белок, принадлежащий к семейству трансглутаминаз, в котором боковая цепь и/или пространственное положение по меньшей мере одного поверхностного аминокислотного остатка, являющегося частью основного целиакального эпитопа, изменены по сравнению с эталонным белком, в котором основной целиакальный эпитоп является целостным,

поверхностного аминокислотного остатка первой альфа-спирали центрального домена, предпочтительно поверхностного аминокислотного остатка, выбранного из первых четырех, трех или двух аминокислотных остатков указанной альфа-спирали, более предпочтительно первого аминокислотного остатка указанной альфа-спирали, и/или

поверхностного аминокислотного остатка первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена и поверхностного аминокислотного остатка консервативного мотива HisHisThr бета-сэндвич-домена, предпочтительно поверхностного аминокислотного остатка, выбранного из последних шести, пяти, четырех или трех аминокислотных остатков указанной первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена и аминокислотных остатков мотива HisHisThr, более предпочтительно шестого аминокислотного остатка указанной спирали и/или первой аминокислоты указанного мотива HisHisThr,

и где центральный домен имеет свернутую трехмерную структуру, предпочтительно нативную свернутую трехмерную структуру, и

b) эталонный белок, принадлежащий семейству трансглутаминаз, причем указанный белок имеет целостный основной целиакальный эпитоп, или по меньшей мере носитель, содержащий инструкции по предоставлению и применению указанного эталонного белка, относящегося к семейству трансглутаминаз;

и необязательно

средства для взятия биологического образца от индивидуума, где указанный образец содержит аутоантитела указанного индивидуума, и/или

средства для выделения аутоантител из указанного образца, и/или

средства для оценки уровня связывания и/или кинетики аутоантител в отношении белков белки.

В диагностическом наборе по изобретению можно использовать любой тестовый белок и/или эталонный белок, как определено в настоящем документе.

В предпочтительном варианте осуществления

a) тестовый белок представляет собой мутантную трансглутаминазу (TG), предпочтительно мутантную TG2, TG3 или TG6, и

b) эталонный белок представляет собой TG дикого типа, предпочтительно TG2, TG3 или TG6 дикого типа.

В предпочтительном варианте осуществления средства для оценки уровня связывания включают планшет, например микропланшет для титрования, имеющий лунки, в которых первая часть лунок покрыта эталонным белком, а вторая часть лунок покрыта по меньшей мере одним тестовым белком.

В одном варианте осуществления лунки планшета также покрыты фибронектином.

В следующем аспекте изобретение относится к диагностическому способу для диагностики индуцируемого глютеном аутоиммунного заболевания у индивидуума, включающему стадии:

i) взятие биологического образца или предоставление биологического образца, взятого от указанного индивидуума, где указанный образец содержит аутоантитела указанного индивидуума, и необязательно выделение аутоантител из указанного образца,

ii) контактирование аутоантител указанного образца с белком, принадлежащим семейству трансглутаминаз, причем указанный белок имеет целостный основной целиакальный эпитоп, и

iii) оценка уровня связывания аутоантител с белком семейства TG, как в отсутствие, так и в присутствии тестового соединения, причем указанное тестовое соединение известно тем, что оно способно связываться с основным целиакальным эпитопом, где, если уровень связывания аутоантител в отсутствие тестового соединения превышает заданную пороговую величину и если уровень связывания аутоантител с эталонным белком в присутствии тестового соединения является значительно более низким по сравнению с уровнем связывания аутоантител в отсутствие указанного тестового антитела, этот факт считают указывающим на индуцируемые глютеном аутоиммунные заболевания у указанного индивидуума. Предпочтительно уровень связывания аутоантител с эталонным белком в присутствии тестового соединения снижен по меньшей мере на заданную величину, предпочтительно по меньшей мере на 40%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, 70% или 80%, соответствующую уровню связывания, где остаточное связывание составляет не более 60%, предпочтительно не более 50%, более предпочтительно не более 40%, 30% или 20%, соответственно.

Таким образом, тестовое соединение представляет собой соединение, которое способно связываться с основным целиакальным эпитопом с аффинностью или авидностью, достаточно высокими для замены, по меньшей мере частично, целиакальных антител пациента или наоборот. Тестовое соединение должно связывать основной целиакальный эпитоп с аффинностью или авидностью связывания, достаточно высокими для конкуренции с аутоантителами пациента, предпочтительно с аффинностью или авидностью связывания, превышающими аффинность или авидность связывания антител пациента. Квалифицированному специалисту будет понятно, что даже если аффинность или авидность связывания тестового соединения является сравнимой или более низкой, чем аффинность или авидность связывания аутоантител пациента, достаточная степень вытеснения может быть достигнута с использованием более высокой концентрации тестового соединения.

В альтернативном варианте осуществления проводят детекцию вытеснения тестового соединения целиакальными антителами пациента. Установка концентрации для достижения надлежащего вытеснения аутоантител тестовым соединением лежит в пределах квалификации специалиста в данной области.

Предпочтительным тестовым соединением является антитело или фрагмент антитела, высокоспецифичные в отношении основного целиакального эпитопа. Особенно предпочтительным тестовым соединением является моноклональное антитело, индуцированное против указанного эпитопа.

Предпочтительным примером является Mab885, Phadia, депонированное 25 марта 2010 года согласно Будапештскому договору Phadia AB (P.O.Box 6460 751 37 UPPSALA, Швеция, адрес для посещения: Rapsgatan 7P 754 50 Uppsala) под регистрационным номером … в DSMZ - Deutsche Sammlung von Miroorganismen un Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Германия, как указано в соответствующей международной форме.

В предпочтительном варианте осуществления тестовое соединение представляет собой тестовое антитело или его фрагмент, вариант, производное или аналог, известные тем, что они способны связывать основной целиакальный эпитоп белка, принадлежащего семейству трансглутаминаз, причем указанный белок представляет собой аутоантиген при глютеновой болезни, предпочтительно TG2, TG3 или TG6, более предпочтительно TG2 или TG6, высокопредпочтительно TG2.

В предпочтительном варианте осуществления тестовое соединение представляет собой фрагмент, вариант, производное или аналог Mab885, содержащий связывающую область, имеющую аминокислотную последовательность вариабельной области Mab885 или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90% 95%, 98% или 99% идентичность последовательности с ней, причем указанный фрагмент, вариант, производное или аналог способны связываться с основным целиакальным эпитопом белка, принадлежащего семейству трансглутаминаз.

Целесообразно, чтобы биологический образец, взятый от индивидуума, представлял собой образец ткани или части организма, либо в нативном, либо в преобразованном состоянии, в котором могут находиться целиакальные аутоантитела. В предпочтительном варианте осуществления изобретения биологический образец, взятый от указанного индивидуума, представляет собой образец жидкости организма, например образец слюны, дуоденального сока, стула или крови, или их преобразованный образец, например образец сыворотки или образец, содержащий соответствующие ингибиторы.

В следующих вариантах осуществления биологический образец представляет собой образец солидной ткани, в которой депонированы целиакальные аутоантитела, например предпочтительно образец, взятый из тонкого кишечника, тощей кишки, плаценты или печени [Korponay-Szabo, LR. et al. Gut 53, 641-648 (2004)]. Образец может быть взят из кожи, где установлено присутствие антител против TG3.

Преимущество применения образца жидкости организма состоит в том, что аутоантитела пациента присутствуют в образце непосредственно в применимой форме, и нет необходимости в их выделении. Предпочтительно, из образцов солидной ткани аутоантитела пациента можно получать по меньшей мере частичным выделением или элюированием аутоантител из образца, как описано в Salmi TT et al, Gut. 2006; 55(12):1746-53].

Также изобретение относится к применению тестового соединения, как описано в настоящем документе, где указанное соединение специфично связывается с основным целиакальным эпитопом, для диагностики глютеновой болезни или в способе диагностики глютеновой болезни в анализе вытеснения.

В применении настоящего изобретения как антитела пациента, так и тестовые соединения по изобретению связываются с основным целиакальным эпитопом и, тем самым, конкурируют за участок связывания. Условия анализа могут быть установлены либо таким образом, что аутоантитела пациентов с глютеновой болезнью вытесняют тестовое соединение, или альтернативно таким образом, что тестовое соединение вытесняет аутоантитела пациента с глютеновой болезнью. Согласно следующему аспекту изобретения, кроме того, предусмотрен диагностический набор для диагностики индуцируемого глютеном аутоиммунного заболевания у индивидуума, причем указанный набор содержит

a) тестовое соединение, известное тем, что оно способно связываться с основным целиакальным эпитопом белка, принадлежащего семейству трансглутаминаз, причем указанный белок представляет собой аутоантиген при глютеновой болезни;

b) носитель, содержащий инструкции по предоставлению и применению эталонного белка, принадлежащего семейству трансглутаминаз, где указанный белок имеет целостный основной целиакальный эпитоп;

и необязательно одно или несколько из следующих:

c) эталонный белок, принадлежащий семейству трансглутаминаз, где указанный белок имеет целостный основной целиакальный эпитоп, и

c) средства для взятия биологического образца от индивидуума, где указанный образец содержит аутоантитела указанного индивидуума, и/или средства для выделения аутоантител из указанного образца, и/или

d) средства для оценки уровня связывания и/или кинетики аутоантител в отношении белков.

Предпочтительно тестовое соединение представляет собой тестовое антитело или его фрагмент, вариант или аналог, известные тем, что они способны связываться с основным целиакальным эпитопом белка, принадлежащего семейству трансглутаминаз, где указанный белок представляет собой аутоантиген при глютеновой болезни. Более предпочтительно тестовое антитело представляет собой происходящие из пациента с глютеновой болезнью антитело или его фрагмент, вариант или аналог, имеющие участок связывания и/или паттерн распознавания, типичные для происходящего из пациента антитела.

Предпочтительно, тестовое антитело представляет собой моноклональные антитело или его фрагмент, вариант или аналог, имеющие участок связывания с теми же связывающими свойствами. В высокопредпочтительном варианте осуществления моноклональные антитело представляет собой антитело, способное связываться с поверхностной частью первых от одной до четырех аминокислот первой альфа-спирали центрального домена. Предпочтительно, антитело представляет собой моноклональное антитело Mab885. В следующем аспекте изобретение относится к применению тестового белка в способе диагностики индуцируемого глютеном аутоиммунного заболевания,

где указанный тестовый белок принадлежит семейству трансглутаминаз и в котором боковая цепь и/или пространственное положение по меньшей мере одного поверхностного аминокислотного остатка, являющегося частью основного целиакального эпитопа, изменены по сравнению с эталонным белком, в котором основной целиакальный эпитоп является целостным,

поверхностного аминокислотного остатка первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена и поверхностного аминокислотного остатка консервативного мотива HisHisThr бета-сэндвич-домена, предпочтительно поверхностного аминокислотного остатка, выбранного из последних шести, пяти, четырех или трех аминокислотных остатков указанной первой альфа-спирали бета-сэндвич домена и аминокислотных остатков мотива HisHisThr, более предпочтительно шестого аминокислотного остатка указанной спирали и/или первой аминокислоты указанного мотива HisHisThr,

и где центральный домен имеет свернутую трехмерную структуру, предпочтительно нативную свернутую трехмерную структуру.

Предпочтительно, в применении настоящего изобретения, тестовый белок и эталонный белок представляют собой любой тестовый белок и эталонный белок, соответственно, как определено в настоящем документе.

Предпочтительно, в применении настоящего изобретения способ диагностики глютеновой болезни представляет собой любой диагностический способ, как описано в настоящем документе.

Например, при применении диагностического способа или тестового набора согласно изобретению, тестовый белок является мутантом белка дикого типа, принадлежащего семейству трансглутаминаз и являющегося аутоантигеном при глютеновой болезни, и эталонный белок представляет собой белок дикого типа, принадлежащий семейству трансглутаминаз, который является аутоантигеном при глютеновой болезни.

Предпочтительно, эталонный белок представляет собой TG2, TG3 или TG6, содержащие N-концевой бета-сэндвич- и центральный домены дикого типа, и тестовый белок представляет собой TG2, TG3 или TG6, содержащие мутантный бета-сэндвич- и центральный домены.

В следующем аспекте изобретение относится к способу получения тестового белка, принадлежащего семейству трансглутаминаз, пригодного в диагностическом способе для диагностики глютеновой болезни у индивидуума, включающему стадии:

i) выбор эталонного белка, принадлежащего семейству трансглутаминаз, в котором целиакальный эпитоп является целостным,

ii) конструирование мутантного варианта указанного белка, где боковая цепь и/или пространственное положение по меньшей мере одного поверхностного аминокислотного остатка, являющегося частью основного целиакального эпитопа, изменены по сравнению с эталонным белком, в котором основной целиакальный эпитоп является целостным,

и где центральный домен имеет свернутую трехмерную структуру, предпочтительно нативную свернутую трехмерную структуру

iii) получение мутантной рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантную аминокислотную последовательность, содержащую указанную мутацию,

iv) экспрессия указанной мутантной рекомбинантной нуклеиновой кислоты в хозяине,

v) получение указанного мутантного белка из указанного хозяина для предоставления тестового белка, который при контактировании его с целиакальным антителом демонстрирует сниженный уровень связывания (предпочтительно по меньшей мере на 30% сниженный, более предпочтительно по меньшей мере 40% сниженный, еще более предпочтительно по меньшей мере 50% сниженный уровень связывания) по сравнению с соответствующим эталонным белком дикого типа.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к способу получения эталонного белка, принадлежащего семейству трансглутаминаз, пригодного в диагностическом способе для диагностики глютеновой болезни у индивидуума, включающему стадии

i) выбор тестового белка, принадлежащего семейству трансглутаминаз, в котором целиакальный эпитоп является нарушенным, дефицитным или отсутствует,

ii) конструирование мутантного варианта указанного тестового белка, где боковая цепь и/или пространственное положение по меньшей мере одного поверхностного аминокислотного остатка, являющегося частью основного целиакального эпитопа, изменены по сравнению с тестовым белком, в котором основной целиакальный эпитоп является нарушенным, с получением эталонного белка, в котором основной целиакальный эпитоп является целостным,

iv) экспрессия указанной мутантной рекомбинантной нуклеиновой кислоты в хозяине,

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Укладку белковой или доменной структуры понимают в настоящем документе как пространственное (трехмерное) расположение ее вторичных структурных элементов (включая основные структурные элементы, например спирали, например альфа-спирали, и протяженные структуры, например бета-структуры, например бета-цепи, параллельные и антипараллельные бета-слои, бета-бочонки, и малые структурные элементы, например различные изгибы, например бета- или гамма-изгибы, петли и т.д.) относительно друг друга.

Вторичный структурный элемент (SSE) представляет собой элемент вторичной структуры данной части или сегмента белка, имеющий определенную конформацию. SSE можно оценивать, предсказывать или вычислять различными способами (см. ниже). Например, в соответствии с одним вариантом осуществления используется два или необязательно три типа SSE: альфа-спираль, протяженная структура и необязательно витки или случайные структуры (см. ниже).

Укладку двух белков или двух белковых доменов считают в настоящем документе аналогичными или сходными, если по меньшей мере большая часть, предпочтительно по меньшей мере 60%, 70%, 80% или по меньшей мере 90% каждого из основных SSE одного из белков или доменов, может соответствовать им из другого белка или домена. В случае, если их укладка по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90% идентична, их называют по существу идентичными. Это имеет место, например, если для данного элемента вторичной структуры в первом белке или домене, который связан или является соседним с данными следующими элементами, может быть найден соответствующий элемент того же типа во втором белке или домене, который связан или является соседним с элементом того же типа, что и данные следующие элементы в первом белке или домене. Соотношение соответствующих SSE можно вычислять по количеству аминокислот или по количеству SSE.

Укладка белка после какого-либо события или эффекта остается по существу неизмененной или сохраняется, если удовлетворяется любой из следующих критериев:

i) пространственное расположение по меньшей мере основных SSE (спиралей, например альфа-спиралей и протяженных структур, например бета-структур, таких как бета-слои и бета-бочонки) сохраняется и/или если укладка остается аналогичной или сходной или по существу идентичной,

ii) соотношение основных структурных элементов изменяется не более чем на 40% или 30%, предпочтительно не более чем на 25% или 20%, более предпочтительно не более чем на 15%, 10% или 5% и соотношение произвольных структур изменяется не более чем на 40% или 30%, предпочтительно не более чем на 25% или 20%, более предпочтительно не более чем на 15%, 10% или 5%,

iii) любая активность белка остается поддающейся детекции,

iv) любой составной или конформационный (не непрерывный) эпитоп белка остается иммунологически выявляемым.

Следует понимать, что для настоящего изобретения можно использовать любые способы данной области, пригодные для исследования указанных критериев. Квалифицированному специалисту известно, что все эти способы имеют их ограничения, так что представленное выше определение следует интерпретировать обязательно ввиду этих ограничений.

Белок или домен белка, включающий любой его мутант, вариант или гомолог, имеет нативную укладку, если его укладка сходна или аналогична или по существу идентична укладке белка дикого типа. Укладку белка или домена трансглутаминазы понимают в настоящем документе как укладку, аналогичную или сходную или по существу идентичную укладке белка семейства TG или его соответствующего домена (например домена I, II, III или IV), предпочтительно, где указанный белок семейства TG может представлять собой аутоантиген при глютеновой болезни и предпочтительно где указанный белок семейства TG представляет собой белок эукариот, животных, позвоночных или млекопитающих.

Свернутую трехмерную структуру белка или домена понимают в настоящем документе, как структуру, где пространственно (трехмерно) определенные структурные элементы, например SSE (включая основные структурные элементы, например спирали, например альфа-спирали, и протяженные бета-структуры) упорядочены в пространственно определенную, хотя и подвижную третичную структуру, которая обеспечивает определенную степень термодинамической стабильности белка или домена в данных условиях. Альтернативно свернутый белок или домен имеет определенную или определимую укладку. Несвернутый белок или домен или состояние "расплавленной глобулы" не считаются укладкой.

Свернутая трехмерная структура белка или домена является нативной, если она имеет нативную укладку.

В предпочтительных вариантах осуществления в свернутой или нативной свернутой трехмерной структуре укладка белка или домена остается по существу неизмененной или сохраняется. Как очевидно специалисту в данной области, это может быть экспериментально показано рядом способов структурного анализа. Любой из этих способов можно использовать для охарактеризации свернутой природы указанного белка или домена, при условии, что определение свернутой природы в этом случае ограничивается или определяется определяемым способом.

Как также очевидно квалифицированному специалисту, если белок остается активным, белок должен быть по существу или по меньшей мере частично свернутым, что следует считать в настоящем документе как свернутый. Более того, если присутствуют составные или конформационные (не непрерывные) эпитопы, белок или домен также считается свернутым и детекцию этого факта можно проводить с помощью подходящего антитела.

