Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства

Изобретение относится к пролекарственным препаратам пептидов глюкагонового надсемейства, в которых пептид глюкагонового надсемейства модифицирован связыванием дипептида с пептидом глюкагонового надсемейства амидной связью. Пролекарства, раскрытые в настоящем изобретении, имеют увеличенное время полужизни и превращаются в активную форму в физиологических условиях в результате неферментативной реакции, вызываемой химической нестабильностью. 3 н. и 27 з.п. ф-лы, 15 ил., 8 табл., 16 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет согласно предварительной патентной заявке США № 61/139210, поданной 19 декабря 2008, предварительной патентной заявке США № 61/144271, поданной 13 января 2009, и предварительной патентной заявке США № 61/187556, поданной 16 июня 2009. Описание каждой заявки специально включено в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Предшествующий уровень техники

Основанные на пептидах лекарственные средства являются высокоэффективными лекарственными средствами с относительно короткой продолжительностью действия и непостоянным терапевтическим индексом. Настоящее изобретение относится к основанным на пептидах пролекарствам, где пролекарственное производное предназначено для задержки начала действия и удлинения времени полужизни лекарственного средства. Задержка начала действия имеет преимущество, которое заключается в том, что она обеспечивает возможность системного распределения пролекарства перед его активацией. Соответственно, введение пролекарств исключает осложнения, вызываемые максимальными активностями при введении, и повышает терапевтический индекс исходного лекарственного средства.

Распознавание рецептором и последующий процессинг пептидных и белковых агонистов является основным путем разложения многих лекарственных средств, основанных на пептидах и белках. Таким образом, связывание пептидного лекарственного средства с его рецептором будет приводить к биологической стимуляции, но также будет инициировать последующую дезактивацию индуцированных фармакологических свойств пептида/белка путем ферментативного расщепления пептида или белка. Согласно настоящему изобретению пролекарства могут быть получены для того, чтобы продлить биологическое время полужизни пептида или белка, на основании методики ингибирования распознавания пролекарства соответствующим рецептором.

Пролекарства, раскрытые в настоящем изобретении, в конечном счете, будут химически превращаться в структуры, которые могут распознаваться рецептором, где скорость такого химического превращения будет определять время начала и продолжительность биологического действия in vivo. Конструкция молекулы, описанная в настоящем описании, основана на внутримолекулярной химической реакции, которая не зависит от дополнительных химических добавок или ферментов.

Препроглюкагон является полипептидом-предшественником длиной 158 аминокислот, который процессируется в разных тканях с образованием нескольких различных происходящих из проглюкагона пептидов, включая глюкагон (SEQ ID NO:701), глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1; аминокислоты 7-36, представленные SEQ ID NO:703 и SEQ ID NO:704), глюкагон-подобный пептид-2 (GLP-2; SEQ ID NO:708) и оксинтомодулин (OXM; SEQ ID NO:706), которые вовлечены в широкое множество физиологических функций, включая гомеостаз глюкозы, секрецию инсулина, опорожнение желудка и рост кишечника, а также регуляцию потребления пищи.

Глюкагон представляет собой 29-аминокислотный пептид (который соответствует аминокислотам 33-61 препроглюкагона), тогда как GLP-1 продуцируется в виде 37-аминокислотного пептида, который соответствует аминокислотам 72-108 препроглюкагона. GLP-1(7-36)-амид (SEQ ID NO:704; на C-конце находится амид аргинина) или GLP-1(7-37)-кислота (SEQ ID NO:703; на C-конце находится глицин) являются биологически эффективными формами GLP-1, которые проявляют по существу эквивалентную активность в отношении рецептора GLP-1.

Глюкагон является жизненно важным лекарственным средством, которое применяют при остром лечении тяжелой гипогликемии. Сообщалось, что оксинтомодулин обладает фармакологической способностью подавлять аппетит и снижать массу тела. Клинические исследования агонистов рецептора GLP-1 или стабилизированных аналогов GLP-1 подтвердили, что указанное семейство пептидов является эффективным при лечении диабета типа II. Кроме того, в действительности, они могут быть безопаснее, чем инсулиновая терапия, благодаря их зависимого от глюкозы действия, что исключает случаи гипогликемии. Исследования взаимосвязи структура-активность показали, что N-концевой гистидин каждого из трех указанных пептидов (глюкагона, GLP-1 и оксинтомодулина) особенно важен для полного воздействия, и что удлиненные на N-конце формы сильно снижают биологическую эффективность.

Известны дополнительные пептиды, которые сходны с глюкагоном и GLP-1 по структуре и обладают сходными активностями. Например, эксендин-4 представляет собой пептид, присутствующий в слюне ящерицы-ядозуба, который сходен с GLP-1 по структуре и подобно глюкагону и GLP-1 увеличивает высвобождение инсулина.

Кроме того, желудочный ингибирующий полипептид (GIP) также известен как зависимый от глюкозы инсулинотропный пептид и является представителем секретинового семейства гормонов. GIP образуется из 153-аминокислотного пробелка, кодируемого геном GIP, и циркулирует в виде биологически активного 42-аминокислотного пептида (SEQ ID NO:707). Ген GIP экспрессируется в тонком кишечнике, а также слюнных железах и является слабым ингибитором секреции кислоты в желудке. Кроме ингибирующего действия в желудке в присутствии глюкозы GIP усиливает высвобождение инсулина островковыми бета-клетками в поджелудочной железе при введении в физиологических дозах. Полагают, что GIP функционирует в качестве кишечного фактора, который стимулирует высвобождение инсулина поджелудочной железой и играет физиологическую роль в поддержании гомеостаза глюкозы.

Остеокальцин (SEQ ID NO:709) является неколлагеновым белком, встречающимся в костях и дентине. Он секретируется остеобластами и, как полагают, играет роль в минерализации и гомеостазе ионов кальция. Также сообщалось, что остеокальцин функционирует в качестве гормона в организме, вынуждая бета-клетки в поджелудочной железе высвобождать больше инсулина, и в то же время, приводя к тому, что жировые клетки высвобождают гормон адипонектин, который увеличивает чувствительность к инсулину.

Одним из недостатков, ассоциированных с терапевтическим применением биологически активных пептидов, таких как остеокальцин, GIP, глюкагон, GLP-1 и оксинтомодулин, является их экстремально короткое время полужизни (примерно две минуты для глюкагона и GLP-1) в плазме. Соответственно, чтобы обеспечить приемлемый контроль, нативные родственные глюкагону пептиды необходимо вводить непрерывно в течение длительного периода времени. Короткое время полужизни пептидов, родственных глюкагону и GLP-1, обусловлено быстрым расщеплением дипептидилпептидазой IV (DPP-IV), которая расщепляет между второй и третьей аминокислотами. Такое расщепление не только инактивирует нативные пептиды, но в случае глюкагона и GLP-1 укороченные формы могут быть функциональными антагонистами соответствующих рецепторов. Соответственно, существует необходимость в более длительно действующих вариантах GIP, глюкагона, GLP-1 и оксинтомодулина и родственных пептидов, чтобы реализовать полные терапевтические возможности таких механизмов действия лекарственных средств.

Сущность изобретения

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пролекарственное производное биологически активного полипептида, выбранного из группы, состоящей из глюкагона, эксендина-4, GLP-1, GLP-2, GIP, вазоактивного интестинального пептида (VIP), полипептида 27, активирующего аденилатциклазу гипофиза (PACAP-27), пептид-гистидин-метионина (PHM), оксинтомодулина, секретина, остеокальцина, соматотропин-рилизинг-гормона, а также аналогов, производных и конъюгатов указанных выше пептидов. Пролекарственное производное содержит дипептидный элемент пролекарства, ковалентно связанный с активным участком биологически активного полипептида амидной связью. В некоторых вариантах осуществления дипептид ковалентно связан с биологически активным полипептидом в положении, которое препятствует способности биологически активного полипептида взаимодействовать с соответствующим ему рецептором или кофактором. В некоторых вариантах осуществления дипептидный элемент пролекарства связан с амино-концом биологически активного пептида. Последующее удаление дипептида в физиологических условиях и в отсутствие ферментативной активности восстанавливает полную активность полипептида.

В некоторых вариантах осуществления предлагается пролекарство, имеющее общую структуру A-B-Q. В данном варианте осуществления Q означает биологически активный пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов глюкагонового надсемейства, включая родственные глюкагону пептиды, остеокальцин, а также аналоги, производные и конъюгаты вышеуказанного; и A-B означает дипептидное пролекарство, связанное с биологически активным пептидом амидной связью. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления A означает аминокислоту или гидроксикислоту, и B означает N-алкилированную аминокислоту, связанную с Q через образование амидной связи между карбоксилом B (в A-B) и амином Q. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления A, B или аминокислота в Q, с которой связан A-B, является некодируемой аминокислотой, и химическое отщепление A-B от Q осуществляется по меньшей мере примерно на 90% в пределах примерно от 1 до примерно 720 часов в PBS в физиологических условиях. В другом варианте осуществления химическое отщепление A-B от Q завершается по меньшей мере примерно на 50% в течение примерно 1 часа или примерно 1 недели в PBS в физиологических условиях.

В некоторых вариантах осуществления A и B выбирают так, чтобы ингибировать ферментативное отщепление дипептида A-B от Q ферментами, имеющимися в сыворотке млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления A и/или B выбраны так, чтобы время полуотщепления A-B от Q в PBS в физиологических условиях не превышало двукратного времени полуотщепления A-B от Q в растворе, содержащем DPP-IV-протеазу (т.е. отщепление A-B от Q происходит не более чем в 2 раза быстрее в присутствии DPP-IV-протеазы и в физиологических условиях по сравнению с идентичными условиями в отсутствие фермента). В некоторых вариантах осуществления A и/или B означает аминокислоту в D-стереоизомерной конфигурации. В некоторых примерах вариантов осуществления A означает аминокислоту в D-стереоизомерной конфигурации, и B означает аминокислоту в L-стереоизомерной конфигурации. В некоторых примерах вариантов осуществления A означает аминокислоту в L-стереоизомерной конфигурации, и B означает аминокислоту в D-стереоизомерной конфигурации. В некоторых примерах вариантов осуществления A означает аминокислоту в D-стереоизомерной конфигурации, и B означает аминокислоту в D-стереоизомерной конфигурации.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный элемент пролекарства (A-B) содержит соединение, имеющее общую структуру формулы I:

где

R₁, R₂, R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₁-C₁₈алкил)OH, (C₁-C₁₈алкил)SH, (C₂-C₃алкил)SCH₃, (C₁-C₄алкил)CONH₂, (C₁-C₄алкил)COOH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₁-C₄алкил)NHC(NH₂ ⁺)NH₂, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆циклоалкила), (C₀-C₄алкил)(C₂-C₅гетероцикла), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇, (C₁-C₄алкил)(C₃-C₉гетероарила) и C₁-C₁₂алкил(W₁)C₁-C₁₂алкила, где W₁ означает гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, S и O, или R₁ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C₃-C₁₂циклоалкил или арил; или R₄ и R₈ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C₃-C₆циклоалкил;

R₃ выбран из группы, состоящей из C₁-C₁₈алкила, (C₁-C₁₈алкил)OH, (C₁-C₁₈алкил)NH₂, (C₁-C₁₈алкил)SH, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆)циклоалкила, (C₀-C₄алкил)(C₂-C₅гетероцикла), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇ и (C₁-C₄алкил)(C₃-C₉гетероарила), или R₄ и R₃ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R₅ означает NHR₆ или OH;

R₆ означает H, C₁-C₈алкил, или R₆ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R₇ выбран из группы, состоящей из H и OH.

В другом варианте осуществления дипептидный элемент пролекарства (A-B) содержит соединение, имеющее общую структуру формулы I:

где

R₁, R₂, R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₁-C₁₈алкил)OH, (C₁-C₁₈алкил)SH, (C₂-C₃алкил)SCH₃, (C₁-C₄алкил)CONH₂, (C₁-C₄алкил)COOH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₁-C₄алкил)NHC(NH₂ ⁺)NH₂, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆циклоалкила), (C₀-C₄алкил)(C₂-C₅гетероцикла), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇, (C₁-C₄алкил)(C₃-C₉гетероарила) и C₁-C₁₂алкил(W₁)C₁-C₁₂алкила, где W₁ означает гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, S и O, или R₁ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C₃-C₁₂циклоалкил; или R₄ и R₈ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C₃-C₆циклоалкил;

R₃ выбран из группы, состоящей из C₁-C₁₈алкила, (C₁-C₁₈алкил)OH, (C₁-C₁₈алкил)NH₂, (C₁-C₁₈алкил)SH, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆)циклоалкила, (C₀-C₄алкил)(C₂-C₅гетероцикла), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇ и (C₁-C₄алкил)(C₃-C₉гетероарила), или R₄ и R₃ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R₅ означает NHR₆ или OH;

R₆ означает H, C₁-C₈алкил, или R₆ и R₁ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₀-C₄алкил)CONH₂, (C₀-C₄алкил)COOH, (C₀-C₄алкил)NH₂, (C₀-C₄алкил)OH и галогена.

Как описано выше, в некоторых аспектах предлагается пролекарство, имеющее общую структуру A-B-Q, где Q означает пептид глюкагонового надсемейства (например, родственный глюкагону пептид, соматотропин-рилизинг-гормон (GHRH; SEQ ID NO:719), вазоактивный интестинальный пептид (VIP; SEQ ID NO:720), полипептид 27, активирующий аденилатциклазу гипофиза (PACAP-27; SEQ ID NO:721), пептид-гистидин-метионин (PHM; SEQ ID NO:722) или секретин (SEQ ID NO:723) и/или их аналоги, производные и конъюгаты). Пептиды глюкагонового надсемейства могут иметь общие структурные признаки, включая, но без ограничения, гомологи в пределах N-концевых аминокислот и/или альфа-спиральную структуру в C-концевой части. Полагают, что C-конец обычно функционирует в связывании рецептора, и N-конец обычно функционирует в передаче сигнала рецептора. Несколько аминокислот в N-концевой части и C-концевой части высоко консервативны среди представителей глюкагонового надсемейства, например, His1, Gly4, Phe6, Phe22, Val23, Trp25 и Leu26, где аминокислоты в указанных положениях проявляют идентичность, имеют консервативные замены или сходство боковых цепей аминокислот. В некоторых вариантах осуществления Q означает родственный глюкагону пептид, например глюкагон (SEQ ID NO:701), оксинтомодулин (SEQ ID NO:706), эксендин-4 (SEQ ID NO:718), глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1) (аминокислоты 7-37, представленные SEQ ID NO:703 и 707), глюкагон-подобный пептид-2 (GLP-2) (SEQ ID NO:708), GIP (SEQ ID NO:707) или их аналоги, производные и конъюгаты. В некоторых вариантах осуществления Q в качестве родственного глюкагону пептида содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична соответствующей последовательности нативного глюкагона, нативного оксинтомодулина, нативного эксендина-4, нативного (7-37)GLP-1, нативного GLP-2 или нативного GIP по всей длине нативного пептида (или в положениях, которые соответствуют глюкагону, см., например, фиг.10). В других вариантах осуществления пептид глюкагонового надсемейства (Q) содержит аминокислотную последовательность нативного глюкагона, нативного эксендин-4, нативного (7-37)GLP-1, нативного GLP-2, нативного GHRH, нативного VIP, нативного PACAP-27, нативного PHM, нативного оксинтомодулина, нативного секретина или нативного GIP с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотными модификациями. В следующих вариантах осуществления Q содержит аминокислотную последовательность, которая представляет собой химеру двух или более последовательностей нативных родственных глюкагону пептидов. В некоторых вариантах осуществления Q содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере примерно на 50% идентичную нативному глюкагону (SEQ ID NO:701), которая сохраняет альфа-спиральную конформацию аминокислот, соответствующих аминокислотам 12-29 SEQ ID NO:701.

Q может быть любым из пептидов глюкагонового надсемейства, которые известны в данной области, включая, например, любые родственные глюкагону пептиды, которые известны в данной области, некоторые из которых описаны в настоящем описании в качестве неограничивающих примеров. В данной области известно множество аналогов GLP-1 и представляют собой родственный глюкагону пептид согласно настоящему изобретению, см., например, WO 2008023050, WO 2007030519, WO 2005058954, WO 2003011892, WO 2007046834, WO 2006134340, WO 2006124529, WO 2004022004, WO 2003018516, WO 2007124461, каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте для каждого описания последовательностей или формул аналогов или производных GLP-1. В некоторых вариантах осуществления Q означает родственный глюкагону пептид класса 1, 2, 3, 4 или 5, который подробно описан в настоящем описании. В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящем описании, Q означает любую из последовательностей SEQ ID NO:1-684, 701-742, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776 и 1801-1921.

Хотя дипептидное пролекарство, например A-B, может быть связано с Q в любом положении, которое препятствует активности Q, варианты осуществления, описанные в настоящем описании, иллюстрируют примеры положений, которые подходят для связывания A-B. Когда в настоящем описании указываются номера положений со ссылкой на положение нативной последовательности глюкагона (SEQ ID NO:701), соответствующее положение в аналогах глюкагона или в других пептидах глюкагонового надсемейства могут быть определены с помощью выравнивания. См., например, фиг.10, на которой показано выравнивание некоторых пептидов глюкагонового надсемейства. Например, положение 24 на основании нативного глюкагона соответствует положению 24 (7-37) GLP-1.

В некоторых вариантах осуществления пептид глюкагонового надсемейства может содержать C-конец или C-концевую аминокислотную последовательность, включая, но без ограничения: COOH, CONH₂, GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:710), GPSSGAPPPS-CONH₂ (SEQ ID NO:711), удлинение карбоксильного конца оксинтомодулина, KRNRNNIA (SEQ ID NO:714) или KGKKNDWKHNITQ (SEQ ID NO:713). Дополнительные C-концевые аминокислотные последовательности пептидов глюкагонового надсемейства дополнительно описаны ниже.

В других аспектах Q содержит остеокальцин (SEQ ID NO:709) или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична нативному остеокальцину по длине нативного пептида. Q может содержать аналог остеокальцина, имеющий до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 модификаций аминокислот по сравнению с нативным остеокальцином. В следующих аспектах Q содержит соматотропин-рилизинг-гормон (GHRH) (SEQ ID NO:719) или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична нативному GHRH по длине нативного пептида. Q может содержать аналог GHRH, имеющий до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 модификаций аминокислот по сравнению с нативным GHRH. В некоторых вариантах осуществления Q может представлять собой любой аналог остеокальцина или GHRH, известный в данной области.

