Способ предварительной пробоподготовки белков для электрофореза
Владельцы патента RU 2550135:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Орловский государственный аграрный университет" (ФГБОУ ВПО Орел ГАУ) (RU)
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии мяса и мясопродуктов, может быть использовано в ветеринарии. Изобретение представляет собой способ предварительной пробоподготовки белков для электрофореза, заключающийся в измельчении образцов мяса и мясных изделий до состояния фарша, гомогенизации, центрифугировании гомогенатов при температуре 20°C в течение 30 мин с последующим хранением полученных образцов, отличающийся тем, что гомогенизацию проводят с 10% раствором сахарозы, центрифугирование проводят со скоростью 10000 оборотов в мин, хранение при -4±2°C. Использование 10% р-ра сахарозы упрощает пробоподготовку белков. 2 табл.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии мяса и мясопродуктов, может быть использовано в ветеринарии.
Чтобы обеспечить наилучшие результаты для проявления активности гистохимически выявляемого фермента, необходимо, чтобы в среде поддерживалось значение pH, оптимальное для данного фермента. Это условие достигается введением в среду инкубации буферных растворов с заданными значениями pH. Наиболее распространенными буферными растворами являются фосфатный, ацетатный и трис-буфер.
Известен способ проведения электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, в котором описана предварительная пробоподготовка белков для электрофореза с использованием буферного раствора 0,015 М Трис HCl+0,15 М NaCl (Усанова О.Е. / Диссертация. Изучение протеомных изменений мышечной ткани свинины под воздействием технологических факторов // О.Е. Усанова - М. 2011. - 138, с. - 68) [1]. Буферный раствор приготавливали следующим образом:
1. 0,2 г Триса растворили в небольшом количестве воды;
2. Добавили 0,2 мл (200 мкл) HCl и довели до 100 мл водой;
3. Для приготовления 2N HCl - 18,2 мл HCl довели до 100 мл водой;
4. К раствору 0,015 М Трис HCl прилили 0,3 мл (300 мкл) 0,15 М NaCl.
Образцы мяса и мясных изделий измельчали до состояния фарша в блендаре, 10-20 г полученной массы гомогенизировали при комнатной температуре в течение 2-3 мин в 50 мл буферного раствора 0,015 М Трис HCl+0,15 М NaCl. Полученные гомогенаты центрифугировали при 20°C со скоростью 15000 оборотов в течение 30 мин. После центрифугирования образцы полученных проб хранили в замороженном состоянии при -18°C.
Расход времени составил 3-4 часа.
Недостатком данного способа является сложность проведения пробоподготовки из-за длительного и дорогостоящего процесса приготовления буферного раствора.
Задачей предлагаемого способа является упрощение пробоподготовки белков для электрофореза, использование более дешевого реактива.
Техническим результатом является сокращение времени на приготовление раствора 0,015 М Трис HCl+0,15 М NaCl для подготовки белков для электрофореза путем замены на 10% р-р сахарозы.
Для решения поставленной задачи и указанного технического результата в известном способе предварительной пробоподготовки белков для электрофореза, заключающемся в измельчении образцов мяса и мясных изделий до состояния фарша, гомогенизации, центрифугировании гомогенатов при температуре 20°C в течение 30 мин и последующей заморозке полученных образцов, согласно изобретению гомогенизацию проводят с 10% раствором сахарозы, центрифугирование проводят со скоростью 10000 оборотов в мин и хранят полученные образцы при температуре -4°C±2°C.
Сущность метода заключается в следующем: мясо и мясные изделия измельчают в блендаре, полученную массу гомогенизируют при комнатной температуре 5 мин с 50 мл раствора -10 г сахарозы на 100 мл воды. Полученные гомогенаты центрифугируют при температуре 20°C со скоростью 10000 оборотов в мин в течение 30 мин. Подготовленные таким образом полученные образцы для последующего хранения охлаждают при температуре -4°C±2°C.