Мутант данного белка или домена белка представляет собой белок или домен белка, в последовательности которого один или несколько аминокислотных остатков были удалены, замещены или встроены способом генетической инженерии или случайного мутагенеза по сравнению с последовательностью данного белка или домена белка.

Вариант данного белка или домена белка представляет собой белок или домен белка, последовательность которого отличается в одном или нескольких аминокислотных остатках по сравнению с последовательностью данного белка или домена белка, где вариант может содержать делеции, замены или инсерции.

Гомолог данного белка, или домена белка, или белка, или домена, гомологичного им, имеет идентичность последовательности по меньшей мере 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%, и его укладка является аналогичной или сходной. Предпочтительно, в белке или домене и их гомологе по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% консервативных областей данного семейства белков являются одинаковыми.

Мутант, вариант или гомолог имеет предпочтительно аналогичную или по существу идентичную укладку с данным белком или доменом белка, и еще более предпочтительно идентичность аминокислотных последовательностей между указанным мутантом, вариантом или гомологом, независимо друг от друга, и данным белком или доменом белка составляет по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60% или более предпочтительно по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% или 95%. В случае мутанта или варианта, в предпочтительном варианте осуществления мутант или вариант отличается от данного белка.

Изменение боковой цепи аминокислотного остатка в данном белке, т.е. в аминокислотной последовательности или трехмерной структуре, может включать изменение геометрии боковой цепи, размера боковой цепи, функциональной группы боковой цепи или заряда боковой цепи либо посредством мутагенеза, включая сайт-направленный или случайный мутагенез, либо химическим преобразованием в производное.

Геометрия боковой цепи аминокислоты, присутствующей в молекуле полипептида или белка, может быть охарактеризована любым способом или с помощью любой модели, подходящей для вычисления молекулярной геометрии. Например, геометрию боковой цепи можно понимать, например, как форму трехмерной поверхности боковой цепи (заключающей в себе молекулярный объем), например поверхность Ван-дер-Ваальса, или пространственное расположение атомных ядер в наборе атомов либо с атомами водорода, либо без них, образующих боковую цепь относительно друг друга и т.д. Геометрию боковой цепи можно вычислять любым пригодным математическим способом, как хорошо известно специалисту в данной области.

Размер боковых цепей аминокислоты, присутствующей в молекуле полипептида или белка, относится к любой геометрической мере, связанной с размером указанной боковой цепи или характерной для него, например длине (выражаемой, например в пм или Ǻ), площади поверхности (выражаемой, например, в пм² или Ǻ²) или молекулярному объему (выражаемому, например, в пм³ или Ǻ³) боковой цепи указанной аминокислоты.

Функциональную группу боковой цепи понимают в настоящем документе как химическую функциональную группу, присутствующую в боковой цепи аминокислоты, находящейся в молекуле полипептида или белка.

Пространственное положение аминокислотного остатка в молекуле полипептида или белка, т.е. в трехмерной белковой структуре, например трансглутаминазы, понимают в настоящем документе как набор или совокупность положений его атомов в трехмерной структуре белка, или набор или совокупность его атомных или позиционных координат в системе координат, полученной для трехмерной структуры данного белка, определенной с ее помощью или аппроксимированной для нее. Таким образом, изменение пространственного положения аминокислотного остатка следует понимать как изменение или мутацию белковой структуры так, чтобы эти положения или координаты изменялись в большей степени, чем положения или координаты вследствие подвижности или конформационного движения этого белка в данных условиях. Например, изменение пространственного положения аминокислоты может быть следствием мутации вблизи или рядом с указанной аминокислотой, что приводит к изменению положения или конформации боковой цепи, или мутации, также влияющей на положение альфа-углеродного атома или пептидного остова, связанного с этой аминокислотой.

В частности, в белках принадлежащих семейству трансглутаминаз и имеющих свернутый бета-сэндвич-домен и свернутый центральный домен, такое изменение пространственных положений поверхностного аминокислотного остатка первой альфа-спирали центрального домена, и поверхностного аминокислотного остатка первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена, могут быть охарактеризованы расстоянием между этими группами аминокислот т.е. их пространственными положениями друг относительно друга.

Выражения суперсемейство трансглутаминаз или семейство белков трансглутаминаз (белки семейства TG) используют взаимозаменяемо и понимают в настоящем документе как класс белков, относящихся к категории EC 2.3.2.13, причем указанные белки имеют структуру домена, содержащую N-концевой бета-сэндвич-домен, центральный домен, который представляет собой каталитический домен в этих белках, когда они обладают активностью, первый домен бета-бочонка и второй домен бета-бочонка (также называемые доменами I, II, III и IV, где домен II представляет собой центральный домен) или их мутант или фрагмент, содержащий по меньшей мере свернутый N-концевой бета-сэндвич домен и свернутый центральный домен. В качестве обзора, см. например [Lorand, L., и Graham, R. M., Nat Rev Mol Cell Biol 2003, 4, 140-156]. Белок, принадлежащий семейству трансглутаминаз, как определено выше, сокращенно называют в настоящем документе белком семейства TG.

Предпочтительно, центральный домен имеет укладку, аналогичную или по существу идентичную центральному домену любого из продуктов любого из следующих генов: F13A1, TGM1, TGM2, TGM3, TGM4, TGM5, TGM6, TGM7 или EPB42, как указано, например в таблице 1 и на фигуре 7 в Grenard et al. [J. Biol. Chem. (2001) vol. 276(35) pages 33056-33078], или любого из эукариотического эквивалента или гомолога, при условии что он имеет указанный центральный домен с указанной укладкой или любой его мутант, вариант или гомолог. Предпочтительно, в указанных продуктах генов бета-сэндвич-домен имеет первую альфа-спираль бета-сэндвич-домена и указанный центральный домен также имеет первую альфа-спираль центрального домена, как определено ниже или в кратком описании изобретения.

Первая альфа-спираль центрального домена белка, принадлежащего семейству трансглутаминаз, представляет собой первую альфа-спираль из N-концевого центрального домена или домена II (который представляет собой каталитический домен активных представителей семейства трансглутаминаз, но также присутствует в неактивных представителях этого семейства в каталитически неактивной форме). Первая альфа-спираль центрального домена является соседней с первой альфа-спиралью бета-сэндвич-домена в нативной укладке трансглутаминазы. Таким образом, первая альфа-спираль центрального домена представляет собой альфа-спиральный SSE, соответствующий любому из следующих альфа-спиральных элементов вторичной структуры (SSE):

SSE, располагающийся от Glu153 до по меньшей мере Tyr159 или Val160 в трансглутаминазе 2 человека,

SSE, располагающийся от Glu 98 до по меньшей мере Tyr204 или Val205 в факторе XIII человека,

SSE, располагающийся от Glu153 до по меньшей мере Tyr159 или Val160 в трансглутаминазе 1 человека,

SSE, располагающийся от His148 до по меньшей мере Tyr154 или Val155 в TG3 человека,

как указано, например в Lorand and Graham, Nature Reviews 2003, Vol. 4, стр. 140, фигура 3. Первая альфа-спираль бета-сэндвич-домена белка, принадлежащего семейству трансглутаминаз, представляет собой первую альфа-спираль с N-конца N-концевого бета-сэндвич домена или домена I. Первая альфа-спираль бета-сэндвич-домена является соседней с первой альфа-спиралью центрального домена в нативной укладке трансглутаминазы. Таким образом, первая альфа-спираль бета-сэндвич-домена представляет собой альфа-спиральный SSE, соответствующий любому из следующих альфа-спиральных структурных элементов (SSE):

SSE, располагающийся от Ser14 до His21 в трансглутаминазе 1 человека,

SSE, располагающийся от Leu14 до His21 в трансглутаминазе 2 человека,

SSE, располагающийся от Thr12 до His19 в TG3 человека,

SSE, располагающийся от Trp57 до His64 в факторе XIII человека,

[см. Lorand and Graham, Nature Reviews Volume 4, page 140, 2003].

Первый или первые n аминокислотный остаток(остатков) SSE представляет собой первый или первые n аминокислотный остаток(остатков) SSE с N-конца, т.е. аминокислотный остаток(остатки) указанного SSE, расположенные наиболее близко к N-концу, где n представляет собой положительное целое число. Последний или последние n аминокислотный остаток(остатки) SSE представляет собой последний или последние n аминокислотный остаток(остатки) SSE с C-конца, т.е. аминокислотный остаток(остатки) указанного SSE, расположенные наиболее близко к C-концу, где n представляет собой положительное целое число. Определение того, принадлежит ли аминокислотный остаток к данному SSE, может быть основано на трехмерной структуре белка или гомологичных белков, если они являются родственными при выравнивании последовательностей или при моделировании гомологии или в любом другом подходящем способе, и/или основано на величине(ах) торсионных углов соответствующей амидной плоскости(ей), и/или посредством любого подходящего способа детекции, вычисления или предсказания. Положение аминокислотного остатка, который находится на расстоянии n аминокислот от данной аминокислоты либо в C-концевом (карбокси-концевом), либо в N-концевом (амино-концевом) направлении, вычисляют путем подсчета каждого из n аминокислотных остатков в указанном направлении, начиная с первой аминокислоты, которая является соседней с данной аминокислотой в указанном направлении, где n представляет собой положительное целое число.

Индуцируемое глютеном аутоиммунное заболевание вовлекает любое заболевание, либо в латентной, либо в открытой (явной) форме, симптомы которого могут быть индуцированы глютеном, и в ходе заболевания у пациента вырабатываются аутоантитела против трансглутаминазы (TG), предпочтительно против TG2, TG3 или TG6. Индуцируемые глютеном аутоиммунные заболевания, как правило, включают, например, глютеновую болезнь (также называемую целиакальным заболеванием, нетропическими афтами или глютен-чувствительной энтеропатией), которая, как правило, развивается среди генетически предрасположенных индивидуумов с генетическим фоном лейкоцитарного антигена человека (HLA) DQ2 или DQ8, и герпетиформный дерматит, при котором, в дополнение к нарушениям в кишечнике, возникают гранулярные отложения IgA в субпапиллярных областях кожи.

Эпитоп представляет собой фрагмент или участок на молекуле белка, предпочтительно часть его молекулярной поверхности, с которыми могут связываться антитело или связывающая область антитела.

Эпитоп может быть определен, например, посредством предоставления аминокислотных остатков, являющихся частью этого фрагмента, или участка молекулы, или участвующих в образовании данной молекулярной поверхности, или их координат; путем предоставления его расположения на молекуле белка с помощью структурных элементов, вносящих вклад в укладку указанного белка; или путем определения части молекулярной поверхности способами математического вычисления.

Мимотоп эпитопа представляет собой фрагмент или участок на молекуле, предпочтительно часть его молекулярной поверхности, с которым то же антитело или связывающая область могут связываться, как и с указанным эпитопом.

Эпитопы могут быть приведены в качестве частей молекулярной поверхности и мимотопы можно получать, например, как описано [Goede, Andrean et al.: BMC Bioinformatics 2005, 6:223].

Основной целиакальный эпитоп понимают как эпитоп, для которых является действительным один из следующих признаков:

a) часть молекулярной поверхности белка семейства TG, с которым способно связываться специфичное для заболевания аутоантитело индивидуума с глютеновой болезнью, где указанное аутоантитело способно связываться с указанной частью молекулярной поверхности, в то время как аутоантитела индивидуума с другим заболеванием, имеющего аутоантитела, способные связываться с TG2, обычно или как правило, не связываются с указанной частью молекулярной поверхности; или

часть молекулярной поверхности белка семейства TG, с которой или с частью которой способно связываться Mab885, необязательно включая область поверхности в пределах 2, 3, 4, 5, 6 или 7 Ǻ от области, охватываемой Mab885 при связывании, или

часть молекулярной поверхности белка семейства TG, с которой способно связываться целиакальное аутоантитело индивидуума с глютеноваой болезнью, как объяснено выше, таким образом, чтобы указанное аутоантитело могло быть вытеснено в конкурентном анализе посредством Mab885;

b) часть молекулярной поверхности белка семейства TG, который может быть аутоантигеном при глютеновой болезни, причем указанная часть молекулярной поверхности по меньшей мере частично образована или составлена

одним или несколькими поверхностным аминокислотным остатком(ами) первой альфа-спирали центрального домена, предпочтительно поверхностным аминокислотным остатком, выбранным из первых четырех, трех или двух аминокислотных остатков указанной альфа-спирали, более предпочтительно первого аминокислотного остатка указанной альфа-спирали, и/или

одним или несколькими поверхностным аминокислотным остатком(ами) первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена и консервативного мотива HisHisThr бета-сэндвич-домена, предпочтительно поверхностным аминокислотным остатком, выбранным из последних шести, пяти, четырех или трех аминокислотных остатков указанной первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена и аминокислотных остатков мотива HisHisThr, более предпочтительно шестого аминокислотного остатка указанной спирали и/или первой аминокислоты указанного мотива HisHisThr;

c) часть молекулярной поверхности белка семейства TG, который может представлять собой аутоантиген при глютеновой болезни, перекрывающаяся с или содержащая часть поверхности в пределах сферы, имеющей радиус 6, 7 Ǻ, вычисленный для любого атома Glu153, и/или в пределах сферы, имеющей радиус 6, 7 Ǻ, вычисленный для любого атома Arg19 согласно нумерации аминокислот полноразмерной TG2 человека, или аминокислотного остатка, соответствующего/эквивалентного им соответственно в TG2 животного (предпочтительно позвоночного, более предпочтительно млекопитающего) исходя из множественного выравнивания последовательностей;

d) часть молекулярной поверхности белка семейства TG, который может быть аутоантигеном при глютеновой болезни, по меньшей мере частично образованная аминокислотным остатком, соответствующим/эквивалентным Glu153 и/или Arg19, пронумерованным согласно нумерации аминокислот полноразмерной TG2 человека на основе множественного выравнивания последовательностей;

e) фрагмент молекулярной поверхности молекулы, например часть молекулярной поверхности в белке, предпочтительно белке семейства TG, которая способна связывать распознающую поверхность молекулу, предпочтительно антитело, где указанная распознающая поверхность молекула способна связываться с основным целиакальным эпитопом, как определено в a)-d), где предпочтительно указанный белок семейства TG представляет собой

- эукариотический белок, предпочтительно белок животного, более предпочтительно белок позвоночного или млекопитающего или человека,

- белок TG2 и/или TG6,

- сконструированный белок семейства TG, предпочтительно где основной целиакальный эпитоп получен путем мутации или где основной целиакальный эпитоп нарушен путем мутации.

Основной целиакальный эпитоп можно считать целостным, если он является целым, т.е. имеет молекулярную поверхность, по существу идентичную молекулярной поверхности белка дикого типа семейства TG, который является аутоантигеном при глютеновой болезни, и/или если целиакальное антитело, известное тем, что оно способно связывать основной целиакальный эпитоп, например этот эпитоп в TG2, способно связываться с ним на поддающемся детекции уровне, и/или если геометрия боковой цепи, размер боковой цепи, функциональная группа боковой цепи, заряд и пространственное положение по меньшей мере первого N-концевого экспонированного на поверхности аминокислотного остатка N-концевой альфа-спирали центрального домена, как определено ниже, являются по существу идентичными или иммунологически неотличимыми от тех же величин для соответствующего белка семейства трансглутаминаз (белка семейства TG) дикого типа, который может быть аутоантигеном при глютеновой болезни, и/или если он изменен по сравнению с тестовым белком, в котором основной целиакальный эпитоп нарушен, так, чтобы получить эталонный белок, в котором основной целиакальный эпитоп является целостным или распознаваемым целиакальными антителами. Основной целиакальный эпитоп является нарушенным или дефектным, если при сравнении с основным целиакальным эпитопом трансглутаминазы дикого типа, которая является аутоантигеном при глютеновой болезни, он обеспечивает отличающуюся молекулярную поверхность и, таким образом, может быть найдено целиакальное антитело, которое связывается с нарушенным основным целиакальным эпитопом с более низкой аффинностью или авидностью или не может связываться с ним.

В одном варианте осуществления связывание целиакального антитела с тестовым белком, в котором целиакальный эпитоп отличается от целого целиакального эпитопа, является нарушенным, если аффинность и/или авидность связывания и/или скорость реакции связывания являются сниженными по сравнению с эталонным белком, предпочтительно усредненный или средний уровень связывания снижен по меньшей мере на заданную величину, предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 50%.

Целиакальное антитело представляет собой антитело, способное специфично распознавать и связываться с основным целиакальным эпитопом.

Целиакальное аутоантитело представляет собой целиакальное антитело, которое является аутоантителом у индивидуума при глютеновой болезни, где указанное аутоантитело способно связываться с белком семейства TG дикого типа, где указанный белок представляет собой аутоантиген при глютеновой болезни, предпочтительно TG2 и/или TG6 и необязательно TG3, более предпочтительно TG2, и/или оно способно связываться с основным целиакальным эпитопом, как определено выше.

Эндомизиальное антитело представляет собой целиакальное антитело, способное связываться с соединительнотканной структурой, окружающей гладкомышечные клетки в пищеводе человека или приматов или других срезов тканей, содержащих гладкомышечные клетки, и это антитело выявляется на замороженных срезах тканей способом непрямой иммунофлуоресценции.

Молекулярная поверхность молекулы белка, например белка семейства TG, представляет собой площадь поверхности, которая описывает трехмерную поверхность указанной молекулы белка, которая доступна для других химических структур, например молекул растворителя или других молекул, например ионов или белковых молекул, например антител. Для целей настоящего описание значение молекулярной поверхности также включает "доступную площадь поверхности" или "молекулярную поверхность Lee-Richards", не допускающую растворитель поверхность или поверхность Connolly или поверхность Ван-дер-Ваальса. Таким образом, молекулярную поверхность можно вычислять с помощью любого алгоритма, пригодного для вычисления таких трехмерных поверхностей, независимо от варьирования способов вычисления, при условии что модель, используемая для вычисления, обеспечивает правильную с научной точки зрения оценку поверхности.

Аффинность связывания, как используют в настоящем документе, представляет собой термодинамическое выражение прочности взаимодействия между антигенсвязывающим центром и антигенной детерминантой (и таким образом стереохимического соответствия между ними). В предпочтительном значении термин применяют для взаимодействий межу антигенными детерминантами и участками связывания антител. Аффинность связывания может быть охарактеризована количеством или мерой, вычисленными из или коррелирующими с константой диссоциации или ее функцией, например обратной константой диссоциации 1/K_d (константа ассоциации) или отрицательным логарифмом константы диссоциации или ее функции, таким как -log₁₀[K_d/NA*(моль/л)^-1], которая также обозначается как pK_d. Например, аффинность связывания может быть охарактеризована количеством или соотношением связанных молекул, например лигандов или антител, в равновесном состоянии или после равновесного состояния. Как правило, благодаря гетерогенности аффинности в совокупности молекул антител с данной специфичности, аффинность связывания (и например константа ассоциации или pK_d) в действительности представляет собой отчасти среднюю величину.