В следующих вариантах осуществления предлагается пролекарство, имеющее общую структуру A-B-Q, где Q означает пептид глюкагонового надсемейства остеокальцин или его аналог, производное или конъюгат, и A-B содержит общую структуру:

где R₁ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из H и C₁-C₈алкила;

R₂ и R₄ независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₈алкила, C₂-C₈алкенила, (C₁-C₄алкил)OH, (C₁-C₄алкил)SH, (C₂-C₃алкил)SCH₃, (C₁-C₄алкил)CONH₂, (C₁-C₄алкил)COOH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₁-C₄алкил)NHC(NH₂ ⁺)NH₂, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆циклоалкила), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇, CH₂(C₅-C₉гетероарила), или R₁ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C₃-C₆циклоалкил;

R₃ выбран из группы, состоящей из C₁-C₈алкила, (C₁-C₄алкил)OH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₁-C₄алкил)SH, (C₃-C₆)циклоалкила, или R₄ и R₃ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R₅ означает NHR₆ или OH;

R₆ означает H, или R₆ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R₇ выбран из группы, состоящей из H и OH.

При условии, что когда R₄ и R₃ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо, оба R₁ и R₂ отличны от H.

В других вариантах осуществления предлагается пролекарство, имеющее общую структуру A-B-Q, где Q означает пептид глюкагонового надсемейства остеокальцин или его аналог, производное или конъюгат, и A-B содержит общую структуру:

где

R₁ и R₈ независимо означают H или C₁-C₈алкил;

R₂ и R₄ независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₈алкила, C₂-C₈алкенила, (C₁-C₄алкил)OH, (C₁-C₄алкил)SH, (C₂-C₃алкил)SCH₃, (C₁-C₄алкил)CONH₂, (C₁-C₄алкил)COOH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₁-C₄алкил)NHC(NH₂ ⁺)NH₂, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆циклоалкила), (C₀-C₄алкил)(C₂-C₅гетероцикла), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇ и CH₂(C₃-C₉гетероарила), или R₁ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C₃-C₁₂циклоалкил;

R₃ выбран из группы, состоящей из C₁-C₈алкила, (C₁-C₄алкил)OH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₁-C₄алкил)SH, (C₃-C₆)циклоалкила, или R₄ и R₃ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R₅ означает NHR₆ или OH;

R₆ означает H, C₁-C₈алкил, или R₆ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₀-C₄алкил)CONH₂, (C₀-C₄алкил)COOH, (C₀-C₄алкил)NH₂, (C₀-C₄алкил)OH, галогена, при условии, что когда R₄ и R₃ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо, оба R₁ и R₂ не являются H.

В некоторых вариантах осуществления Q означает пептид, выбранный из группы, состоящей из соматотропин-рилизинг-гормона (GHRH; SEQ ID NO:719), вазоактивного интестинального пептида (VIP; SEQ ID NO:720), полипептида 27, активирующего аденилатциклазу гипофиза, (PACAP-27; SEQ ID NO:721), пептид-гистидин-метионина (PHM; SEQ ID NO:722) или секретина (SEQ ID NO:723), глюкагона (SEQ ID NO:701), эксендина-4 (SEQ ID NO:718), глюкагон-подобного пептида-1 (GLP-1) (аминокислоты 7-37, представленные SEQ ID NO:703 и 704), глюкагон-подобного пептида-2 (GLP-2) (SEQ ID NO:708), GIP (SEQ ID NO:707) или их аналогов, производных и конъюгатов. В некоторых вариантах осуществления Q означает родственный глюкагону пептид.

В другом варианте осуществления предлагается аналог пролекарства пептида глюкагонового надсемейства или остеокальцина или его аналога, производного или конъюгата, в котором пролекарственный фрагмент (A-B) ковалентно связан с Q в одном или нескольких внутренних аминокислотных остатках в последовательности Q, например, в положении Q, соответствующем положению 12, 16, 17, 18, 20, 28 или 29 нативного глюкагона (SEQ ID NO:701). Например, в некоторых вариантах осуществления пролекарственный фрагмент (A-B) связан непосредственно или через линкер с замещенным Lys в положении 20 в Q. В таких вариантах осуществления Q может содержать в положении 20 (по сравнению с нативной последовательностью глюкагона) замещение, имеющее структуру:

В других вариантах осуществления пролекарственный фрагмент (A-B) связан непосредственно или через линкер с замещенным амино-Phe в положении 22. В таких вариантах осуществления Q может содержать в положении 22 (по сравнению с нативной последовательностью глюкагона), замещение, имеющее структуру:

Альтернативно или дополнительно, пролекарственный фрагмент (A-B) связан непосредственно или через линкер с амино-концом Q, где A-B содержит структуру:

где R₁ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из H и C₁-C₈алкила;

R₂ и R₄ независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₈алкила, C₂-C₈алкенила, (C₁-C₄алкил)OH, (C₁-C₄алкил)SH, (C₂-C₃алкил)SCH₃, (C₁-C₄алкил)CONH₂, (C₁-C₄алкил)COOH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₁-C₄алкил)NHC(NH₂ ⁺)NH₂, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆циклоалкила), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇, CH₂(C₅-C₉гетероарила), или R₁ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C₃-C₆циклоалкил;

R₃ выбран из группы, состоящей из C₁-C₈алкила, (C₁-C₄алкил)OH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₁-C₄алкил)SH, (C₃-C₆)циклоалкила, или R₄ и R₃ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R₅ означает NHR₆ или OH;

R₆ означает H, или R₆ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R₇ выбран из группы, состоящей из H и OH,

при условии, что каждый из R₁ и R₂ отличен от H, когда R₄ и R₃ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо.

В других вариантах осуществления пролекарственный фрагмент (A-B) связан непосредственно или через линкер с амино-концом Q, где A-B содержит структуру:

где

R₁ и R₈ независимо означаю H или C₁-C₈алкил;

R₂ и R₄ независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₈алкила, C₂-C₈алкенила, (C₁-C₄алкил)OH, (C₁-C₄алкил)SH, (C₂-C₃алкил)SCH₃, (C₁-C₄алкил)CONH₂, (C₁-C₄алкил)COOH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₁-C₄алкил)NHC(NH₂ ⁺)NH₂, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆циклоалкила), (C₀-C₄алкил)(C₂-C₅гетероцикла), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇ и CH₂(C₃-C₉гетероарила), или R₁ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C₃-C₁₂циклоалкил;

R₃ выбран из группы, состоящей из C₁-C₈алкила, (C₁-C₄алкил)OH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₁-C₄алкил)SH, (C₃-C₆)циклоалкила, или R₄ и R₃ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R₅ означает NHR₆ или OH;

R₆ означает H, C₁-C₈алкил, или R₆ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₀-C₄алкил)CONH₂, (C₀-C₄алкил)COOH, (C₀-C₄алкил)NH₂, (C₀-C₄алкил)OH, галогена, при условии, что оба R₁ и R₂ не являются H, когда R₄ и R₃ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо.

В некоторых вариантах осуществления только один пролекарственный фрагмент связан с Q. Например, в таких вариантах осуществления, когда пролекарственный фрагмент (A-B) связан с Q на N-конце, нет пролекарственных фрагментов (A-B), связанных с внутренним аминокислотным остатком в последовательности Q, и наоборот. В некоторых вариантах осуществления два или три пролекарственных фрагмента связаны с Q, например, на N-конце и в одном или нескольких внутренних участках.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой график, показывающий изменение массы тела у мышей с индуцированным потреблением пищи ожирением (DIO), которым внутрибрюшинно инъецировали однократную недельную дозу 15 или 70 нмоль/кг аналога глюкагона. Мышей ежедневно взвешивали (N=8) после начальной инъекции следующих средств: только наполнителя ▼, пептида A глюкагонового надсемейства («пептида A») в дозе 15 нмоль/кг или 70 нмоль/кг или пролекарственного производного пептида A, в котором дипептид связан с N-концом пептида A амидной связью, где дипептид представляет собой Aib^-1Pro⁰ (вводимый в дозе 15 нмоль/кг (○) или 70 нмоль/кг (●), Aib^-1dPro⁰ (вводимый в дозе 70 нмоль/кг , Lys^-1Sar⁰ (вводимый в дозе 70 нмоль/кг (♦), dAla^-1Pro⁰ (вводимый в дозе 70 нмоль/кг или Ac-Aib^-1Pro^-1 (вводимый в дозе 70 нмоль/кг (■).

Фиг.2 представляет собой график, показывающий изменение массы тела у мышей с индуцированным потреблением пищи ожирением (DIO), которым внутрибрюшинно инъецировали однократную недельную дозу 0,5, 3, 15 или 70 нмоль/кг либо только наполнителя (♦), либо пептида A (в дозе 0,5 ▲, 3 , 15 ▼ или 70 нмоль/кг/сутки), либо Lys^-1Sar⁰-пептида A (в дозе 0,5 , 3 , 15 или 70 нмоль/кг/сутки).

Фиг.3 является графиком уровней глюкозы в крови (мг/дл) у мышей DIO (N=8), которым инъецировали сначала родственный глюкагону пептид, а затем раствор глюкозы. Мышам во временной точке -60 минут внутрибрюшинно инъецировали только наполнитель (▲) или дозу 15 или 70 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) пептид A (в дозе 15 или 70 нмоль/кг/сутки),

(B) Lys^-1Sar⁰-пептид A (в дозе 15 или 70 нмоль/кг/сутки), или

(C) dLys^-1Sar⁰-пептид A (в дозе 15 или 70 ■ нмоль/кг/сутки).

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во временной точке 0 минут. Уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках -60, 0, 15, 30, 60 и 120 минут.

Фиг.4 представляет собой график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у мышей DIO (N=8), которым сначала инъецировали родственный глюкагону пептид, а затем раствор глюкозы. Мышам внутрибрюшинно во временной точке -15 минут инъецировали либо только наполнитель (▲), либо дозу 2 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) Lys^-1Sar⁰-пептид A (■),

(B) Lys^-1(X),Sar⁰-пептид A (▲) (X означает цепь ПЭГ 1 кДа, связанную с боковой цепью Lys),

(C) Lys^-1(Y),Sar⁰-пептид A (♦) (Y означает трет-бутилглицин, связанный с боковой цепью Lys),

(D) dLys^-1Sar⁰-пептид A .

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во временной точке 0 минут. Уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках -15, 0, 15, 30, 60 и 120 минут.

Фиг.5 представляет собой график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у мышей DIO (N=8), которым сначала инъецировали родственный глюкагону пептид, а затем раствор глюкозы. Мышам внутрибрюшинно во временной точке -15 минут инъецировали либо наполнитель (▼), либо дозу 20 нмоль/кг dLys^-1Sar⁰-пептида A , либо дозу 0,67 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) Lys^-1Sar⁰-пептид A (■),

(B) Lys^-1(X),Sar⁰-пептид A (▼) (X означает цепь ПЭГ 1 кДа, связанную с боковой цепью Lys),

C) Lys^-1(Y),Sar⁰-пептид A (♦) (Y означает трет-бутилглицин, связанный с боковой цепью Lys).

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во временной точке 0 минут. Уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках -15, 0, 15, 30, 60 и 120 минут.

Фиг.6 представляет собой график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у мышей DIO (N=8), которым сначала инъецировали родственный глюкагону пептид, а затем раствор глюкозы. Мышам внутрибрюшинно во временной точке -60 минут инъецировали либо только наполнитель (▼), либо дозу 15 или 70 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) пептид A (в дозе 15 или 70 ▲ нмоль/кг/сутки),

(B) dLys^-1Sar⁰-пептид A (в дозе 15 или 70 ■ нмоль/кг/сутки), или

(C) Lys^-1Sar⁰-пептид A (в дозе 15 или 70 нмоль/кг/сутки).

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во временной точке 0 минут и спустя 24 часа (см. фиг.7). Указанные уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках -60, 0, 15, 30, 60 и 120 минут от момента первого введения раствора глюкозы (т.е. с временной точкой 0 минут).

Фиг.7 представляет собой график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у мышей DIO (N=8), которым внутрибрюшинно во временной точке -60 минут инъецировали либо только наполнитель (▼), либо дозу 15 или 70 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) пептид A (в дозе 15 или 70 ▲ нмоль/кг/сутки),

(B) dLys^-1Sar⁰-пептид A (в дозе 15 или 70 нмоль/кг/сутки), или

(C) Lys^-1Sar⁰-пептид A (в дозе 15 ♦ или 70 ■ нмоль/кг/сутки).

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во временной точке 0 минут и спустя 24 часа (см. фиг.7). Указанные уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках 0, 15, 30, 60 и 120 минут от момента введения второго раствора глюкозы через 24 часа.

На фиг.8 представлены данные, показывающие потерю массы у мышей DIO (N=8), которым внутрибрюшинно инъецировали указанные соединения в дозе либо 15, либо 70 нмоль/кг. Указанные массы тела определяли через 7 суток после введения соединений.

На фиг.9A-B представлены графики уровней глюкозы в крови (BG) (мг/дл) у мышей DIO (n=8). Мышам внутрибрюшинно инъецировали только наполнитель или пролекарственный пептид в точках 24, 8, 4 или 1 час до стимуляции (как указано на фигуре) с использованием инъекции 25% глюкозы в физиологическом растворе в дозе 1,5 г/кг массы тела. Указанные уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках 0, 15, 30, 60 и 120 минут от момента стимуляции раствором глюкозы. На фиг.9A показаны уровни глюкозы в крови после введения Lys^-1Sar⁰-пептида A (т.е. содержащего пролекарственный элемент Lys^-1Sar⁰). На фиг.9B показаны уровни глюкозы в крови после введения dLys^-1Sar⁰-пептида A (т.е. содержащего пролекарственный элемент D-Lys^-1-Sar⁰).

На фиг.10 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей различных пептидов глюкагонового надсемейства или их соответствующих фрагментов. Представлены аминокислотные последовательности GHRH (SEQ ID NO:719), PHI (SEQ ID NO:722), VIP (SEQ ID NO:720), PACAP-27 (SEQ ID NO:721), эксендина-4 (SEQ ID NO:718), GLP-1 (SEQ ID NO:703), глюкагона (SEQ ID NO:701), оксинтомодулина (SEQ ID NO:706), GIP (SEQ ID NO:707), GLP-2 (SEQ ID NO:708) и секретина (SEQ ID NO:724).

На фиг.11 представлен график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у мышей DIO (девять групп по восемь мышей), которым подкожно инъецировали однократную дозу либо только наполнителя, либо 10 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) пептида C глюкагонового надсемейства («пептида C»),

(B) dK-Sar-пептида C,

(C) dK-Gly(N-гексил)пептида B глюкагонового надсемейства («пептида B») или

(D) dK-F(N-Me)-пептида C.

Возраст мышей составлял 5,5 месяцев, и они получали корм с высоким содержанием жира в течение примерно 2 месяцев. Уровни глюкозы в крови определяли через 0, 2, 4, 24 и 72 часа после инъекции.

На фиг.12 представлен график изменения массы тела у мышей DIO (девять групп по восемь мышей), которым подкожно инъецировали однократную дозу либо только наполнителя, либо 10 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) пептида C,

(B) dK-Sar-пептида C,

(C) dK-Gly(N-гексил)пептида B или

(D) dK-F(N-Me)пептида C.

Возраст мышей составлял 5,5 месяцев, и они получали корм с высоким содержанием жира в течение примерно 2 месяцев. Потребление пищи и массу жира контролировали в течение недельного исследования.

На фиг.13A и 13B представлена активность при связывании рецептора dK-Gly(N-гексил)пептида B (фиг.13A) и dK-Sar-пептида C (фиг.13B) в 20% плазме человека, которую определяли, используя люциферазный анализ GLP-рецептора.

На фиг.14 представлен график изменения массы тела у мышей DIO (n=8), которым подкожно инъецировали однократную дозу 3, 10 или 30 нмоль/кг либо только наполнителя, либо одного из следующих соединений:

(A) пептида C,

(B) dLys^-1Sar⁰-пептида C или

(C) dLys^-1Gly(N-гексил)⁰-пептида B.

Массы тела определяли в 1, 3, 5 и 7 дни исследования. Возраст мышей составлял 5 месяцев с начальной средней массой тела 31,2 г, и мыши получали стандартный сухой корм в течение примерно 5 месяцев.

На фиг.15A-C представлены графики уровней глюкозы в крови (BG) (мг/дл) у мышей DIO (n=8), которым подкожно инъецировали однократную дозу 3, 10 или 30 нмоль/кг только наполнителя или одного из следующих соединений:

(A) пептида C,

(B) dLys^-1Sar⁰-пептида C или

(C) dLys^-1Gly(N-гексил)⁰-пептида B.

Указанные уровни глюкозы в крови определяли в образцах, взятых внутрибрюшинно в 1 день (фиг.15A), 3 день (фиг.15B) и 5 день (фиг.15C). Возраст мышей составлял 5 месяцев, и они получали стандартный сухой корм в течение примерно 5 месяцев.

Подробное описание

Определения

В описании и в формуле изобретения будет использована следующая терминология в соответствии с определениями, приведенными ниже.

Как используется в настоящем описании, термин «пролекарство» определяют как любое соединение, которое подвергается химической модификации перед проявлением его полных фармакологических эффектов.

Как используется в настоящем описании, термин «аминокислота» охватывает любые молекулы, содержащие как амино, так и карбоксильные функциональные группы, где аминогруппы и карбоксилатные группы связаны с одним и тем же атомом углерода (альфа-атомом углерода). Альфа-атом углерода необязательно может иметь один или два дополнительных органических заместителя. Аминокислота может быть обозначена трехбуквенным кодом, однобуквенным кодом или в некоторых случаях названием ее боковой цепи. Например, неприродную аминокислоту, содержащую группу циклогексана, связанную с альфа-атомом углерода, называют «циклогексан» или «циклогексил». Для целей настоящего изобретения подразумевается, что обозначение аминокислоты без конкретного приведения ее стереохимии охватывает либо L-форму, либо D-форму данной аминокислоты, либо рацемическую смесь. Однако в случае, когда аминокислота обозначена трехбуквенным кодом и имеет надстрочное число (т.е. Lys^-1), подразумевается, что обозначение конкретно указывает нативную L-форму аминокислоты, тогда как D-форма конкретно будет обозначена с помощью включения строчной буквой d перед трехбуквенным кодом и надстрочным числом (т.е. dLys^-1).

Как используется в настоящем описании, термин «гидроксикислота» относится к аминокислоте, которая была модифицирована, чтобы заменить аминогруппу при альфа-атоме углерода гидроксильной группой.

Как используется в настоящем описании, термин «некодируемая аминокислота» включает любую аминокислоту, которая не является L-изомером любой из следующих 20 аминокислот: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr.

«Дипептид» является результатом связывания α-аминокислоты или α-гидроксикислоты с другой аминокислотой через пептидную связь.

Как используется в настоящем описании, термин «химическое расщепление» без любого дополнительного обозначения включает неферментативную реакцию, которая приводит к разрыву ковалентной химической связи.

«Биологически активный полипептид» относится к полипептидам, которые способны оказывать биологическое воздействие in vitro и/или in vivo.

