Биодеградируемые аргининсодержащие полимеры

Изобретение относится к биодеградируемому синтетическому полимеру, а именно к полимеру общей формулы (I)

,

где ^NA имеет структуру:

,

A^N имеет структуру:

,

где n - целое число >2; Z либо отсутствует, либо является остатком аминокислоты -NH-(CH₂)_i-СО-, где i - целое число от 1 до 5; D представляет собой линейный или разветвленный алкил C₁-C₅ либо бензил; B представляет собой остаток алифатического диамина -NH-(CH₂)_k-NH-, где k - целое число от 2 до 6; X и Y могут одновременно принимать следующие значения: Х=H-B, Y=H, либо X=N_α-(D-OCO)-L-аргинил-Z-B, Y=N_α-(D-OCO)-L-аргинил-Z, либо X=R¹-A^N-B, Y=^NA-R¹, где R¹ представляет собой карбоксамидоалкил вида H₂NCO-CH₂- или H₂NCO-СН₂СН₂-. Такой полимер способен осуществлять доставку природного L-аргинина в ткани человека, животных, через биологические мембраны и может быть использован как самостоятельно, так и в сочетании с другими активными началами. Изобретение позволяет получить полимер, растворимый в воде, который не обладает цитотоксичностью и повышает уровень оксида азота в тканях человека и животных. 2 табл., 7 пр.

 

Изобретение относится к области биодеградируемых синтетических полимеров, а именно, к аргинин-содержащим биодеградируемым полимерам, способным осуществлять доставку природного L-аргинина в ткани человека и животных и через биологические мембраны.

Изобретение, в частности, относится

1) к полимерам общей формулы

где n - целое число >2;

^NA имеет структуру:

A^N имеет структуру:

при этом Z либо отсутствует, либо является остатком аминокислоты -NH-(CH₂)_i-СО-, где i - целое число от 1 до 5; D представляет собой линейный или разветвленный алкил C₁-С₅, либо бензил;

В представляет собой остаток алифатического диамина -NH-(CH₂)_k-NH-, где k - целое число от 2 до 6;

X и Y могут одновременно принимать значения:

Х=Н-В, Y=H;

X=N_α-(D-OCO)-L-аргинил-Z-B, Y=N_α-(D-OCO)-L-аргинил-Z;

X=R¹-A^N-B, Y=^NA-R¹,

где R¹ есть карбоксамидоалкил вида H₂NCO-CH₂- или H₂NCO-СН₂СН₂-,

2) к солям полимеров указанной общей формулы (1) с фармацевтически приемлемыми кислотами.

L-Аргинин - природная условно-незаменимая аминокислота, которая входит в состав белков и пептидов и является одним из ключевых метаболитов в процессах азотистого обмена в организме (орнитиновый цикл у позвоночных). Через промежуточное образование α-кетоглутарата L-аргинин включается в цикл трикарбоновьгх кислот и, тем самым, в основные анаболические (окислительное фосфорилирование) и метаболические (глюко-неогенез) процессы в клетке. Важнейшая и уникальная роль L-аргинина состоит в том, что он является единственным источником азота для биосинтеза оксида азота (NO) [Nelson D, Сох М. Lehninger Principles of Biochemistry, 5^th Ed. WH Freeman, N.-Y., 2008].

Оксид азота - двухатомная молекула с высокой реакционной способностью. NO легко диффундирует в ткани, но обладает коротким временем жизни (t_½=3-5 с), так как быстро инактивируется оксигемоглобином [Morris SM Jr, Billiar TR. New insights into the regulation of inducible nitric oxide synthesis. Am J Physiol. (1994) 266: E829-E839]. NO имеет важное значение в физиологии млекопитающих и отвечает за разнообразные функции, в том числе, за сосудистый тонус, состояние и функционирование эндотелия, активацию растворимой гуанилат-циклазы, нервную проводимость в центральной и периферической нервной системе, а также за цитотоксичность активированных макрофагов. Будучи идентифицирован как эндотелиальный фактор релаксации, оксид азота играет ключевую роль в сосудистой релаксации во всем организме и является антагонистом эндотелина-1, сильнейшего вазоконстриктора млекопитающих [Palmer RM, Ferrige AG, Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature (1987) 327: 524-526]. Функция NO заключается в активации растворимой гуанилат-циклазы, в результате происходит повышение внутриклеточного уровня цикло-ГМФ и активация циклоГМФ-зависимых протеинкиназ. Протеинкиназы, в свою очередь, обеспечивают сосудорасширительные эффекты и снижение тонуса кровеносных сосудов. К другим функциям NO можно отнести блокирование прилипания и агрегации тромбоцитов, ингибирование пролиферации клеток гладкомышечной ткани и прилипания лейкоцитов. Таким образом, оксид азота можно рассматривать как паракринный фактор широкого спектра действия, как ингибитор стеноза, рестеноза, сосудистого воспаления, пролиферации сосудистых клеток, тромбоза, атеросклероза и артериосклероза.

Оксид азота синтезируется в клетках из L-аргинина как субстрата при действии ферментов, принадлежащих к семейству NO-синтаз (nitric oxide synthase; NOS). При этом из L-аргинина при участии молекулярного кислорода и NADP-H образуется L-цитруллин и NO. Существует несколько изоформ NOS: эндотелиальная NO-синтаза (eNOS), макрофагальная (индуцибельная) NO-синтаза (iNOS) и нейрональная NO-синтаза (nNOS). Несмотря на наименование, eNOS обнаруживается не только в эндотелиальной ткани сосудов, но и в эпителиальных тканях, в том числе в бронхиальных клетках, и в нейронах головного мозга. С другой стороны, iNOS проявляется не только в макрофагах, но и в гепатоцитах, хондроцитах, клетках эндотелия и фибробластах, в частности, в условиях повреждения эндотелия или как реакция на травму [см., например: Thippeswamy Т, McKay JS, Quinn JP, Morris R. Nitric oxide, a biological double-faced janus--is this good or bad? Histol Histopathol. 2006; 21 (4): 445-58].

Изоформы NOS также классифицируются как конститутивные (eNOS и nNOS) или индуцибельные (iNOS). Конститутивные NO-синтазы (cNOS) постоянно присутствуют в клетках и активны при достаточных концентрациях внутриклеточного кальция, производя некоторый базовый уровень оксида азота в тканях [Yamada М., J Cereb Blood Flow Metab. (2000); 20 (4): 709-17]. iNOS, напротив, не зависит от кальция и в норме в клетках отсутствует, но ее экспрессия может быть индуцирована липополисахаридами и некоторыми цитокинами. iNOS способна производить пиковые уровни NO, намного превышающие физиологические базовые уровни, генерируемые cNOS. При ограниченной доступности исходного L-аргинина это может приводить к токсическим эффектам и повреждению тканей. Индукция iNOS может блокироваться глюкокортикоидами и некоторыми цитокинами [Geller DA, Nussler АК, DiSilvio М, Lowenstein О, Sharpiro RA, Wang SC, et at. Cytokines, endotoxin, and glucocorticoids regulate the expression of inducible nitric oxide synthase in hepatocytes. Proc Natl Acad Sci USA (1993); 90: 522-526].