Авидность, как используют в настоящем документе, в одном аспекте относится к совокупной силе аффинности в комплексе белок-лиганд. В другом аспекте авидность относится к интенсивности связывания при взаимодействиях с множеством связей между белками. Предпочтительно, авидность относится к силе связывания антитело-антиген. Авидность понимают в настоящем документе как термин, включающий аффинность, но в более широком значении, поскольку авидность также применима для описания силы множества связей. Например, единичный участок связывания IgM может иметь низкую аффинность, но, тем не менее, IgM имеет высокую аффинность вследствие того, что он имеет 10 слабых участков связывания в противоположность двум сильным участкам связывания IgG. Ингибитор связывания целиакального антитела с целиакальным эпитопом представляет собой соединение, способное связываться либо с TG2 (трансглутаминаза), либо с целиакальным антителом, и при связывании которого поддающийся детекции уровень или аффинность связывания снижаются по сравнению со связыванием в отсутствие указанного ингибитора.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

1. Охарактеризация мутантных белков рекомбинантной трансглутаминазы 2 (TG2). (A) Вестерн-блот. Верхняя панель: первичное антитело, поликлональное антитело козы против TG2; нижняя панель: первичное моноклональное антитело, антитело козы против трансглутаминазы 2 TG100. Wt, TG2 дикого типа; R, R19S; E, E153S; M, M659S; RE, двойной мутант R19S-E153S; RM, двойной мутант R19S-M659S; EM, двойной мутант E153S-M659S; REM, тройной мутант R19S-E153S-M659S; 154K, мутант E154K; 433, двойной мутант R433S-E435S; D, мутант домена, который содержит только домены I-III-IV.

(B) Трансглутаминазная (TG-азная) и GTP-азная активность мутантных белков в качестве процентов соответствующих величин TG2 дикого типа. Величины представлены в качестве средних значений для двух отдельных измерений, проведенных в трех экземплярах.

2. Связывание фибронектином мутантов TG2. Белки, прямо нанесенные на планшет (aTG-ELISA) или добавленные к фибронектину, количественно определяли с помощью моноклонального антитела против TG2 TG100, распознающего центральный домен (II). Результаты показали равные количества антигена на планшете в анализах и относительно друг друга. Эти количества использовали в последующих измерениях с образцами от индивидуумов с глютеновой болезнью. Величины представлены в качестве средних значений для двух отдельных экспериментов, проведенных в трех экземплярах. Для сокращенного названия белков см. фигуру 1.

3. Связывание сывороточных IgA-антител от пациентов с глютеновой болезнью (n=14) с мутантами по участку 4 (A) и белками TG2 с мутантным доменом (B) в ELISA, проведенном с прямым нанесением антигенов на планшет. Результаты представлены в качестве процентов связывания относительно TG2 дикого типа. S4, мутант по участку 4; S4.1/4/5, комбинированный мутант D151N-E154Q-E155Q.

4. Связывание сывороточных IgA-антител от детей с глутеновой болезнью, с тяжелой мальабсорбцией (верхняя панель), и взрослых пациентов с мальабсорбцией (нижняя панель) с мутантными белками TG2. ELISA против TG2 проводили прямым связыванием антигенов с планшетом. Результаты связывания представлены в качестве процентов от количеств, связавшихся с TG2 дикого типа, по сравнению с моноклональным антителом против TG2 TG100. Все образцы сыворотки исследовали в двух экземплярах. Штриховкой показаны медианы. Для сокращенных названий мутантов, см. фигуру 1.

5. (A) Структура предполагаемого целиакального эпитопа в TG2 и факторе XIII. (B) Связывание сывороточных IgA-антител детей с глютеновой болезнью (n=20) и взрослых с глютеновой болезнью (n=17) с TG2 дикого типа и мутантами TG2, имитирующими поверхность фактора XIII. K, E154K; RKM, тройной мутант R19S-E154K-M659S.

6. Связывание сывороточных IgA-антител от детей и взрослых с глютеновой болезнью со связанными с фибронектином мутантами TG2 в ELISA. Результаты представлены в качестве процентов от количеств, связавшихся с TG2 дикого типа, по сравнению с моноклональным антителом против TG2 TG10.

7. Структура целиакального эпитопа TG2 в закрытой и открытой форме белка.

8. Специфичность в отношении заболевания нацеливания на целиакальный эпитоп. Связывание антител против TG2 от пациентов с глютеновой болезнью и от пациентов с другими аутоиммунными заболеваниями (n=11) с белком TG2 дикого типа и мутантными белками TG2.

9. Антитела от различных пациентов с глютеновой болезнью распознают один и тот же эпитоп в конкурентных анализах. (A) Образцы сыворотки от 56 пациентов с глютеновой болезнью с дефицитом IgA, содержащие IgG-класс антител против TG2, конкурируют с тем же целиакальным IgA в ELISA с использованием TG2 дикого типа и конкуренция пропорциональна их сывороточным концентрациям (A2). Трое из пациентов также имели IgM-класс антител против TG2. Образцы сыворотки от индивидуумов без глютеновой болезни с дефицитом IgA (n=23) и компетентных по IgA индивидуумов (n=22) не демонстрируют взаимного противодействия (A1). (B) Очищенные целиакальные IgG-антитела, реагирующие с N-концевым мутантом R19S (G1) или не реагирующие с мутантом R19S (G5), но оба из них в равной степени не реагирующие с составными мутантами R19S-E153S (RE), конкурируют таким же дозозависимым образом с очищенным целиакальным IgA, не реагирующим с R19S, в то время как общая фракция IgG (K4), полученная от инивидуумов без глютеновой болезни, не демонстрирует взаимного противодействия. Антитела IgA и IgG, связанные с планшетом для ELISA, распознавали по отдельности.

10. Корреляция связывания целиакальных антител с мутантами по участку 4 и участку 5 по сравнению с TG2 дикого типа.

11. Стабильность нацеливания на целиакальный эпитоп у пациентов с глютеновой болезнью, проходящих диагностическую нагрузку глютеном после периода диеты и серонегативности (A-B), и у пациентов с глютеновой болезнь, наблюдаемых в течение 5 лет, без диеты (C).

12. Депонированные в ткани и пассивно перенесенные патогенные антитела против TG2 имеют ту же специфичность к эпитопу, что и антитела в сыворотке пациентов с глютеновой болезнью. (A) Материнские IgA-антитела против TG2, депонированные на поверхности хорионических ворсинчатых структур новорожденного и в материнских частях плаценты у женщины с глютеновой болезнью с активным заболеванием. Пассивно перенесенный материнский IgG, депонированный в тканях пуповины новорожденного, в качестве эндомизиальных антител. (B) Антитела, элюированные с этих тканей, демонстрируют сходную специфичность к эпитопу с сывороточными антителами с использованием мутантных белков TG2. (C) Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) от новорожденного с материнскими целиакальными антителами демонстрируют аномальную форму, распластывание и уменьшение длины клеток по сравнению с HUVEC, полученными от новорожденного от матери с глютеновой болезнью на диете и без антител против TG2.

13. Измерение кинетики связывания очищенных целиакальных IgA с теми же количествами TG2 дикого типа и мутантного по участку 4 TG2 с использованием поверхностного плазмонного резонанса. Наблюдают сниженное связывание и более быструю диссоциацию.

14. Сходная специфичность к эпитопу сывороточных антител у индивидуумов с латентной (CDL, n=11) и явной (CD, n=11) глютеновой болезнью.

15. Замороженный срез тонкого кишечника от индивидуума без глютеновой болезни, инкубированный с сывороточными антителами от пациентов с глютеновой болезнью и моноклональными антителами мыши 885 (A) и CUB7402 (B). Связанный IgA человека распознавали с помощью флуоресцентных конъюгированных с изотиоцианатом вторичных антител с зеленой флуоресценцией и антитела мыши метили конъюгированными с родамином вторичными антителами с красной флоуресценцией. В этих условиях 885 не был способен связываться с тканью вдоль эндомизиальных структур, где связывались антитела пациента. CUB связывалось с эндомезиальными структурами вместе со связыванием IgA пациента, что приводило к суммарному желтому цвету.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения исследовали TG2 человека с использованием комплексного структурного, биохимического и иммунологического подхода.

Мономерный TG2 человека состоит из 687 аминокислот с молекулярной массой 76 кДа и содержит четыре структурных домена: N-концевой бета-сэндвич-домен со связывающей фибронектин областью, каталитический центральный домен с каталитической триадой, и два C-концевых домена в виде бета-бочонков. Несколько лет назад была кристаллизована GDP-связанная форма TG2, которая представляет собой "закрытую" конформацию фермента [Liu S et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99(5):2743-7]. Авторы изобретения начали определение положения потенциальных участков связывания для целиакальных антител с этой модели. В этой конформации GDP связывался с углублением между каталитическим центром и первым β-бочонком, и каталитическая триада, которая ответственна за активность трансамидации, скрыта внутри молекулы и ингибируется двумя петлями, так что фермент не может действовать в качестве трансглутаминазы. Недавно была кристаллизована "открытая" форма фермента в комплексе с происходящим из глютенового пептида ингибитором [Pinkas DM et al, PLoS Biol. 2007; 5(12):e327]. В этом случае C-концевые домены β-бочонков смещены на 120 Ǻ по сравнению с GDP-связанной формой и остатки активного центра становятся доступными для субстратов. Эта активированная форма TG2 является "замороженной" в этой модели с ингибитором активного центра, связанным с каталитическими аминокислотами. Несмотря на это открытие, Ca²⁺-связанная форма TG2, без субстрата или ингибитора, все еще неизвестна. Все еще остается вопрос, какая форма TG2 появляется внеклеточно, где она распознается целиакальными аутоантителами. После серии экспериментов по инженерии белков авторы настоящего изобретения открыли, что два якорных участка в структуре TG2 являются необходимым для образования эпитопа для аутоантител пациента при индуцируемых глютеном аутоиммунных заболеваниях, предпочтительно при глютеновой болезни. Было открыто, что ни участок связывания субстрата, ни ионы Ca²⁺, не образуют часть целиакального эпитопа, однако участок связывания Ca²⁺ 4 перекрывается с ним. Этот эпитоп является конформационным, однако поскольку два якорных участка расположены на N-концевом бета-сэндвич-домене и центральном домене, связывание большинства аутоантител пациентов не блокирует переход открытая-закрытая конформация фермента.

Неожиданно авторами изобретения было открыто, что это фрагмент поверхности молекулы может проводить различие между аутоантителами от пациентов с глютеновой болезнью или пациентов с индуцированным глютеном аутоиммунным заболеванием и аутоантителами при других аутоиммунных заболеваниях. Таким образом, может быть обеспечена высокоселективная диагностика этих заболеваний.

Как очевидно для специалиста в данной области, эпитоп при таком комплексном заболевании может варьировать от пациента к пациенту или в зависимости от типа проявления заболевания или прогрессирования заболевания. Ввиду этого общего знания является существенным, что составная эпитопная область, открытая авторами изобретения, является высокохарактерной, т.е. селективной для аутоиммунитета при глютеновой болезни, и что согласно измерениям с образцами сыворотки от взрослых с глютеновой болезнью, в последние годы происходит только незначительное расширение эпитопа заболевания.

Также в настоящем документе предоставлены доказательства, что эпитопная область, представленная в настоящем документе, присутствует уже на ранней доклинической стадии заболевания и также имеет предсказательную ценность для диагностики глютеновой болезни впоследствии в жизни. Однако следует понимать, что точный целиакальный эпитоп может расширяться на последующие аминокислоты по мере продолжения заболевания, и это можно учитывать в определенных вариантах осуществления тестов по изобретению. Например, но не ограничиваясь ими, следующие аминокислоты в TG2 или аминокислоты, соответствующие им, могут быть мутантными для дальнейшего снижения связывания аутоантитела: Arg 19, His22, Asp 151, Glu153, Glu154, Arg156, Glu157, Leu161, Val431, Arg433, Glu435, Met659, Leu661, пронумерованные согласно нумерации аминокислот полноразмерной TG2 человека. Соответствующие аминокислоты могут быть найдены на основе множественного выравнивания последовательностей.

Очевидно, что точная площадь фрагмента молекулярной поверхности, считающегося эпитопом, может варьировать, как упоминалось выше. Таким образом, следует понимать, что замены аминокислот или другие мутации вне наиболее центральной области эпитопа, могут влиять на связывание антитела. Такие области, без ограничений, могут быть найдены в определенных областях N-концевого домена бета-бочонка и на центральном домене, например в Ca²⁺-свзывающем участке 5. Квалифицированный специалист при конструировании мутантов трансглутаминазы для применения в настоящем изобретении способен учитывать это варьирование и оптимизировать мутанты для данной цели, исходя из указаний, представленных в настоящем документе. Авторы изобретения впервые идентифицировали в качестве конформационного эпитопа, основной целиакальный эпитоп, поиск которого проводили, но который не был найден в уровне техники. Может существовать несколько перекрывающихся вариантов основного целиакального эпитопа. Тот факт, связывается ли данное антитело с целиакальным эпитопом, или не связывается с ним, можно явно установить на основе указаний, представленных в настоящем документе. Авторы настоящего изобретения идентифицировали неотъемлемые части эпитопа, которые обеспечивают специалисту в данной области ключ для создания диагностических способов, мутантных трансглутаминаз, пригодных в них, диагностических наборов для этой цели.

Диагностические способы и наборы

На основании указаний, представленных в настоящем документе, квалифицированному специалисту будет понято, что согласно одному варианту осуществления изобретения диагностический способ имеет два важных признака. С одной стороны, предоставляется тестовый белок семейства TG, в котором нарушен или дефектен или отсутствует целиакальный эпитоп, так чтобы целиакальные аутоантитела не могли связываться с ним или связывались с ним только на сниженном уровне. С другой стороны, предпочтительно присутствуют другие эпитопы для обеспечения селективности способа, таким образом, по меньшей мере бета-сэндвич-домен и центральный домен имеют свернутую структуру. Предпочтительно также являются свернутыми любой или оба из доменов в виде бета-бочонков. Таким образом, в представленном диагностическом способе положительный результат высокодостоверно указывает на то, что пациент страдает глютеновой болезнью. Свернутый характер домена может быть охарактеризован несколькими путями.

Удобным путем является проверка активности. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления мутантная TG2 имеет один или несколько из следующих поддающихся детекции функциональных видов активности: активность фермента трансглутаминазы, GTP-азная активность и/или связывание фибронектина. Если трансглутаминазная активность снижается вследствие мутации, это может быть следствием того факта, что мутантный участок вовлечен в связывание Ca²⁺. Тот факт, что не являющееся целиакальным конформационное антитело способно связываться с белком, также указывает на его свернутый характер.

Специалисту в данной области очевидно, что правильная укладка белка может быть экспериментально показана с помощью ряда способов структурного анализа, например спектроскопию CD (кругового дихроизма), FT-IR (инфракрасная спектроскопия с Фурье-преобразованием), микрокалориметрию DSC (дифференциальная сканирующая калориметрия), спектроскопию ЯМР (ядерный магнитный резонанс), DPI (интерферометрия с двойной поляризацией), атомно-силовую микроскопию и т.д. или ее можно предсказывать способом Chou-Fasman и способами GOR, в моделях нейронных сетей или способами ближайших соседей, как рассмотрено, например, в [Simossis VA, и Heringa J, "Integrating protein secondary structure prediction and multiple sequence alignment", Curr Protein Pept Sci. 2004 5(4) 249-66; Rost B, "Review: protein secondary structure prediction continues to rise" J Struct Biol. 2001 134(2-3) 204-18].

Эти способы можно использовать либо в качестве дактилоскопического отпечатка указанной укладки, либо для детекции любой разницы между укладками различных белков или доменов, например дикого типа или его мутанта, или между укладками одного и того же белка в различных состояниях.

В реальном диагностическом способе должен быть предоставлен эталонный белок, который содержит целостный целиакальный эпитоп или, если используют трансглутаминазу дикого типа, например неизмененный целиакальный эпитоп TG2 или TG6, или в определенных вариантах осуществления TG3. Следует отметить, что молекулярная поверхность эпитопной области в TG6 в высокой степени сходна с молекулярной поверхностью TG2, таким образом, если желательно, эти эпитопные области можно легко превращать друг в друга сайт-направленным мутагенезом. Более того, при условии, что аутоантитела против TG6 в варианте заболевания отличаются от аутоантител против TG2, для диагностики этого конкретного варианта заболевания необходимо применять эпитоп TG6. Это также справедливо для других трансглутаминаз, являющихся аутоантигом при индуцируемом глютеном аутоиммунном заболевании. В способе должно быть показано дифференциальное связывание аутоантител. Например, если величина, предпочтительно усредненная или средняя величина, коррелирующая с аффинностью связывания и/или авидностью и/или скоростью реакции связывания, снижается для тестового белка по сравнению с эталонным белком, предпочтительно указанная величина снижается по меньшей мере на заданную величину, предпочтительно по меньшей мере на 20%, 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 50%, или 60%, или 70%, или 80%, или соответствующая оставшаяся величина не превышает 80%, 70%, более предпочтительно не превышает 60%, еще более предпочтительно не превышает 50%, или 40%, или 30%, или 20% соответственно, то этот результат считают признаком присутствия заболевания. Также предпочтительно, когда средний уровень связывания аутоантител с эталонным белком превышает заданную пороговую величину. Эту пороговую величину можно определять простым проведением предварительных измерений с эталонной трансглутаминазой с использованием либо стандартного целиакального образца, либо образца, полученного от пациента, известного тем, что он имеет глютеновую болезнь. Заданная пороговая величина не должна быть численно определена в каждом случае, может быть достаточным, если связывание надежным образом поддается детекции. Как описано в настоящем документе, связывание обычно приводят как относительную величину по сравнению со связыванием аутоантител, известных тем, что они имеют связывающие свойства в отношении трансглутаминазы с целостным целиакальным эпитопом.

Как тестовый белок, так и эталонный белок, могут представлять собой белки дикого типа или их можно получать способами белковой инженерии из соответствующего каркаса, который достаточно сходен или гомологичен белку, который представляет собой аутоантиген при глютеновой болезни. Например, без ограничений, такой "каркас" представляет собой TG1, TG3, TG4, TG5, TG7, фактор XIII или EBP42 человека или животного [см. например, Lorand, L. and Graham, R. M., Nat Rev Mol Cell Biol 2003, 4, 140-156 и Grenard et al, J. Biol. Chem. (2001) vol. 276(35) pages 33056-33078].