Как используется в настоящем описании, «ацилированная» аминокислота означает аминокислоту, содержащую ацильную группу, которая не является нативной по отношению к встречающейся в природе аминокислоте, независимо от способов, которыми она получена. Примеры способов получения ацилированных аминокислот и ацилированных пептидов известны в данной области и включают ацилирование аминокислоты до включения в пептид или синтез пептида с последующим химическим ацилированием пептида. В некоторых вариантах осуществления ацильная группа приводит к пептиду, обладающему одним или несколькими из следующих свойств: (i) пролонгированное время полужизни в кровообращении, (ii) задержку начала действия, (iii) увеличенную продолжительность действия, (iv) повышенную устойчивость к протеазам, таким как DPP-IV, и (v) повышенную эффективность в отношении рецепторов пептидов глюкагонового надсемейства и/или пептидов остеокальцина.

Как используется в настоящем описании, «алкилированная» аминокислота означает аминокислоту, содержащую алкильную группу, которая не является нативной по отношению к встречающейся в природе аминокислоте, независимо от способов, которыми она получена. Примеры способов получения алкилированных аминокислот и алкилированных пептидов известны в данной области и включают алкилирование аминокислоты до включения в пептид или синтез пептида с последующим химическим алкилированием пептида. Не придерживаясь какой-либо конкретной теории, полагают, что алкилирование пептидов будет приводить к сходным, если не одним и тем же, эффектам, что и ацилирование пептидов, например, пролонгированному времени полужизни в кровообращении, задержке начала действия, увеличенной продолжительности действия, повышенной устойчивости к протеазам, таким как DPP-IV, и повышенной эффективности в отношении рецепторов пептидов глюкагонового надсемейства и/или пептидов остеокальцина.

Как используется в настоящем описании, подразумевается, что общая ссылка на пептид охватывает пептиды, которые имеют модифицированный амино- и карбокси-конец. Например, подразумевается, что аминокислотная последовательность, состоящая из стандартных аминокислот, включает стандартные аминокислоты на N- и C-конце, а также соответствующую гидроксикислоту на N-конце и/или соответствующую C-концевую аминокислоту, модифицированную так, чтобы она содержала амидную группу вместо концевой группы карбоновой кислоты.

Как используется в настоящем описании, термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые стандартные фармацевтические носители, такие как забуференный фосфатом солевой раствор, вода, эмульсии, такие как масло/вода или вода/масло, и различные типы увлажнителей. Термин также охватывает любое из средств, одобренных регулирующим органом Федерального правительства США или перечисленных в Фармакопеи США для применения на животных, включая человека.

Как используется в настоящем описании, термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к солям соединений, которые сохраняют биологическую активность исходного соединения и которые не являются биологически или в других отношениях нежелательными. Многие из соединений, описанных в настоящем описании, способны образовывать соли кислот и/или оснований благодаря присутствию аминогрупп и/или карбоксильных групп или групп, сходных с ними.

Фармацевтически приемлемые основно-аддитивные соли могут быть получены из неорганических и органических оснований. Соли, полученные из неорганических оснований, включают, но только в качестве примера, соли натрия, калия, лития, аммония, кальция и магния. Соли, полученные из органических оснований, включают, но без ограничения, соли первичных, вторичных и третичных аминов.

Фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли могут быть получены из неорганических и органических кислот. Соли, полученные из неорганических кислот, включают соли хлористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты, серной кислоты, азотной кислоты, фосфорной кислоты и подобных. Соли, полученные из органических кислот, включают соли уксусной кислоты, пропионовой кислоты, гликолевой кислоты, пировиноградной кислоты, щавелевой кислоты, яблочной кислоты, малоновой кислоты, янтарной кислоты, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, лимонной кислоты, бензойной кислоты, коричной кислоты, миндальной кислоты, метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты, салициловой кислоты и подобных.

Как используется в настоящем описании, термин «лечение» включает профилактику конкретного расстройства или состояния или ослабление симптомов, ассоциированных с конкретным расстройством или состоянием, и/или предотвращение или устранение указанных симптомов. Например, как используется в настоящем описании, термин «лечение диабета» в основном будет относиться к поддержанию уровней глюкозы в крови около нормальных уровней и может включать повышение или снижение уровней глюкозы в крови в зависимости от данной ситуации.

Как используется в настоящем описании, «эффективное» количество или «терапевтически эффективное количество» пролекарства относится к нетоксичному, но достаточному количеству пролекарства для обеспечения требуемого эффекта. Например, одним из требуемых эффектов может быть профилактика или лечение гипергликемии. Количество, которое является «эффективным» будет варьировать от субъекта к субъекту, в зависимости от возраста и общего состояния здоровья пациента, способа введения и подобного. Таким образом, не всегда можно конкретно указать точное «эффективное количество». Однако подходящее «эффективное» количество в любом отдельном случае может определить специалист в данной области, используя обычное экспериментирование.

Термин «парентеральный» означает не через пищеварительный тракт, а некоторым иным путем, таким как подкожный, внутримышечный, интраспинальный или внутривенный.

Термин «идентичность», как используется в настоящем описании, относится к сходству между двумя или более последовательностями. Идентичность измеряют делением количества идентичных остатков на общее количество остатков и умножением полученного результата на 100, получая идентичность в процентах. Таким образом, две копии, имеющие в точности одну и ту же последовательность, имеют 100% идентичность, тогда как две последовательности, которые имеют делеции, добавления или замены аминокислот по сравнению друг с другом, имеют более низкую степень идентичности. Специалистам в данной области будет понятно, что имеется несколько компьютерных программ, таких как программы, в которых используются такие алгоритмы, как BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215: 403-410) для определения идентичности последовательностей.

Термин «родственный глюкагону пептид» относится к таким пептидам, которые обладают биологической активностью (как агонисты или антагонисты) в отношении любого одного или нескольких рецепторов глюкагона, GLP-1, GLP-2 и GIP и содержат аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична (например, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%) по меньшей мере с одной из последовательностей нативного глюкагона, нативного оксинтомодулина, нативного эксендина-4, нативного GLP-1, нативного GLP-2 или нативного GIP. Если не указано иное, любая ссылка на положение аминокислоты в родственном глюкагону пептиде (например, для связывания пролекарственного фрагмента, конъюгируемого фрагмента, гидрофильного полимера, ацилирования или алкилирования) относится к положению относительно аминокислотной последовательности нативного глюкагона (SEQ ID NO:701).

Термин «пептид глюкагонового надсемейства» относится к группе пептидов, родственных по структуре в их N-концевых и C-концевых областях (см., например, Sherwood et al., Endocrine Reviews 21: 619-670 (2000)). Представители такой группы включают все родственные глюкагону пептиды, а также соматотропин-рилизинг-гормон (GHRH; SEQ ID NO:719), вазоактивный интестинальный пептид (VIP; SEQ ID NO:720), полипептид 27, активирующий аденилатциклазу гипофиза (PACAP-27; SEQ ID NO:721), пептид-гистидин-изолейцин (PHI), пептид-гистидин-метионин (PHM; SEQ ID NO:722), секретин (SEQ ID NO:723) и аналоги, производные или конъюгаты, имеющие до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных модификаций по сравнению с нативным пептидом. Такие пептиды предпочтительно сохраняют способность взаимодействовать (как агонисты или антагонисты) с рецепторами надсемейства рецепторов глюкагона. Если не указано иное, любая ссылка на положение аминокислоты в пептиде глюкагонового надсемейства (например, для связывания пролекарственного фрагмента, конъюгируемого фрагмента, гидрофильного полимера, ацилирования или алкилирования) относится к положению относительно аминокислотной последовательности нативного глюкагона (SEQ ID NO:701), см. фиг.10 в отношении выравнивания репрезентативных пептидов глюкагонового надсемейства.

Термин «агонист GLP-1» относится к соединению, которое стимулирует активность рецептора GLP-1, измеренную по продуцированию цАМФ с использованием подтвержденного анализа на модели in vitro, такого как анализ, описанный в примере 13 опубликованной международной заявки № WO 2007/056362, которая опубликована 18 мая 2007, описание которой, таким образом, специально включено в настоящее описание посредством ссылки.

Как используется в настоящем описании, термин «нативный GLP-1» является родовым термином, который означает GLP-1(7-36)амид (состоящий из последовательности SEQ ID NO:704), GLP-1(7-37)кислоту (состоящую из последовательности SEQ ID NO:703) или смесь указанных двух соединений. Как используется в настоящем описании, подразумевается, что общее указание «GLP-1» в отсутствие любого дополнительного обозначения означает нативный GLP-1.

Как используется в настоящем описании, термин «глюкагоновый пептид» является родовым термином, который обозначает природный глюкагоновый пептид с последовательностью SEQ ID NO:701, а также модифицированные производные, имеющие одну или несколько аминокислотных модификаций по сравнению с нативной последовательностью глюкагона, необязательно включая, но без ограничения, замены в положениях аминокислот 1, 2, 5, 7, 8, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 24, 28 и 29. Обычно все обозначения конкретного положения аминокислоты номером (например, положение 28) относятся к аминокислоте в указанном положении в нативном глюкагоне (SEQ ID NO:701) или соответствующему положению аминокислоты в любом его аналоге. Например, обозначение «положение 28» будет указывать на соответствующее положение 27 в случае аналога глюкагона, в котором первая аминокислота в SEQ ID NO:701 была делетирована. Подобным образом, обозначение «положение 28» будет указывать на соответствующее положение 29 в случае аналога глюкагона, в котором одна аминокислота была добавлена перед N-концом последовательности SEQ ID NO:701.

Как используется в настоящем описании, термин «пептид GLP-1» является родовым термином, который означает нативный GLP-1, а также модифицированные производные, имеющие одну или несколько модификаций аминокислот по сравнению с нативной последовательностью GLP-1.

Как используется в настоящем описании, «модификация» аминокислоты относится к замене, добавлению или делеции аминокислоты и включает замену или добавление любой из 20 аминокислот, обычно встречающихся в белках человека, а также необычных или не встречающихся в природе аминокислот. Коммерческие источники необычных аминокислот включают Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), ChemPep Inc. (Miami, FL) и Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, MA). Необычные аминокислоты можно приобрести у коммерческих поставщиков, синтезировать de novo или можно химически модифицировать или дериватизировать встречающиеся в природе аминокислоты. Модификации аминокислот включают связывание аминокислоты с конъюгируемым фрагментом, таким как гидрофильный полимер, ацилирование, алкилирование и/или другую химическую дериватизацию аминокислоты.

Как используется в настоящем описании, «замена» аминокислоты относится к замене одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком.

Как используется в настоящем описании, термин «консервативная аминокислотная замена» определяют как замену в пределах одной из следующих пяти групп:

I. малые алифатические, неполярные или слабо полярные остатки:

Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;

II. полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды:

Asp, Asn, Glu, Gln;

III. полярные, положительно заряженные остатки:

His, Arg, Lys; орнитин (Orn);

IV. крупные алифатические неполярные остатки:

Met, Leu, He, Val, Cys, норлейцин (Nle), гомоцистеин;

V. крупные ароматические остатки:

Phe, Tyr, Trp, ацетилфенилаланин.

Как используется в настоящем описании, термин «химера 2» относится к глюкагоновому пептиду, в котором аминокислотная последовательность нативного глюкагона (SEQ ID NO:701) содержит следующие модификации: Gln в положении 17, Ala в положении 18, Lys в положении 20, Glu в положении 21, Ile в положении 23 и Ala в положении 24 и C-концевой амид.

Как используется в настоящем описании, общий термин «цепь полиэтиленгликоля» или «цепь ПЭГ» относится к смесям конденсированных полимеров этиленоксида и воды с разветвленной или неразветвленной цепью, представленных общей формулой H(OCH₂CH₂)_kOH, где k равно по меньшей мере 9. В отсутствии какой-либо дополнительной характеристики подразумевают, что термин включает полимеры этиленгликоля со средней молекулярной массой, выбранной из диапазона от 500 до 80000 дальтон. «Цепь полиэтиленгликоля» или «цепь ПЭГ» используют в сочетании с числовым подстрочным индексом, который указывает примерную среднюю молекулярную массу. Например, ПЭГ-5000 (ПЭГ 5 кДа) относится к цепи полиэтиленгликоля, имеющей общую среднюю молекулярную массу примерно 5000 дальтон.

Как используется в настоящем описании, термин «пегилированный» и подобные термины относятся к соединению, которое было модифицировано по сравнению с его нативным состоянием путем связывания цепи полиэтиленгликоля с соединением. «Пегилированный полипептид» представляет собой полипептид, который имеет цепь ПЭГ, ковалентно связанную с полипептидом.

Как используется в настоящем описании, «линкер» означает связь, молекулу или группу молекул, которые связывают два отдельных объекта друг с другом. Линкеры могут обеспечивать оптимальное расположение двух объектов или могут дополнительно обеспечивать лабильную связь, которая обеспечивает отделение двух объектов друг от друга. Лабильные связи включают фотоотщепляемые группы, кислотолабильные фрагменты, щелочелабильные фрагменты и отщепляемые ферментами группы.

Как используется в настоящем описании, «димер» означает комплекс, содержащий две субъединицы, ковалентно связанные друг с другом линкером. Термин димер при использовании в отсутствие какого-либо уточняющего пояснения охватывает как гомодимеры, так и гетеродимеры. Гомодимер содержит две идентичные субъединицы, тогда как гетеродимер содержит две субъединицы, которые являются хотя разными, но в значительной степени сходными друг с другом субъединицами.

Термин «C₁-C_nалкил», где n может быть равен от 1 до 6, как используется в настоящем описании, означает разветвленную или неразветвленную алкильную группу, имеющую от одного до указанного количества атомов углерода. Конкретные C₁-C₆алкильные группы включают, но без ограничения, метил, этил, н-пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, гексил и подобные.

Термин «C₂-C_nалкенил», где n может быть равен от 2 до 6, как используется в настоящем описании, означает олефиновую ненасыщенную разветвленную или неразветвленную группу, имеющую от 2 до указанного количества атомов углерода и по меньшей мере одну двойную связь. Примеры таких групп включают, но без ограничения, 1-пропенил, 2-пропенил (-CH₂-CH=CH₂), 1,3-бутадиенил, (-CH=CHCH=CH₂), 1-бутенил (-CH=CHCH₂CH₃), гексенил, пентенил и подобные.

Термин «C₂-C_nалкинил», где n может быть равен от 2 до 6, относится к ненасыщенной разветвленной или неразветвленной группе, имеющей от 2 до n атомов углерода и по меньшей мере одну тройную связь. Примеры таких групп включают, но без ограничения, 1-пропинил, 2-пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил и подобные.

Как используется в настоящем описании, термин «арил» относится к моно или бициклической карбоциклической кольцевой системе, имеющей один или два ароматических кольца, включая, но без ограничения, фенил, нафтил, тетрагидронафтил, инданил, инденил и подобные. Размер арильного кольца и наличие заместителей или связывающих групп указаны путем обозначения количества присутствующих атомов углерода. Например, термин «(C₁-C₃алкил)(C₆-C₁₀арил)» относится к 6-10-членному арилу, который связан с исходным остатком одно-трехчленной алкильной цепью.

Термин «гетероарил», как используется в настоящем описании, относится к моно или бициклической кольцевой системе, содержащей одно или два ароматических кольца и содержащей по меньшей мере один атом азота, кислорода или серы в ароматическом кольце. Размер гетероарильного кольца и наличие заместителей или связывающих групп указывают, обозначая количество присутствующих атомов углерода. Например, термин «(C₁-C_nалкил)(C₅-C₆гетероарил)» относится к 5 или 6-членному гетероарилу, который связан с исходным остатком одно-n-членной алкильной цепью.

Как используется в настоящем описании, термин «гетероалкил» относится к неразветвленному или разветвленному углеводороду, содержащему указанное количество атомов углерода и по меньшей мере один гетероатом в остове структуры. Подходящие гетероатомы для целей настоящего изобретения включают, но без ограничения, N, S и O.

Как используется в настоящем описании, термин «галоген» относится к одному или нескольким представителям группы, состоящей из фтора, хлора, брома и йода.

Как используется в настоящем описании, термин «заряженная аминокислота» относится к аминокислоте, которая содержит боковую цепь, которая отрицательно заряжена (т.е. депротонирована) или положительно заряжена (т.е. протонирована) в водном растворе при физиологическом pH. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, цистеиновую кислоту, гомоцистеиновую кислоту и гомоглутаминовую кислоту, тогда как положительно заряженные аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин. Заряженные аминокислоты включают заряженные аминокислоты из 20 аминокислот, обычно встречающихся в белках человека, а также нетипичные или не встречающиеся в природе аминокислоты.

Как используется в настоящем описании, термин «кислая аминокислота» относится к аминокислоте, которая содержит второй остаток кислоты (т.е. остаток, отличный от α-карбоксильной группы, которую имеют все аминокислоты), включая, например, группу карбоновой кислоты или сульфоновой кислоты.

Как используется в настоящем описании, подразумевается, что термин «пациент» без дополнительного определения охватывает любое теплокровное позвоночное домашнее животное (включая, например, но без ограничения, крупный рогатый скот, лошадей, кошек, собак и других комнатных животных), млекопитающих и человека.

Варианты осуществления изобретения

В настоящем описании раскрыт препарат пролекарственных производных биологически активных полипептидов, полезных при лечении заболевания, например, диабета, ожирения. Более конкретно, пролекарства, описанные в настоящем описании, составляют в композиции для того, чтобы увеличить время полужизни исходного биологически активного пептида или белка, обеспечивая при этом возможность для последующей активации пролекарства посредством механизма неферментативного расщепления. Идеальное пролекарство должно быть растворимым в воде в физиологических условиях (например, при pH 7,2 и 37°C), и оно должно быть стабильным в форме порошка при длительном хранении. Также оно должно быть иммунологически бессимптомным и проявлять низкую активность по сравнению с исходным лекарственным средством. В некоторых вариантах осуществления пролекарство будет проявлять не более чем 10% активность от исходного лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления пролекарство проявляет менее чем примерно 10%, менее чем примерно 5%, примерно 1% или менее чем примерно 1% активность по сравнению с исходным лекарственным средством. Кроме того, пролекарство при инъекции в организм должно количественно превращаться в активное лекарственное средство в течение определенного периода времени. Как указано в настоящем описании, авторы изобретения предложили общий способ получения пролекарств известного биологически активного полипептида, выбранного из группы, состоящей из пептидов глюкагонового надсемейства, включая родственные глюкагону пептиды, и остеокальцин, и аналоги, производные и конъюгаты таких полипептидов, которые соответствуют каждой из указанных целей.

Более конкретно, предлагается химически обратимое пролекарство, содержащее последовательность пептида глюкагонового надсемейства, включая, например, родственный глюкагону пептид или остеокальцин, или его аналог, производное или конъюгат, модифицированный таким образом, чтобы он содержал дипептидный пролекарственный элемент, ковалентно связанный с пептидом амидной связью. Ковалентное связывание дипептидного пролекарственного элемента с активным участком пептида глюкагонового надсемейства ингибирует активность полипептида вплоть до отщепления дипептидного пролекарственного элемента. В некоторых вариантах осуществления предлагается пролекарство, имеющее «время неферментативной полуактивации» (t_1/2) примерно от 1 до примерно 720 часов в физиологических условиях. Подразумевается, что физиологические условия, описанные в настоящем описании, включают температуру примерно от 35 до 40°C и pH примерно от 7,0 до примерно 7,4, и, как правило, включают pH от 7,2 до 7,4 и температуру от 36 до 38°C.