Пример. Сыровяленый продукт (Суджук) из говядины в количестве 20 г измельчали в блендаре, 10 г полученной массы гомогенизировали в 50 мл 10% р-ра сахарозы при комнатной температуре, далее центрифугировали при температуре 20°C в течение 30 мин со скоростью 10000 оборотов в мин. Подготовленные таким образом экстракты охлаждали при температуре -4°C± 2°C для последующего хранения. Результаты целесообразности применения 10% раствора сахарозы показана в таблице 1.
| Таблица 1 | |
| Влияние различных концентраций сахарозы на разделение белковых фракций в процессе электрофореза | |
| Наименование раствора | Полученный результат |
| 5% раствор сахарозы | Белковые фракции выражены слабо, нет четко выделенных границ между зоной тяжелых белков, средних и легких белков. |
| 10% раствор сахарозы | Белковые фракции выражены четко, ясно прослеживаются границы между зонами тяжелых, средних и легких белков. |
| 15% раствор сахарозы | Белковые фракции сливаются, границы между зонами не выделены. |
Согласно результатам, приведенным в таблице 1, можно сделать следующие выводы: использование 10% раствора сахарозы для предварительной пробоподготовки белков для электрофореза более целесообразно, чем 5 и 15% растворы сахарозы.
| Таблица 2 | ||||
| Сравнение способов при использовании различных методов исследований (использование раствора 0,015 М Трис HCl+0,15 М NaCl, 10% р-ра сахарозы, центрифугирования, хранения, расхода времени) | ||||
| Наименование способа | Наименование методов исследований | |||
| Используемые растворы | Центрифугирование | Хранение | Расход времени | |
| Известный способ | 1.В растворе 0,015 М Трис HCl+0,15 М NaCl идет экстрагирование веществ. | При ценрифугировании со скоростью 15000 об/мин полученные гомогенаты располагаются в надосадочной зоне в количестве 35-40 мл. | 1. Требуется размораживание полученных образцов. | 3-4 ч |
| 2. Требуется проводить дополнительное центрифугирование образцов. | ||||
| Предлагаемый способ | 1. В растворе идет экстрагирование веществ. | При центрифугировании со скоростью 10000 об/мин полученные гомогенаты располагаются в надосадочной зоне в количестве 37-42 мл. | 1. He требуется размораживание образцов. | 1-1,5 ч |
| 2. Не требуется проводить дополнительное центрифугирование. | ||||
| 2. Используется как катализатор в процессе солюбилизации. |
Согласно данным, приведенным в таблице 2, можно сделать следующий вывод:
1. При использовании буферного раствора 015 М Трис HCl+0,15 М NaCl и 10% р-ра сахарозы идет экстрагирование веществ, а раствор сахарозы используется и как катализатор процессов;
2. При центрифугировании в известном способе количество гомогенатов на 2 мл меньше, чем в предлагаемом способе;
3. В известном способе полученные гомогенаты хранят в замороженном виде и образцы нужно размораживать и дополнительно центрифугировать;
4. Предлагаемый способ не требует размораживания и центрифугирования, что значительно сокращает время приготовления раствора в целом на 1,5 ч;
5. Кроме того, экспериментальные данные показали, что при использовании 10% раствора сахарозы в среде поддерживается требуемый уровень pH для электрофоретических исследований.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет упростить пробоподготовку белков для электрофореза и использовать более дешевые реактивы.
Способ предварительной пробоподготовки белков для электрофореза, заключающийся в измельчении образцов мяса и мясных изделий до состояния фарша, гомогенизации, центрифугировании гомогенатов при температуре 20°C в течение 30 мин с последующим хранением полученных образцов, отличающийся тем, что гомогенизацию проводят с 10% раствором сахарозы, центрифугирование проводят со скоростью 10000 оборотов в мин, полученные образцы хранят при температуре -4°C±2°C.