Для конструирования подходящего мутанта в белке, происходящем из трансглутаминазы или трансглутаминазы, целесообразно идентифицировать ключевые аминокислотные остатки. Для этой цели можно проводить выравнивание аминокислотных последовательностей, как хорошо известно в данной области, и оно включает способы, хорошо известные в данной области, например способ, рассмотренный Shyu et al. [Shyu et al. Genetic Programming and Evolvable Machines 2004 June; 5(2): 121-144] или способы, доступные, например на домашней странице European Bioinformatics Institute, например ClustalW2, MAFFT, MUSCLE, T-Coffee и т.д. и/или с использованием пакета программ Genetic Data Environment (GDE) [Smith SW et al. Comput Appl Biosci. 1994 Dec; 10(6):671-5]. В настоящее время также в пределах квалификации специалиста в данной области лежит получение мутантов, которые содержат фрагмент молекулярной поверхности, образующий соответствующий эпитоп. Способы вычисления молекулярных поверхностей белков доступны в данной области, и их можно выполнять, например, с помощью программы WHATIF [G.Vriend, J. Mol. Graph. (1990) 8, 52-56], Molecular Surface Package от Michael L. Connolly, Version 3.9.3 [1259 El Camino Real, #184 Menlo Park, CA 94025, U.S.A]; Molecular Surfaces Computation (MSMS) [M.F. Sanner et al. Biopolymers, 1996 Vol. 38, (3), 305-320]; SURFNET [R.A. Laskowski J. Mol. Graph., (1995) 13, 323-330]; The Analytic Surface Calculation Package (ASC) [F. Eisenhaber et al. J. Comp. Chem. 1995 16(3): 273-284]; SUPERFICIAL [Goede, Andrean et al. BMC Bioinformatics 2005, 6:223] и способа Xiang и Hu [Xiang and Hu, BioMedical Engineering and Informatics, 2008. BMEI 2008. International Conference on; Volume 1, Issue 27-30, Page(s):52-56].

Как тестовый белок, так и эталонный белок могут представлять собой фрагмент белка, при условии что он удовлетворяет требованиям, определенным в настоящем документе. В предпочтительном варианте осуществления тем не менее, тестовый и эталонный белки также содержат свернутый N-концевой домен бета-бочонка. Также понятно, что в настоящем изобретении можно использовать любой белок, который представляет собой подходящий каркас, как объяснено выше. Таким образом, белок, принадлежащий семейству трансглутаминаз, может представлять собой эукариотический белок, более предпочтительно белок животного, еще более предпочтительно белок позвоночного, необязательно земноводного, пресмыкающегося, рыбы, птицы или высокопредпочтительно млекопитающего или человека.

В определенном предпочтительном варианте осуществления изобретения тестовые белки по изобретению отличаются от мутантных белков уровня техники, предпочтительно от мутантов, как конкретно описано в любой из следующих публикаций [Sblattero et al. Eur J Biochem. 2002 Nov; 269(21):5175-81, Nakachi K et al. J Autoimmun. 2004 Feb; 22(1):53-63. Seissler et al. Clin Exp Immunol. 2001 Aug; 125(2):216-21]. Как правило, эти мутации представляют собой мутанты с делециями, которые, при условии что они нарушены или дефектны по целиакальному эпитопу, не содержат как свернутого бета-сэндвич-домена, так и центрального домена. В случае, если справедливо обратное и в определенной технологии показана свернутая структура по меньшей мере этих доменов в белках с дефектным эпитопом, мутанты предпочтительно исключаются из заявленного объема.

В определенном конкретном варианте осуществления, при необходимости, из заявленного объема исключаются тройной мутант E153S (E), R19S (R), M659S (M) и двойной мутант R19S (R), M659S (M) TG2, где предпочтительно последовательность не содержит дополнительных мутаций. В следующем конкретном варианте осуществления, при необходимости, исключаются мутанты, содержащие мутацию Met659 или мутацию M659S TG2, где предпочтительно последовательность не содержит дополнительных мутаций. В следующем варианте осуществления из объема настоящего изобретения исключены мутантные трансглутаминазы, описанные Kiraly et al. FEBS J. 2009 Dec; 276(23):7083-96. В одном варианте осуществления Met659 в TG2 не является мутантным. В следующем варианте осуществления из объема настоящего изобретения исключен каждый мутант, описанный в одной или всех или в любой комбинации описанных выше публикаций. В следующем варианте осуществления из объема настоящего изобретения исключено диагностическое применение любого или всех или любой комбинации указанных выше мутантов уровня техники.

Детекция связывания аутоантител лежит в пределах квалификации специалиста в данной области. Специалисту в данной области очевидно, что применимы как кинетические способы, так и способ, характеризующий аффинность или авидность связывания. Например, применим любой из способов, представленных ниже, без каких-либо ограничений:

иммуноанализ, например ELISA, RIA, растекание в радиальном направлении, иммунопреципитация,

анализ связывания, например Biacore, тушение флуоресценции,

спектрофотометрический способ, например FT-IR, циркулярный дихроизм, ЯМР,

физико-химический способ, например калориметрия, ультрацентрифугирование и т.д.

В предпочтительном варианте осуществления диагностический способ проводят в форме иммуноанализа, такого как RIA или DELPHIA или предпочтительно иммуносорбентный анализ, такой как ELISA. В предпочтительном варианте осуществления диагностического способа по изобретению трансглутаминаза является связанной с фибронектином. Связывание с фибронектином обеспечивает предварительную ориентацию белка трансглутаминазы, тем самым экспонируя его целиакальный эпитоп антителам. Таким образом, диагностический тест становится более чувствительным.

Однако в определенных вариантах осуществления задачей является предоставление анализа, который селективно отличает аутоантитела пациента с глютеновой болезнью и другие антитела, которые не являются целиакальными антителами, т.е. не являются типичными для глютеновой болезни. В таких случаях может быть применимым исключение фибронектина для обеспечения доступа ко всей поверхности как тестового белка, так и эталонного белка. В этом случае предпочтительно не являющееся целиакальным аутоантитело пациента с глютеновой болезнью связывается как с тестовым белком, так и с эталонным белком практически с равной аффинностью связывания. В варианте этого варианта осуществления анализ проводят в жидкой фазе. Полагают, что в обоих способах предоставление конформационных эпитопов является в некоторой степени лучшим. В предпочтительном варианте в качестве аутоантител измерят IgA или IgG, при условии, что пациенты не имеют дефицита какого-либо из этих типов.

Также изобретение относится к наборам для проведения диагностических способов, как описано выше, эти наборы могут включать части, как упоминалось выше или как пригодно для осуществления способов, описанных выше.

Набор обязательно содержит тестовый белок и по меньшей мере инструкции по получению эталонного белка, или также эталонный белок.

Предпочтительно, набор содержит белок семейства TG человека и средства для детекции связывания с ним антитела. Таким образом, набор желательно представляет собой иммунологический набор и средства для детекции включают применение прямых маркеров и/или вторичных маркеров. Прямые маркеры могут представлять собой флуоресцентные маркеры или радиоактивные маркеры, вторичные маркеры могут представлять собой вторичные антитела, необязательно конъюгированные, например меченые или связанные с ферментом антитела. Таким образом, набор может действовать по принципам ELISA, EMA, DELFIA, RIA и т.д. В предпочтительном варианте осуществления изобретения тестовый белок по настоящему изобретению добавляют в набор для анализа, пригодного в качестве анализа антител против тканевой трансглутаминазы, пригодный для детекции глютеновой болезни. Такие наборы для анализа, так называемые анализы антител против тканевой трансглутаминазы человека второго поколения, рассмотрены Meensel et al [Clinical Chemistry 50:11 2125-2135 (2004)]. Этот анализ можно проводить, по существу как описано, за исключением оценки связывания аутоантител пациента также с тестовым белком и оценки отличия в связывании по сравнению с белком семейства TG с целостным основным целиакальным эпитопом, упоминаемым в настоящем документе как эталонный белок.

Специалисту в данной области понятно, что при получении калибровочной кривой, указывающей на сигнал, например OD в ELISA, в качестве функции уровня антител предпочтительно использовать сами величины сигнала, как описано Meensel et al, выше. Например, калибровочные кривые можно получать с использованием соответствующим образом разбавленного антитела с известными связывающими свойствами, такого как антитело TG100.

Диагностические способы, применения и наборы на основе вытеснения антител

В этих вариантах осуществления, как указано в кратком описании изобретения, если аутоантитело пациента вытесняется предварительно выбранным тестовым соединением, способным специфично связываться с основным целиакальным эпитопом, тогда это указывает на тот факт, что указанное аутоантитело пациента представляет собой целиакальное аутоантитело и, таким образом, на само заболевание, т.е. что указанный пациент страдает индуцируемым глютеном аутоиммунным заболеванием или предпочтительно глютеновой болезнью или является предрасположенным к ним.

Предпочтительно, тестовое соединение представляет собой тестовое антитело или его фрагмент, вариант или аналог, известные тем, что они способны связываться с основным целиакальным эпитопом белка, принадлежащего семейству трансглутаминаз, причем указанный белок представляет собой аутоантиген при глютеновой болезни, предпочтительно выбранный из TG2, TG3 или TG6. В принципе в этом варианте осуществления применимо любое антитело, связывающееся с целиакальным эпитопом с достаточной аффинностью или авидностью связывания. Такое антитело может представлять собой, например, выделенное аутоантитело пациента, как в примере 7.

Более предпочтительно, моноклональные антитела получают против целиакального эпитопа. Такие антитела можно получать известными способами, например способом гибридом. Технологии способа гибридом хорошо известны и описаны, например, в Kontermann, Roland; Dubel, Stefan (Eds.) Antibody Engineering Series: Springer Lab Manuals 2001, XII, 792 p. ISBN: 978-3-540-41354-7; Gary C. Howard, Matthew R. Kaser (Eds) Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, CRC Press, 2006, ISBN: 9780849335280. Более того, можно заказывать препарат продуцирующих моноклональное антитело гибридом в ряде компаний, таких как GL Biochem Ltd. (Shanghai, CH), LC Sciences (Houston, TX, США) или LAMPIRE Biological Laboratories (Pipersville, PA, США), FusionAntibodies (Pembroke Loop Rd. BT17 0QL, Северная Ирландия).

В настоящем изобретении селекция антитела вовлекает селекцию по эпитопу. В одном варианте осуществления это можно проводить путем селекции клонов, которые секретируют антитела, которые связываются с неизмененным TG2 или другим белком-трансглутаминазой, но не связываются с мутантом, который имеет нарушенный целиакальный эпитоп.

Альтернативно отбирают клоны, которые секретируют антитела, которые могут быть вытеснены антителом, известным тем, что оно способно связываться с целиакальным эпитопом, как описано в настоящем документе. Это можно проводить общепринятым иммунологически тестированием, например посредством ELISA, как описано в разделе "Примеры". После получения моноклональных антител в форме гибридом, их можно легко секвенировать.

Услуги по секвенированию можно заказать, например, от FusionAntibodies (Pembroke Loop Rd. BT17 0QL, Северная Ирландия) на основе последовательности кДНК.

В альтернативном подходе последовательность антитела можно получать секвенированием аминокислот, например, способом Эдмана. Этот способ, хотя иногда и трудоемкий, является стандартным способом и такую услугу можно заказать в различных фирмах, например в Proteome Factory AG Magnusstr. 11 D-12489 Berlin, Германия.

Альтернативно можно применять относительно новый способ, секвенирование методом "выстрела из дробового ружья" [Nuno Bandeira et al. Nature Biotechnology, December 2008, v26, n12, ppl336-1338].

Обычно может быть достаточным секвенирование только вариабельных доменов или вариабельных доменов вместе с лидерной последовательностью. В определенных случаях можно получать полную последовательность антитела. Исходя из последовательности гена антитела или его фрагменты можно клонировать и адаптировать для данного применения, например, его можно гуманизировать [например можно получать HAMA (антитело человека против антител мыши); эту услугу также предлагают в FusionAntibodies], аффинность связывания можно увеличивать способами направленной эволюции и т.д.

Можно получать фрагменты антител, такие как одноцепочечные фрагменты антител (scFv) и Fab-фрагменты, несущие вариабельную область, и они имеют несколько преимуществ вследствие их размера и надежности. Fab-фрагменты отличаются от scFv тем, что они также содержат вариабельные домены, константные области и представляют собой димер, связанный между двумя остатками цистеина.

Fab и scFv обеспечивают несколько преимуществ относительно моноклональных антител в качестве носителей и более низкую чувствительность вследствие их малого размера и более низкий отрицательный ответ иммунной системой человека. Эти фрагменты можно получать как из синтетической ДНК, так и из моноклональной клеточной линии. Такие фрагменты можно даже получать, когда известна только последовательность вариабельной области.

Специалист в данной области может использовать способ фагового дисплея, описанный, например, в [Marzari, R. et al. J. Immunol. 166, 4170-4176 (2001)], посредством которого также можно получать scFv. Иллюстративные способы получения диагностических антител на основе способа фагового дисплея описаны в разделе "Примеры". На основе указаний, представленных в настоящем документе, в пределах квалификации специалиста в данной области лежит идентификация других тестовых соединений.

Следует понимать, что вместо антител и фрагментов антител можно использовать другие распознающие молекулы, например другие рецепторы на основе белков, известные в данной области. Например, с использованием принципов, выявленных для IgG-доменов, были предприняты успешные попытки конструировать участки связывания, специфичные к данной молекуле-мишени, на белках, которые первоначально не обладают рецепторными характеристиками [Xu, L. et al. Chemistry & Biology 2002, 9, 933-942; Skerra, A. Rev. Mol. Biotech. 2001, 74, 257-275; Nygren P. и Uhlen, M. Curr. Op. Struct. Biol. 1997, 7, 463-469]. Подходящими каркасами являются, например, белок фибронектина типа 3 и липокалина, и образования участка связывания можно достигать способом направленной эволюции в комбинации, например, с технологией дисплея. Поверхность этих молекул можно конструировать способами, упомянутыми выше.

Предпочтительно, для вытеснения аутоантител тестовое соединение должно связываться более сильно и/или его следует использовать в более высокой концентрации.

В предпочтительном варианте осуществления проводят детекцию связывания тестового соединения. Детекцию можно проводить с помощью меченого соединения, специфично связывающегося с тестовым соединением. Альтернативно может быть меченым непосредственно тестовое соединение. В таком случае, например, сигнал без образца пациента или антител можно определить как 0%-ингибирование (максимальное связывание тестового соединения - нет заболевания) и сигнал для пустого образца можно определить как 100%-ингибирование (что соответствует полному вытеснению тестового соединения антителами пациента). Теоретически может случиться так, что если тестовое соединение связывается очень сильно, заболевание не выявляется. Однако на уровни связывания может влиять концентрация, как хорошо известно в данной области и таким образом, в пределах квалификации специалиста в данной области лежит установление условий анализа, как показано в примере 7. В предпочтительном варианте осуществления проводят детекцию связанных антител. В этом случае, например, для детекции связывания антитела можно использовать конъюгированное вторичное антитело. Вторичное антитело должно быть специфичным к тестовому антителу и не должно распознавать антитела пациента. В предпочтительном варианте осуществления тип антитела отличается (например пациентов с дефицитом IgA-антител диагностируют с помощью IgA-антитела). Альтернативно тестовое антитело содержит конкретную последовательность, например, оно представляет собой антитело не человека. В случае сконструированных антител или фрагментов антител (например scFv или Fab) способами генетической инженерии легко добавлять такие последовательности, которые обеспечивают определенные участки распознавания для вторичных антител (Kontermann et al., 2001, Howard and Kaser, 2006, см. выше). Как известно в данной области, в дополнение к вторичным антителам, фрагментам и производным антител, также можно использовать другие распознающие молекулы.

В альтернативном способе детекцию связывания антител пациента можно проводить с помощью молекулы, специфично распознающей такие антитела, например вторичного антитела. В этом случае детекцию специфичного связывания целиакалных аутоантител пациента с целиакальным эпитопом проводят по вытеснению указанных антител тестовым соединением и, тем самым, снижению сигнала, измеренного при максимально связывании. Также изобретение относится к наборам для проведения диагностических способов, как описано выше. Наборы согласно настоящим вариантам осуществления могут содержать составляющие компоненты наборов, как описано выше, с тем отличием, что вместо или в дополнение к тестовому белку, в указанном наборе содержится тестовое соединение, как определено в настоящем документе.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения тестовое соединение, как определено по настоящему изобретению, может быть добавлено в известный набор для анализа, пригодный в качестве анализа антител против тканевой трансглутаминазы, пригодного для детекции глютеновой болезни. Таким образом, такой анализ можно использовать в качестве анализа вытеснения, как описано в настоящем документе, который пригоден для исключения ложноположительных данных. Анализ можно проводить в присутствии тестового соединения по изобретению. Можно проводить мониторинг либо вытеснения тестового соединения аутоантителами пациента, либо вытеснения аутоантител пациента тестовым соединением, в зависимости от способа детекции. Такие наборы для анализа, так называемые анализы антител против тканевой трансглутаминазы человека, рассмотрены van Meensel et al [Clinical Chemistry 50:11 2125-2135 (2004)]. Условия анализа можно оптимизировать относительно руководства изготовителей, хотя в основном процедуру можно проводить, как описано.

Также изобретение относится к применениям тестовых соединений по настоящему изобретению для диагностики индуцируемого глютеном аутоиммунного заболевания, как описано в настоящем документе.

В предпочтительном варианте осуществления тестовое соединение по настоящему изобретению отличается от антитела, фрагмента или производного антитела, описанного в каком-либо из следующих документов: Sblattero et al. Eur J Biochem. 2002 Nov; 269(21):5175-81, Nakachi K et al. J Autoimmun. 2004 Feb; 22(1):53-63. Seissler et al. Clin Exp Immunol. 2001 Aug; 125(2):216-21], при условии, что указанное антитело способно связываться, предпочтительно специфично связываться, с основным целиакальным эпитопом. Альтернативно любые антитела, фрагменты или производные антител, описанные в любом или во всех или в любой комбинации из указанных выше публикаций или их диагностическое применения исключены из объема настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

1.1 Молекулярное моделирование

Остатки 1-14, 44-55 и 123-132 отсутствовали в кристаллической структуре TG2 человека (код PDB: 1KV3) [Liu S et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2002:99(5):2743-7], однако соответствующие области были видны в структуре TG3 (код PDB: 1VJJ,) [Ahvazi B et al., EMBO J. 2002; 21(9):2055-67], так что ее использовали для моделирования полноразмерной TG2. Гомологичная модель была построена Modeller [Sali A, Blundell TL, J Mol Biol. 1993; 234(3):779-815] с использованием опции множества матриц в программе. Графический анализ был проведен на рабочей станции Silicon Graphics Fuel workstation с использованием пакета программ Sybyl (Tripos, St. Louis, MO), и исследование проводили для поиска аминокислот, которые расположены достаточно близко друг от друга, но принадлежат к различным доменам. В частности, исследовали границу контакта центрального домена с N-концевым (I) доменом и границу контакта центрального домена с C-концевым (IV) доменом. Предпочтение отдавали заряженным аминокислотам, исходя из наблюдений для Ca²⁺-зависимых мутантов TG2.