Преимущественно скорость расщепления и, следовательно, активации пролекарства зависит от структуры и стереохимии дипептидного пролекарственного элемента. Пролекарства, предлагаемые в изобретении, в конечном счете, химически превращаются в структуры, которые распознаются нативным рецептором лекарственного средства, где скорость такого химического превращения определяет время начала и продолжительность биологического действия in vivo. Структура молекул, раскрытых в настоящем изобретении, основана на внутримолекулярной химической реакции, которая не зависит от дополнительных химических добавок или ферментов. Скорость превращения регулируется химической природой дипептидного заместителя и его отщеплением в физиологических условиях. Так как физиологическое значение pH и температура строго регулируются в сильно ограниченном диапазоне, скорость превращения из пролекарства в лекарственное средство будет в высокой степени воспроизводима у пациента и между пациентами.

Как описано в настоящем описании, предлагаются пролекарства, которые имеют увеличенное время полужизни благодаря существованию в пролекарственной форме, составляющее по меньшей мере примерно 1 час и в некоторых вариантах осуществления больше примерно 20 часов. В некоторых вариантах осуществления время полужизни пролекарств составляет примерно 1, 6, 8, 12, 20, 24, 48 или 72 часов. В некоторых вариантах осуществления время полужизни пролекарства составляет примерно 100 часов или больше, включая время полужизни вплоть до примерно 168, 336, 504, 672 или 720 часов, и пролекарства превращаются в активную форму в физиологических условиях в результате неферментативной реакции, стимулируемой свойственной им химической нестабильностью. В некоторых вариантах осуществления время t_1/2 неферментативной активации пролекарства составляет 1-100 часов, и, как правило, от 12 до 72 часов, например, от 12 до 48 часов и от 48 до 72 часов, и в некоторых вариантах осуществления t_1/2 составляет 24-48 часов согласно измерению посредством инкубации пролекарства в забуференном фосфатом растворе (например, PBS) при 37°C и pH 7,2. В другом варианте осуществления время t_1/2 неферментативной активации пролекарства составляет от 1 до 6 часов, например примерно 1 час, примерно 2 часа, примерно 3 часа, примерно 4 часа, примерно 5 часов или примерно 6 часов. В другом варианте осуществления время t_1/2 неферментативной активации пролекарства составляет от 6 до 24 часов. Время полужизни различных пролекарств вычисляют, используя формулу t_1/2=0,693/k, где «k» означает константу скорости первого порядка разложения пролекарства. В некоторых вариантах осуществления активация пролекарства осуществляется после отщепления связанного амидной связью дипептида, образования дикетопиперазина или дикетоморфолина и высвобождения активного полипептидного лекарственного средства. Были идентифицированы конкретные дипептиды, состоящие из природных, некодируемых и/или синтетических аминокислот, которые способствуют внутримолекулярному разложению в физиологических условиях с высвобождением активных полипептидов.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пролекарство пептида глюкагонового надсемейства или остеокальцина, или его аналога, производного или конъюгата, имеющее структуру A-B-Q. В данном варианте осуществления Q означает пептид, A означает аминокислоту или гидроксикислоту, и B означает N-алкилированную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления пептид глюкагонового надсемейства является родственным глюкагону пептидом. A и B вместе представляют собой дипептидный пролекарственный элемент, который связан с Q в результате образования амидной связи между A-B и амином Q. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна из аминокислот A, B или аминокислоты Q, с которой связан A-B, представляет собой некодируемую аминокислоту. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент выбирают таким образом, чтобы химическое отщепление A-B от Q завершалось по меньшей мере примерно на 90% в пределах примерно от 1 до примерно 720 часов в PBS в физиологических условиях. В следующем варианте осуществления аминокислоты дипептида выбирают таким образом, чтобы время полуотщепления A-B от Q в PBS в физиологических условиях было не больше, чем двух-пяти-кратное время полуотщепления A-B от Q в растворе, содержащем протеазу DPP-IV (включая, например, сыворотку человека).

Согласно некоторым вариантам осуществления аминогруппу алифатического соединения Q (например, первичный амин), включая, например, N-концевой амин или аминогруппу боковой цепи аминокислоты, модифицируют ковалентным связыванием дипептидного пролекарственного элемента амидной связью. В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связывают с аминогруппой боковой цепи аминокислоты, присутствующей в Q, либо непосредственно, либо через связывающий остаток. В некоторых вариантах осуществления связывающий остаток содержит амин, несущий ацильную группу или алкильную группу. В некоторых вариантах осуществления предлагается пептид глюкагонового надсемейства, например, родственный глюкагону пептид, содержащий ацильную группу или алкильную группу, ковалентно связанную с аминокислотой в положении 10 или 20 пептида глюкагонового надсемейства, где ацильная группа или алкильная группа дополнительно содержит дипептидный пролекарственный элемент, связанный с ацильной группой или алкильной группой амидной связью. Например, данный вариант осуществления предусматривает, что пролекарство связано с аминогруппой Q либо непосредственно, либо через линкерную группу, и ацильная или алкильная связана с пролекарством либо непосредственно, либо через линкерный остаток.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан непосредственно с боковой цепью аминокислоты, где аминокислота имеет общую структуру:

где n означает целое число от 1 до 4.

Альтернативно, дипептидный пролекарственный элемент может быть связан с амино-заместителем, присутствующим на арильном кольце ароматической аминокислоты, включая, например, ароматическую аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из амино-Phe, аминонафитилаланина, аминотриптофана, аминофенилглицина, аминогомо-Phe и аминотирозина. В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с аминогруппой ароматической аминокислоты, имеющей общую структуру:

где m означает целое число от 0 до 3. В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с 4-аминогруппой аминокислоты, имеющей общую структуру:

где m означает целое число от 0 до 3. В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с аминогруппой боковой цепи аминокислоты лизина или аминогруппой ароматического соединения 4-аминофенилаланина (которым заменен остаток нативного фенилаланина или тирозина биологически активного пептида). В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с первичным амином, присутствующим на внутренней аминокислоте пептида глюкагонового надсемейства, включая родственный глюкагону пептид или остеокальцин, или его аналог, производные или конъюгат.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент имеет общую структуру A-B, где A означает аминокислоту или гидроксикислоту, и B означает N-алкилированную аминокислоту, которая может быть связана амидной связью с первичной аминогруппой такого пептида с получением соответствующего пролекарства пептида. В некоторых вариантах осуществления пептидом глюкагонового надсемейства является родственный глюкагону пептид. В некоторых вариантах осуществления A и B выбраны так, чтобы в случае, когда дипептид A-B связан с первичным амином такого пептида амидной связью, химическое отщепление A-B от пептида завешалось по меньшей мере примерно на 90% в пределах примерно от 1 до примерно 720 часов в PBS в физиологических условиях. В некоторых вариантах осуществления аминокислоты A и/или B являются аминокислотами в D-стереоизомерной конфигурации. В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислота A является аминокислотой в D-стереоизомерной конфигурации, а аминокислота B является аминокислотой в L-стереоизомерной конфигурации. В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислота A является аминокислотой в L-стереоизомерной конфигурации, а аминокислота B является аминокислотой в D-стереоизомерной конфигурации. В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислота A является аминокислотой в D-стереоизомерной конфигурации, и аминокислота B является аминокислотой в D-стереоизомерной конфигурации.

Согласно некоторым вариантам осуществления дипептидный пролекарственный элемент может быть дополнительно модифицирован так, чтобы он содержал гидрофильный остаток. В некоторых вариантах осуществления гидрофильный остаток представляет собой цепь полиэтиленгликоля. Согласно некоторым вариантам осуществления цепь полиэтиленгликоля с молекулярной массой 40 кДа или выше ковалентно связана с боковой цепью аминокислоты A или B дипептидного пролекарственного элемента. В другом варианте осуществления дипептидный пролекарственный элемент, дополнительно или альтернативно, ацилирован или алкилирован жирной кислотой или желчной кислотой или ее солью, например, C4-C30-жирной кислотой, C8-C24-жирной кислотой, холевой кислотой, C4-C30алкилом, C8-C24алкилом или алкилсодержащим стероидным остатком желчной кислоты. Альтернативно, дипептидный пролекарственный элемент может быть связан с депонируемым белком, таким как декстран, или крупной молекулой ПЭГ (с молекулярной массой больше или равной 80000 дальтон), которые служат для депонирования пролекарства в месте инъекции вплоть до того, как при отщеплении дипептида высвобождается биологически активный пептид. Дополнительные модификации дипептидных пролекарств описаны ниже в разделе, касающемся родственных глюкагону пептидов.

Дипептидный пролекарственный элемент создан так, чтобы он отщеплялся на основе внутримолекулярной химической реакции, которая не зависит от дополнительных химических добавок или ферментов. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления структуру дипептида выбирают так, чтобы она была устойчивой к отщеплению пептидазами, имеющимися в сыворотке млекопитающих, включая, например, дипептидилпептидазу IV (DPP-IV). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления скорость отщепления дипептидного пролекарственного элемента от биологически активного пептида по существу не увеличена (например, больше чем в 2 раза) в случае, когда реакция осуществляется с использованием физиологических условий в присутствии сывороточных протеаз по сравнению с осуществлением реакции в отсутствии протеаз. Таким образом, время полуотщепления A-B от биологически активного пептида в PBS в физиологических условиях не превышает более чем в два, три, четыре или пять раз время полуотщепления A-B от биологически активного белка в растворе, содержащем протеазу DPP-IV. В некоторых вариантах осуществления раствором, содержащим протеазу DPP-IV, является сыворотка, более конкретно сыворотка млекопитающих, включая сыворотку человека.

Согласно некоторым вариантам осуществления A или B дипептидного пролекарственного элемента или аминокислота пептида глюкагонового надсемейства, с которой связан A-B, является некодируемой аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления аминокислота «B» является N-алкилированной, но не является пролином. В некоторых вариантах осуществления N-алкилирующей группой аминокислоты B является C₁-C₁₈алкил и, в некоторых вариантах осуществления, C₁-C₆алкил.

Согласно некоторым вариантам осуществления пролекарственное производное пептида глюкагонового надсемейства, содержащее дипептидный пролекарственный элемент, описанный в настоящем описании, можно вводить совместно с ингибитором протеаз, включая специфический ингибитор DPP-IV (например, Januvia^®, Merck & Co, Inc), в качестве средства замедления активации пролекарства. В данном варианте осуществления аминокислоты пролекарственного элемента выбирают таким образом, чтобы дипептид был приемлемым субстратом для расщепления DPP-IV. В некоторых вариантах осуществления пептидом глюкагонового надсемейства является родственный глюкагону пептид. Ингибитор протеаз можно вводить в отдельной композиции или пролекарство и ингибитор протеаз можно вводить в виде одной композиции. При введении виде отдельных композиций ингибитор протеаз обычно вводят за 1-5 часов, 1-2 часов, 30 минут или 10 минут до введения пролекарства. В некоторых вариантах осуществления две отдельных композиции вводят сразу один за другим.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент имеет общую структуру формулы I:

где

R₁, R₂, R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₁-C₁₈алкил)OH, (C₁-C₁₈алкил)SH, (C₂-C₃алкил)SCH₃, (C₁-C₄алкил)CONH₂, (C₁-C₄алкил)COOH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₁-C₄алкил)NHC(NH₂ ⁺)NH₂, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆циклоалкила), (C₀-C₄алкил)(C₂-C₅гетероцикла), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇, (C₁-C₄алкил)(C₃-C₉гетероарила) и C₁-C₁₂алкил(A)(W₁)C₁-C₁₂алкила, где W₁ означает гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, S и O, или R₁ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C₃-C₁₂циклоалкил или арил; или R₄ и R₈ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C₃-C₆циклоалкил;

R₃ выбран из группы, состоящей из C₁-C₁₈алкила, (C₁-C₁₈алкил)OH, (C₁-C₁₈алкил)NH₂, (C₁-C₁₈алкил)SH, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆)циклоалкила, (C₀-C₄алкил)(C₂-C₅гетероцикла), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇ и (C₁-C₄алкил)(C₃-C₉гетероарила), или R₄ и R₃ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R₅ означает NHR₆ или OH;

R₆ означает H, C₁-C₈алкил, или R₆ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R₇ выбран из группы, состоящей из H и OH.

В других вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент имеет общую структуру формулы I:

где

R₁, R₂, R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₁-C₁₈алкил)OH, (C₁-C₁₈алкил)SH, (C₂-C₃алкил)SCH₃, (C₁-C₄алкил)CONH₂, (C₁-C₄алкил)COOH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₁-C₄алкил)NHC(NH₂ ⁺)NH₂, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆циклоалкила), (C₀-C₄алкил)(C₂-C₅гетероцикла), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇, (C₁-C₄алкил)(C₃-C₉гетероарила) и C₁-C₁₂алкил(W₁)C₁-C₁₂алкила, где W₁ означает гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, S и O, или R₁ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C₃-C₁₂циклоалкил; или R₄ и R₈ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C₃-C₆циклоалкил;

R₃ выбран из группы, состоящей из C₁-C₁₈алкила, (C₁-C₁₈алкил)OH, (C₁-C₁₈алкил)NH₂, (C₁-C₁₈алкил)SH, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆)циклоалкила, (C₀-C₄алкил)(C₂-C₅гетероцикла), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇ и (C₁-C₄алкил)(C₃-C₉гетероарила), или R₄ и R₃ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R₅ означает NHR₆ или OH;

R₆ означает H, C₁-C₈алкил, или R₆ и R₁ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₀-C₄алкил)CONH₂, (C₀-C₄алкил)COOH, (C₀-C₄алкил)NH₂, (C₀-C₄алкил)OH и галогена.

В некоторых вариантах осуществления R₈ означает H, и R₅ означает NHR₆.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент имеет структуру формулы I, где

R₁ и R₈ независимо означают H или C₁-C₈алкил;

R₂ и R₄ независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₈алкила, C₂-C₈алкенила, (C₁-C₄алкил)OH, (C₁-C₄алкил)SH, (C₂-C₃алкил)SCH₃, (C₁-C₄алкил)CONH₂, (C₁-C₄алкил)COOH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₁-C₄алкил)NHC(NH₂ ⁺)NH₂, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆циклоалкила), (C₀-C₄алкил)(C₂-C₅гетероцикла), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇ и CH₂(C₃-C₉гетероарила), или R₁ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C₃-C₁₂циклоалкил или арил;

R₅ означает NHR₆; и

R₆ означает H или C₁-C₈алкил.

В других вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент имеет структуру формулы I, где

R₁ и R₈ независимо означают H или C₁-C₈алкил;

R₂ и R₄ независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₈алкила, C₂-C₈алкенила, (C₁-C₄алкил)OH, (C₁-C₄алкил)SH, (C₂-C₃алкил)SCH₃, (C₁-C₄алкил)CONH₂, (C₁-C₄алкил)COOH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₁-C₄алкил)NHC(NH₂ ⁺)NH₂, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆циклоалкила), (C₀-C₄алкил)(C₂-C₅гетероцикла), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇ и CH₂(C₃-C₉гетероарила), или R₁ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C₃-C₁₂циклоалкил;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил;

R₅ означает NHR₆;

R₆ означает H или C₁-C₈алкил; и

R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₀-C₄алкил)CONH₂, (C₀-C₄алкил)COOH, (C₀-C₄алкил)NH₂, (C₀-C₄алкил)OH и галогена.

Время полужизни пролекарства, образованного согласно настоящему изобретению, определяется заместителями дипептидного пролекарственного элемента, их положением и аминокислотой, с которой он связан. Например, пролекарство может содержать пептид глюкагонового надсемейства, где дипептидный пролекарственный элемент связан через альфа-аминогруппу N-концевой аминокислоты белка глюкагонового надсемейства. В данном варианте осуществления пролекарства, имеющие t_1/2, например, примерно 1 час, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где

R₁ и R₂ независимо означают C₁-C₁₈алкил или арил; или R₁ и R₂ связаны через -(CH₂)_p, где p равно 2-9;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил;

R₄ и R₈ каждый означают водород; и

R₅ означает амин.

В других вариантах осуществления пролекарства, имеющие t_1/2, например, примерно 1 час, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где

R₁ и R₂ независимо означают C₁-C₁₈алкил или (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇; или R₁ и R₂ связаны через -(CH₂)_p, где p равно 2-9;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил;

R₄ и R₈ каждый означают водород;

R₅ означает NH₂; и

R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₀-C₄алкил)CONH₂, (C₀-C₄алкил)COOH, (C₀-C₄алкил)NH₂, (C₀-C₄алкил)OH и галогена.

Кроме того, пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный с N-концевой альфа-аминокислотой пептида глюкагонового надсемейства, и имеющие t_1/2, например, примерно от 6 до примерно 24 часов, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила и арила, или R₁ и R₂ связаны через (CH₂)_p, где p равно 2-9;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-членное гетероциклическое кольцо;

R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C₁-C₈алкила и арила; и R₅ означает амин;

при условии, что оба R₁ и R₂ не являются водородом, и при условии, что один из R₄ или R₈ означают водород.

В некоторых вариантах осуществления пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный с N-концевой альфа-аминокислотой пептида глюкагонового надсемейства, и имеющие t_1/2, например, примерно от 12 до примерно 72 часов, или в некоторых вариантах осуществления примерно от 12 до примерно 48 часов, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила, (C₁-C₁₈алкил)OH, (C₁-C₄алкил)NH₂ и (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇, или R₁ и R₂ связаны через (CH₂)_p, где p равно 2-9;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-членное гетероциклическое кольцо;

R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C₁-C₈алкила и (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇;

R₅ означает NH₂; и

R₇ выбран из группы, состоящей из H, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₀-C₄алкил)CONH₂, (C₀-C₄алкил)COOH, (C₀-C₄алкил)NH₂, (C₀-C₄алкил)OH и галогена;

при условии, что оба R₁ и R₂ не являются водородом, и при условии, что по меньшей мере один из R₄ или R₈ означают водород.

В некоторых вариантах осуществления пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный с N-концевой аминокислотой пептида глюкагонового надсемейства, и имеющие t_1/2, например, примерно от 12 до примерно 72 часов, или в некоторых вариантах осуществления примерно от 12 до примерно 48 часов, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C₁-C₈алкила и (C₁-C₄алкил)NH₂, или R₁ и R₂ связаны через (CH₂)_p, где p равно 2-9;

R₃ означает C₁-C₈алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;

R₄ выбран из группы, состоящей из водорода и C₁-C₈алкила; и

R₅ означает NH₂;

при условии, что оба R₁ и R₂ не являются водородом.