Генерация физиологического базового уровня NO при действии cNOS, особенно eNOS, является важнейшим фактором гомеостаза практически всех тканей организма. Постоянный синтез NO поддерживает, в частности, целостность и функциональную активность сосудистого эндотелия, обеспечивает адекватное регулирование кровяного давления и тонуса сосудов, препятствует развитию атеросклероза, артериосклероза, тромбоза, ишемии, рестенозов, гиперлипидемии.

Конститутивный биосинтез NO регулируется рядом разнонаправленных факторов, в том числе: а) функциональным состоянием eNOS (внутриклеточная локализация фермента, наличие кофакторов - NADP-H, тетрагидробиоптерина); б) уровнем внутриклеточного кальция; в) концентрацией субстрата - L-аргинина; г) концентрациями эндогенных ингибиторов eNOS - асимметричного N,N-диметиларгинина (ADMA) и N-монометиларгинина (NMMA); д) активностью конкурирующего фермента - аргиназы, расщепляющей L-аргинин на L-орнитин и мочевину [Braam В., Verhaar МС. Understanding eNOS for Pharmacological Modulation of Endothelial Function: A Translational View. Curr Pharm Des (2007), 13: 1727-1740].

В нормальных физиологических условиях, при достаточном поступлении эндогенного и экзогенного L-аргинина, все эти факторы сбалансированы и обеспечивают адекватный уровень биосинтеза оксида азота. При этом внутриклеточная концентрация субстрата существенно превышает значение K_m (константы Михаэлиса) для eNOS, поэтому на базовый уровень синтеза NO кратковременные колебания внеклеточных концентраций L-аргинина влияют незначительно [Pollock JS, Forstermann U, Mitchell JA, Warner TD, Schmidt HH, Nakane M, et al. Purification and characterization of particulate endothelium-derived relaxing factor synthase from cultured and Native bovine aortic endothelial cells. Proc Natl Acad Sci USA (1991); 88: 10480-10484; Harrison, DG. Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction J. Clin. Invest. (1997) 100: 2153-2157].

Однако, в некоторых условиях локальные внутриклеточные концентрации L-аргинина оказываются недостаточными и становятся скорость-лимитирующим фактором для биосинтеза NO. Такими условиями могут быть локальные воспаления; повышенные уровни ингибитора eNOS ADMA в тканях и плазме крови; повышенная экспрессия и активность аргиназы; действие индукторов iNOS, например, интерлейкина-1 и липополисахаридов [Wu G, Morris SM Jr. Arginine metabolism: nitric oxide and beyond. Biochem J. (1998) 336: 1-17]. Сдвиг внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса (окислительный стресс) и повышение продукции супероксид-аниона и других активных форм кислорода (АФК) даже при относительно высоких уровнях L-аргинина может приводить к значительному снижению биодоступности NO, так как АФК окисляют NO в цитотоксичный пероксинитрит и инактивируют NO-синтазу [Higashi Y, Noma K, Yoshizumi М, Kihara Y. Endothelial function and oxidative stress in cardiovascular diseases. Circ J. (2009); 73 (3): 411-8].

Дефицит продукции NO является одной из основных причин нарушения функции и повреждения эндотелия кровеносных сосудов и патофизиологическим фактором различных метаболических расстройств и связанных с ними сердечно-сосудистых заболеваний - атеросклероза, артериосклероза, тромбоза, ишемии, гиперлипидемии. Расстройство эндотелий-зависимой релаксации сосудов также связано с такими заболеваниями, как почечная недостаточность, сердечная недостаточность, легочная гипертензия, с рестенозами, явлениями ишемии/реперфузии различной природы [Vane JR, Anggard ЕЕ, Botting RM. Regulatory functions of the vascular endothelium. N Engl J Med (1990); 323: 27-36].

Таким образом, желательно иметь возможность увеличить эффективные концентрации оксида азота в клетках, тканях, органах, чтобы обеспечить адекватную релаксацию, расширение кровеносных сосудов, васкуляризацию, оксигенацию тканей и другие физиологические процессы, опосредованные NO, и располагать для этого соответствующими лекарственными средствами. Известными средствами для этой цели являются доноры NO, такие как тринитрат глицерина, изосорбиддинитрат, тетранитрат пентаэритрита и др., широко применяемые как системно, так и локально. Однако, серьезными недостатками доноров NO являются: трудность локального применения из-за высокой проникающей способности органических нитратов в тканях, развитие толерантности к нитратам, а также значительный риск вызвать тяжелую системную гипотензию практически при любом способе введения препаратов [Horowitz JD. Nitrovasodilators. In: Contemporary Cardiology, vol.4: Nitric Oxide and the Cardiovascular System, J. Loscalzo and J. Vita, Eds. Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2000, pp.383-409].

В качестве средства для повышения уровня оксида азота в организме описано применение мономерного L-аргинина. В отличие от органических нитратов, поступающий извне L-аргинин способен генерировать NO, лишь проникая в клетку и вовлекаясь в метаболический путь с участием NO-синтаз. Основным недостатком экзогенного L-аргинина является его весьма малая биодоступность. Показано, что L-аргинин при пероральном и внутривенном введении нормализует функции эндотелия, обладает вазодилатирующим эффектом, препятствует развитию атеросклероза, рестеноза и тромбоза, улучшает коронарный кровоток, оказывает благоприятное действие на функциональное состояние скелетной мускулатуры. Однако такие эффекты достигались при продолжительном пероральном или внутривенном введении L-аргинина в дозах от 0,1 до 1 г/кг [Maxwell AJ, Cooke JP. L-Arginine: Its Role in Cardiovascular Therapy. In: Contemporary Cardiology, vol. 4: Nitric Oxide and the Cardiovascular System, J. Loscalzo and J. Vita, Eds. Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2000, pp.547-585; Boger RH. L-Arginine therapy in cardiovascular pathologies: beneficial or dangerous? Curr Opin Clin Nutr Metab Care. (2008); 11 (1): 55-61]. Описано также использование L-аргинина в высоких концентрациях (до 20% по массе) в составе композиций для топического применения: с целью заживления ран [US 20030091601 Use of topical arginine to enhance wound healing; WO 2010100063 Topical pharmaceutical composition comprising an antiseptic and arginine for wound healing]; для лечения глаукомы [US 5364884 Arginine compounds as ocular hypotensive agents], геморроидальных болей [US 5595753 Topical formulations and methods for treating hemorrhoidal pain and sphincter and smooth muscle spasm in the gastrointestinal tract; US 6159944 Method for treating painful conditions of the anal region and compositions therefor; US 6627632 Compositions and methods for the treatment of anorectal disorders; US 6833139 Composition and method for the treatment of anorectal disorders], сексуальной дисфункции [US 7128930 Compositions and methods for treating sexual dysfunction; US 7214390 Topical compositions for enhancing sexual responsiveness]; в качестве лечебно-косметических средств [ЕР 1676570 Topical pharmaceutical compositions comprising L-arginine and uses thereof; US 6716436 Cosmetic composition for slimming containing L-arginine, an L-arginine analogue, or one of their derivatives, for topical application; US 20080045909 Topical Delivery of a Nitric Oxide Donor to Improve and Skin Appearance; US 20100261794 Composition for topical use to achieve a rapid and intense lifting effect].