Авторами изобретения был предложен набор аминокислот, которые могут принимать участие в построении целиакального эпитопа, такой как:

Arg¹⁹, His²², Glu¹⁵³, Glu¹⁵⁴, Arg¹⁵⁶, Arg⁴³³, Glu⁴³⁵, Met⁶⁵⁹, Leu⁶⁶¹.

Также было выявлено, что Arg¹⁹, Glu¹⁵³, Met⁶⁵⁹, расположены относительно близко друг к другу

Arg¹⁹ Glu¹⁵³- 12,9 Ǻ

Arg¹⁹ Met⁶⁵⁹- 7,7 Ǻ

Glu¹⁵³ Met⁶⁵⁹- 16,8 Ǻ

Все эти остатки расположены на поверхности молекулы и было предположено, что они, возможно, образуют общий конформационный эпитоп. При необходимости с помощью экспериментальных результатов оценивали положение и эффекты изменений, касающиеся других аминокислот.

1.2 Получение мутантов TG2

Для получения His-меченной рекомбинантный TG2 человека конструкцию ДНК, кодирующую ген TG2 (pGEX-2T-TG2; Ambrus A et al, 2001) использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции, которую проводили со специфическими праймерами (согласно набору для клонирования Ek/LIC Cloning Kit, Novagen): олигонуклеотидным праймером 1, 5'-gac gac gac aag atg aga att cag ace atg gcc gag gag ctg g-3', и праймером 2, 5'-gag gag aag ccc ggt tga att egg tta ggc ggg gcc aat gat gac-3'. His-меченную TG2 получали субклонированием амплифицированной способом ПЦР ДНК в вектор pET-30 Ek/LIC.

Мутанты TG2 получали в соответствии с набором для сайт-направленного мутагенеза QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) с His-меченной конструкцией TG2 в векторе pET-30 Ek/LIC (упомянутом выше) в качестве матрицы. Для мутантов конструировали пару олигонуклеотидных праймеров, содержавших желаемые мутации. После реакции ПЦР исходную цепь удаляли расщеплением посредством DpnI. Мутации подтверждали секвенированием ДНК с использованием анализатора ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer.

Для замены использовали серин вместо более традиционного Ala, поскольку все исследуемые положения были расположены на поверхности молекулы, и гидрофобная часть, внесенная Ala-мутагенезом может привести к проблеме при сворачивании.

Праймеры, использованные для мутагенеза, приведены в таблице 1.

Таблица 1

Использованная последовательность TG2 была такой, как описано в базе данных UniProtKB/Swiss-Prot Database, ID: P21980 (TGM2_HUMAN), которая включена в настоящий документ в качестве ссылки.

На основе указанной последовательности можно получать другие праймеры тем же способом.

1.3 Экспрессия и очистка белков TG2

Клетки Rosetta 2^TM (Novagen) трансформировали экспрессирующими векторами и выращивали в LB при 37°С до OD₆₀₀ 0,6-0,8. Для индукции экспрессии His-меченных белков, культуры выращивали в течение 5 ч при 20°С в присутствии 0,3 мМ изопропил-β-D-тиогалактозида (IPTG), затем клетки собирали центрифугированием при 4°С.

Все стадии очистки проводили на льду. Клетки ресуспендировали в лизирующем буфере [50 мМ фосфат натрия (pH 7,4), 500 мМ NaCl, 5 мМ имидазол, 20 мМ β-меркаптоэтанол, 10% (об./об.) глицерин, 1% (об./об.) Triton X-100] с 1 мМ фенилметилсульфонилфторидом (PMSF). Лизис клеток проводили обработкой ультразвуком с последующим центрифугированием в течение 35 мин при 20000 g. Супернатанты наносили на 2-мл колонку Ni Sepharose High Performance (GE Healthcare Bio-Sciences AB) в присутствии 20 мМ имидазола. Колонку промывали 80 мл буфера для промывания 1 [50 мМ фосфат натрия (pH 7,4), 800 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 20 мМ β-меркаптоэтанол], затем 40 мл буфера для промывания 2 [50 мМ фосфат натрия (pH 7,4), 500 мМ NaCl, 30 мМ имидазол, 20 мМ β-меркаптоэтанол]. Белок элюировали с помощью 12 мл буфера для промывания 2, содержавшего 250 мМ имидазол. Элюент концентрировали с помощью Amicon Centricon-YM 50 MW (Millipore) и буфер заменяли три раза на буфер для хранения [20 мМ Tris-HCl (pH 7,2), 150 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 1 мМ ЭДТА, 10% (об./об.) глицерин].

Мутанты с делецией домена получали и экспрессировали, как описано [Korponay-Szabo I et al., J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2008; 46:253-61.

1.4 Охарактеризация мутантных белков

A) Вестерн-блоттинг

SDS/PAGE проводили согласно стандартным способам. Белки TG2 разделяли посредством SDS/PAGE и переносили на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану (Millipore). Мембрану блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в 50 мМ Tris-буферном солевом растворе, содержавшем 0,1% (об./об.) Tween 20 (TTBS), в течение 1 ч при комнатной температуре, с последующей инкубацией с поликлональным антителом козы против TG2 (Upstate), разбавленным 1:20000 в TTBS или с моноклональным антителом мыши против TG2 TG100 (NeoMarkers), разбавленным 1:15000 в течение 1 ч при комнатной температуре. После тщательного промывания посредством TTBS, мембрану инкубировали с антителом против антител козы или с антителом против антител мыши, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) (Sigma), 1:30000 в TTBS, в течение 1 ч при комнатной температуре. Полосы выявляли с помощью Chemiluminescent ECL Detection System (Millipore). Все мутантные TG2 могли успешно экспрессироваться в бактериях, и были выявлены только небольшие отличия в выходе белка и интенсивности полос для белка, по сравнению с ферментом дикого типа (Wt) (фигура 1A). Это явление, возможно, является следствием различных свойств мутантов, которые могут влиять на экспрессию или эффективность очистки. Окрашивание бриллиантовым синим Кумасси SDS-геля показало чистоту более 80% для всех экспрессированных белков.

B) Активность трансглутаминазы

Активность трансглутаминазы измеряли в анализе на микропланшете для титрования на основе включения S-(биотинамидо)пентиламина в иммобилизованный N,N-диметилированный казеин (DMC) [Kiraly R et al, J Autoimmun. 2006; 26(4):278-87].

На лунки наносили 4 мг N,N-диметилированного казеина (Sigma) в 100 мМ Tris/HCl, pH 8,0, в течение ночи, при 4°C. После промывания лунки блокировали 0,5% раствором сухого молока в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляли реакционную смесь (в общем объеме 200 мкл 100 мМ Tris/HCl pH 8,0), содержащую 10 мМ дитиотреитол, 1 мМ N-(5-аминопентил)биотинамид (Molecular Probes, Eugene, OR), 5 мМ CaCl₂ и 0,5 мкг TG2. Реакцию проводили при 37°C в течение 30 мин. Планшет промывали посредством 200 мМ ЭДТА, pH 8,5, и инкубировали с 0,42 мкг/лунка стрептавидин-щелочной фосфатазы (Sigma). Ферментную реакцию выявляли добавлением 200 мл 25 мМ п-нитрофенилфосфата (Sigma) и измерением поглощения при 405 нм. Величины ферментативной активности получали из ΔA405/мин проявления цвета от 10 до 30 мин. Пустые реакционные смеси содержали 10 мМ ЭДТА и в них не был добавлен CaCl₂.

Мутант R продемонстрировал Ca-зависимую TG-азную активность, которая была ~30% выше, чем у трансглутаминазы дикого типа (Wt) (фиг. 1B). Все другие мутанты продемонстрировали сниженную, но поддающуюся измерению TG-азную активность (фигура 1B). Контрольный мутант (D), в котором присутствовали домены I-III-IV, но каталитический центральный (II) домен отсутствовал, не проявлял TG-азную активность.

C) Анализ GTP-азной активности

GTP-азную активность определяли способом на активированном угле [Kiraly R et al, J Autoimmun. 2006; 26(4):278-87]. Реакционная смесь объемом 100 мкл содержала 2 мкг рекомбинантного TG2 дикого типа мутантного TG2 в 50 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 4 мМ MgCl₂, 1 мМ DTT, 1 мМ ЭДТА, 10% (об./об.) глицерин, 9,9 мМ GTP и 0,1 мМ [g-32P]GTP (3000 Ки/ммоль, Institute of Isotopes Ltd., Budapest, Венгрия). Реакцию проводили при 37°C в течение 30 мин и останавливали с помощью 700 мкл 6% (масс./об.) активированного угля в ледяном 50 мМ NaH₂PO₄, pH 7,5. Смесь центрифугировали и высвобожденный [³²P] P_i определяли путем подсчета 150-мкл образцов супернатанта. Путой образец определяли без фермента.

Удельная активность (пмоль отщепленного GTP/мин/мг фермента) фермента Wt была принята за 100%. GTP-азная активность мутантов RM, EM и REM более чем в два раза превышала активность Wt (фигура 1B). Единичные и другие двойные мутанты продемонстрировали 24-50%.

D) Способность мутантов связывать фибронектин (Фибронектин-TG2 ELISA)

На микропланшеты для титрования (ImmunoPlate Maxisorp, Nunc, Denmark) наносили 0,3 мкг фибронектина человека (FBN) (Sigma), разбавленного в бикарбонатном буфере на 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали 3 раза посредством TTBS, содержавшего 10 мМ ЭДТА (TTBS+ЭДТА) и инкубировали с 0,8 мкг TG2 в TBS, содержавшем 5 мМ CaCl₂ и 0,1% (об./об.) Tween 20 (Ca-TBS-Tween) в течение 1 ч при комнатной температуре. Моноклональное антитело [TG100, 1:500 в TTBS+ЭДТА; (HeoMarkers, Fremont, CA)] инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали и инкубировали с конъюгированным с HRP антителом против IgG мыши (1:4000, Sigma) в течение 1 ч при комнатной температуре. Цветную реакцию проявляли добавлением 100 мкл субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (Sigma), а затем останавливали 50 мкл 1н H₂SO₄. Считывание поглощения проводили при 450 нм. Стандартные кривые получали из разведений моноклонального антитела TG100 для каждого мутанта.

Мутанты реагировали с моноклональным антителом мыши TG100 в той же степени, как и Wt (фигура 2), когда они были связаны с FBN. Эти данные подтверждают, что мутанты обладали надлежащей конформацией для применения для дальнейших измерений с сывороткой индивидуумов с глютеновой болезнью.

1.5 Пациенты

Если конкретно не упомянуты другие условия, использовали образцы сыворотки всего от 216 пациентов с глютеновой болезнью в возрасте 0,9-78 лет, из них 56 с селективным гуморальным дефицитом IgA (тотальный сывороточный IgA <0,05 г/л); все пациенты имели диагноз, установленный с помощью биопсии тонкого кишечника, показавшей атрофию ворсинок по меньшей мере Марш класса III. Образцы собирали перед лечением и 22 из них были взяты в ходе периода наблюдения, составлявшего вплоть до 17 лет. 11 индивидуумов имели сохранившуюся архитектуру ворсинок тонкого кишечника, но впоследствии в ходе проспективного наблюдения у них развивалась атрофия ворсинок по типу глютеновой болезни (латентные случаи). Включенные контроли без глютеновой болезни имели нормальную архитектуру ворсинок тонкого кишечника.

1.6 Антитела и одноцепочечные вариабельные фрагменты (ScFv)

Клон моноклонального антитела мыши Mab885 (Cl. 885A) Phadia был депонирован согласно Будапештскому договору Phadia AB (Box 6460 751 37 UPPSALA, Швеция, адрес для посещения: Rapsgatan 7P 754 50 Uppsala) под регистрационным номером …, как указано в международной форме, в DSMZ - Deutsche Sammlung von Miroorganismen un Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Германия. Партнер по слиянию для Mab885 представляет собой cl. 321B SP2/0 (крыса). Условия культивирования Cl. 885A являются следующими:

Культуральная среда: F-DMEM + 4 мМ L-глутамин + 5% эмбриональная телячья сыворотка

Предпочтительная температура: 37°С

Газообразная фаза: 6% CO₂

Оптимальный индекс разведения: приблизительно 1/10.

Длительное хранение предпочтительно в F-DMEM + 10% эмбриональная телячья сыворотка + 7,5% DMSO, при -150°С.

1.7 ELISA против TG2

Измерения с помощью ELISA проводили аналогично тестированию, описанному ранее [Sulkanen, S. et al., Gastroenterology 115, 1322-1328 (1998)]. В кратком изложении на микропланшеты для титрования (ImmunoPlate Maxisorp, Nunc) наносили 0,6 мкг TG2 в 100 мкл TBS, содержавшего 5 мМ CaCl₂ (pH 7,4). Планшеты промывали 3 раза посредством TTBS, содержавшего 10 мМ ЭДТА (TTBS+ЭДТА). Все антитела разбавляли в TTBS+ЭДТА. Образцы сыворотки (разбавленные 1:200) или моноклональные антитела (TG100, 1:500; NeoMarkers) инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали и инкубировали с конъюгированным с HRP антителом кролика против IgA человека или IgG человека (1:5000; Dako), а затем с конъюгированным с HRP антителом против IgG мыши (1:5000; Sigma) в течение 1 ч при комнатной температуре. Цветную реакцию проявляли добавлением 100 мкл субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (Sigma), а затем останавливали 50 мкл 1н H₂SO₄. Считывание поглощения проводили при 450 нм. Стандартные кривые получали из разведений моноклонального антитела TG100 для каждого мутанта и связывание других антител вычисляли с помощью 4-параметрической аппроксимации, если связывание с TG2 Wt было 100%. Все образцы сыворотки исследовали в двух экземплярах.

1.8 Конкурентные анализы ELISA

На микропланшеты для титрования наносили 0,6 мкг или менее TG2 дикого типа (Wt) в 100 мкл TBS, содержавшего 5 мМ CaCl₂ (pH 7,4). Лунки инкубировали с сывороткой от индивидуума с глютеновой болезнью (1:800) и проводили детекцию возрастающих количеств очищенных тотальных целиакальных IgG-антител (разведение 1:200-1:50) или с сывороткой пациентов с дефицитом IgA и проводили детекцию IgA- и IgG-антител. В следующих конкурентных анализах сыворотку от больных глютеновой болезнью добавляли в планшет совместно с возрастающими количествами (вплоть до 18 мкг/лунка) моноклональных антител мыши (885, CUB7402, H23) и измеряли связанный IgA.

1.9 Иммунофлуоресцентные исследования

Нефиксированные замороженные срезы инкубировали с антителом против IgA или IgG человека (DAKO) для детекции связанных in vivo иммуноглобулинов отдельно или в комбинации с двойным мечением по TG2, проведенным как описано ранее [Korponay-Szabo, LR. et al. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 31, 520-527 (2000), Korponay-Szabo, LR. et al. Gut 53, 641-648 (2004)]. Детекцию конкуренции со специфичными к TG2 MAb проводили посредством добавления MAb к ткани на 30 минут в PBS, удаления растворов для инкубации и тестирования их в отношении IgA пациента и антител мыши. Детекцию связывания MAb проводили с помощью конъюгированных с Alexa-Fluor 594 или конъюгированных с родамином антител против антител мыши.

1.10 Получение HUVEC и эксперименты с клеточной культурой

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) получали из свежих пуповин и культивировали стандартными способами [Palatka K. et al. World J. Gastroenterol. 12, 1730-1738 (2006)]. Для анализа эффектов антител на дифференцировку клеток, HUVEC культивировали на коллагене I в течение 48 часов [Myrsky, E. et al. CHn. Exp. Immunol. 152, 11 1-119 (2008)] и длину эндотелиальных трубок анализировали с помощью программного обеспечения Image J. Получили десять различных фотографий для трех лунок с 50000 клеток/лунка.

1.11 Статистический анализ

Данные измерений способом ELISA анализировали с использованием программного обеспечения GraphPad Prism Software и STATISTICA. Для сравнения связывания антитела с мутантным TG2 данные анализировали с использованием повторяющихся измерений ANOVA с последующим множественным апостериорным критерием Даннета, односторонним ANOVA с последующим апостериорным критерием Tukeys или критерием Kruskal-Wallis с последующим критерием множественных сравнений Dunn, в зависимости от ситуации. Значимой считали величину p<0,05.

ПРИМЕР 2

ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ ПО ЛОКАЛИЗАЦИИ ЦЕЛИАКАЛЬНОГО ЭПИТОПА

Связывание целиакальных антител взаимосвязано со связывающим кальций участком TG2

В процессе исследования связывания Ca2⁺ TG2 человека авторы изобретения идентифицировали два отрицательно заряженных поверхностных фрагмента на центральном домене, которые расположены близко друг к другу и могут служить в качестве участков связывания Ca²⁺. Многократные мутации кислотных остатков глутамата и аспартата на нейтральный глутамин и аспарагин в участке 4 (151DSEEERQE158→151NSQQQRQQ158) или участке 5 (434DERED438→434NQRQN438) привели к снижению количества связанных ионов Ca²⁺ на молекулу TG2 от 6 до 3 и также снизили связывание образцов сыворотки пациентов с глютеновой болезнью значительно (участок 4, остаточное связывание по сравнению с TG2 дикого типа 11,6±-8,5%) или умеренно (участок 5, 51,3+16,0%) в твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA). Эти анализы ELISA проводили с образцами сыворотки от 62 пациентов с глютеновой болезнью (возраст при постановке диагноза 1-42 лет) и 20 контрольных для заболевания индивидуумов (возраст 1-17 лет). Взятие образцов сыворотки проводили во время первоначальной клинической диагностики, индивидуумы с глютеновой болезнью имели антитела против TG2 и эндомизиальные антитела в сыворотке и имели тяжелую атрофию ворсинок при биопсии тонкого кишечника, в то время как контроли имели нормальную архитектуру тонкого кишечника и отрицательные серологические результаты, соответственно.