В других вариантах осуществления пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный с N-концевой аминокислотой пептида глюкагонового надсемейства, и имеющие t_1/2, например, примерно от 12 до примерно 72 часов, или в некоторых вариантах осуществления примерно от 12 до примерно 48 часов, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где

R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C₁-C₈алкила и (C₁-C₄алкил)NH₂;

R₃ означает C₁-C₆алкил;

R₄ означает водород; и

R₅ означает NH₂;

при условии, что оба R₁ и R₂ не являются водородом.

В некоторых вариантах осуществления пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный с N-концевой аминокислотой пептида глюкагонового надсемейства, и имеющие t_1/2, например, примерно от 12 до примерно 72 часов, или в некоторых вариантах осуществления примерно от 12 до примерно 48 часов, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где

R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C₁-C₈алкила, (C₁-C₄алкил)NH₂, или R₁ и R₂ связаны через (CH₂)_p, где p равно 2-9;

R₃ означает C₁-C₈алкил;

R₄ означает (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇;

R₅ означает NH₂; и

R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₈алкила и (C₀-C₄алкил)OH;

при условии, что оба R₁ и R₂ не являются водородом.

В некоторых вариантах осуществления пептидом глюкагонового надсемейства является родственный глюкагону пептид. В любом из указанных вариантов осуществления пептид глюкагонового надсемейства имеет любую из последовательностей SEQ ID NO:1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776 и 1801-1921.

Кроме того, предлагается пролекарство, имеющее дипептидный пролекарственный элемент, связанный с N-концевой альфа-аминокислотой пептида глюкагонового надсемейства, и имеющее t_1/2, например, примерно от 72 до примерно 168 часов, где дипептидный пролекарственный элемент имеет структуру:

где R₁ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₈алкила и арила;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил;

R₄ и R₈ каждый означают водород; и

R₅ означает амин или N-замещенный амин или гидроксил;

при условии, что если R₁ означает алкил или арил, то R₁ и R₅ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-11-членное гетероциклическое кольцо.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент имеет структуру:

где R₁ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₈алкила и (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил;

R₄ и R₈ каждый означают водород;

R₅ означает NHR₆ или OH;

R₆ означает H, C₁-C₈алкил, или R₆ и R₁ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₀-C₄алкил)CONH₂, (C₀-C₄алкил)COOH, (C₀-C₄алкил)NH₂, (C₀-C₄алкил)OH и галогена;

при условии, что если R₁ означает алкил или (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇, то R₁ и R₅ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-11-членное гетероциклическое кольцо. В некоторых вариантах осуществления пептид глюкагонового надсемейства представляет собой родственный глюкагону пептид.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с амином боковой цепи внутренней аминокислоты пептида глюкагонового надсемейства. В данном варианте осуществления пролекарства, имеющие t_1/2, например, примерно 1 час, имеют структуру:

где

R₁ и R₂ независимо означают C₁-C₈алкил или арил; или R₁ и R₂ связаны через (CH₂)_p, где p равно 2-9;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил;

R₄ и R₈ каждый означают водород; и R₅ означает амин.

В некоторых вариантах осуществления пролекарства, имеющие t_1/2, например, примерно 1 час, имеют структуру:

где

R₁ и R₂ независимо означают C₁-C₈алкил или (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇; или R₁ и R₂ связаны через -(CH₂)_p-, где p равно 2-9;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил;

R₄ и R₈ каждый означают водород;

R₅ означает NH₂; и

R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₀-C₄алкил)CONH₂, (C₀-C₄алкил)COOH, (C₀-C₄алкил)NH₂, (C₀-C₄алкил)OH и галогена.

Кроме того, пролекарства, имеющие t_1/2, например, примерно от 6 до примерно 24 часов, и имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный с боковой цепью внутренней аминокислоты, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C₁-C₈алкила и арила, или R₁ и R₂ связаны через -(CH₂)_p, где p равно 2-9;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-членное гетероциклическое кольцо;

R₄ и R₈ независимо означают C₁-C₁₈алкил или арил; и

R₅ означает амин или N-замещенный амин;

при условии, что оба R₁ и R₂ не являются водородом, и при условии, что один из R₄ или R₈ означает водород.

В некоторых вариантах осуществления пролекарства, имеющие t_1/2, например, примерно от 12 до примерно 72 часов, или в некоторых вариантах осуществления примерно от 12 до примерно 48 часов, и имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный с боковой цепью внутренней аминокислоты, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C₁-C₈алкила и (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇, или R₁ и R₂ связаны через -(CH₂)_p-, где p равен 2-9;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-членное гетероциклическое кольцо;

R₄ и R₈ независимо означают водород, C₁-C₁₈алкил или (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇;

R₅ означает NHR₆;

R₆ означает H или C₁-C₈алкил, или R₆ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₀-C₄алкил)CONH₂, (C₀-C₄алкил)COOH, (C₀-C₄алкил)NH₂, (C₀-C₄алкил)OH и галогена;

при условии, что оба R₁ и R₂ не являются водородом, и при условии, что по меньшей мере один из R₄ или R₈ является водородом. В некоторых вариантах осуществления пептид глюкагонового надсемейства является родственным глюкагону пептидом.

Кроме того, предлагается пролекарство, имеющее t_1/2, например, примерно от 72 до примерно 168 часов и имеющее дипептидный пролекарственный элемент, связанный с боковой цепью внутренней аминокислоты пептида глюкагонового надсемейства, где дипептидный пролекарственный элемент имеет структуру:

где R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила и арила;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил;

R₄ и R₈ каждый означают водород; и

R₅ означает амин или N-замещенный амин или гидроксил;

при условии, что если оба R₁ и R₂ независимо означают алкил или арил, то либо R₁, либо R₂ связаны через (CH₂)_p с R₅, где p равно 2-9.

В некоторых вариантах осуществления предлагается пролекарство, имеющее t_1/2, например, примерно от 72 до примерно 168 часов и имеющее дипептидный пролекарственный элемент, связанный с боковой цепью внутренней аминокислоты пептида глюкагонового надсемейства, где дипептидный пролекарственный элемент имеет структуру:

где R₁ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила и (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил;

R₄ и R₈ каждый означают водород;

R₅ означает NHR₆ или OH;

R₆ означает H или C₁-C₈алкил, или R₆ и R₁ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₀-C₄алкил)CONH₂, (C₀-C₄алкил)COOH, (C₀-C₄алкил)NH₂, (C₀-C₄ алкил)OH и галогена;

при условии, что если оба R₁ и R₂ независимо означают алкил или (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇, то либо R₁, либо R₂ связан через (CH₂)_p с R₅, где p равно 2-9. В некоторых вариантах осуществления пептидом глюкагонового надсемейства является родственный глюкагону пептид. В любом из указанных вариантов пептид глюкагонового надсемейства имеет любых из последовательностей SEQ ID NO:1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776 и 1801-1921.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с амином боковой цепи внутренней аминокислоты пептида глюкагонового надсемейства, где внутренняя аминокислота содержит структуру формулы II:

где

n означает целое число, выбранное из 1-4. В некоторых вариантах осуществления n равно 3 или 4, и в некоторых вариантах осуществления внутренней аминокислотой является лизин. В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с первичным амином боковой цепи аминокислоты, находящейся в положении 12, 16, 17, 18, 20, 28 или 29 пептида глюкагонового надсемейства. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 12, 16, 17, 18, 20, 28 или 29 содержит структуру формулы II:

где n означает целое число, выбранное из 1-4, и дипептидный пролекарственный элемент связан с боковой цепью аминокислоты амидной связью. В некоторых вариантах осуществления n равно 4, и аминокислота находится в положении 20. В некоторых вариантах осуществления пептидом глюкагонового надсемейства является родственный глюкагону пептид.

В следующем варианте осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с пептидом глюкагонового надсемейства посредством амина, присутствующего на арильной группе ароматической аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления ароматическая аминокислота является внутренней аминокислотой пептида глюкагонового надсемейства, однако ароматическая аминокислота также может представлять собой N-концевую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления пептид глюкагонового надсемейства является родственным глюкагону пептидом. В некоторых вариантах осуществления ароматическая аминокислота выбрана из группы, состоящей из амино-Phe, аминонафтилаланина, аминотриптофана, аминофенилглицина, амино-гомо-Phe и аминотирозина. В некоторых вариантах осуществления первичный амин, который образует амидную связь с дипептидным пролекарственным элементом, находится в параположении арильной группы. В некоторых вариантах осуществления ароматический амин имеет структуру формулы III:

где m равно целому числу от 1 до 3.

В случае таких вариантов осуществления, в которых дипептидный пролекарственный элемент связан с пептидом глюкагонового надсемейства через амин, присутствующий в арильной группе ароматической аминокислоты, пролекарства, имеющие t_1/2, например, составляющее примерно 1 час, имеют структуру дипептида:

где R₁ и R₂ независимо означают C₁-C₁₈алкил или арил;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-членное гетероциклическое кольцо;

R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила и арила; и R₅ означает амин или гидроксил.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с пептидом глюкагонового надсемейства через амин, присутствующий в арильной группе ароматической аминокислоты, где пролекарства, имеющие t_1/2, составляющее, например, примерно 1 час, имеют структуру дипептида:

где R₁ и R₂ независимо означают C₁-C₁₈алкил или (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-членное гетероциклическое кольцо;

R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила и (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇;

R₅ означает NH₂ или OH; и

R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₀-C₄алкил)CONH₂, (C₀-C₄алкил)COOH, (C₀-C₄алкил)NH₂, (C₀-C₄алкил)OH и галогена. В некоторых вариантах осуществления пептидом глюкагонового надсемейства является родственный глюкагону пептид.

Кроме того, предлагаются пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, который связан через ароматическую аминокислоту, и имеющие t_1/2, составляющее, например, примерно от 6 до примерно 24 часов, где дипептид содержит структуру:

где

R₁ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила и арила, или R₁ и R₂ связаны через -(CH₂)_p, где p равно 2-9;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;

R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила и арила; и R₅ означает амин или N-замещенный амин.

В некоторых вариантах осуществления предлагаются пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный через ароматическую аминокислоту, и имеющие t_1/2, составляющее, например, примерно от 6 до примерно 24 часов, где дипептид содержит структуру:

где

R₁ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила, (C₁-C₁₈алкил)OH, (C₁-C₄алкил)NH₂ и (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;

R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила и (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇;

R₅ означает NHR₆;

R₆ означает H, C₁-C₈алкил, или R₆ и R₁ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₀-C₄алкил)CONH₂, (C₀-C₄алкил)COOH, (C₀-C₄алкил)NH₂, (C₀-C₄алкил)OH и галогена.

Кроме того, предлагаются пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, который связан через ароматическую аминокислоту, и имеющие t_1/2, составляющее, например, примерно от 72 до примерно 168 часов, где дипептид содержит структуру:

где R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C₁-C₈алкила и арила;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;

R₄ и R₈ каждый означают водорода; и

R₅ выбран из группы, состоящей из амина, N-замещенного амина и гидроксила.

В некоторых вариантах осуществления предлагаются пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный через ароматическую аминокислоту, и имеющие t_1/2, составляющее, например, примерно от 72 до примерно 168 часов, где дипептид содержит структуру:

где R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C₁-C₈алкила, (C₁-C₄алкил)COOH и (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇, или R₁ и R₅ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-11-членное гетероциклическое кольцо;

R₃ означает C₁-C₁₈алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;

R₄ означает водород или образует 4-6-членное гетероциклическое кольцо с R₃;

R₈ означает водород;

R₅ означает NHR₆ или OH;

R₆ означает H или C₁-C₈алкил, или R₆ и R₁ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₀-C₄алкил)CONH₂, (C₀-C₄алкил)COOH, (C₀-C₄алкил)NH₂, (C₀-C₄алкил)OH и галогена.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с ароматической аминокислотой через первичный амин, присутствующий в арильном заместителе ароматической аминокислоты, где ароматическая аминокислота находится в положении 10, 13, 22 или 25 пептида глюкагонового надсемейства (на основе нумерации для глюкагона, см., например, фиг.10). В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с ароматической аминокислотой, находящейся в положении 22 пептида глюкагонового надсемейства.

Согласно некоторым вариантам осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с N-концевым амином пептида глюкагонового надсемейства, включая, например, родственный глюкагону пептид или остеокальцин, а также их аналоги, производные и конъюгаты, где дипептидный пролекарственный элемент содержит структуру:

где R₁ выбран из группы, состоящей из H и C₁-C₈алкила;

R₂ и R₄ независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₈алкила, C₂-C₈алкенила, (C₁-C₄алкил)OH, (C₁-C₄алкил)SH, (C₂-C₃алкил)SCH₃, (C₁-C₄алкил)CONH₂, (C₁-C₄алкил)COOH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₁-C₄алкил)NHC(NH₂ ⁺)NH₂, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆циклоалкила), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇, CH₂(C₅-C₉гетероарила), или R₁ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C₃-C₆циклоалкил;

R₃ выбран из группы, состоящей из C₁-C₈алкила, (C₃-C₆)циклоалкила, или R₄ и R₃ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R₅ означает NHR₆ или OH;

R₆ означает H, или R₆ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R₇ выбран из группы, состоящей из H и OH. В некоторых вариантах осуществления R₁ означает H или C₁-C₈алкил, R₂ выбран из группы, состоящей из H, C₁-C₆алкила, CH₂OH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₃-C₆циклоалкила) и CH₂(C₆арил)R₇, или R₆ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо, R₃ означает C₁-C₆алкил, и R₄ выбран из группы, состоящей из H, C₁-C₄алкила, (C₃-C₆)циклоалкила, (C₁-C₄алкил)OH, (C₁-C₄алкил)SH и (C₀-C₄алкил)(C₆арил)R₇, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо. В следующем варианте осуществления R₃ означает CH₃, R₅ означает NHR₆, и в следующем альтернативном варианте осуществления R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо, и R₅ означает NHR₆.

Согласно другому варианту осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с N-концевым амином пептида глюкагонового надсемейства, включая, например, родственный глюкагону пептид или остеокальцин, а также их аналоги, производные и конъюгаты, где дипептидный пролекарственный элемент содержит структуру:

где R₁ выбран из группы, состоящей из H и C₁-C₈алкила;

R₂ и R₄ независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₈алкила, C₂-C₈алкенила, (C₁-C₄алкил)OH, (C₁-C₄алкил)SH, (C₂-C₃алкил)SCH₃, (C₁-C₄алкил)CONH₂, (C₁-C₄алкил)COOH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₁-C₄алкил)NHC(NH₂ ⁺)NH₂, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆циклоалкила), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇, CH₂(C₅-C₉гетероарила), или R₁ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C₃-C₆циклоалкил;

R₃ выбран из группы, состоящей из C₁-C₈алкила, (C₃-C₆)циклоалкила, или R₄ и R₃ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R₅ означает NHR₆ или OH;

R₆ означает H, или R₆ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₁₈алкила, C₂-C₁₈алкенила, (C₀-C₄алкил)CONH₂, (C₀-C₄алкил)COOH, (C₀-C₄алкил)NH₂, (C₀-C₄алкил)OH и галогена. В некоторых вариантах осуществления R₁ означает H или C₁-C₈алкил, R₂ выбран из группы, состоящей из H, C₁-C₆алкила, CH₂OH, (C₁-C₄алкил)NH₂, (C₃-C₆циклоалкила) и CH₂(C₆арил)R₇, или R₆ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо, R₃ означает C₁-C₆алкил, и R₄ выбран из группы, состоящей из H, C₁-C₄алкила, (C₃-C₆)циклоалкила, (C₁-C₄алкил)OH, (C₁-C₄алкил)SH и (C₀-C₄алкил)(C₆арил)R₇, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо. В следующем варианте осуществления R₃ означает CH₃, R₅ означает NHR₆, и в следующем альтернативном варианте осуществления R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо, и R₅ означает NHR₆.

В некоторых вариантах осуществления Q имеет любую из последовательностей SEQ ID NO:1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776 и 1801-1921.

Родственные глюкагону пептиды

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к родственным глюкагону пептидам (в виде части группы, обозначенной «Q»). Термин «родственный глюкагону пептид» относится к таким пептидам, которые обладают биологической активностью (как агонисты или антагонисты) в отношении любого одного или нескольких рецепторов глюкагона, GLP-1, GLP-2 и GIP и содержат аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 40% идентичность последовательности (например, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%) по меньшей мере с одной из последовательностей нативного глюкагона, нативного оксинтомодулина, нативного эксендина-4, нативного GLP-1, нативного GLP-2 или нативного GIP. Следует понимать, что рассматриваются все возможные подгруппы активностей родственных глюкагону пептидов, например, пептиды, которые обладают биологической активностью (как агонисты или антагонисты) в отношении любого одного или нескольких рецепторов глюкагона или GLP-1, или GIP, наряду со всеми возможными подгруппами идентичности последовательностей с каждым из перечисленных нативных пептидов, например, пептиды содержат аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичность последовательности с последовательностью нативного глюкагона по длине нативного глюкагона. В некоторых вариантах осуществления изобретения родственным глюкагону пептидом является пептид, обладающий активностью агониста рецептора глюкагона, активностью агониста рецептора GIP, коагонистической активностью в отношении рецептора глюкагона/рецептора GLP-1, активностью антагониста рецептора глюкагона или активностью антагониста рецептора глюкагона и активностью агониста рецептора GLP-1. В некоторых вариантах осуществления пептид сохраняет альфа-спиральную конформацию в C-концевой половине молекулы. В некоторых вариантах осуществления пептид сохраняет положения, вовлеченные во взаимодействие с рецептором или передачу сигнала, например положение 3 глюкагона или положение 7, 10, 12, 13, 15 или 17 (1-37)GLP-1. Соответственно, родственный глюкагону пептид может представлять собой пептид класса 1, класса 2, класса 3, класса 4 и/или класса 5, каждый из которых дополнительно описан в настоящем описании.

Согласно некоторым вариантам осуществления дипептидный пролекарственный элемент может быть связан амидной связью с любыми биологически активными соединениями, ранее описанными в международных заявках № PCT/US2008/08608 (поданной 3 января, 2008), PCT/US2008/053857 (поданной 13 февраля 2008), PCT/US2009/47437 (поданной 16 июня 2009), PCT/US2009/47438 (поданной 16 июня 2009), PCT/US2009/47447 (поданной 16 июня 2009), PCT/US2008/080973 (поданной 23 октября 2008) и PCT/US2008/081333 (поданной 27 октября 2008), описания которых, таким образом, специально включены в настоящее описание посредством ссылки. Дипептидный пролекарственный элемент, описанный в настоящем описании, в некоторых примерах вариантов осуществления может быть связан с биологически активными пептидами, описанными в PCT/US2008/08608, PCT/US2008/053857, PCT/US2009/47437, PCT/US2009/47438, PCT/US2009/47447, PCT/US2008/08097 и PCT/US2008/081333, либо через N-концевой амин, либо с аминогруппой боковой цепи лизина в положении 20, либо с аминогруппой ароматической аминокислоты 4-аминофенилаланина, которым заменена аминокислота в положении 22 любого из описанных биологически активных пептидов. В некоторых примерах вариантов осуществления дипептидный пролекарственный элемент, описанный в настоящем описании, связан амидной связью с N-концевым амином биологически активного пептида, описанного в PCT/US2008/08608, PCT/US2008/053857, PCT/US2009/47437, PCT/US2009/47438 и PCT/US2009/47447, PCT/US2008/08097 и PCT/US2008/081333. В некоторых вариантах осуществления пептид глюкагонового надсемейства имеет любую из последовательностей SEQ ID NO:1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776 и 1801-1921.