Известен способ решения проблемы низкой биодоступности экзогенного L-аргинина путем применения пептидных полимеров аргинина, например, поли-L-аргининов. Установлено, что поли-L-аргинины, состоящие не менее, чем из семи остатков аргинина, способны эффективно проникать через клеточные мембраны, в эпителиальные ткани, слизистые оболочки и кожу [Mitchell DJ, Kim DT, Steinman L, Fathman CG, Rothbard JB. Polyarginine enters cells more efficiently than other polycationic homopolymers. J Peptide Res., (2000), 56: 318-325; US 6495663 Method and composition for enhancing transport across biological membranes; US 6593292 Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues]. В данном случае L-аргинин, субстрат для NO-синтазы, образуется в результате внутриклеточной протеолитической деградации поли-L-аргинина. Показано, что высокой проникающей способностью обладают не только полипептиды, состоящие лишь из остатков аргинина (гомополимеры), но и гетерополимеры, кроме остатков аргинина содержащие спейсеры - остатки других α-аминокислот и ω-аминокислот [ЕР 1401473 Transporters comprising spaced arginine moieties; US 7169814 Guanidinium transport reagents and conjugates].

Установлено, что гепта-аргинин (L-R7) проникает в клетки сосудистого эндотелия и стенки сосудов. У венозных шунтов (сегментов яремной вены кролика), перед имплантацией животным обработанных L-R7, наблюдался существенно повышенный базовый уровень синтеза NO и значительно сниженная гиперплазия миоинтимы [Uemura S, Fathman CG, Rothbard JB, Cooke JP., Rapid And Efficient Vascular Transport Of Arginine Polymers Inhibits Myointimal Hyperplasia, Circulation (2000) 102 (21): 2629-35; Uemura S, Rothbard JB, Matsushita H, Tsao PS, Fathman CG, Cooke JP., Short Polymers Of Arginine Rapidly Translocate Into Vascular Cells: Effects On Nitric Oxide Synthesis. Ore J (2002) 66: 1155-1160; Kown MH, Yamaguchi A, Jahncke CI, Miniati D, Murata S, Grunenfelder J, Koransky ML, Rothbard JB, Robbins RC. L-Arginine Polymers Inhibit The Development of Vein Graft Neointimal Hyperplasia, J Thorac Cardiovasc Surg (2001) 121 (11): 971-80; US 6605115 Method and composition for inhibiting cardiovascular cell proliferation].

Для снижения риска трансплантационной коронарной болезни после пересадки сердца предложено предварительно обрабатывать донорские органы растворами поли-L-аргинина (от L-R7L до L-R9) [Kown MH, van Der Steenhoven Т, Uemura S, Jahncke CL, Hoyt GE, Rothbard JB, Robbins RC, L-Arginine Polymer Mediated Inhibition of Graft Coronary Artery Disease After Cardiac Transplantation. Transplantation (2001) 71 (11): 1542-1548; Kown MH, Lijkwan MA, Jahncke CL, Murata S, Rothbard JB, Robbins RC. L-arginine polymers enhance coronary flow and reduce oxidative stress following cardiac transplantation in rats. J Thorac Cardiovasc Surg (2003), 126 (4): 1065-1070; EP 1656945 Pharmaceutical composition comprising oligoarginine].

Предложено использовать гомо- и гетерополимеры L-аргинина в составе композиций для топического применения с целью лечения или профилактики заболеваний, связанных с нарушением функции кровеносных сосудов, в тех случаях, когда терапевтический эффект может быть достигнут локальным повышением уровней оксида азота в тканях и клетках [US 7820626 Compositions and methods for treating diseases], а также в качестве лечебно-косметических средств [ЕР 1482894 Cosmetic formulations containing l-arginine oligomers].

Широкому применению поли-L-аргининов в практике препятствуют некоторые известные проблемы. Во-первых, полимеры аргинина (особенно олигомеры с заданным числом остатков аргинина) весьма дороги. Например, по каталогу швейцарской компании Bachem AG цена L-R7 445 €/25 мг, L-R9 - 951 €/25 мг. Это связано со сложностью химического синтеза таких соединений. Разработан масштабируемый метод синтеза октааргинина (L-R8) из L-орнитина [WO 2003014076 Bi-directional synthesis of oligoguanidine transport agents], однако этот метод также многостадийный и трудоемкий.

Во-вторых, установлено, что олигомеры аргинина являются эффективными ингибиторами ряда внутриклеточных протеолитических ферментов - фурина и других пропротеин-конвертаз (РРС), отвечающих за процессинг полипептидов при биосинтезе белков [Cameron A, Appel J, Houghten RA and Lindberg I. Polyarginines Are Potent Furin Inhibitors. J Biol Chem (2000) 275:36741-36749; Kacprzak MM, Peinado JR, Than ME, Appel J, Henrich S, Lipkind G, Houghten RA, Bode W and Lindberg I. Inhibition of Furin by Polyarginine-containing Peptides. J Biol Chem (2004) 279: 36788-36794; US 7569547 Inhibiting furin with polybasic peptides]. Показано также, что октааргинин способен блокировать активность протеасом - протеиназных комплексов, утилизирующих отслужившие свой срок белковые молекулы [Kloss A, Henklein Р, Siele D, Schmolke М, Apcher S, Kuehn L, Sheppard PW, Dahlmann B. The cell-penetrating peptide octa-arginine is a potent inhibitor of proteasome activities. Eur J Pharm Biopharm. 2009; 72 (1): 219-25]. Указанные эффекты затрагивают фундаментальные метаболические процессы в клетке, могут оказывать значительное влияние на ее жизнедеятельность и, несомненно, требуют внимательного изучения.

Таким образом, существует необходимость в эффективных, безопасных и доступных лекарственных средствах, способных доставлять L-аргинин в ткани и клетки с целью локального повышения в них уровней оксида азота.

Целью предполагаемого изобретения является изыскание новых биодеградируемых полимеров, способных осуществлять доставку природного L-аргинина в ткани человека и животных и через биологические мембраны.