Для проведения ELISA, белок TG2 дикого типа и мутантные белки TG2 разбавляли в Ca-TBS-Tween, а затем наносили на планшет Maxisorp (0,6 мкг/лунка) при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем проводили ELISA, как описано в примере 1, посредством добавления антител пациента в разведениях 1:200 в буфере для анализа и с использованием поликлональных антител кролика против IgA (DAKO, разбавленные 1:4000 в буфере для анализа) для детекции сигнала. Связывание TG2 дикого типа принимали за 100%, и связывание образцов пациента вычисляли пропорционально этому, с использованием эталонного моноклонального антитела TG100 для контроля того, что планшеты имели сравнимые количества антигенов TG2 дикого типа и мутантных антигенов TG2.

В варианте анализа в жидкой фазе на микропланшеты для титрования (Maxisorp, Nunc, Дания) наносили 0,6 мкг TG2 дикого типа (Wt). Сыворотку индивидуумов с глютеновой болезнью преинкубировали с различными количествами TG2 Wt или мутантного TG2 в Ca-TBS-Tween в течение 10 мин при комнатной температуре. Эту смесь добавляли в лунки и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Детекцию нанесенных IgA-антител, связанных с TG2 Wt, проводили аналогично тому, как в ELISA против TG2.

В поиске якорных остатков, которые могли образовывать целиакальный эпитоп в участке 4, авторы настоящего изобретения получили мутантные молекулы TG2, несущие мутации D151N, E153Q, E154Q, E155Q, E158Q и E158L по отдельности. Из них мутация остатков 153 или 158 значительно снижала (p<0,0001) связывание целиакальных антител (фигура 3A), в то время как другие изменения не имели какого-либо эффекта. Поскольку E158 не является экспонированным на поверхности, эти результаты показали важность Glu¹⁵³, который мог образовывать якорную точку для связывания антитела. Однако мутация с Glu на Gln в этом положении не была достаточной для полного устранения связывания антитела пациента, или также могла существовать возможность, что для образования функционального эпитопа для Glu¹⁵³ требовалась кооперативность других частей поверхности.

Сайт-направленный мутагенез также проводили в участке 5. При анализе поверхностных свойств две аминокислоты-кандидата (Arg⁴³³ и Glu⁴³⁵) с заряженными боковыми цепями в середине предполагаемого эпитопа участка 5 заменяли на серин (мутант 433), поскольку они были ближайшими к участку 4. Однако мутант 433 не продемонстрировал измененного связывания с образцами сыворотки от пациентов с глютеновой болезнью. Кроме того, в ELISA моноклональное антитело против TG2 мыши H23 [Korponay-Szabo I et al. J Ped^'mtr Gastroenterol Nutr. 2008; 46,253-61], которое имело связывающий эпитоп в участке 5, не препятствовало связыванию антител глютеновой болезни с TG2 дикого типа при совместном введении в избытке с образцами сыворотки от индивидуумов с глютеновой болезнью.

Авторы настоящего изобретения также получили мутант активного центра трансглутаминазы (C277S), однако этот белок связывал целиакальные антитела также хорошо, как и TG2 дикого типа.

Ионы кальция не образуют часть целиакального эпитопа(ов)

Участок 4 представляет собой Ca²⁺-связывающий участок и в предшествующих клинических лабораторных исследованиях было показано, что целиакальные антитела распознают TG2 предпочтительно в присутствии Ca²⁺ [Sulkanen S et al, Gastroenterology 1998; 115:1322-8]. Поскольку поверхностные аминокислоты, вовлеченные в координацию Ca²⁺ в участке 4 или участке 5, не полностью были ответственны за связывание целиакальных антител, авторы изобретения исследовали, являются ли ионы кальция сами по себе частью эпитопа. Для этой цели авторы изобретения использовали препараты TG2 в качестве антигена после истощающего диализа в этилендиаминтетраацетате (ЭДТА), и авторы изобретения использовали ЭДТА во всех буферных растворах в ELISA. Однако эта процедура могла удалить весь связанный Ca²⁺ из белка, только когда его сильный участок связывания Ca²⁺ (участок 1, аминокислоты 229-233, гомологичные сильному участку связывания Ca²⁺ в TG3) подвергнут мутации. Этот мутант участка 1, где аминокислоты участка 4 и участка 5 оставались неизмененными, был хорошим антигеном для целиакальных антител и они связывали его в равной степени хорошо (>100%) в ELISA как в присутствии, так и в отсутствие Ca²⁺. Этот результат исключает структурную роль ионов Ca в потенциальном целиакальном эпитопе(ах) в участке 4, а также в участке 5.

Существование якорных точек эпитопа вне центрального домена

Поскольку Glu¹⁵³ находился вблизи границы контакта между доменами, авторы изобретения пытались установить, какие из доменов, отличные от центрального домена, могут содержать дополнительные эпитопы или могут кооперироваться с Glu¹⁵³ при связывании антитела. Учитывая, что более ранние результаты с укороченными фрагментами TG2 были противоречивыми в уровне техники, авторы изобретения экспрессировали мутанты TG2, каждый из которых был лишен одного структурного домена TG2, как описано [Korponay-Szabo et al, J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2008; 46:253-61]. Когда эти конструкции мутантных доменов применяли в эквимолярных концентрациях в твердофазных иммуноанализах и в иммуноанализах в жидкой фазе, авторы изобретения открыли, что связывание целиакального антитела протекало нормально даже в полном отсутствие домена III (аминокислоты 472-584). В противоположность этому, отсутствие либо домена I, либо домена II, приводило к белкам, которые совсем не связывали целиакальные антитела (фигура 3B), указывая на то, что оба этих домена имеют прямую или непрямую роль в связывании антитела. Также утрата домена IV (аминокислоты 585-687) повлияла на связывание в некоторой степени (O.D. относительно TG2 дикого типа 0,8, p<0,0001). Однако неожиданно было установлено, что конструкция, состоящая из доменов I-III-IV, но не содержащая домен II, не связывала целиакальные антитела даже несмотря на то, что известно, что эти домены принимают их свернутые формы [Hang J et al, J Biol Chem. 2005; 280(25):23675-83; Pinkas DM et al, PLoS Biol. 2007; 5(12):e327] также независимо от центрального домена. Таким образом, эти результаты показали, что в целиакальном эпитопе(ах) присутствие якорных остатков центрального домена требуется для эффективного связывания и, таким образом, в их отсутствие другие части эпитопа были неспособны образовать функциональные участки связывания.

ПРИМЕР 3

ЭФФЕКТЫ МУТАЦИЙ В ПРЕДПОЛАГАЕМОМ ЦЕЛИАКАЛЬНОМ ЭПИТОПЕ И ВЗАИМОСВЯЗАННЫХ С НИМ ОБЛАСТЯХ ПОВЕРХНОСТИ

На основе предварительных результатов и компьютерного анализа в большом наборе аминокислот идентифицировано 6 аминокислот (R19, D151, E153, E154, E155, M659), которые находятся на поверхности или являются соседними с поверхностью TG2, относящейся к участку 4, и достаточно близко друг от друга для потенциального образования составных эпитопов. Эти остатки изменяли по одному (единичные мутанты) или в комбинации (двойные и тройные мутанты) сайт-направленным мутагенезом на серин или в случае кислотных остатков на их нейтральные гомологи.

Авторы изобретения получили молекулы TG2 со следующими точковыми мутациями: E153S (E), R19S (R), M659S (M) или соответствующими мутациями в комбинации (D151N/E154Q/E155Q, RE, EM, RM, REM, E154K/R19S/M659S [RKM]), и тестировали белки на большом наборе последовательных образцов сыворотки от пациентов (n=76). Относительные количества связанных антител вычисляли посредством сравнения с калибровочной кривой, построенной на основе зависимого от концентрации связывания моноклонального антитела мыши против TG2 TG100, которое имеет линейный эпитоп в аминокислотах 447-538.

Каждая единичная мутация приводила к значительному снижению связывания целиакальных антител (остаточное связывание 26,5%, 28,8% и 39,1% для R, E и M, соответственно) и двойные и тройные мутации приводили к пропорциональным изменениям. Мутант D151N/E154Q/E155Q также связывал значительно меньше антител, чем его мутанты с единичными точковыми мутациями (фигура 3A), но не утрачивал полностью его связывающую способность. Мутант RM все еще сохранял связывающую способность 35,8%, EM имел 18,5% и REM и, неожиданно, RE имели наиболее низкую связывающую способность, давая связывание 13,4% и 6,6%, соответственно. Тот же паттерн связывания наблюдали как для последовательно диагностированных пациентов-детей, так и для пациентов-взрослых с глютеновой болезнью (фигура 4), и эти результаты вместе указали на важность первой альфа-спирали центрального домена для связывания антитела.

Несмотря на сниженное связывание целиакальных антител, эти мутантные белки TG2 нормально связывали большой набор моноклональных антител мыши против TG2 [Korponay-Szabo I et al, J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2008; 46:253-61] и продемонстрировали функциональность в анализе связывания фибронектина и в анализе либо TG2-азы или GTP-азы, как показано в примере 1. Кроме того, анализ CD-спектров выбранных мутантов (мутантов R, S4, E¹⁵³ и E¹⁵⁸) показал, что эти белки имели свернутую структуру без значительного увеличения (<5%) доли несвернутых сегментов.

Прямое связывание целиакальных антител с поверхностью вокруг Glu¹⁵³, далее было подтверждено путем модификации другой якорной точки центрального домена предполагаемого составного эпитопа. Как показано выше, замена Glu¹⁵⁴ на нейтральный Gln (E154Q) не была существенной для изменения связывания целиакального антитела, однако замена в TG2 (E154K) в комбинации с мутациями R и M (RKM) привела к сходному значительному снижению связывания целиакального антитела (остаточное связывание 22,0%), как и мутация REM (фигура 5). Этот результат также подтверждается тем фактом, что фактор XIII, другой представитель семейства трансглутаминаз, с которым целиакальные антитела не связываются [Sjober et al, Autoimmunity 2002; 35:357-64] содержит положительно заряженный лизин в соответствующем положении в высокогомологичной в ином случае поверхности.

Напротив, поиск в библиотеках последовательностей TG2 из различных видов и TG человека показал, что все белки TG2 животных, которые известны тем, что они служат в качестве высокочувствительных антигенов для детекции антител глютеновой болезни в клинических лабораториях посредством ELISA (морская свинка) или традиционных иммунофлуоресценных анализов со срезами тканей (обезьяна, крыса, кролик, мышь), содержат гомологичные отрицательно заряженные поверхности и якорные точки в соответствующих положениях (таблица 2). Сходная поверхность также может быть найдена в TG6 человека.

Для установления области поверхности, которая может являться частью предполагаемого целиакального эпитопа, авторы изобретения использовали данные, полученные с помощью мутанта 433 (фигура 4), который показал, что предполагаемый целиакальный эпитоп не распространяется на эти остатки в направлении участка 5.

Таблица 2
Сравнение аминокислот, являющихся частью целиакального эпитопа, в белках TG2 из различных видов и других представителях семейства трансглутаминаз

a) [Korponay-Szabo et al, J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2000; 31:520-7]

b) [Dieterich et al, Nat Med. 1997; 3:797-801]

c) [Korponay-Szabo et al, Gut. 2003; 52: 199-204]

d) [Hadjivassiliou et al, Ann Neurol. 2008; 64:332-43]

e) [Sardy et al, J Exp Med. 2002; 195:747-57]

f) Фактор XIII [Sjober et al, Autoimmunity 2002; 35:357-64]

g) белок эритроцитов с полосой 4.2, собственные неопубликованные результаты

Две якорных точки в достаточной степени определяют целиакальный эпитоп

Для установления относительной важности Arg¹⁹ и Met⁶⁵⁹ для связывания целиакального антитела проводили дополнительные исследования со связанной с фибронектином TG2, которая имитирует доступность эпитопов во внеклеточном матриксе, где антитела, главным образом, встречают аутоантиген у пациентов. Для этого 0,8 мкг TG2/лунка наносили на фибронектин, как описано в примере 1, и проводили детекцию связанных целиакальных антител класса IgA с помощью вторичных антител кролика против IgA (DAKO), разбавленных 1:4000 в буфере для анализа. В этих условиях мутации Arg¹⁹ и Glu¹⁵³имели сходные эффекты, когда их тестировали с TG2, непосредственно связанным с планшетом для ELISA. Однако неожиданно мутация Met⁶⁵⁹ не изменяла связывание целиакального антитела ни у детей, ни у взрослых (фигура 6), также как и аддитивный эффект при ее использовании в комбинации с другими двумя мутациями. Таким образом, эти результаты показали, что Glu¹⁵³ и Arg¹⁹ вместе являются достаточными для связывания антитела, и, таким образом, целиакальные антитела могут связываться с TG2 также в ее каталитически активной форме, когда TG2 принимает открытую протяженную конформацию [Pinkas DM et al, PLoS Biol. 2007; 5(12):e327], где домен IV с Met⁶⁵⁹ повернут. Это является еще более неожиданным, поскольку Arg¹⁹ в закрытой конформации значительно более близко расположен к Met⁶⁵⁹ (7,7 Ǻ), чем к Glu¹⁵³ (12,9 Ǻ). С другой стороны, определение положений Arg¹⁹ и Glu¹⁵³ в кристаллической структуре открытой формы (2Q3Z) не продемонстрировало отличий по сравнению с закрытой конформацией (1KV3, 2,8-Ǻ) (фигура 7).

В анализе в жидкой фазе антитела продемонстрировали тот же паттерн, что и в твердофазном ELISA, подтверждая данные о том, что Glu¹⁵³ и Arg¹⁹ обладают главной ролью в связывании антитела.

ПРИМЕР 4

ДРУГИЕ МУТАЦИИ, НЕПРЯМО ВЛИЯЮЩИЕ НА ЦЕЛИАКАЛЬНЫЙ ЭПИТОП

Как показано на фигуре 3A, единичная точковая мутация на центральном домене (E158Q или E158L) также снижала связывание целиакальных аутоантител с TG2 в ELISA. Поскольку эта аминокислота не экспонирована на поверхности, авторы изобретения провели дополнительный анализ in silico и молекулярное моделирование для исследования эффекта этой мутации. Glu¹⁵⁸ расположен в основании первой альфа-спирали центрального домена, и утрата отрицательного заряда на его боковой цепи приводит к разрушению водородных связей и придает спирали нестабильность. Этот процесс может влиять на относительное расположение поверхностных остатков 153, 154 и 155 друг относительно друга или относительно Arg¹⁹ на N-концевом домене.

При оценке также положения аминокислот в участке 5 был сделан вывод, что эти изменения также могут непрямо влиять на спираль в участке 4, но в меньшей степени.

Кроме того, авторы изобретения провели оценку того, могут ли изменения, отличные от мутации Arg¹⁹ в первой альфа-спирали N-концевого домена, оказывать эффект на связывание целиакальным антителом. Таким образом, авторы изобретения получили мутант TG2, где N-концевые первые 14 аминокислот полноразмерной TG2 удалены, что предположительно также влияло на указанную спираль. Было показано значительное снижение связывания целиакальных антител с этим мутантом (остаточное связывание 8,4% по сравнению с TG2 дикого типа).

Для всех этих мутантных аминокислот справедливо, что они не образуют часть молекулярной поверхности целиакального эпитопа, однако мутация непрямо влияет на указанный эпитоп.

ПРИМЕР 5

СПЕЦИФИЧНОСТЬ К ЗАБОЛЕВАНИЮ И КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ СОСТАВНОГО ЭПИТОПА

Специфичность к заболеванию

Авторы изобретения проводили оценку того, является ли идентифицированный составной эпитоп характерным только для аутоиммунитета при глютеновой болезни. Таким образом, авторы изобретения сравнили паттерн связывания 11 образцов от индивидуумов с глютеновой болезнью, которые были положительными как по эндомизиальным антителам, так и по антителам против TG2, с образцами сыворотки от 11 пациентов с антителами против TG2 в сыворотке вследствие других аутоиммунных заболеваний (SLE, синдром Шегрена, ревматоидный артрит). Паттерн связывания группы без глютеновой болезни значительно отличался и не имел отношения к целиакальному эпитопу (фигура 8), и эти индивидуумы также были отрицательными по антителам против эндомизия и дезамидированных глиадинов. Пациенты с аутоиммунным нарушением не имели мальабсорбции и других кишечных симптомов, и когда проводили гистологию тонкого кишечника (в 1 случае), тонкий кишечник был нормальным.

Антитела различных пациентов с глютеновой болезнью распознают части одного и того же эпитопа.

Поскольку естественные антитела пациента являются поликлональными и могут содержать смесь антител с различной специфичностью к эпитопу, авторы изобретения далее исследовали, определяет ли вновь идентифицированный конформационный эпитоп ответ антител во всех случаях глютеновой болезни. Таким образом, авторы изобретения провели конкурентные исследования с образцами сыворотки и очищенными IgG- и IgA-иммуноглобулинами пациента. Образцы сыворотки от всех 56 исследованных пациентов с глютеновой болезнью с дефицитом IgA (в возрасте 0,9-78 лет) с IgG- или IgM-антителами против TG2 были способны вытеснять указанное целиакальное IgA-антитело против TG2 от того же компетентного по IgA пациента с глютеновой болезнью (фигура 9), в то время как сыворотка 23 дефицитных по IgA контрольных индивидуумов без глютеновой болезни без антител против TG2 была неэффективной. Эффект вытеснения был пропорционален концентрации антител против TG2 класса IgG и IgM в сыворотке и, таким образом, они были пригодны для измерения неизвестных не-IgA целиакальных антител в клинической лаборатории.

Хотя все образцы сыворотки пациентов с глютеновой болезнью демонстрировали значительно сниженную реакцию с REM, тройными RKM и двойными RE мутантами, их реакция продемонстрировала некоторую вариабельность в случае мутанта R с точковой мутаций, где была изменена только N-концевая якорная точка (Arg¹⁹), как показано на фигуре 4. Однако когда авторы изобретения провели конкурентные исследования с очищенными IgG-антителами от пациента с глютеновой болезнью, антитела которого не реагировали с R, авторы изобретения получили тот же эффект конкуренции для того же целиакального IgA-антитела, что и при использовании другого целиакального IgG-антитела, которое не реагировало с R (фигура 9).

Кроме того, когда авторы изобретения сравнили результаты связывания антитела с Ca²⁺-связывающими мутантами участка 4 и участка 5, полученные для первоначально исследованных 62 образцов сыворотки от индивидуумов с глютеновой болезнью, связывание с участком 5 коррелировало с логарифмическими величинами связывания участка 4 для отдельных образцов (фигура 10). Этот результат указывает на то, что связывание, главным образом, определялось спиралью участка 4, а также изменениями в ближайшем участке 5, т.е. на границе области поверхности участка 4 и может влиять на положение спирали участка 4, и что оно имело пропорциональный эффект, указывающий на существование одного главного участка связывания для всех пациентов. Эта серия также включала взрослых, для которых наблюдаемые результаты были сходными.