Модификации

Родственный глюкагону пептид может содержать аминокислотную последовательность нативного глюкагона (SEQ ID NO:701) с модификациями. В примерах вариантов осуществления родственный глюкагону пептид может содержать всего 1, до 2, до 3, до 4, до 5, до 6, до 7, до 8, до 9 или до 10 модификаций аминокислот, по сравнению с нативной последовательностью глюкагона, например, консервативных или неконсервативных замен. Модификации и замены, описанные в настоящем описании, в некоторых аспектах осуществляют в конкретных положениях в родственном глюкагону пептиде, где нумерация положения соответствует нумерации глюкагона (SEQ ID NO:701). В некоторых вариантах осуществления 1, 2, 3, 4 или 5 неконсервативные замены осуществляют в любом из положений 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29, и осуществляют до 5 дополнительных консервативных замен в любом из указанных положений. В некоторых вариантах осуществления осуществляют 1, 2 или 3 модификации аминокислот среди аминокислот в положениях 1-16, и осуществляют 1, 2 или 3 модификации аминокислот среди аминокислот в положениях 17-26. В некоторых вариантах осуществления такие родственные глюкагону пептиды сохраняют по меньшей мере 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 встречающихся в природе аминокислот в соответствующих положениях нативного глюкагона (например, имеют 1-7, 1-5 или 1-3 модификации по сравнению с встречающимся в природе глюкагоне).

Устойчивость к DPP-IV

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид содержит модификацию в положении 1 или 2, чтобы снизить чувствительность к расщеплению дипептидилпептидазой IV. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления положение 1 родственного глюкагону пептида (например, выбранного из пептидов, указанных на фиг.10) заменяют аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-гистидина, альфа,альфа-диметилимидазолуксусной кислоты (DMIA), N-метилгистидина, альфа-метилгистидина, имидазолуксусной кислоты, дезаминогистидина, гидроксилгистидина, ацетилгистидина и гомогистидина. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления положение 2 родственного глюкагону пептида заменяют аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-серина, D-аланина, валина, глицина, N-метилсерина и аминоизомасляной кислоты. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 2 родственного глюкагону пептида не является D-серином.

Гидрофильные остатки

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид (например, родственный глюкагону пептид класса 1, родственный глюкагону пептид класса 2, родственный глюкагону пептид класса 3, родственные глюкагону пептиды класса 4 или родственный глюкагону пептид класса 5) связан (ковалентно связан) с гидрофильным остатком. Гидрофильные остатки могут быть связаны с родственным глюкагону пептидом в любых подходящих условиях, используемых для взаимодействия белка с активированной полимерной молекулой. Можно использовать любые способы, известные в данной области, включая ацилирование, восстановительное алкилирование, реакцию Михаэля, алкилирование тиолов или другие способы хемоселективного конъюгирования/лигирования посредством реакционноспособной группы остатка ПЭГ (например, альдегидной группы, аминогруппы, сложноэфирной, тиольной, α-галогенацетильной, малеимидной или гидразиновой группы) с реакционноспособной группой соединения-мишени (например, альдегидной группой, аминогруппой, сложноэфирной, тиольной, α-галогенацетильной, малеимидной или гидразиновой группой). Активирующие группы, которые можно использовать для связывания растворимого в воде полимера с одним или несколькими белками, включают, но без ограничения, сульфон, малеимид, сульфгидрил, тиол, трифторметансульфонат, трезилат, азидирин, оксиран и 5-пиридил. В случае связывания с пептидом посредством восстановительного алкилирования выбранный полимер должен иметь один химически активный альдегид для того, чтобы контролировать степень полимеризации. См., например, Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002); и Zalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995).

Что касается родственных глюкагону пептидов классов 1-3, то дополнительные активирующие группы, которые можно использовать для связывания растворимого в воде полимера с одним или несколькими белками, включают альфа-галогенированную ацильную группу (например, альфа-йодуксусную кислоту, альфа-бромуксусную кислоту, альфа-хлоруксусную кислоту). В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид является родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, аминокислоту, содержащую тиол, модифицируют активированным малеимидом ПЭГ в реакции присоединения Михаэля, получая пегилированный пептид, содержащий тиоэфирную связь, показанную ниже:

.

В других вариантах осуществления тиол аминокислоты родственного глюкагону пептида класса 1, класса 2 или класса 3 модифицируют активированным галогенацетилом ПЭГ в реакции нуклеофильного замещения, получая пегилированный пептид, содержащий тиоэфирную связь, показанную ниже:

.

Подходящие гидрофильные остатки включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль, полиоксиэтилированные полиолы (например, POG), полиоксиэтилированный сорбит, полиоксиэтилированную глюкозу, полиоксиэтилированный глицерин (POG), полиоксиалкилены, пропиональдегид полиэтиленгликоля, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, монометоксиполиэтиленгликоль, моно(C1-C10)алкокси или арилоксиполиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, полиацетали, поливиниловый спирт (PVA), поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-l,3,6-триоксалан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, поли(бета-аминокислоты) (либо гомополимеры, либо случайные сополимеры), поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля (PPG) и другие полиалкиленоксиды, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, колановые кислоты или другие полисахаридные полимеры, фиколл или декстран и их смеси. Декстраны представляют собой полисахаридные полимеры, состоящие из субъединиц глюкозы, преимущественно связанных 1-6 α-связями. Декстраны существуют в нескольких диапазонах по молекулярной массе, например, примерно от 1 кДа до примерно 100 кДа, или примерно от 5, 10, 15 или 20 кДа до примерно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90 кДа.

В некоторых вариантах осуществления гидрофильным остатком является цепь полиэтиленгликоля (ПЭГ) или другого водорастворимого полимера, которая ковалентно связана с боковой цепью аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях 16, 17, 21, 24, 29, 40 указанного родственного глюкагону пептида, в C-концевом удлинении или с C-концевой аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления нативную аминокислоту в данном положении заменяют аминокислотой, имеющей боковую цепь, подходящую для поперечного сшивания с гидрофильными остатками, чтобы облегчить связывание гидрофильного остатка с пептидом. Примеры аминокислот включают Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или ацетилфенилаланин (Ac-Phe). В других вариантах осуществления к пептиду на C-конце добавляют аминокислоту, модифицированную таким образом, чтобы она содержала гидрофильную группу.

Гидрофильный остаток, например цепь полиэтиленгликоля, согласно некоторым вариантам осуществления имеет молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 500 до примерно 40000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 500 до примерно 5000 дальтон или примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон. В другом варианте осуществления гидрофильный остаток, например цепь полиэтиленгликоля, имеет молекулярную массу примерно от 10000 до примерно 20000 дальтон. В следующих примерах вариантов осуществления гидрофильный остаток, например цепь полиэтиленгликоля, имеет молекулярную массу примерно от 20000 до примерно 40000 дальтон.

Предусмотрены неразветвленные или разветвленные гидрофильные полимеры. Полученные препараты конъюгатов могут быть по существу монодисперсными или полидисперсными, и могут иметь примерно 0,5, 0,7, 1, 1,2, 1,5 или 2 полимерных остатка на пептид.

Ацилирование

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид (например, родственный глюкагону пептид класса 1, родственный глюкагону пептид класса 2, родственный глюкагону пептид класса 3, родственный глюкагону пептид класса 3, родственные глюкагону пептиды класса 4 или родственный глюкагону пептид класса 5) модифицируют, чтобы они содержали ацильную группу. Например, родственный глюкагону пептид может быть родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3 и может содержать ацильную группу, которая не является нативной для встречающейся в природе аминокислоты. Ацилирование может быть осуществлено в любом положении в родственном глюкагону пептиде, включая любое из положений 1-29, положение в пределах C-концевого удлинения или C-концевую аминокислоту, при условии, что активность, проявляемая неацилированным родственным глюкагону пептидом, сохраняется после ацилирования. Например, если неацилированный пептид обладает активностью агониста глюкагона, то ацилированный пептид сохраняет активность агониста глюкагона. Также, например, если неацилированный пептид обладает активностью антагониста глюкагона, то ацилированный пептид сохраняет активность антагониста глюкагона. Например, если неацилированный пептид обладает агонистической активностью GLP-1, то ацилированный пептид сохраняет агонистическую активность GLP-1. Неограничивающие примеры включают ацилирование в положениях 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа). Что касается родственных глюкагону пептидов класса 1, класса 2 и класса 3, то ацилирование может быть осуществлено в любом из положений 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28, 29, 30, 37, 38, 39, 40, 41, 42 или 43 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа). Ацильная группа может быть ковалентно связана непосредственно с аминокислотой родственного глюкагону пептида, или опосредованно с аминокислотой родственного глюкагону пептида через спейсер, где спейсер расположен между аминокислотой родственного глюкагону пептида и ацильной группой. Родственные глюкагону пептиды могут быть ацилированы в том же положении аминокислоты, в котором связан гидрофильный остаток, или в другом положении аминокислоты. Неограничивающие примеры включают ацилирование в положении 10 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) и пегилирование в одном или нескольких положениях в C-концевой части глюкагонового пептида, например, в положении 24, 28 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа), в пределах C-концевого удлинения или на C-конце (например, в результате присоединения C-концевого Cys).

В конкретном аспекте изобретения родственный глюкагону пептид модифицируют, чтобы он содержал ацильную группу, прямым ацилированием амина, гидроксила или тиола боковой цепи аминокислоты родственного глюкагону пептида. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид непосредственно ацилируют через амин, гидроксил или тиол боковой цепи аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления ацилирование осуществляют в положении 10, 20, 24 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа). В связи с этим, ацилированный родственный глюкагону пептид может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:701 или модифицированную аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько модификаций аминокислот, описанных в настоящем описании, где по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 10, 20, 24 и 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) модифицирована до получения любой аминокислоты, содержащей амин, гидроксил или тиол боковой цепи. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения прямое ацилирование родственного глюкагону пептида происходит по амину, гидроксилу или тиолу боковой цепи аминокислоты в положении 10 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа).

В некоторых вариантах осуществления аминокислота, содержащая амин в боковой цепи, представляет собой аминокислоту формулы I:

где n=1-4

[формула I]

В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислота формулы I представляет собой аминокислоту, где n равно 4 (Lys) или n равно 3 (Orn).

В других вариантах осуществления аминокислота, содержащая гидроксил в боковой цепи, представляет собой аминокислоту формулы II:

где n=1-4

[формула II]

В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислотой формулы II является аминокислота, где n равно 1 (Ser).

В следующих вариантах осуществления аминокислота, содержащая тиол в боковой цепи, представляет собой аминокислоту формулы III:

где n=1-4

[формула III]

В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислота формулы III представляет собой аминокислоту, где n равно 1 (Cys).

В следующих вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, аминокислота, содержащая амин, гидроксил или тиол в боковой цепи, является дизамещенной аминокислотой, имеющей такую же структуру формулы I, формулы II или формулы III, за исключением того, что водород, связанный с альфа-атомом углерода аминокислоты формулы I, формулы II или формулы III, заменен второй боковой цепью.

В некоторых вариантах осуществления изобретения ацилированный родственный глюкагону пептид содержит спейсер между пептидом и ацильной группой. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид ковалентно связан со спейсером, который ковалентно связан с ацильной группой. В некоторых примерах вариантов осуществления родственный глюкагону пептид модифицируют, чтобы он содержал ацильную группу, ацилированием амина, гидроксила или тиола спейсера, и такой спейсер связан с боковой цепью аминокислоты в положении 10, 20, 24 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) или с C-концевой аминокислотой родственного глюкагону пептида. Аминокислотой, с которой связан спейсер, может быть любая аминокислота, содержащая остаток, который обеспечивает возможность связывания со спейсером. Например, подходящей является аминокислота, содержащая -NH₂, -OH или -COOH в боковой цепи (например, Lys, Orn, Ser, Asp или Glu). Также, что касается родственных глюкагону пептидов класса 1, класса 2 и класса 3, то подходящей является аминокислота (например, моно или ди-α-замещенная аминокислота), содержащая -NH₂, -OH или -COOH в боковой цепи (например, Lys, Orn, Ser, Asp или Glu). В этой связи, ацилированный родственный глюкагону пептид может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:701 или модифицированную аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько модификаций аминокислот, описанных в настоящем описании, где по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 10, 20, 24 и 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) модифицирована в любую аминокислоту, содержащую амин, гидроксил или карбоксилат в боковой цепи.

В некоторых вариантах осуществления спейсером является аминокислота, содержащая амин, гидроксил или тиол в боковой цепи, или дипептид или трипептид, содержащий аминокислоту, имеющую амин, гидроксил или тиол в боковой цепи. В некоторых вариантах осуществления аминокислотный спейсер не является аминокислотой γ-Glu. В некоторых вариантах осуществления дипептидным спейсером не может быть γ-Glu-γ-Glu.

Когда происходит ацилирование группы амина аминокислоты спейсера, ацилирование может осуществляться по альфа-амину аминокислоты или амину боковой цепи. В случае, когда ацилирован альфа-амин, спейсерной аминокислотой может быть любая аминокислота. Например, спейсерной аминокислотой может быть гидрофобная аминокислота, например, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид является родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, спейсерной аминокислотой может быть, например, гидрофобная аминокислота, например, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr, 6-аминокапроновая кислота, 5-аминовалериановая кислота, 7-аминогептановая кислота, 8-аминооктановая кислота. Альтернативно, спейсерной аминокислотой может быть кислый остаток, например, Asp и Glu. В случае, когда ацилирован амин боковой цепи спейсерной аминокислоты, спейсерной аминокислотой является аминокислота, содержащая амин в боковой цепи, например, аминокислота формулы I (например, Lys или Orn). В этом случае могут быть ацилированы как альфа-амин, так и амин боковой цепи ацилируемой спейсерной аминокислоты, так что глюкагоновый пептид является диацилированным. Варианты осуществления изобретения включают такие диацилированные молекулы.

Когда ацилирование происходит по гидроксильной группе аминокислоты спейсера, аминокислота или одна из аминокислот дипептида или трипептида может представлять собой аминокислоту формулы II. В конкретном примере варианта осуществления аминокислотой является Ser.

Когда ацилирование происходит по тиольной группе аминокислоты спейсера, аминокислота или одна из аминокислот дипептида или трипептида может представлять собой аминокислоту формулы III. В конкретном примере варианта осуществления аминокислотой является Cys.

В некоторых вариантах осуществления спейсер содержит гидрофильный бифункциональный спейсер. В конкретном варианте осуществления спейсер содержит аминополи(алкилокси)карбоксилат. В связи с этим, спейсер может содержать, например, NH₂(CH₂CH₂O)_n(CH₂)_mCOOH, где m равно любому целому числу от 1 до 6, и n равно любому целому числу от 2 до 12, такую как, например, 8-амино-3,6-диоксакаприловая кислота, которая коммерчески доступна от Peptides International, Inc. (Louisville, KY).

В некоторых вариантах осуществления, относящихся только к родственным глюкагону пептидам класса 1, класса 2 и класса 3, спейсер содержит гидрофильный бифункциональный спейсер. В некоторых вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит две или несколько реакционноспособных групп, например, амин, гидроксил, тиол и карбоксильную группу или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит гидроксильную группу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит аминогруппу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит тиольную группу и карбоксилат.

В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид является родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер представляет собой гидрофобный бифункциональный спейсер. Гидрофобные бифункциональные спейсеры известны в данной области. См., например, публикацию Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996), которая включена посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит две или несколько реакционноспособных групп, например, амин, гидроксил, тиол и карбоксильную группу или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит гидроксильную группу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит аминогруппу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит тиольную группу и карбоксилат. Подходящие гидрофобные бифункциональные спейсеры, содержащие карбоксилат и гидроксильную группу или тиольную группу, известны в данной области и включают, например, 8-гидроксиоктановую кислоту и 8-меркаптооктановую кислоту.

В некоторых вариантах осуществления бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, не является дикарбоновой кислотой, содержащей неразветвленный алкилен из 1-7 атомов углерода между карбоксилатными группами. В некоторых вариантах осуществления бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, является дикарбоновой кислотой, содержащей неразветвленный алкилен из 1-7 атомов углерода между карбоксилатными группами.

Cпейсер (например, аминокислота, дипептид, трипептид, гидрофильный бифункциональный спейсер или гидрофобный бифункциональный спейсер) в конкретных вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, имеет длину от 3 до 10 атомов (например, от 6 до 10 атомов, (например, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов). В более конкретных вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер имеет длину примерно от 3 до 10 атомов (например, от 6 до 10 атомов), и ацильной группой является C₁₂-C₁₈ацильная группа жирной кислоты, например, C₁₄ацильная группа жирной кислоты, C₁₆ацильная группа жирной кислоты, так что общая длина спейсера и ацильной группы составляет от 14 до 28 атомов, например примерно 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 атомов. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длина спейсера и ацильной группы составляет от 17 до 28 (например, от 19 до 26, от 19 до 21) атомов.