В соответствии с указанной целью, предметом изобретения являются новые полимеры общей формулы

где n - целое число больше 2,

которые могут быть представлены как сополимеры, полученные поликонденсацией N,N′-дизамещенного L-цистина HO-^NA-^AN-ОН (2) и алифатического α,ω-диамина Н-В-Н.

Заместители при N и N′-атомах цистина идентичны и представляют собой пептидил вида N_α-(D-OCO)-L-аргинил-Z, где D есть линейный или разветвленный алкил C₁-С₅ либо бензил, a Z либо отсутствует, либо является спейсерным аминоацильным остатком вида -NH-(CH₂)_i-CO-, где i - целое число от 1 до 5:

В представляет собой остаток алифатического диамина -NH-(CH₂)_k-NH-, где k - целое число от 2 до 6.

Структуры терминальных групп X и Y определяются способом получения полимера. В зависимости от тактической схемы химического синтеза группы X и Y могут одновременно принимать значения:

Х=Н-В,	Y=H;
X=Nα-(D-OCO)-L-аргинил-Z-B,	Y=Nα-(D-OCO)-L-аргинил-Z;
X=R1-AN-B,	Y=NA-R1,

где R есть карбоксамидоалкил вида H₂NCO-CH₂- или H₂NCO-СН₂СН₂-.

Альтернативно, полимеры (1) могут быть представлены как продукты окислительной полимеризации мономера вида Н-A^N-B-^NA-H (3), где H-A^N и ^NA-Н имеют идентичную структуру и представляют собой пептидил вида N_α-(D-ОСО)-L-аргинил-Z-L-цистеинил:

где B, D, Z, а также терминальные группы X и Y принимают указанные выше значения. Полимеры общей формулы (1) могут быть также представлены как линейные цепи, полученные поликонденсацией L-цистина и алифатического α,ω-диамина Н-В-Н, либо окислительной полимеризацией α,ω-бис-L-цистеинил-В, к аминогруппам которых привиты пептидильные остатки вида N_α-(D-OCO)-L-аргинил-Z-.

В соответствии с приведенными.выше представлениями структуры, полимеры формулы (1) могут быть получены путем химического синтеза с использованием разнообразных тактических схем синтеза. Необходимые для этого методические приемы, реагенты, условия реакций известны в химии пептидов и описаны в литературе (Houben-Weyl Methods of Organic Chemistry, Vols. 22a, 22b: Synthesis of Peptides and Peptidomimetics; Goodman M. et al., Eds; Stuttgart - N.-Y.: G.Thieme, 2002).

N,N′-Дизамещенный L-цистин HO-^NA-AN-OH (2) можно получить окислительной димеризацией пептида N_α-(D-OCO)-L-Arg-Z-Cys(R²)-OH при действии кислорода воздуха, перекиси водорода, диметилсульфоксида и других известных окислителей, если R²=Н, или раствора I₂ если R² есть тиол-защитная группа, предпочтительно S-ацетамидометил (Acm) или S-трифенилметил (тритил, Trt). Полученный N,N′-дизамещенный L-цистин (2) вводят в реакцию с алифатическим α,ω-диамином Н-В-Н в стехиометрическом соотношении 1:1 в апротонном растворителе в присутствии конденсирующего агента, по завершении реакции к смеси добавляют избыток α,ω-диамина Н-В-Н и далее известными способами выделяют целевой продукт - полимер формулы (1) в виде соли. В качестве конденсирующих агентов могут быть использованы карбодиимиды, соли фосфония, соли урония и иные агенты, известные для этой цели в химии пептидов. Основным критерием для выбора апротонного растворителя является его способность растворять исходные реагенты и целевой продукт реакции. Полимер формулы (1), полученный описанным выше способом, имеет терминирующие группы X=H-В, Y=Н.

Альтернативно, конденсацией указанного выше пептида N_α-(D-OCO)-L-Arg-Z-Cys(R²)-ОН, где R² есть тиол-защитная группа, с алифатическим α,ω-диамином Н-В-Н в стехиометрическом соотношении 2:1 в апротонном растворителе в присутствии конденсирующего агента получается соединение вида R²-A^N-В-^NA-R² (S-защищенный мономер). Полученное соединение путем отщепления тиол-защитных групп R² известными способами можно превратить в мономер Н-A^N-В-^NA-Н (3), далее подвергнуть его окислительной полимеризации при действии кислорода воздуха, перекиси водорода, диметилсульфоксида и других известных окислителей и получить полимер формулы (1). Остаточные тиольные группы блокируются алкилированием при действии алкилирующих реагентов, например, акриламида или α-бромацетамида. Полимер формулы (1), полученный описанным выше способом, имеет терминирующие группы X=R¹-A^N-B, Y=^NA-R¹, где R¹ есть карбоксамидоалкил вида H₂NCO-CH₂- или H₂NCO-СН₂СН₂-. Если R²=Acm или Trt, то S-защищенный мономер можно непосредственно подвергнуть полимеризации, используя в качестве окислителя раствор I₂.

Пептид N_α-(D-OCO)-L-Arg-Z-Cys(R²)-OH, в свою очередь, может быть получен известными методами твердофазного или растворного синтеза пептидов из исходного сложного эфира L-цистеина H-Cys(R²)-OR³ путем последовательного присоединения по α-аминогруппе остатков Z и Arg в виде N_α-защищенных производных. N_α-3ащитные группы для этой цели подбирают таким образом, чтобы их можно было селективно удалить, не затрагивая защитные группы R² и R³. Исходя из сочетания групп R² и R³, N_α-защитные группы выбирают из числа известных защитных групп уретанового типа.

Для твердофазного синтеза предпочтительно использовать R²=Trt или Acm, R³=2хлор-тритил-полимер, в качестве N_α-защиты - удаляемую основаниями по механизму β-элиминирования 9-флуоренилметоксикарбонильную (Fmoc), либо 2-(4-нитрофенилсульфонил)-этоксикарбонильную (Nsc) группу. После завершения сборки пептидной цепи и удаления N_α-защиты с остатка Arg, пептидил-полимер обрабатывают для введения группы N_α-(D-ОСО)-соответствующим активированным карбонатом D-ОСО-R⁴, где R⁴ может быть N-сукцинимидилокси-, 4-нитрофенокси-, пентафторфенокси- или иной активированной группой. Остаток аргинина может быть также введен в синтез сразу в виде N_α-(D-OCO)-L-Arg-OH. Целевой пептид N_α-(D-OCO)-L-Arg-Z-Cys(R²)-OH отщепляют с полимера и выделяют известными способами.