Стабильность и оценка паттерна связывания эпитопа в ходе развития заболевания

Глютеновая болезнь является строго глютен-зависимой нозологической формой и продукция аутоантител к TG2 зависит от употребления глютена, исчезает и появляется при устранении и повторном употреблении глютена. Таким образом, авторы исследовали специфичность к эпитопу циркулирующих аутоантител против TG2 отдельных пациентов из первоначально полученных и последующих образцов сыворотки. В серии из 7 пациентов, у которых антитела исчезали при диете, но которым глютен повторно вводили в последующее время (через 1-4 лет) для диагностики нагрузки глютеном, как ранее было клинической практикой, пациенты при нагрузке глютеном отвечали антителами с той же специфичностью к эпитопу. Аналогично, в случаях несоблюдения диеты и постоянно положительных результатов на антитела против TG2 в сыворотке с течением времени с детского до взрослого возраста, стабильность паттерна связывания эпитопа наблюдали в течение 3,5-14 лет (фигура 11).

Сходная специфичность к эпитопу циркулирующих антител и антител, связанных in vivo с тканями пациента

Далее, авторы изобретения оценивали, имеют ли также значение для клинических проявлений заболевания антитела к составному эпитопу. Существует несколько клинических наблюдений, что высокоавидные антитела могут улавливаться тканями и не циркулируют, объясняя серонегативные случаи глютеновой болезни у небольшого числа пациентов [Salmi TT et al, Gut. 2006; 55(12):1746-53]. Целиакальные антитела, депонированные в тканях, присутствовали во всех пораженных органах [Korponay-Szabo IR et al, Gut. 2004; 53(5):641-8] и было показано, что они являются функциональными, поскольку они связывались с добавленной извне рекомбинантной TG2 [Salmi TT et al, Gut. 2006; 55(12): 1746-53], таким образом, они могут быть более важными для патогенеза заболевания, чем антитела крови. Таким образом, авторы изобретения поставили цель протестировать, является ли специфичность к эпитопу связанных с тканью антител против TG2 сходной с антителами крови. Авторы изобретения элюировали IgA-антитела пациента, депонированные в тканях пациента, из срезов тканей и тестировали их с помощью панели соответствующих мутантных белков TG2 после очистки. Для получения только функциональных антител пациента, которые связываются с антигеном TG2, и для предотвращения контаминации фракции IgA неспецифическими IgA, содержащимися в плазматических клетках или эпителиальных клетках, которые необязательно участвуют в процессе заболевания, авторы изобретения решили использовать биоптаты не кишечника, внекишечного органа без локальной продукции IgA. Такая ткань пациента была легкодоступна в достаточных количествах для биохимических исследований без проведения инвазивных процедур, когда авторы изобретения тестировали образцы плаценты от двух матерей с глютеновой болезнью, родивших при наличии серологически активного заболевания. В действительности, авторы изобретения наблюдали, что плацента при глютеновой болезни содержит высокие количества связанных с TG2 материнских антител, как в децидуальных частях, так и на поверхности хорионических ворсинчатых структур (фигура 12). Эти IgA элюировали из тканей плаценты с помощью хлоруксусной кислоты, как описано ранее [Korponay-Szabo I et al, Gut. 2004; 53(5):641-8,9], и они показали идентичный паттерн нацеливания на эпитоп, с типичным паттерном, наблюдаемым для образцов сыворотки с глютеновой болезнью.

Целиакальные антитела, нацеленные против идентифицированного составного эпитопа, вызывают заболевание при пассивном переносе

Для оценки того, вовлечено ли антитело, нацеленное на целиакальный эпитоп, идентифицированный авторами изобретения, в процесс заболевания, авторы изобретения искали модель заболевания, где гуморальный и клеточный компоненты иммунной реакции можно было бы исследовать по отдельности. К сожалению, глютеновая болезнь представляет собой нарушение строго у человека и не существуют подходящих моделей на животных, где могли бы быть функциональными специфичные к TG2 антитела. Таким образом, авторы изобретения исследовали, может ли естественный перенос материнских антител происходить у новорожденных детей человека и сопровождается ли этот процесс патологическими признаками. Эти потомки часто обладают сниженным весом и более часто имеют осложнения при родах, чем дети от здоровых матерей [Hadziselimovic F,et al. Fetal Pediatr Pathol. 2007; 26:125-34]. Таким образом, авторы изобретения исследовали плаценту, пуповину и образцы сыворотки после 8 родов, где матери имели глютеновую болезнь, и получали эндотелиальные клетки пуповины человека (HUVEC). Трое из этих матерей имели активное заболевание с циркулирующими антителами против TG2 с типичной специфичностью при оценке путем ELISA с их образцами сыворотки. Одна из этих матерей имела дефицит IgA с высокими уровнями антител класса IgG. Антитела против TG2 класса IgG были найдены в сыворотке трех новорожденных. Эти антитела имели сходную специфичность к эпитопу, что и IgG-антитела их матерей (фигура 12). IgG-антитела также были выявлены в ткани пуповины новорожденного от матери с дефицитом IgA, и этот ребенок обладал сниженным весом и имел повреждение печени, для которого не было выявлено другой клинической причины и которое устранилось параллельно со снижением уровней сывороточных антител в крови. Биопсия тощей кишки не была возможна у этого ребенка по этическим причинам. Клетки HUVEC, полученные от другого ребенка, подвергнутого воздействию материнских антител до рождения, проявляли сниженную выживаемость клеток, аномалии их формы и распластывания на поверхностях по сравнению с клетками от детей с негативными по антителам матерями с глютеновой болезнью.

ПРИМЕР 6

КОНСТРУИРОВАНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МУТАНТОВ ТРАНСГЛУТАМИНАЗЫ, ОТЛИЧНОЙ ОТ TG2

С использованием молекулярного моделирования авторы изобретения оценили структуру белков-представителей семейства трансглутаминаз и их поверхности, соответствующие составному целиакальному эпитопу, идентифицированному в TG2. Как показано в таблице 2, первая N-концевая спираль центрального домена является сходной также в факторе XIII и TG3, но она, однако, отличается в некоторых из якорных точек целиакального эпитопа и, как правило, не реагирует перекрестно с классическими целиакальными аутоантителами. С учетом сходства общей структуры каркаса этих молекул авторы изобретения ожидали, что изменение аминокислот, соответствующих главным якорным точкам целиакального эпитопа, приведет к усилению их связывающих свойств. Исходя из результатов молекулярного моделирования и экспериментальных данных авторов изобретения для мутации E154K в TG2 было предсказано, что замена в факторе XIII с Lys¹⁹⁹ на Glu усилит целиакальную антигенность фактора XIII (фигура 5). Этот сконструированный антиген TG можно было использовать в качестве эталонного белка вместе с исходным фактором XIII в качестве тестового белка для исследования образцов пациента на специфичность к целиакальному эпитопу в ELISA или другом иммуноанализе. В этом варианте осуществления сигнал в случае сконструированного белка, но отсутствие сигнала в случае исходного фактора XIII может указывать на связывание антитела целиакального типа. Аналогично изменение Gly¹⁴⁶ и/или His¹⁴⁸ в TG3 или соответствующих аминокислот в других представителях семейства TG человека или эукариот может иметь сходный эффект.

ПРИМЕР 7

РАЗРАБОТКА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ НАБОРОВ

Диагностический набор на основе мутанта TG2

Может быть разработан диагностический набор на основе участка связывания специфического целиакального антитела в TG2 и условий анализа, описанных в примере 1-3. Этот набор основан на способе ELISA, других иммуноанализах и или анализах связывания без метки. В случае ELISA, TG2 дикого типа и одну или несколько мутантных TG2 с измененным целиакальным эпитопом связывают с поверхностью планшета и паттерн связывания исследуемого образца может отличить ложноположительную от "реальной" сыворотки при глютеновой болезни. Белок TG2 с неизмененным целиакальным эпитопом может быть эталоном и снижение связывания антитела со специфичными мутантами по целиакальному эпитопу указывают на паттерн связывания по типу глютеновой болезни. Если выявляют связывание с эталонным белком, но без по меньшей мере 30% изменения связывания тестового белка, результат интерпретируют как результат для антитела против нецелиакального типа TG2 и не проводят дальнейших клинических исследований. Таким образом, можно избежать необязательных инвазивных исследований, таких как верхняя эндоскопия и биопсия тонкого кишечника. Если результаты как с эталонным, так и с тестовым белком, оказываются ниже заданного порогового уровня, образец не содержит антитела TG2 и, таким образом, также можно избежать инвазивных исследований. Пригодный порог для того, чтобы считать антитела реактивными в отношении белка TG2, устанавливается с помощью рабочей характеристической кривой (ROC), полученной на известных образцах индивидуумов с глютеновой болезнью и без глютеновой болезни. Предлагается 5% предел связывания, полученный для образца от пациента с глютеновой болезнью в отсутствие лечения, исходя из результатов примера 5.

В дополнение к полноразмерной TG2 дикого типа, следующие рекомбинантные белки авторов изобретения продемонстрировали связывание, сходное с TG2 дикого типа и пригодны для применения в качестве эталонных белков в указанном выше анализе: D151N, E154Q, E155Q, C277S, мутант 433, доменные мутанты B (домены I-II-IV) и A (домены I-II-III) и Ca²⁺-связывающий мутант участка 1 с или без ионов Ca²⁺. Последний пригоден в условиях анализа, когда добавление кальция было бы нежелательным. Кроме того, эталонный белок может представлять собой сконструированный белок с целиакальным эпитопом, сконструированном на каркасе семейства TG, который сам по себе не является антигенным для целиакальных антител. Для тестового белка предлагаются мутанты R, E, E158Q, E158L, но более предпочтительно комбинированные мутанты RE, REM, RKM, мутант участка 4, или гомологичный белок TG без связываемого целиакального эпитопа, представляющий собой аналог сконструированного белка.

На фигуре 13 представлен пример для измерения без метки связывания целиакального антитела способом Biacore, где как связывание, так и диссоциация целиакальных антител изменены в отношении мутанта участка 4 по сравнению с TG2 дикого типа.

Диагностический набор на основе вытеснения антител

Было выявлено, что природные IgA- и IgG-антитела, очищенные из сывороток пациентов с глютеновой болезнью и по-разному распознающие R19S, также конкурировали друг с другом, но не с IgG человека без глютеновой болезни (фиг. 9 B1-B3). Исходя из этих данных авторы изобретения разработали диагностический ELISA с 98% чувствительностью и 96% специфичностью в отношении определения целиакальных антител класса IgG у индивидуумов с селективным гуморальным дефицитом IgA по их зависимому от концентрации эффекту вытеснения (r=0,88) в отношении известного целиакального IgA-индикаторноего антитела (фиг.9 A1-A2).

В этом иллюстративном анализе авторы изобретения измеряли сывороточные антитела против TG2 класса IgG у пациентов с дефицитом IaA путем вытеснения IgA-антител пациентов с глютеновой болезнью. Образцы сыворотки от 56 пациентов с глютеновой болезнью, не проходивших лечение, в возрасте 0,9-73 лет (срединное значение 10,5) с селективным дефицитом IgA (общий сывороточный IgA<0,05 г/л), от 23 контролей с дефицитом IgA без глютеновой болезни и 22 контролей с нормальными сывороточными IgA с нормальной архитектурой тонкого кишечника (возраст контролей 1-18, срединное значении 5,5), анализировали в ELISA с антигеном TG2 дикого типа. В то время как большинство пациентов имели антитела подкласса IgG, трое из них также имели антитела против TG2 класса IgM. Исследованные образцы сыворотки разбавляли 1:100 в буфере для анализа, содержавшем целиакальное индикаторное IgA-антитело, разбавленное 1:500, и связывание IgA-антитела измеряли с помощью конъюгированных с пероксидазой вторичных антител против IgA. Величины оптической плотности (OD), полученные для пустого раствора, были определены как 100% ингибирование, и сигнал с индикаторным IgA-антителом без добавления IgA-дефицитных образцов был определен как 0% ингибирование. Ингибирование, полученное с исследуемыми образцами, вычисляли как 100-(OD индикатора-OD образца/OD индикатора). Вариабельность в пределах анализа составляла 5,9% и вариабельность между анализами составляла 9,2%. Оптимальный предел в качестве заданного порога, вычисленного из рабочих характеристических кривых, составил 11% ингибирование, где анализ вытеснения имел чувствительность 98,2% (доверительный интервал 95%: 94,5-100) и специфичность 95,6% (доверительный интервал 95%: 89,9-100) для диагностики глютеновой болезни у индивидуумов с дефицитом IgA (фиг.9 A1). Корреляция эффекта вытеснения с концентрацией в сыворотке IgG-антител против TG2, измеренной путем прямого распознавания IgG человека моноклональными антителами мыши против IgG человека (Phadia) и конъюгированными с HRP вторичными антителами против антител мыши; r=0,88. (фиг. 9 A2). В представленных экспериментальных условиях наиболее предпочтительное соотношение для вытеснения наблюдали при разведении IgG 1:100 и разведении IgA 1:500.

ПРИМЕР 8

ПРЕДСКАЗАНИЕ ПРЕДСТОЯЩЕГО КЛИНИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ ПО СПЕФИФИЧНОСТИ К ЭПИТОПУ АНТИТЕЛ ПАЦИЕНТА

Чтобы увидеть, заметна ли реакция на идентифицированный составной целиакальный эпитоп уже на ранней доклинической стадии заболевания и имеет ли она также прогнозирующее значение в отношении диагноза глютеновой болезни позднее в жизни, авторы изобретения протестировали 11 образцов сыворотки от пациентов, положительных по эндомизиальным антителам и антителам против TG2, у которых во время сбора сыворотки признаки кишечного заболевания отсутствовали (нормальная архитектура ворсинок) и, таким образом, диагноз глютеновой болезни не мог быть поставлен незамедлительно. Шесть из этих индивидуумов были бессимптомными членами семей пациентов с установленной глютеновой болезнью и они были отобраны путем скрининга семей. В ходе наблюдения в течение 0,8-3 лет, у семи из этих индивидуумов развилась тяжелая атрофия ворсинок в тонком кишечнике c локальным отложением антител, а другие двое имели отложение антител с другими небольшими очагами повреждения. Образцы сыворотки, собранные на латентной стадии заболевания, продемонстрировали во всех 11 случаях сходный паттерн распознавания эпитопов с образцами сыворотки пациентов с явным клиническим заболеванием (фигура 14), и отличие в реакции c TG2 дикого типа и мутантами RE и REM было еще более выраженным.

Следующими случаями диагностической задачи являются индивидуумы, у которых антитела против TG2 не циркулируют. В таких случаях антитела могут быть уловлены тканями и быть доступны в форме элюатов. Поскольку в этих случаях часто присутствуют внекишечные симптомы, которые могут быть вызваны другими заболеваниями, специфичность к эпитопу может помочь установить, является ли наблюдаемая патология связанной с глютеном или нет.

ПРИМЕР 9

ПОЛУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ СПОСОБОМ ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ

Следующим инструментом для продукции моноклональных антител, которые нацелены на целиакальный эпитоп, является создание библиотеки из вариабельных областей антител человека способом фагового дисплея. В этом способе одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv) клонируют из образцов человека, продуцируют и подвергают селекции в отношении данного антигена [Marzari, R. et al. J. Immunol. 166, 4170-4176 (2001)]. Это дает возможность найти специфичное к TG2 антитело, имеющее тот же участок связывания, что и целиакальные антитела от симптоматических пациентов. Первой стадией процесса получения библиотеки тотальных антител является выделение тотальной РНК с помощью Trizol из лимфоцитов кишечника. Далее синтезируют кДНК первой цепи с использованием выделенной РНК в качестве матрицы и вариабельную область цепей H, κ и λ IgA-антител амплифицируют с помощью специфических проймеров способом ПЦР. После добавления линкерной области амплифицированные вариабельные области тяжелой (VH+линкер) и легкой (Vκ+линкер и Vλ+линкер) цепей собирают с помощью другой ПЦР. Для получения библиотеки собранные VH-V_K и VH-Vλ расщепляют ферментами рестрикции и лигируют с вектором pDAN5, расщепленным теми же ферментами. После этой стадии вектор содержит собранный scFv в качестве вставки и его можно трансформировать в электерокомпетентные клетки E. coli DH5ΔF' способом электропорации. Бактерии, которые содержат библиотеку антител, выращивают в течение ночи на селективной среде, и на следующие сутки библиотеку антител собирают и хранят при -80°С. Библиотека должна содержать ~10⁷ клонов для сохранения вариабельности, сравнимой с вариабельностью антител в организме человека.

Селекцию библиотеки в отношении данного антигена проводят способом фагового дисплея. Для этого бактерии, содержащие библиотеку, выращивают в селективной среде и инфицируют фагом-помощником. Фаг-помощник обеспечивает ферменты и другие белки для сборки новых рекомбинантных фагов, которые содержат scFv, слитый с его белком оболочки p3. После продукции рекомбинантные фаги, реагирующие с TG2, подвергают селекции с покрытыми антигеном-белком TG2 иммунотрубками, которые имеют поверхность Maxisorp (DAKO). Этот антиген содержит неизмененный целиакальный эпитоп. Непокрытую поверхность блокируют буфером, содержащим бычий сывороточный альбумин, и в иммунотрубки добавляют фаги с тем же блокирующим раствором. Фаги, которые содержат специфичный к TG2 scFv на их поверхности, связываются с покрытым антигеном. Затем эти фаги элюируют с иммунотрубки с помощью бактерий DH5ΔF', выращенных в течение ночи из посеянных бактерий и собранных на следующие сутки в качестве 1 продукта селекции. Второй и последующие раунды селекции проводят (выращивание бактерий из предшествующего продукта и с теми же стадиями, что и в первом раунде) для увеличения специфичности клонов, с использованием белков TG2 - предпочтительно мутантов E или RE, полученных авторами изобретения - в которых изменен целиакальный эпитоп, с последующим выращиванием только бактерий, которые содержат вставки, специфичные для неизмененного TG2, но не для белка TG2 с измененным целиакальным эпитопом. Таким образом, специфично отбирают клоны, содержащие антитела, нацеленные на желаемый эпитоп TG2, а затем далее выращивают их на селективной среде, в то время как клоны, реагирующие с другими эпитопами TG2, отбраковывают. Специфичность клонов к эпитопу подтверждают с помощью ELISA с использованием продуцированных антител, охарактеризованных способом дактилоскопической ПЦР и с помощью расщепления ферментами рестрикции. На планшеты для ELISA наносили полноразмерный рекомбинантный белок TG2 и мутантные белки TG2 человека, а затем инкубировали их с фагами. Детекцию связывания проводят с помощью антитела против фага M13, конъюгированного с пероксидазой (GE Healthcare), проявляют с помощью тетраметилбензидина и реакцию останавливают серной кислотой. Считывание величин поглощения проводят при OD450 на спектрофотометре.