Согласно некоторым вариантам осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, бифункциональный спейсер может представлять собой синтетическую или встречающуюся в природе аминокислоту (включая, но без ограничения, любую из аминокислот, описанных в настоящем описании), содержащую остов аминокислоты, который имеет длину от 3 до 10 атомов (например, 6-аминокапроновую кислоту, 5-аминовалериановую кислоту, 7-аминогептановую кислоту и 8-аминооктановую кислоту). Альтернативно, спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, может представлять собой дипептидный или трипептидный спейсер, имеющий пептидный остов длиной от 3 до 10 атомов (например, от 6 до 10 атомов). Каждая аминокислота дипептидного или трипептидного спейсера, связанного с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, может быть такой же или отличной от другой аминокислоты (аминокислот) дипептида или трипептида и может быть независимо выбрана из группы, состоящей из: встречающихся в природе и/или не встречающихся в природе аминокислот, включая, например, любой из D или L-изомеров встречающихся в природе аминокислот (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr) или любой из D или L-изомеров не встречающихся в природе аминокислот, выбранных из группы, состоящей из: β-аланина (β-Ala), N-α-метилаланина (Me-Ala), аминомасляной кислоты (Abu), γ-аминомасляной кислоты (γ-Abu), аминокапроновой кислоты (ε-Ahx), аминоизомасляной кислоты (Aib), аминометилпирролкарбоновой кислоты, аминопиперидинкарбоновой кислоты, аминосерина (Ams), аминотетрагидропиран-4-карбоновой кислоты, N-метокси-N-метиламида аргинина, β-аспарагиновой кислоты (β-Asp), азетидинкарбоновой кислоты, 3-(2-бензотиазолил)аланина, α-трет-бутилглицина, 2-амино-5-уреидо-н-валериановой кислоты (цитруллина, Cit), β-циклогексилаланина (Cha), ацетамидометилцистеина, диаминомасляной кислоты (Dab), диаминопропионовой кислоты (Dpr), дигидроксифенилаланина (DOPA), диметилтиазолидина (DMTA), γ-глутаминовой кислоты (γ-Glu), гомосерина (Hse), гидроксипролина (Hyp), N-метокси-N-метиламида изолейцина, метилизолейцина (MeIle), изонипекотиновой кислоты (Isn), метиллейцина (MeLeu), метиллизина, диметиллизина, триметиллизина, метанопролина, метионинсульфоксида (Met(O)), метионинсульфона (Met(O₂)), норлейцина (Nle), метилнорлейцина (Me-Nle), норвалина (Nva), орнитина (Orn), парааминобензойной кислоты (PABA), пеницилламина (Pen), метилфенилаланина (MePhe), 4-хлорфенилаланина (Phe(4-Cl)), 4-фторфенилаланина (Phe(4-F)), 4-нитрофенилаланина (Phe(4-NO₂)), 4-цианофенилаланина ((Phe(4-CN)), фенилглицина (Phg), пиперидинилаланина, пиперидинилглицина, 3,4-дегидропролина, пирролидинилаланина, саркозина (Sar), селеноцистеина (Sec), O-бензилфосфосерина, 4-амино-3-гидрокси-6-метилгептановой кислоты (Sta), 4-амино-5-циклогексил-3-гидроксипентановой кислоты (ACHPA), 4-амино-3-гидрокси-5-фенилпентановой кислоты (AHPPA), 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновой кислоты (Tic), тетрагидропиранглицина, тиенилаланина (Thi), O-бензилфосфотирозина, O-фосфотирозина, метокситирозина, этокситирозина, O-(бис-диметиламинофосфоно)тирозина, тирозинсульфата тетрабутиламина, метилвалина (MeVal), 1-амино-1-циклогексанкарбоновой кислоты (Acx), аминовалериановой кислоты, бета-циклопропилаланина (Cpa), пропаргилглицина (Prg), аллилглицина (Alg), 2-амино-2-циклогексилпропановой кислоты (2-Cha), трет-бутилглицина (Tbg), винилглицина (Vg), 1-амино-1-циклопропанкарбоновой кислоты (Acp), 1-амино-1-циклопентанкарбоновой кислоты (Acpe) и алкилированной 3-меркаптопропионовой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер имеет суммарный отрицательный заряд, например содержит одну или две отрицательно заряженных аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, дипептид не является любым из дипептидов с общей структурой A-B, где A выбран из группы, состоящей из Gly, Gln, Ala, Arg, Asp, Asn, Ile, Leu, Val, Phe и Pro, где B выбран из группы, состоящей из Lys, His, Trp. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, дипептидный спейсер выбран из группы, состоящей из: Ala-Ala, β-Ala-β-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, γ-аминомасляная кислота-γ-аминомасляная кислота и γ-Glu-γ-Glu.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, родственный глюкагону пептид модифицируют, чтобы он содержал ацильную группу, путем ацилирования длинноцепочечного алкана родственным глюкагону пептидом. В конкретных аспектах, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длинноцепочечный алкан содержит аминную, гидроксильную или тиольную группу (например, октадециламин, тетрадеканол и гексадекантиол), которая взаимодействует с карбоксильной группой или ее активированной формой родственного глюкагону пептида. Карбоксильная группа или ее активированная форма родственного глюкагону пептида класса 1, класса 2 или класса 3 может быть частью боковой цепи аминокислоты (например, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты) родственного глюкагону пептида или может быть частью остова пептида.

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3 модифицируют, чтобы он содержал ацильную группу, путем ацилирования длинноцепочечного алкана спейсером, который связан с глюкагоновым пептидом. В конкретных аспектах длинноцепочечный алкан содержит аминную, гидроксильную или тиольную группу, которые взаимодействуют с карбоксильной группой или ее активированной формой спейсера. Подходящие спейсеры, содержащие карбоксильную группу или ее активированную форму, описаны в настоящем описании и включают, например, бифункциональные спейсеры, например аминокислоты, дипептиды, трипептиды, гидрофильные бифункциональные спейсеры и гидрофобные бифункциональные спейсеры.

Как используется в настоящем описании, термин «активированная форма карбоксильной группы» относится к карбоксильной группе общей формулы R(C=O)X, где X означает уходящую группу, и R означает родственный глюкагону пептид или спейсер. Например, активированные формы карбоксильных групп могут включать, но без ограничения, ацилхлориды, ангидриды и сложные эфиры. В некоторых вариантах осуществления активированная карбоксильная группа представляет собой сложный эфир с уходящей группой N-гидроксисукцинимида (NHS).

Что касается указанных аспектов изобретения, в которых длинноцепочечный алкан ацилируют родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3 или спейсером, то длинноцепочечный алкан может быть любого размера и может иметь любую длину углеродной цепи. Длинноцепочечный алкан может быть неразветвленным или разветвленным. В некоторых аспектах, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длинноцепочечный алкан является C4-C30алканом. Например, длинноцепочечный алкан может представлять собой любой из алканов: C4алкан, C6алкан, C8алкан, C10алкан, C12алкан, C14алкан, C16алкан, C18алкан, C20алкан, C22алкан, C24алкан, C26алкан, C28алкан или C30алкан. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длинноцепочечный алкан включает C8-C20алкан, например, C14алкан, C16алкан или C18алкан.

Также в некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, амин, гидроксил или тиольная группа родственного глюкагону пептида ацилирированы холестериновой кислотой. В конкретном варианте осуществления родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3 связан с холестериновой кислотой через алкилированный дезамино-Cys-спейсер, т.е. спейсер на основе алкилированной 3-меркаптопропионовой кислоты.

Подходящие способы ацилирования пептидов по аминам, гидроксилам и тиолам известны в данной области. См., например, Miller, Biochem. Biophys. Res. Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi and Stammer, Int. J. Pept. Protein Res. 19: 54-62 (1982); и Previero et al., Biochim. Biophys. Acta 263: 7-13 (1972) (в отношении способов ацилирования по гидроксилу); и San and Silvius, J. Pept. Res. 66: 169-180 (2005) (в отношении способов ацилирования по тиолу); Bioconjugate Chem. «Chemical Modifications of Proteins: History and Applications» p. 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. «Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity» Vol. 6, NO:2 pp.171-176 (1989).

Ацильная группа ацилированного родственного глюкагону пептида может быть любого размера, например, с любой длиной углеродной цепи, и может быть неразветвленной или разветвленной. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения ацильная группа может быть представлена C4-C30 жирной кислотой. Например, ацильная группа может быть представлена любой из кислот: C4 жирной кислотой, C6 жирной кислотой, C8 жирной кислотой, C10 жирной кислотой, C12 жирной кислотой, C14 жирной кислотой, C16 жирной кислотой, C18 жирной кислотой, C20 жирной кислотой, C22 жирной кислотой, C24 жирной кислотой, C26 жирной кислотой, C28 жирной кислотой или C30 жирной кислотой. В некоторых вариантах осуществления ацильная группа представлена C8-C20 жирной кислотой, например, C14 жирной кислотой или C16 жирной кислотой.

В альтернативном варианте осуществления ацильная группа представлена желчной кислотой. Желчной кислотой может быть любая желчная кислота, включая, но без ограничения, холевую кислоту, хенодезоксихолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, литохолевую кислоту, таурохолевую кислоту, гликохолевую кислоту и холестериновую кислоту.

Ацилированные родственные глюкагону пептиды, описанные в настоящем описании, могут быть дополнительно модифицированы, чтобы дополнительно содержать гидрофильный остаток. В некоторых конкретных вариантах осуществления гидрофильный остаток может содержать цепь полиэтиленгликоля (ПЭГ). Включение гидрофильного остатка можно осуществить любыми подходящими способами, такими как любой из способов, описанных в настоящем описании. В этой связи, ацилированный родственный глюкагону пептид может содержать последовательность SEQ ID NO:701, содержащую любую из модификаций, описанных в настоящем описании, в которой по меньшей мере одна из аминокислот в положении 10, 20, 24 и 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) содержит ацильную группу, и по меньшей мере одна из аминокислот в положении 16, 17, 21, 24 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа), в положении в пределах C-концевого удлинения или C-концевая аминокислота модифицированы до Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или Ac-Phe, и боковая цепь аминокислоты ковалентно связана с гидрофильным остатком (например, ПЭГ). В некоторых вариантах осуществления ацильная группа связана в положении 10 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа), необязательно через спейсер, содержащий Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или Ac-Phe, и гидрофильный остаток включен по остатку Cys в положении 24.

Альтернативно, ацилированный родственный глюкагону пептид может содержать спейсер, где спейсер является как ацилированным, так и модифицированным таким образом, чтобы содержать гидрофильный остаток. Неограничивающие примеры подходящих спейсеров включают спейсер, содержащий одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из Cys, Lys, Orn, гомо-Cys и Ac-Phe.

Алкилирование

Согласно некоторым вариантам осуществления родственный глюкагону пептид, например родственный глюкагону пептид класса 1, родственный глюкагону пептид класса 2, родственный глюкагону пептид класса 3, глюкагоновый пептид класса 4 или родственный глюкагону пептид класса 5, модифицируют, чтобы он содержал алкильную группу, которая связана с родственным глюкагону пептид эфирной, тиоэфирной или амидной связью в целях увеличения времени полужизни в циркуляции и/или задержки начала и/или увеличения продолжительности действия и/или повышения устойчивости к протеазам, таким как DPP-IV. В примерах вариантов осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, родственный глюкагону пептид содержит алкильную группу, которая не является нативной по отношению к встречающимся в природе аминокислотам.

Алкилирование можно осуществлять в любом положении родственного глюкагону пептида, включая любое из положений 1-29, положение в пределах C-концевого удлинения или C-концевую аминокислоту, при условии, что сохраняется агонистическая или антагонистическая активность родственного глюкагону пептида в отношении рецептора глюкагона, GLP-1 или другого родственного глюкагону пептида. В некоторых вариантах осуществления, если неалкилированный пептид обладает активностью агониста глюкагона, то алкилированный пептид сохраняет активность агониста глюкагона. В других вариантах осуществления, если неалкилированный пептид обладает активностью антагониста глюкагона, то алкилированный пептид сохраняет активность антагониста глюкагона. В некоторых вариантах осуществления, если неалкилированный пептид обладает агонистической активностью GLP-1, то алкилированный пептид сохраняет агонистическую активность GLP-1. Неограничивающие примеры включают алкилирование в положениях 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа). Что касается родственных глюкагону пептидов класса 1, класса 2 и класса 3, то алкилирование может быть осуществлено в положениях 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28, 29, 30, 37, 38, 39, 40, 41, 42 или 43 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа). Алкильная группа может быть ковалентно связана непосредственно с аминокислотой родственного глюкагону пептида, или опосредованно с аминокислотой родственного глюкагону пептида через спейсер, где спейсер расположен между аминокислотой родственного глюкагону пептида и алкильной группой. Родственные глюкагону пептиды могут быть алкилированы в том же положении аминокислоты, с которым связан гидрофильный остаток, или в другом положении аминокислоты. Неограничивающие примеры включают алкилирование в положении 10 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) и пегилирование в одном или нескольких положениях в C-концевой части родственного глюкагону пептида, например, в положении 24, 28 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа), в пределах C-концевого удлинения или на C-конце (например, путем добавления C-концевого Cys).

В конкретном аспекте изобретения родственный глюкагону пептид модифицируют, чтобы он содержал алкильную группу, прямым алкилированием амина, гидроксила или тиола боковой цепи аминокислоты родственного глюкагону пептида. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид непосредственно алкилируют по амину, гидроксилу или тиолу боковой цепи аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления алкилирование осуществляют в положении 10, 20, 24 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа). В связи с этим, алкилированный родственный глюкагону пептид может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:701 или модифицированную аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько модификаций аминокислот, описанных в настоящем описании, где по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 10, 20, 24 и 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) модифицирована до любой аминокислоты, содержащей амин, гидроксил или тиол в боковой цепи. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения прямое алкилирование родственного глюкагону пептида осуществляют по амину, гидроксилу или тиолу боковой цепи аминокислоты в положении 10 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа).

В некоторых вариантах осуществления аминокислотой, содержащей амин в боковой цепи, является аминокислота формулы I. В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислота формулы I представляет собой аминокислоту, где n равно 4 (Lys) или n равно 3 (Orn).

В других вариантах осуществления аминокислотой, содержащей гидроксил в боковой цепи, является аминокислота формулы II. В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислота формулы II представляет собой аминокислоту, где n равно 1 (Ser).

В еще других вариантах осуществления аминокислотой, содержащей тиол в боковой цепи, является аминокислота формулы III. В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислота формулы II представляет собой аминокислоту, где n равно 1 (Cys).

В следующих вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, аминокислота, содержащая амин, гидроксил или тиол в боковой цепи, представляет собой дизамещенную аминокислоту, имеющую такую же структуру формулы I, формулы II или формулы III, за исключением того, что водород, связанный с альфа-атомом углерода аминокислоты формулы I, формулы II или формулы III заменен второй боковой цепью.

В некоторых вариантах осуществления изобретения алкилированный родственный глюкагону пептид содержит спейсер между пептидом и алкильной группой. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид ковалентно связан со спейсером, который ковалентно связан с алкильной группой. В некоторых примерах вариантов осуществления родственный глюкагону пептид модифицируют, чтобы он содержал алкильную группу, алкилированием амина, гидроксила или тиола спейсера, где такой спейсер связан с боковой цепью аминокислоты в положении 10, 20, 24 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) родственного глюкагону пептида. Аминокислотой, с которой связан спейсер, может быть любая аминокислота, содержащая остаток, который обеспечивает возможность связывания со спейсером. Что касается родственных глюкагону пептидов класса 1, класса 2 и класса 3, то аминокислотой, с которой связан спейсер, может быть любая аминокислота (например, одно-α-замещенная аминокислота или α,α-дизамещенная аминокислота), содержащая остаток, который обеспечивает возможность связывания со спейсером. Например, подходящей является аминокислота, содержащая -NH₂, -OH или -COOH в боковой цепи (например, Lys, Orn, Ser, Asp или Glu). В этой связи, ацилированный родственный глюкагону пептид может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:701 или модифицированную аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько модификаций аминокислот, описанных в настоящем описании, где по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 10, 20, 24 и 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) модифицирована в любую аминокислоту, содержащую амин, гидроксил или карбоксилат в боковой цепи.

В некоторых вариантах осуществления спейсером является аминокислота, содержащая амин, гидроксил или тиол в боковой цепи, или дипептид или трипептид, содержащий аминокислоту, имеющую амин, гидроксил или тиол в боковой цепи. В некоторых вариантах осуществления аминокислотный спейсер не является аминокислотой γ-Glu. В некоторых вариантах осуществления дипептидным спейсером не может быть γ-Glu-γ-Glu.

Когда происходит алкилирование группы амина аминокислоты спейсера, такое алкилирование может быть осуществлено по альфа-амину аминокислоты или амину боковой цепи. В случае, когда алкилирован альфа-амин, спейсерной аминокислотой может быть любая аминокислота. Например, спейсерной аминокислотой может быть гидрофобная аминокислота, например, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr. Альтернативно, спейсерной аминокислотой может быть кислый остаток, например, Asp и Glu. В примерах вариантов осуществления, в которых родственный глюкагону пептид является родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, спейсерной аминокислотой может быть гидрофобная аминокислота, например, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr, 6-аминокапроновая кислота, 5-аминовалериановая кислота, 7-аминогептановая кислота, 8-аминооктановая кислота. Альтернативно, спейсерной аминокислотой, связанной с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, может быть кислый остаток, например, Asp и Glu, при условии, что алкилирование происходит по альфа-амину кислого остатка. В случае, когда алкилирован амин боковой цепи спейсерной аминокислоты, спейсерной аминокислотой является аминокислота, содержащая амин в боковой цепи, например, аминокислота формулы I (например, Lys или Orn). В таком случае, возможно алкилирование как альфа-амина, так и амина боковой цепи спейсерной аминокислоты, так что глюкагоновый пептид оказывается диалкилированным. Варианты осуществления изобретения включают такие диалкилированные молекулы.

Когда алкилирование происходит по гидроксильной группе аминокислоты спейсера, аминокислотой или одной из аминокислот спейсера может быть аминокислота формулы II. В конкретном примере варианта осуществления аминокислотой является Ser.

Когда алкилирование происходит по тиольной группе аминокислоты спейсера, аминокислотой или одной из аминокислот спейсера может быть аминокислота формулы III. В конкретном примере варианта осуществления аминокислотой является Cys.

В некоторых вариантах осуществления спейсер включает гидрофильный бифункциональный спейсер. В конкретном варианте осуществления спейсер содержит аминополи(алкилокси)карбоксилат. В связи с этим, спейсер может содержать, например, NH₂(CH₂CH₂O)_n(CH₂)_mCOOH, где m означает любое целое число от 1 до 6, и n означает любое целое число от 2 до 12, такую как, например, 8-амино-3,6-диоксаоктановая кислота, которая коммерчески доступна от Peptides International, Inc. (Louisville, KY).

В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер представляет собой гидрофильный бифункциональный спейсер. В некоторых вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит две или несколько реакционноспособных групп, например, амино, гидроксильную, тиольную и карбоксильную группу или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, содержит гидроксильную группу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит аминогруппу и карбоксилат.

В некоторых вариантах осуществления спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, представляет собой гидрофобный бифункциональный спейсер. В некоторых вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит две или несколько реакционноспособных групп, например, аминную, гидроксильную, тиольную и карбоксильную группу или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит гидроксильную группу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит аминогруппу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит тиольную группу и карбоксилат. Подходящие гидрофобные бифункциональные спейсеры, содержащие карбоксилат и гидроксильную группу или тиольную группу, известны в данной области и включают, например, 8-гидроксиоктановую кислоту и 8-меркаптооктановую кислоту.

Спейсер (например, аминокислота, дипептид, трипептид, гидрофильный бифункциональный спейсер или гидрофобный бифункциональный спейсер) в конкретных вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, имеет длину от 3 до 10 атомов (например, 6-10 атомов, (например, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов)). В более конкретных вариантах осуществления спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, имеет длину примерно от 3 до 10 атомов (например, 6-10 атомов), и алкил представляет собой C12-C18алкильную группу, например, C14алкильную группу, C16алкильную группу, так что общая длина спейсера и алкильной группы составляет 14-28 атомов, например примерно 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 атомов. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длина спейсера и алкила составляет 17-28 (например, 19-26, 19-21) атомов.