Для синтеза пептида в растворе можно использовать R²=Acm, R³ = низший алкил (метил, этил) или бензил, в качестве N_α-защиты - кислотолабильную трет-бутоксикарбонильную (Boc), либо 4-метоксибензилоксикарбонильную (MeOZ) группу. Остаток аргинина предпочтительно вводить в виде N_α-(D-OCO)-L-Arg-OH. После сборки защищенного эфира пептида целевой продукт N_α-(D-OCO)-L-Arg-Z-Cys(R²)-OH получают щелочным омылением С-концевой сложноэфирной группы.

Другой тактический подход к синтезу полимеров формулы (1) заключается в предварительной сборке линейной полимерной цепи, а именно, сополимера L-цистина и алифатического α,ω-диамина Н-В-Н, и последующей прививке к свободным аминогруппам полимерной цепи пептидильных остатков вида N_α-(D-ОСО)-L-аргинил-Z-.

Указанный линейный полимер может быть получен поликонденсацией N,N′-защищенного L-цистина вводят с алифатическим α,ω-диамином Н-В-Н в стехиометрическом соотношении 1:1 в апротонном растворителе в присутствии конденсирующего агента. По завершении реакции к смеси добавляют избыток α,ω-диамина Н-В-Н и далее известными способами выделяют линейный полимер с амино-защищенными остатками цистина. Амино-защитные группы для цистина могут быть выбраны из числа известных кислотолабильных уретановых групп, например, Boc или MeOZ. В качестве конденсирующих агентов могут быть использованы карбодиимиды, соли фосфония, соли урония и иные агенты, известные для этой цели в химии пептидов. Основным критерием для выбора апротонного растворителя является его способность растворять исходные реагенты и целевой продукт реакции. Линейный полимер, полученный описанным выше способом, имеет на концах свободные аминогруппы.

Для полного деблокирования аминогрупп в остатках цистина полимер обрабатывают кислотным реагентом, например, трифторуксусной кислотой и выделяют деблокированный линейный полимер в виде соли, в данном случае, в виде трифторацетата.

Полученный деблокированный линейный полимер вводят в реакцию с пептидом N_α-(D-ОСО)-L-аргинил-Z-ОН, взятом в 5-20% эквивалентном избытке по отношению к свободным аминогруппам линейного полимера, в апротонном растворителе в присутствии конденсирующего агента и далее выделяют известными способами целевой продукт - полимер формулы (1) в виде соли, имеющий в данном случае терминирующие группы X=N_α-(D-OCO)-L-аргинил-Z-B; Y=N_α-(D-OCO)-L-аргинил-Z.

Указанный линейный полимер может быть также получен окислительной полимеризацией мономера - N,N′-бис[R⁵-Cys(R²)]B, где R⁵ есть уретановая N_α - защитная группа, например, BOc или MeOZ, а R² - атом водорода, либо тиол-защитная группа, предпочтительно Trt или Acm. Данный мономер получают путем конденсации защищенного цистеина R⁵-Cys(R²)-OH (R²≠Н) с алифатическим α,ω-диамином Н-В-Н в стехиометрическом соотношении 2:1 в апротонном растворителе в присутствии конденсирующего агента. Далее тиол-защитную группу R² селективно удаляют известными способами, и полученный мономер со свободными SH-группами (R²=Н) полимеризуют при действии кислорода воздуха, перекиси водорода, диметилсульфоксида и других известных окислителей, либо S-защищенный мономер (R=Acm или Trt) непосредственно подвергают окислительной полимеризации при действии раствора I₂. Остаточные тиольные группы блокируются алкилированием при действии алкилирующих реагентов, например, акриламида или α-бромацетамида. Амино-защищенный линейный полимер, полученный описанным выше способом, имеет на концах карбоксамидоалкильные группы R¹.

Далее полученный линейный полимер деблокируют, конденсируют с пептидом N_α-(D-OCO)-L-аргинил-Z-ОН, как описано выше, и получают полимер формулы (1), имеющий терминирующие группы X=R¹-A^N-В, Y=^NA-R¹, где R¹ есть карбоксамидоалкил вида H₂NCO-CH₂- или H₂NCO-СН₂СН₂-.

Если Z является остатком аминокислоты -NH-(CH₂)_i-СО- (i - целое число от 1 до 5), то дипептид N_α-(D-OCO)-L-аргинил-Z-OH может быть получен способами, известными в химии пептидов, например, конденсацией N_α-(D-OCO)-L-Arg-OH и сложного эфира аминокислоты H-Z-OR⁶ (R⁶=метил, этил, бензил) с последующим щелочным омылением или каталитическим гидрогенолизом сложноэфирной группы.

Приведенные выше варианты тактических схем синтеза полимеров формулы (1) из доступного сырья содержат небольшое число технически несложных химических стадий и могут служить основой для разработки эффективных и масштабируемых технологий синтеза.

Полимеры формулы (1) являются поликатионными соединениями и получаются в процессе химического синтеза в виде солей, растворимых в воде и водно-органических растворителях. Отделение низкомолекулярных примесей и переведение полимеров в желаемую фармацевтически приемлемую солевую форму может быть произведено известными методами - путем ионного обмена, диализа, ультрафильтрации, либо сочетания этих методов. Для получения полимеров в твердой форме можно использовать осаждение органическими растворителями, лиофильную или распылительную сушку.

Физико-химические свойства полимеров формулы (1) (растворимость, гидрофильность/гидрофобность, плотность заряда, жесткость полимерной цепи, гидролитическая устойчивость и пр.) и связанные с ними биологические свойства (например, способность проникать через клеточные мембраны и в ткани, скорость биодеградации, цитотоксичность) в значительной степени зависят от вариабельных элементов структуры B, D, Z, а также от солевой формы (природы противоиона). Это дает возможность путем подбора указанных структурных элементов и противоиона целевым образом придавать полимеру свойства, желаемые для решения конкретных задач.

Молекулярные массы полученных полимеров формулы (1) существенным образом зависят не только от строения B, D, Z, но и от тактических схем и методических приемов, использованных при синтезе. Образцы полимеров, синтезированные авторами настоящего изобретения, содержали, в основном, молекулы с массами от 2500 до 15000, что соответствует степеням полимеризации, или значениям n в формуле (1), в диапазоне от 3 до 20, и, соответственно, содержанию аргинина от 6 до 40 остатков на молекулу. Известно, что способностью эффективно проникать через клеточные мембраны и в эпителиальные ткани обладают молекулы, содержащие не менее 6 гуанидиновых групп [Mitchell DJ, Kim DT, Steinman L, Fathman CG, Rothbard JB. Polyarginine enters cells more efficiently than other polycationic homopolymers. J Peptide Res., (2000), 56: 318-325; EP 1401473 Transporters comprising spaced arginine moieties; US 7169814 Guanidinium transport reagents and conjugates].