ПРИМЕР 10

КОНКУРЕНТНЫЙ ELISA ДЛЯ ОЦЕНКИ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ ПАЦИЕНТА В ОТНОШЕНИИ СПЕЦИФИЧНОСТИ К ЭПИТОПУ

Антитела против TG2 в образцах пациентов могут вызывать диагностические трудности либо вследствие того, что может быть трудной детекция их класса антител (такого как IgM), либо вследствие того, что их специфичность к эпитопу является неясной. Для получения результата для специфичных к заболеванию антител, авторы изобретения разработали два типа конкурентного ELISA, где оценивали связывание антител пациентов с антигеном TG2 с неизмененным целиакальным эпитопом в присутствии и в отсутствие тестового антитела, препятствующего связыванию антитело пациента-целиакальный антиген на уровне эпитопа. Для применения ELISA изотип тестового антитела отличался от антитела, подлежащего определению.

a) В первом типе ELISA в качестве конкурентного тестового антитела использовали моноклональное антитело 885, имеющее частично перекрывающийся эпитоп с антителами пациентов, в избытке и остаточное связывание целиакальных IgA-антител пациента с TG2 дикого типа измеряли, как описано в примере 9. Перед добавлением 885 вместе с антителами пациента проводили эксперимент по оптимизации. Количество TG2, нанесенного на планшет, минизировали так, чтобы, тем не менее, получить при данном разведении антител пациента сигнала приблизительно O.D. 0,8-1,0, с которым можно было сравнить снижение. Авторы изобретения продемонстрировали, что в этих условиях эффект вытеснения был дозозависимым: 90,6%, 85%, 64% при снижении количеств 885 и в отношении образца одного и того же пациента, таким образом в присутствии 885 связывались только 9,3%, 15% и 36% антител пациента. В одном варианте осуществления этот ELISA также может показать, что если антитело пациента в наибольшей степени вытесняется 885 или сходным тестовым антителом, специфичность к эпитоп исследованного антитела пациента является таковой, что она нацелена на основной составной целиакальный эпитоп, идентифицированный авторами изобретения.

b) Если ELISA проводят так, чтобы количество тестового антитела поддерживалось постоянным и количество связавшегося тестированного антитела измеряют с помощью конъюгата с HRP, снижение сигнала доказывает присутствие конкурирующих специфичных к TG2 антител в образце, обладающих специфичностью к эпитопу целиакального типа. Таким образом, например, неизвестные антитела пациента с каркасами IgG, IgM или IgA можно измерять одновременно с использованием тестового антитела 885 в высоких разведениях, в то время как антитела пациентов находятся в избытке. С использованием надлежащим образом разбавленных антител 885, авторы могли достигнуть того, чтобы в иммунофлуоресцентном тесте с нормальными образцами ткани IgA пациента связывались с антигеном TG2 в эндомизии, в то время как сигнал в отношении связывания Mab 885 снижался (фигура 16). Этот тип ELISA также можно было проводить с использованием известного IgA-класса антител пациента с глютеновой болезнью и измеряя специфичные к глютеновой болезни антитела класса IgG пациентов с дефицитом IgA, как описано в примере 5. Однако конкуренция между двумя целиакальными антителами класса IgA также могла быть показана, если тестовое антитело является меченым (например биотинилированным) и метка специфично распознается.

1. Диагностический способ для диагностики индуцируемого глютеном аутоиммунного заболевания у индивидуума, включающий стадии:
i) предоставление биологического образца, взятого от индивидуума, где указанный образец содержит аутоантитела указанного индивидуума, и необязательно выделение аутоантител из указанного образца,
ii) контактирование аутоантител указанного образца с белком, принадлежащим семейству трансглутаминаз, причем указанный белок имеет неизмененный основной целиакальный эпитоп, и
iii) оценка уровня связывания аутоантител с белком семейства TG как в отсутствие, так и в присутствии тестового соединения, причем указанное тестовое соединение известно тем, что оно способно связываться с основным целиакальным эпитопом, по меньшей мере частично образованным или сформированным
одним или несколькими поверхностным аминокислотным остатком(ами) первой альфа-спирали центрального домена и/или
одним или несколькими поверхностным аминокислотным остатком(ами) первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена
и консервативным мотивом HisHisThr бета-сэндвич-домена,
где если средний уровень связывания аутоантител в отсутствие тестового соединения превышает заданную пороговую величину и если средний уровень связывания аутоантител с эталонным белком в присутствии тестового соединения является значительно более низким, предпочтительно сниженным по меньшей мере на 50% по сравнению с уровнем связывания аутоантител в отсутствие указанного тестового антитела, этот факт считается указывающим на индуцируемое глютеном аутоиммунное заболевание у указанного индивидуума.

2. Диагностический способ для диагностики индуцируемого глютеном аутоиммунного заболевания у индивидуума, включающий стадии:
i) предоставление биологического образца, взятого от индивидуума,
ii) контактирование тестового соединения с белком, принадлежащим семейству трансглутаминаз, причем указанный белок имеет неизмененный основной целиакальный эпитоп и указанное тестовое соединение известно тем, что оно способно связываться с основным целиакальным эпитопом, по меньшей мере частично образованным или сформированным
одним или несколькими поверхностным аминокислотным остатком(ами) первой альфа-спирали центрального домена и/или
одним или несколькими поверхностным аминокислотным остатком(ами) первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена
и консервативным мотивом HisHisThr бета-сэндвич-домена;
iii) оценка уровня тестового соединения с белком семейства TG как в отсутствие, так и в присутствии указанного биологического образца;
где если средний уровень связывания тестового соединения с эталонным белком в присутствии образца является более низким, чем уровень связывания в отсутствие образца, то этот факт указывает на присутствие аутоантител, способных связываться с основным целиакальным эпитопом, и на индуцируемое глютеном аутоиммунное заболевание у указанного индивидуума.

3. Диагностический способ по п.1 или 2, где тестовое соединение представляет собой тестовое антитело или фрагмент, вариант или аналог антитела, известные тем, что они способны связываться с основным целиакальным эпитопом белка, принадлежащего семейству трансглутаминаз, причем указанный белок является аутоантигеном при глютеновой болезни,
где предпочтительно указанное соединение представляет собой Mab885, или его фрагмент, или производное, способные связываться с той же эпитопной областью.

4. Диагностсический набор для диагностики индуцируемого глютеном аутоиммунного заболевания у индивидуума, включающий
a) тестовый белок, принадлежащий семейству трансглутаминаз, в котором боковая цепь и/или пространственное положение по меньшей мере одного поверхностного аминокислотного остатка, являющегося частью основного целиакального эпитопа, изменены по сравнению с эталонным белком, в котором основной целиакальный эпитоп является неизмененным,
где указанный по меньшей мере один поверхностный аминокислотный остаток основного целиакального эпитопа содержит или выбран из
поверхностного аминокислотного остатка первой альфа-спирали центрального домена, предпочтительно первого аминокислотного остатка указанной альфа-спирали, и/или
поверхностного аминокислотного остатка первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена и поверхностного аминокислотного остатка консервативного мотива HisHisThr бета-сэндвич-домена, предпочтительно шестого аминокислотного остатка указанной альфа-спирали и/или первого аминокислотного остатка указанного мотива HisHisThr,
и где центральный домен имеет свернутую трехмерную структуру, и
b) эталонный белок принадлежащий семейству трансглутаминаз, причем указанный белок имеет неизмененный основной целиакальный эпитоп, и/или носитель, содержащий инструкции по предоставлению и применению эталонного белка принадлежащего семейству трансглутаминаз, причем указанный белок имеет неизмененный основной целиакальный эпитоп, и, необязательно,
средства для взятия или обработки биологического образца от индивидуума, где указанный образец содержит аутоантитела указанного индивидуума и/или
средства для выделения аутоантител из указанного образца и/или
средства для оценки уровня связывания и/или кинетики аутоантител в отношении белков.

5. Диагностический набор по п.4, где первый аминокислотный остаток указанной первой альфа-спирали центрального домена представляет собой аминокислотный остаток, соответствующий или эквивалентный Glu153, пронумерованному согласно нумерации аминокислот полноразмерной TG2 человека на основе выравнивания аминокислотных последовательностей, и/или
шестой аминокислотный остаток указанной первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена представляет собой аминокислотный остаток, соответствующий или эквиалентный Arg19, пронумерованному согласно нумерации аминокислот полноразмерной TG2 человека на основе выравнивания аминокислотных последовательностей, и/или
первый аминокислотный остаток мотива HisHisThr указанной первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена представляет собой аминокислотный остаток, соответствующий или эквивалентный His22, пронумерованному согласно нумерации аминокислот полноразмерной TG2 человека на основе выравнивания аминокислотных последовательностей, где предпочтительно
a) тестовый белок представляет собой мутантную трансглутаминазу (TG), предпочтительно мутантную TG2, TG3 или TG6, и
b) эталонный белок представляет собой TG дикого типа, предпочтительно TG2, TG3 или TG6 дикого типа.

6. Диагностический набор по п.4 или 5, где в указанном тестовом белке, принадлежащем семейству трансглутаминаз, боковая цепь или пространственное положение по меньшей мере одной дополнительной аминокислоты изменены по сравнению с эталонным белком, в котором основной целиакальный эпитоп является неизмененным,
где предпочтительно указанная дополнительная аминокислота выбрана из группы из аминокислотных остатков, соответствующих или эквивалентных Arg151, Glu153, Glu154, Arg156, Arg19, His22, Val431, Arg433, Glu435, Met659, Leu661, пронумерованным согласно нумерации аминокислот полноразмерной TG2 человека на основе многократного выравнивания последовательностей.

7. Диагностический набор по п.4, где средство для оценки уровня связывания включает планшет, имеющий лунки, где первая часть лунок покрыта эталонным белком, предпочтительно TG2 или TG6 дикого типа, и вторая часть лунок покрыта по меньшей мере одним тестовым белком, предпочтительно по меньшей мере одним мутантом TG2 или TG6.

8. Диагностический набор для диагностики индуцируемого глютеном аутоиммунного заболевания у индивидуума, включающий
a) эталонный белок, принадлежащий семейству трансглутаминаз, причем указанный белок имеет неизмененный основной целиакальный эпитоп, где центральный домен указанного эталонного белка имеет свернутую трехмерную структуру, и/или носитель, содержащий инструкции по предоставлению и применению указанного эталонного белка, принадлежащего семейству трансглутаминаз, и
b) тестовое соединение, известное тем, что оно способно связываться с основным целиакальным эпитопом указанного эталонного белка, принадлежащего семейству трансглутаминаз, причем основной целиакальный эпитоп по меньшей мере частично образованным или сформированным
одним или несколькими поверхностным аминокислотным остатком(ами) первой альфа-спирали центрального домена и/или
одним или несколькими поверхностным аминокислотным остатком(ами) первой альфа-спирали бета-сэндвич-домена и консервативным мотивом HisHisThr бета-сэндвич-домена;
и необязательно
средства для взятия или обработки биологического образца от индивидуума, где указанный образец содержит аутоантитела указанного индивидуума и/или
средства для выделения аутоантител из указанного образца и/или
средства для оценки уровня связывания и/или кинетики тестового белка в отношении эталонного белка.

Группа изобретений относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Способ идентификации модуляторов катехол о-метилтрансферазы // 2535125

Изобретение относится к медицине и описывает способ идентификации модуляторов активности фермента катехол-O-метилтрансферазы (СОМТ), включающий а) получение 4-нитрокатехола, ковалентно связанного с Alexa Fluor® 488, б) приведение в контакт молекулы из этапа а) с ферментом катехол-O-метилтрансферазой (COMT), S-аденозилметионином (SAM) и соединением-кандидатом и в) измерение показателей флуоресценции смеси из этапа б), в котором измененные показатели флуоресценции в присутствии соединения-кандидата по сравнению с контролем являются признаком наличия модулятора фермента катехол-O-метилтрансферазы (COMT).

Способ дифференциальной диагностики стадий хронизации вирусного гепатита с у подростков // 2528911

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, инфектологии и гепатологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики стадий хронизации вирусного гепатита С у подростков.

Способ прогнозирования неблагоприятного исхода гипертрофической кардиомиопатии // 2527768

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования неблагоприятного исхода гипертрофической кардиомиопатии. Методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) в крови пациента определяют величины тканевого ингибитора металлопротеиназы 1 (TIMP 1) и терминального фрагмента мозгового натрийуретического пептида (NT pro BNP).

Способ диагностики онкологических заболеваний и иммуноферментный набор для его осуществления // 2522231

Группа изобретений относится к области медицинской диагностики, иммунологии и онкологии, в частности к новым онкомаркерам и способам диагностики онкологических заболеваний.

Высокочувствительный способ определения иммуноглобулин-протеиназной активности с использованием полимерных матриц // 2519071

Изобретение относится к области биохимии и предназначено для определения IgG-протеиназной активности. В лунках полистиролового планшета сорбируют полимерные матрицы небелковой природы - ДНК, хитин, затем в лунки добавляют специфические к этой матрице IgG и раствор, содержащий протеолитические ферменты.

Способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроогранизмов к антибиотикам на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический дигуанозинмонофосфат // 2518249

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам и факта присутствия бактериальных биопленок на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический дигуанозинмонофосфат, с пороговой чувствительностью 50 пг/мл, включающий: 1) выделение фосфодиэстеразы-мишени из лизированных бактериальных клеток; 2) связывание фосфодиэстеразы биотинилированными антителами, специфичными к некаталитическим доменам фосфодиэстеразы; 3) аффинную очистку комплексов, сформированных фосфодиэстеразой-мишенью и биотинилированным антителом при помощи парамагнитных частиц, содержащих нейтравидин или его аналоги, связывающие биотин; 4) взаимодействие комплексов фосфодиэстераза/биотинилированное антитело, иммобилизованных на парамагнитных частицах, с комплексами, содержащими с-di-GMP в форме G-квадруплексов с интеркалированным красителем, сопровождающееся падением интенсивности флуоресценции по мере разрушения комплексов интеркалирующего красителя c-di-GMP; 5) измерение падения флуоресценции при гидролизе c-di-GMP и разрушении комплекса c-di-GMP с интеркалирующим красителем с последующим количественным определением активности фосфодиэстеразы на основании калибровочных кривых, построенных с использованием известных количеств рекомбинантного фермента фосфодиэстеразы, идентичного исследуемой мишени; 6) выявление повышенного уровня фосфодиэстеразной активности, обнаруживаемого тестируемыми антибиотикоустойчивыми бактериальными штаммами, способными к формированию биопленок, по сравнению с уровнем фосфодиэстеразной активности, обнаруживаемым для контрольных штаммов бактерий того же вида, не обладающих антибиотикоустойчивостью и способностью к формированию биопленок.

Способы созревания фолликулов яичника in vitro // 2492866

Группа изобретений относится к медицине, фармакологии, к способам и композициям ингибиторов фосфатазы PTEN для созревания овариальных фолликулов и ооцитов in vitro. Использование ингибиторов фосфатазы PTEN, таких как комплексы оксованадата и пероксованадата: биспероксо (бипиридин) оксованадат, биспероксо (1,10-фенантролин) оксованадат, биспероксо (пиколинато) оксованадат, биспероксо (5-гидроксипиридин-2-карбоксил) оксованадат, ди-(пиколинат) оксованадат, ди-(3-гидроксипиколинат) оксованадат, биспероксо (фенилбигуанид) оксованадат, ди-(фенилбигуанид) оксованадат и биспероксо (изохинолинкарбоновой кислоты) оксованадат, обеспечивает созревание и/или активацию in vitro ооцитов и фолликулов, таких как примордиальные, промежуточные и первичные фолликулы.

Композиция реагентов для постановки ксантиноксидазной реакции // 2488120

Изобретение относится к химическим композициям реагентов. .

Способ оценки степени цитолиза кардиомиоцитов при инфекционных поражениях миокарда // 2487361

Изобретение относится к лабораторной диагностике осложнений инфекционных болезней и может быть использовано для оценки степени выраженности цитолиза кардиомиоцитов при поражениях миокарда, развивающихся на фоне различных острых инфекционных заболеваний.

Экспресс-способ определения холестерина в иммунных комплексах // 2530627

Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано для экспресс-определения холестерина в иммунных комплексах (ХИК). Сущность изобретения состоит в том, что преципитат иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности, из сыворотки крови человека, готовят путем обработки 0,01 М Трис-HCl-буфером, содержащим 8,3%-ный ПЭГ 3350, 3,3%-ный ПВП 12600 и 0,15 М NaCl, pH 7,4 в соотношении 1:1,2.

Иммунологический тест для определения аутоантител против антигенов семенников // 2528060

Настоящее изобретение относится к иммунологическому тесту для обнаружения и специфического определения аутоантител против антигенов семенников, которые присутствуют при воспалительных заболеваниях половой системы самцов млекопитающих, в биологическом образце самца млекопитающего, в частности для обнаружения тестикулярных аутоантител к ER-60 и/или трансферриновых аутоантител.

Улучшенные способы иммуноанализа // 2416095

Изобретение относится к области медицины и касается улучшенных способов иммуноанализа для выявления болезненного состояния или предрасположенности к заболеванию у млекопитающего.

Способ оценки риска развития и предрасположенности к развитию патологии, ассоциированной с присутствием аутоантител против epcr // 2375716

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к иммунодиагностике. .

Анализ нейтрализующих антител и его применение // 2370775

Изобретение относится к медицине и биохимии и касается способа обнаружения нейтрализующих антител к терапевтическому антителу, такому как антитело против CD20. .

Способ диагностики рассеянного склероза // 2369874

Изобретение относится к медицине, а именно, к медицинской диагностике. .

Способ оценки тяжести преэклампсии у беременных // 2250468

Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано для оценки тяжести преэклампсии у беременных. .

Способ диагностики аутоиммунных поражений печени у больных хроническими гепатитами // 2247387

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для диагностики аутоиммунных поражений печени у больных хроническими гепатитами. .

Способ прогнозирования преходящего неонатального гипотиреоза у детей от матерей с эндемическим зобом // 2237247

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования преходящего неонатального гипотиреоза у детей, родившихся от матерей с эндемическим зобом.

Способ прогнозирования результата коррекции венозной недостаточности при варикозной болезни // 2225986

Изобретение относится к медицине, а именно к флебологии, и может быть использовано для прогнозирования результата коррекции венозной недостаточности при варикозной болезни.

Способ прогнозирования часто рецидивирующего течения хронического панкреатита у женщин с отягощенным анамнезом // 2547582

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования часто рецидивирующего течения хронического панкреатита. Определяют концентрацию цитокинов МСР-1 и G-CSF в сыворотке крови.