Полимеры формулы (1) содержат гидролитически устойчивые, но легко расщепляемые в клетке дисульфидные, амидные и уретановые связи. При распаде полимера образуется L-аргинин и другие биосовместимые компоненты - L-цистеин, алифатический спирт, алифатическая аминокислота, алифатический диамин. Наличие дисульфидных связей в полимере представляется важным фактором быстрой внутриклеточной биодеградации полимера. Известно, что дисульфиды весьма устойчивы в плазме крови, но быстро восстанавливаются до тиолов в клетке. Это обусловлено значительной разницей окислительно-восстановительных потенциалов внеклеточной среды и цитозоля клетки. Такое свойство дисульфидной связи используется при конструировании биоконъюгатов для направленной терапии рака [Saito G, Swanson JA, Lee KD. Drug delivery strategy utilizing conjugation via reversible disulfide linkages: role and site of cellular reducing activities. Adv Drug Del Rev (2003) 55: 199-215; Wang J, Li S, Luo T, Wang С and Zhao J. Disulfide Linkage: A Potent Strategy in Tumor-Targeting Drug Discovery. Curr Med Chem (2012) 19: 2976-2983]. Установлено, что введение дисульфидных связей в высокомолекулярные катионные полимеры, предназначенные для трансфекции нуклеиновых кислот в эукариотические клетки, позволяет резко снизить присущую таким полимерам цитотоксичность [Peng Q, Zhong Z and Zhuo R. Disulfide cross-linked polyethylenimines (PEI) prepared via thiolation of low molecular weight PEI as highly efficient gene vectors. Bioconjug Chem (2008)19:499-506; Kim T, Ou M, Lee M, Kim SW. Arginine-grafted Bioreducible Polyfdisulfide amine) for Gene Delivery Systems. Biomaterials (2009) 30(4): 658-664; Won YW, Yoon SM, Li KM, Kim YH. Poly(oligo-d-arginine) With Internal Disulfide Linkages as a Cytoplasm-sensitive Carrier for siRNA Delivery. Mol Ther (2011) 19 (2): 372-380]. Таким образом, проникая в клетку, полимер формулы (1) будет быстро восстанавливаться до низкомолекулярных фрагментов, далее легко гидролизуемых до L-аргинина и других компонентов внутриклеточными протеолитическими ферментами и эстеразами.

Необходимо также подчеркнуть, что полимеры формулы (1) не имеют в своей структуре неустойчивых в водных растворах сложноэфирных групп, поэтому их можно использовать в лекарственных и косметических композициях, содержащих воду.

Полимеры формулы (1) растворимы в воде, устойчивы в водных растворах и не обладают цитотоксичностью. Предлагаемые полимеры способны повышать уровень продукции оксида азота в стимулированных гладкомышечных клетках грудной аорты крысы с эффективностью, не меньшей, чем окта-L-аргинин. Блокирование этого эффекта L-N_ω-монометиларгинином однозначно свидетельствует о зависимости его от NO-синтазы. Данные факты указывают на то, что полимеры способны проникать в клетку иным способом, чем экзогенный внеклеточный аргинин, не зависимым от клеточных транспортеров основных аминокислот.

Полимеры формулы (1) могут использоваться как самостоятельно, так и в сочетании с другими активными началами, в виде композиций для локального применения, например, мазей, кремов, гелей, спреев, растворов, суппозиториев, пластырей, повязок, с целью лечения или профилактики заболеваний и состояний, связанных с нарушением функции кровеносных сосудов, в тех случаях, когда терапевтический эффект может быть достигнут локальным повышением уровней оксида азота в тканях и клетках. К таким заболеваниям и состояниям могут относиться болезни периферических и коронарных артерий; васкулопатия, связанная с диабетом; склеродерма; глаукома; легочная гипертензия; заживление ран, ожогов, обморожений, пролежней, анальных фиссур; эректильная дисфункция.

Полимеры формулы (1) могут также использоваться в составе соответствующих композиций как гигиенические и лечебно-косметические средства, стимулирующие микроциркуляцию в тканях кожи.

Сущность настоящего изобретения иллюстрируется примерами. При описании примеров используются следующие сокращения и условные обозначения:

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

ГПХ - гель-проникающая хроматография

ДМСО - диметилсульфоксид;

ДМФА - диметилформамид;

МТБЭ - метил-трет-бутиловый эфир;

ТГФ - тетрагидрофуран;

ТФУ - трифторуксусная кислота;

Acm - ацетамидометил;

βAla - β-аланин;

Aha - 6-аминогексановая кислота;

Boc - трет-бутоксикарбонил;

ВОР - гексафторфосфат бензотриазолил-1-окси-трис(диметиламино)фосфония;

Bzl - бензил;

Сае - 2-карбоксамидоэтил;

Cbz - бензилоксикарбонил;

DCC - N,N′-дициклогексилкарбодиимид;

DIEA - N,N-диизопропилэтиламин;

EDAC - 1-этил-3-(3-диметиламино)пропилкарбодиимид;

EtOC - этоксикарбонил

Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил;

HOBt - 1-гидроксибензотриазол;

MTT - бромид3-[4,5-диметилтиазолил-2]-2,5-дифенилтетразолия

PBS - изотонический натрий-фосфатный буфер по Дульбекко.

Сокращенные обозначения аминокислот и защитных групп используются в соответствии с рекомендациями Комиссии по биохимической номенклатуре при IUPAC-IUB, опубликованными в Eur. J. Biochem. (1984) 138(1): 9-37. Оптические изомеры аминокислот и их производные, приведенные в описаниях примеров и во всем тексте, по умолчанию имеют L-конфигурацию.

Обращенно-фазовую ВЭЖХ осуществляли на хроматографе Accela с УФ-детекцией на Accela PDA Detector и масс-спектрометрической детекцией с ионизацией распылением в электрическом поле на Thermo LCQ Fleet (Thermo Scientific, США); колонкг Hypersil GOLD 18 5×2,1 мм, градиент ацетонитрила в воде (0,05% ТФУ), скорость потока 200 мкл/мин.

Для ГПХ использовали серию колонок Waters Ultrahydrogel 250 и Ultrahydrogel 120 с предколонкой. Калибровка колонок производилась по маркерному пептиду с молекулярной массой 3,1 кДа, инсулину (5,7 кДа), интерферону-альфа (19,8 кДа). Элюент 0,05 М сульфат натрия, скорость потока 0,75 мл/мин, объем пробы 20 мкл (2-5 мг/мл).

Пример 1. Получение полимера (1а).

Трипептид EtOC-Arg-Aha-Cys(Trt)-OH. 2 г (1,4 ммол) Н-Cys(Trt)-2-хлортритил-полимера (GL Bochem Ltd., КНР) загружают в 50-мл реактор для ручного твердофазного синтеза, суспендируют 30 мин в 30 мл ДМФА и промывают 2×30 мл ДМФА. В реактор загружают раствор 3 зкв. Fmoc-Aha-OH, 3 экв. HOBt, 4 экв. DIEA и 3,5 экв. ВОР в 25 мл ДМФА и перемешивают 90 мин. Полимер отфильтровывают и промывают ДМФА (4×30 мл, 3 мин), затем обрабатывают 20% раствором пирролидина в ДМФА (2×30 мл, 30 мин) и промывают ДМФА (4×30 мл, 3 мин). Далее проводят конденсацию с 3 экв. EtOC-Arg-ОН, как описано выше для Fmoc-Aha-OH. Полученный пептидил-полимер обрабатывают 1% раствором ТФУ в дихлорметане (2×30 мл, 20 мин), затем промывают дихлорметаном (3×30 мл, 3 мин). Объединенный фильтрат промывают в делительной воронке 2×50 мл 0,5 М фосфатного буфера (pH 6,5), 50 мл насыщенного водного раствора NaCl, органическую фазу сушат безводным сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Остаток растирают с МТБЭ и получают 1,09 г (95%) трифторацетата EtOC-Arg-Aha-Cys(Trt)-OH. Масс-спектр ESI: 706,0 (М+Н)⁺. Вычислено: MW 704,92 (основание); 819,95 (трифторацетат). Хроматографическая однородность по ВЭЖХ 95%.

Димер трипептида . 1,0 г трифорацетата трипептида EtOC-Arg-Aha-Cys(Trt)-OH растворяют в смеси 10 мл ТФУ и 2 мл м-крезола и выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Смесь упаривают в вакууме, остаток растирают с МТБЭ, отфильтровывают, промывают МТБЭ и сушат в вакууме, затем растворяют в смеси 10 мл метанола и 3 мл ДМСО. Через 12 ч метанол отгоняют в вакууме, остаток обрабатывают 30 мл МТБЭ и получают 0,60 г димера трипептида в виде бис-трифторацетата. Масс-спектр ESI: 463,0 (М+2Н)²⁺. Вычислено: MW 923,16 (основание); 1151,21 (бис-трифторацетат). Хроматографическая однородность по ВЭЖХ 94%.

Поликонденсация. 0,55 г бис-трифторацетата димера трипептида растворяют в 3 мл ДМФА, добавляют 32,5 мкл этилендиамина, 0,135 г HOBt и 0,25 г DCC. Смесь перемешивают 48 ч при комнатной температуре, добавляют еще 10 мкл этилендиамина и выдерживают еще 4 ч. К смеси добавляют 0,1 г щавелевой кислоты 0,5 мл воды, через 30 мин отфильтровывают осадок, и фильтрат упаривают в вакууме. Остаток растирают с МТБЭ, отфильтровывают, сушат в вакууме и растворяют в 10 мл воды. Водный раствор фильтруют через мембранный фильтр 0,45 мкм и пропускают через колонку с 5 мл ионообменной смолы Dowex 1×4 в ацетатной форме. Колонку промывают 10 мл воды, объединенный элюат концентрируют в вакууме до 3 мл и лиофилизируют. Получают 0,42 г ацетата полимера (1а) в виде белой аморфной массы. Молекулярная масса по ГПХ 6200 (дисперсность D=1,32).

Пример 2. Получение полимера (1б).

Трипептид Cbz-Arg-βAla-Cys(Trt)-OH. Получают из 2 г (1,4 ммол) H-Cys(Trt)-2-хлортритил-полимера путем последовательных конденсаций с 3 экв. Fmoc-βAla-ОН и с 3 экв. Cbz-Arg-OH, как описано в Примере 1. Выход трифторацетата трипептида 1,09 г (93%). Масс-спектр ESI: 726,0 (М+Н)⁺. Вычислено: MW 724,92 (основание); 838,95 (трифторацетат). Хроматографическая однородность по ВЭЖХ 96%.

N,N′-Бис(трипептидил-амино)этан[Cbz-Arg-βAla-Cys(Trf)-NH]₂(CH₂)₂. 1,0 г трифторацетата трипептида с предыдущей стадии растворяют в 5 мл ДМФА, добавляют 38 мкл этилендиамина, 0,150 г HOBt и 0,30 г DCC. Смесь перемешивают 12 ч при комнатной температуре, добавляют еще 10 мкл этилендиамина и выдерживают еще 4 ч. К смеси добавляют 0,1 г щавелевой кислоты и 0,5 мл воды, через 30 мин отфильтровывают осадок, и фильтрат упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 50 мл хлороформа, хлороформный раствор промывают в делительной воронке 2×50 мл 0,5 М фосфатного буфера (pH 6,5), 50 мл воды, органическую фазу сушат безводным сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Остаток растирают с МТБЭ и получают получают 0,845 г (88%) N,N′-бис(трипептидил-амино)этана в виде бис-трифторацетата. Масс-спектр ESI: 737,8 (М+2Н)²⁺. Вычислено: MW 1473,02 (основание); 1701,08 (бис-трифторацетат). Хроматографическая однородность по ВЭЖХ 94%.

Окислительная полимеризация. 0,82 г бис-трифторацетата N,N′-бис(трипептидил-амино)этана с предыдущей стадии растворяют в 5 мл метанола и при перемешивании добавляют со скоростью 5-6 капель в минуту 5% раствор (вес/объем) I₂ в метаноле до появления устойчивой фиолетовой окраски. К раствору добавляют 10 мг акриламида и через 1 ч 30 мл воды. Реакционную смесь экстрагируют в делительной воронке 2×20 мл МТБЭ, водную фазу фильтруют через мембранный фильтр 0,45 мкм и пропускают через колонку с 10 мл ионообменной смолы Amberlyst А26 в ацетатной форме. Колонку промывают 20 мл воды, объединенный элюат концентрируют в вакууме до 5 мл и лиофилизируют. Получают 0,48 г ацетата полимера (1б) в виде желтоватой аморфной массы. Молекулярная масса по ГПХ 7600 (дисперсность D=1,28).

Пример 3. Получение полимера (1в).

Линейный сополимер N,N′-ди-Вос-цистина и этилендиамина. 4,40 г N,N′-ди-Вос-цистина растворяют в 25 мл ДМФА, добавляют 335 мкл этилендиамина, 1,35 г HOBt и 2,5 г DCC. Смесь перемешивают 48 ч при комнатной температуре, добавляют еще 100 мкл этилендиамина и выдерживают еще 4 ч. К смеси добавляют 0,5 г щавелевой кислоты и 3 мл воды, через 30 мин отфильтровывают осадок, и фильтрат упаривают в вакууме. Остаток растирают с водой, осадок отделяют фильтрованием, промывают водой на фильтре и сушат в вакууме. Сухой осадок промывают этилацетатом и МТБЕ, сушат и получают 4.1 г сополимера.

Сополимер цистина и этилендиамина. N_α-Защищенный сополимер с предыдущей стадии растворяют в 30 мл ТФУ, выдерживают 60 мин при комнатной температуре, раствор упаривают в вакууме. Остаток растирают с МТБЭ, образовавшийся осадок промывают МТБЭ на фильтре и сушат в вакууме над гранулированным гидроксидом калия. Выход 4,2 г полимера в виде трифторацетата.

Полимер (1в). 4,0 г трифторацетата сополимера цистина и этилендиамина с предыдущей стадии (15,4 мэкв. свободных аминогрупп), 4,19 г (17 ммол) EtOC-Arg-OH и 1,35 г (10 ммол) HOBt растворяют при перемешивании в 30 мл ДМФА и охлаждают в раствор в ледяной бане. К раствору добавляют 3,92 г (19 ммол) DCC и перемешивают смесь 18 ч, затем добавляют 5 мл воды и перемешивают еще 4 ч. Осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме. Остаток растирают с МТБЭ, отфильтровывают, сушат в вакууме и растворяют в 100 мл воды. Водный раствор экстрагируют в делительной воронке 2×30 мл этилацетата, водный слой фильтруют через мембранный фильтр 0,45 мкм и пропускают через колонку с 50 мл ионообменной смолы Dowex 1×4 в ацетатной форме. Колонку промывают 100 мл воды, объединенный элюат концентрируют в вакууме до 50 мл и лиофилизируют. Получают 7,2 г ацетата полимера (1а) в виде белой аморфной массы. Молекулярная масса по ГПХ 5600 (дисперсность D=1,36).

Пример 4. Получение полимера (1г).

Полимер синтезируют из 4,40 г N,N′-ди-Вос-цистина, как описано в примере 3, используя на первой стадии 1,6-диаминогексан вместо этилендиамина. Выход 7,5 г ацетата полимера (1 г), аморфная масса с бежевым оттенком. Молекулярная масса по ГПХ 7400 (дисперсность D=1,25).

Пример 5. Оценка гидролитической устойчивости полимеров.

Растворы полимеров (1а), (1б), (1в), (1г) (5 мг/мл) в PBS, содержащем 0,1% азида натрия, выдерживали в течение длительного времени в темноте при температуре 22-25°С. Один раз в неделю из растворов отбирали аликвоты объемом 20 мкл, анализировали ГПХ в стандартных условиях и вычисляли значения молекулярных масс и дисперсности. На протяжении шести последовательных измерений (время выдерживания 6-7 недель) значимых изменений молекулярных масс и дисперсности образцов полимеров не обнаруживалось.

Пример 6. Оценка цитотоксичности полимеров.

Цитотоксичность полимеров формулы (1) оценивали с помощью МТТ-теста по известным методикам [Mosmann Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods (1983) 65: 55-63; Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов. Методические указания. МУ 1.2.2635-10 (утв. Роспотребнадзором 24.05.2010)] на культуре мышиных фибробластов L929. Посевная концентрация клеток 2×10⁵/мл (по 100 мкл в лунку). Использовались растворы полимеров (1а), (1б), (1в) и (1г) с концентрациями 0 (контроль); 0,6; 1,25; 2,5; 5 и 10 мг/мл (8 лунок для каждой концентрации) при длительности инкубации 24 ч. Для растворения МТТ-формазана использовали ДМСО (200 мкл на лунку). Оптические плотности измеряли при 570 нм на планшетном спектрофотометре Model 680 (Bio-Rad, США). Долю выживших клеток определяли как отношение оптического поглощения в опыте и контроле. Для полимеров (1а), (1в) и (1г) выживаемость клеток в контроле и опыте достоверно не отличалась при всего использованных концентрациях. Для полимера (1б) при высоких концентрациях наблюдалось некоторое снижение выживаемости клеток: 80%о при 5 мг/мл (p=0,35) и 65% при 10 мг/мл (р=0,20).

Пример 7. Влияние полимеров на биосинтез оксида азота в стимулированных гладкомышечных клетках аорты.

Эксперименты проводились на культурах гладкомышечных клеток грудной аорты крысы (VSMC) по методике, приведенной в работе [Uemura S, Rothbard JB, Matsushita H, Tsao PS, Fathman CG, Cooke IP., Short Polymers Of Arginine Rapidly Translocate Into Vascular Cells: Effects On Nitric Oxide Synthesis. CircJ (2002) 66: 1155-1160]. Клетки получали, культивировали и вносили в лунки планшета, как описано в приведенном источнике. Субконфлюэнтные клетки инкубировали 24 ч в среде, содержащей насыщающую концентрацию свободного L-аргинина 100 мкМ (экспериментально определяется как концентрация аргинина, дальнейшее повышение которой не приводит к увеличению продукции NO стимулированными клетками), затем проводили кратковременную (40 мин) обработку растворами (по 6 лунок на каждый раствор): полимера (1в) (50 и 500 мкМ Arg); полимера (1г) (50 и 500 мкМ Arg); окта-L-аргинина (50 и 500 мкМ Arg) как референс-препарата. Контрольные лунки обрабатывали 500 мкМ Arg. После этого растворы заменяли на среду, содержащую активаторы - 100 мкг/мл липополисахарида Е. coli и 100 МЕ/мл γ-интерферона, и 100 мкМ аргинина и инкубировали 24 ч. В половину всех лунок вносили дополнительно ингибитор NO-синтазы L-Н_ω-монометиларгинин NMMA (1 мМ). Условия инкубации и используемые среды описаны цитированном источнике. После инкубации отбирали по 80 мкл культуральной среды и измеряли концентрацию нитрита в супернатанте с помощью реактива Грисса, как описано в [Green LC, Wagner DA, GlodowskyZ. Analysis of nitrate, nitrite and [¹⁵N] nitrate in biological fluids. Anal Biochem (1982) 126 (13): 131-138]. Результаты выражали как разность между экспериментальными и контрольными значениями, вычисленную в процентах от контрольного значения (Таблица 2). Положительные значения в данном случае отражают стимуляцию биосинтеза NO, отрицательные - ингибирование.

Полимер общей формулы
,
где n - целое число >2;
^NA имеет структуру:
,
A^N имеет структуру:
,
при этом Z либо отсутствует, либо является остатком аминокислоты -NH-(CH₂)_i-СО-, где i - целое число от 1 до 5;
D представляет собой линейный или разветвленный алкил C₁-C₅ либо бензил;
B представляет собой остаток алифатического диамина -NH-(CH₂)_k-NH-, где k - целое число от 2 до 6;
X и Y могут одновременно принимать значения:
Х=H-B, Y=H;
X=N_α-(D-OCO)-L-аргинил-Z-B, Y=N_α-(D-OCO)-L-аргинил-Z;
X=R¹-A^N-B, Y=^NA-R¹,
где R¹ есть карбоксамидоалкил вида H₂NCO-CH₂- или H₂NCO-СН₂СН₂-, и его соли с фармацевтически приемлемыми кислотами.