Согласно некоторым приведенным выше вариантам осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, бифункциональный спейсер может представлять собой синтетическую или не встречающуюся в природе аминокислоту, имеющую аминокислотный остов, длина которого составляет 3-10 атомов (например, 6-аминокапроновую кислоту, 5-аминовалериановую кислоту, 7-аминогептановую кислоту и 8-аминооктановую кислоту). Альтернативно, спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, может представлять собой дипептидный или трипептидный спейсер, имеющий пептидный остов, длина которого составляет 3-10 атомов (например, 6-10 атомов). Дипептидный или трипептидный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, может состоять из встречающихся в природе и/или не встречающихся в природе аминокислот, включая, например, любую из аминокислот, описанных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер имеет суммарный отрицательный заряд, например содержит одну или две отрицательно заряженных аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, дипептидный спейсер выбран из группы, состоящей из: Ala-Ala, β-Ala-β-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, γ-аминомасляная кислота-γ-аминомасляная кислота и γ-Glu-γ-Glu. В некоторых вариантах осуществления дипептидным спейсером является γ-Glu-γ-Glu.

Подходящие способы алкилирования пептидов по аминам, гидроксилам и тиолам известны в данной области. Например, можно использовать простой эфирный синтез Вильямсона для образования простой эфирной связи между родственным глюкагону пептидом и алкильной группой. Также, реакция нуклеофильного замещения пептида с алкилгалогенидом может приводить к образованию любой из эфирной, тиоэфирной или амидной связи.

Алкильная группа алкилированного родственного глюкагону пептида может иметь любой размер, например, любую длину углеродной цепи, и может быть неразветвленной или разветвленной. В некоторых вариантах осуществления изобретения алкильная группа представляет собой C4-C30алкил. Например, алкильная группа может представлять собой любую из алкильных групп: C4алкил, C6алкил, C8алкил, C10алкил, C12алкил, C14алкил, C16алкил, C18алкил, C20алкил, C22алкил, C24алкил, C26алкил, C28алкил или C30алкил. В некоторых вариантах осуществления алкильная группа представляет собой C8-C20алкил, например, C14алкил или C16алкил.

В некоторых конкретных вариантах осуществления алкильная группа содержит стероидный остаток желчной кислоты, например, холевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, дезоксихолевой кислоты, литохолевой кислоты, таурохолевой кислоты, гликохолевой кислоты и холестериновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, родственный глюкагону пептид модифицируют, чтобы он содержал алкильную группу, путем взаимодействия нуклеофильного длинноцепочечного алкана с родственным глюкагону пептидом, где родственный глюкагону пептид содержит уходящую группу, подходящую для нуклеофильного замещения. В конкретных аспектах, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, нуклеофильная группа длинноцепочечного алкана содержит аминную, гидроксильную или тиольную группу (например, октадециламин, тетрадеканол и гексадекантиол). Уходящая группа родственного глюкагону пептида класса 1, класса 2 или класса 3 может быть частью боковой цепи аминокислоты или может быть частью пептидного остова. Подходящие уходящие группы включают, например, N-гидроксисукцинимид, галогены и сложные сульфонатные эфиры.

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3 модифицируют, чтобы он содержал алкильную группу, путем взаимодействия нуклеофильного длинноцепочечного алкана со спейсером, который связан с родственным глюкагону пептидом, где спейсер содержит уходящую группу. В конкретных аспектах, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длинноцепочечный алкан содержит аминную, гидроксильную или тиольную группу. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер, содержащий уходящую группу, может представлять собой любой спейсер, обсуждаемый в настоящем описании, например, аминокислоты, дипептиды, трипептиды, гидрофильные бифункциональные спейсеры и гидрофобные бифункциональные спейсеры, дополнительно содержащие подходящую уходящую группу.

Что касается указанных аспектов изобретения, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, и в которых длинноцепочечный алкан алкилирован родственным глюкагону пептидом или спейсером, длинноцепочечный алкан может иметь любой размер и может иметь углеродную цепь любой длины. Длинноцепочечный алкан может быть неразветвленным или разветвленным. В некоторых аспектах длинноцепочечный алкан представляет собой C4-C30алкан. Например, длинноцепочечный алкан может представлять собой любой из алканов: C4алкан, C6алкан, C8алкан, C10алкан, C12алкан, C14алкан, C16алкан, C18алкан, C20алкан, C22алкан, C24алкан, C26алкан, C28алкан или C30алкан. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длинноцепочечный алкан представляет собой C8-C20алкан, например, C14алкан, C16алкан или C18алкан.

Также в некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, алкилирование может происходить между родственным глюкагону пептидом и остатком холестерина. Например, гидроксильная группа холестерина может заменять уходящую группу на длинноцепочечном алкане с образованием продукта холестерин-глюкагоновый пептид.

Алкилированные родственные глюкагону пептиды, описанные в настоящем описании, могут быть дополнительно модифицированы, чтобы они содержали гидрофильный остаток. В некоторых конкретных вариантах осуществления гидрофильный остаток может содержать цепь полиэтиленгликоля (ПЭГ). Введение гидрофильного остатка можно осуществить подходящими способами, такими как любой из способов, описанных в настоящем описании. В связи с этим, алкилированный родственный глюкагону пептид может содержать последовательность SEQ ID NO:701 или модифицированную аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько модификаций аминокислот, описанных в настоящем описании, в которой по меньшей мере одна из аминокислот в положении 10, 20 24 и 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) содержит алкильную группу, и по меньшей мере одна из аминокислот в положении 16, 17, 21, 24 и 29, в положении в пределах C-концевого удлинения или C-концевая аминокислота модифицирована до Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или Ac-Phe, и боковая цепь аминокислоты ковалентно связана с гидрофильным остатком (например, ПЭГ). В некоторых вариантах осуществления алкильная группа связана в положении 10 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа), необязательно через спейсер, содержащий Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или Ac-Phe, и гидрофильный остаток введен по остатку Cys в положении 24.

Альтернативно, алкилированный родственный глюкагону пептид может содержать спейсер, где спейсер является как алкилированным, так и модифицированным, чтобы содержать гидрофильный остаток. Неограничивающие примеры подходящих спейсеров включают спейсер, содержащий одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из Cys, Lys, Orn, гомо-Cys и Ac-Phe.

Стабилизация альфа-спиральной структуры

В некоторых вариантах осуществления формируют внутримолекулярный мостик между боковыми цепями двух аминокислот, стабилизируя трехмерную структуру части, находящейся на карбоксильном конце (например, аминокислоты 12-29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа)) родственного глюкагону пептида. Две боковых цепи аминокислот могут быть связаны друг с другом через водородные связи, ионное взаимодействие, такое как образование солевых мостиков, или ковалентные связи.

В некоторых вариантах осуществления внутримолекулярный мостик образуется между двумя аминокислотами, которые отделены друг от друга 3 аминокислотами, например, между аминокислотами в положениях i и i+4, где i означает любое целое число от 12 до 25 (например, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 25) согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа. Более конкретно, боковые цепи пар аминокислот 12 и 16, 16 и 20, 20 и 24 или 24 и 28 (пары аминокислот, в которых i равно 12, 16, 20 или 24) согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа связаны друг с другом и таким образом стабилизируют альфа-спираль глюкагона. Альтернативно, i может быть равно 17.

В некоторых конкретных вариантах осуществления, в которых аминокислоты в положениях i и i+4 связаны внутримолекулярным мостиком, размер линкера составляет примерно 8 атомов или примерно 7-9 атомов.

В других вариантах осуществления внутримолекулярный мостик образован между двумя аминокислотами, которые отделены друг от друга двумя аминокислотами, например, между аминокислотами в положениях j и j+3, где j означает любое целое число от 12 до 26 (например, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 и 26) согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа. В некоторых конкретных вариантах осуществления j равно 17.

В некоторых конкретных вариантах осуществления, в которых аминокислоты в положениях j и j+3 связаны внутримолекулярным мостиком, размер линкера составляет примерно 6 атомов или примерно от 5 до 7 атомов.

В следующих вариантах осуществления внутримолекулярный мостик образуется между двумя аминокислотами, которые отделены друг от друга 6 аминокислотами, например, между аминокислотами в положениях k и k+7, где k означает любое целое число от 12 до 22 (например, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 и 22) согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа. В некоторых конкретных вариантах осуществления k равно 12, 13 или 17. В примере варианта осуществления k равно 17.

Примерами пар аминокислот, которые способны к ковалентному связыванию с образованием шестиатомного связывающего мостика, являются Orn и Asp, Glu и аминокислота формулы I, где n равно 2, и гомоглутаминовая кислота и аминокислота формулы I, где n равно 1, где формула I представляет собой:

где n=1-4

[Формула I]

Примерами пар аминокислот, которые способны к ковалентному связыванию с образованием семиатомного связывающего мостика, являются Orn-Glu (лактамовое кольцо), Lys-Asp (лактам) или гомо-Ser-гомо-Glu (лактон). Примерами пар аминокислот, которые могут образовывать восьмиатомный линкер, являются Lys-Glu (лактам), гомо-Lys-Asp (лактам), Orn-гомо-Glu (лактам), 4-аминоPhe-Asp (лактам) или Tyr-Asp (лактон). Примерами пар аминокислот, которые могут образовывать девятиатомный линкер, являются гомо-Lys-Glu (лактам), Lys-гомо-Glu (лактам), 4-аминоPhe-Glu (лактам) или Tyr-Glu (лактон). Любые боковые цепи таких аминокислот могут быть дополнительно замещены дополнительными химическими группами, при условии, что трехмерная структура альфа-спирали не нарушается. Специалист в данной области может предложить альтернативные пары или альтернативные аналоги аминокислот, включая химически модифицированные производные, которые могут создавать стабилизирующую структуру, имеющую сходный размер и оказывающую требуемое влияние. Например, дисульфидный мостик гомоцистеин-гомоцистеин имеет длину 6 атомов и может быть дополнительно модифицирован для получения требуемого эффекта. Даже при отсутствии ковалентного связывания пары аминокислот, описанные выше, или сходные пары, которые может предоставить специалист в данной области, также могут обеспечить дополнительную стабильность альфа-спирали благодаря нековалентным связям, например, в результате образования солевых мостиков или образования водородных связей.

Размер лактамового кольца может варьировать в зависимости от длины боковых цепей аминокислот, и в некоторых вариантах осуществления лактам образуется в результате связывания боковых цепей аминокислоты лизина с боковой цепью глутаминовой кислоты. Дополнительные иллюстративные варианты (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа) включают следующие пары, необязательно с лактамовым мостиком: Glu в положении 12 с Lys в положении 16; нативный Lys в положении 12 с Glu в положении 16; Glu в положении 16 с Lys в положении 20; Lys в положении 16 с Glu в положении 20; Glu в положении 20 с Lys в положении 24; Lys в положении 20 с Glu в положении 24; Glu в положении 24 с Lys в положении 28; Lys в положении 24 с Glu в положении 28. Альтернативно, порядок амидной связи в кольце лактама может быть обратным (например, лактамовое кольцо может быть образовано между боковыми цепями Lys12 и Glu16 или, альтернативно, между Glu 12 и Lys 16).

Можно использовать другие внутримолекулярные мостики, отличные от лактамового мостика, чтобы стабилизировать альфа-спираль родственных глюкагону пептидов. В некоторых вариантах осуществления внутримолекулярный мостик является гидрофобным мостиком. В данном случае, внутримолекулярный мостик необязательно находится между боковыми цепями двух аминокислот, которые представляют собой часть гидрофобной внешней поверхности альфа-спирали родственного глюкагону пептида. Например, одной из аминокислот, связанной гидрофобным мостиком, может быть аминокислота в положении 10, 14 и 18 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа).

В одном конкретном аспекте используют метатезис олефинов для перекрестного сшивания одного или двух поворотов альфа-спирали родственного глюкагону пептида, используя полностью углеводородную систему поперечного сшивания. В этом случае, родственный глюкагону пептид может содержать α-метилированные аминокислоты, несущие олефиновые боковые цепи разной длины и имеющие либо R-, либо S-стереохимическую конфигурацию по положениям i и i+4 или i+7. Например, олефиновая боковая цепь может содержать (CH₂)n, где n означает любое целое число от 1 до 6. В некоторых вариантах осуществления n равно 3 в случае длины поперечной сшивки из 8 атомов. Подходящие способы образования таких внутримолекулярных мостиков описаны в данной области. См., например, Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000) и Walensky et al., Science 305: 1466-1470 (2004). Альтернативно, глюкагоновый пептид может содержать остатки O-аллил-Ser, расположенные на соседних поворотах спирали, которые связаны вместе мостиком в результате катализируемого рутением метатезиса с замыканием кольца. Такие способы поперечного сшивания описаны, например, Blackwell et al., в Angew, Chem., Int. Ed. 37: 3281-3284 (1998).

В другом конкретном аспекте неприродную тиодиаланиновую аминокислоту, лантионин, широко используемую в качестве пептидомиметика цистеина, используют для поперечного сшивания одного витка альфа-спирали. Подходящие способы, основанные на лантионине циклизации, известны в данной области. См., например, Matteucci et al., Tetrahedron Letters 45: 1399-1401 (2004); Mayer et al., J. Peptide Res. 51: 432-436 (1998); Polinsky et al., J. Med. Chem. 35: 4185-4194 (1992); Osapay et al., J. Med. Chem. 40: 2241-2251 (1997); Fukase et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 65: 2227-2240 (1992); Harpp et al., J. Org. Chem. 36: 73-80 (1971); Goodman and Shao, Pure Appl. Chem. 68: 1303-1308 (1996); и Osapay and Goodman, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1599-1600 (1993).

В некоторых вариантах осуществления α,ω-диаминоалкановые связки, например, 1,4-диаминопропановые и 1,5-диаминопентановые, между двумя остатками Glu в положениях i и i+7 используют для стабилизации альфа-спирали глюкагонового пептида. Такие связки приводят к образованию мостика длиной 9 атомов или больше, в зависимости от длины диаминоалкановой связки. Подходящие способы получения пептидов, поперечно сшитых такими связками, описаны в данной области. См., например, Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 455-460 (1997).

В еще одном варианте осуществления изобретения используют дисульфидный мостик для поперечного сшивания одного или двух витков альфа-спирали родственного глюкагону пептида. Альтернативно, используют модифицированный дисульфидный мостик, в котором один или два атома серы заменены группой метилена, приводящей к изостерической макроциклизации, чтобы стабилизировать альфа-спираль родственного глюкагону пептида. Подходящие способы модификации пептидов дисульфидными мостиками или основанной на сере циклизации описаны, например, в Jackson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 9391-9392 (1991) и Rudinger and Jost, Experientia 20: 570-571 (1964).

В еще одном варианте осуществления альфа-спираль родственного глюкагону пептида стабилизируют, используя связывание атома металла двумя остатками His или парой His и Cys, находящимися в положениях i и i+4. Атомом металла может быть, например, Ru(III), Cu(II), Zn(II) или Cd(II). Такие способы основанной на связывании металла стабилизации альфа-спирали известны в данной области. См., например, Andrews and Tabor, Tetrahedron 55: 11711-11743 (1999); Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1630-1632 (1990); и Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 9063-9064 (1997).

Альфа-спираль родственного глюкагону пептида, альтернативно, может быть стабилизирована другими способами циклизации пептидов, и обзор таких способов приведен у Davies, в J. Peptide Sci. 9: 471-501 (2003). Альфа-спираль может быть стабилизирована в результате образования амидной связи, простого тиоэфирного мостика, сложного тиоэфирного мостика, мочевинного мостика, карбаматного мостика, сульфонамидного мостика и подобных. Например, сложный тиоэфирный мостик может быть образован между C-концом и боковой цепью остатка Cys. Альтернативно, простой тиоэфир может быть образован благодаря боковым цепям аминокислот, имеющих тиол (Cys) и остаток карбоновой кислоты (например, Asp, Glu). В другом способе поперечно сшивающий агент, такой как дикарбоновая кислота, например субериновая кислота (октандиовая кислота) и т.д., может вводить связь между двумя функциональными группами боковой цепи аминокислоты, такими как свободная аминогруппа, гидроксильная, тиольная группа и их комбинации.

Согласно некоторым вариантам осуществления альфа-спираль родственного глюкагону пептида стабилизируют путем введения гидрофобной аминокислоты в положения i и i+4. Например, i может представлять собой Tyr, и i+4 может быть либо Val, либо Leu; i может представлять собой Phe, и i+4 может быть Cys или Met; i может представлять собой Cys, и i+4 может быть Met; или i может быть Phe, и i+4 может быть Ile. Следует понимать, что для целей настоящего изобретения указанные выше пары аминокислот могут быть обратными, так что указанная аминокислота в положении I, альтернативно, может находиться в положении i+4, тогда как аминокислота i+4 может находиться в положении i.

Согласно другим вариантам осуществления изобретения, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой пептид, обладающий активностью агониста глюкагона, активностью агониста GIP, активностью антагониста глюкагона и активностью GLP-1, альфа-спираль стабилизируют путем введения (либо посредством замены аминокислоты, либо посредством инсерции аминокислоты) одной или несколько стабилизирующих альфа-спираль аминокислот в C-коневую часть родственного глюкагону пептида (вблизи аминокислот 12-29, согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа). В конкретном варианте осуществления стабилизирующей альфа-спираль аминокислотой является α,α-дизамещенная аминокислота, включая, но без ограничения, любую из аминокислот: аминоизомасляную кислоту (AIB), аминокислоту, дизамещенную одинаковыми или различными группами, выбранными из метила, этила, пропила и н-бутила, или замещенную циклооктаном или циклогептаном (например, 1-аминоциклооктан-1-карбоновая кислота). В некоторых вариантах осуществления в одном, двух, трех, четырех или больше положениях 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 или 29 родственного глюкагону пептида имеется замена α,α-дизамещенной аминокислотой. В конкретном варианте осуществления в одном, двух, трех или во всех положениях 16, 20, 21 и 24 имеется замена аминокислотой AIB.

Конъюгаты

Настоящее изобретение также относится к конъюгатам, в которых родственный глюкагону пептид (например, родственный глюкагону пептид класса 1, родственный глюкагону пептид класса 2, родственный глюкагону пептид класса 3, родственный глюкагону пептид класса 4 или родственный глюкагону пептид класса 5) связывают, необязательно ковалентной связью и необязательно через линкер, с конъюгируемым остатком. Связывание можно осуществлять с использованием ковалентных химических связей, физических сил, таких как электростатические, водородные, ионные, Ван-дер-Ваальса или гидрофобные или гидрофильные взаимодействия. Можно использовать множество систем нековалентного связывания, включая системы биотин-авидин, лиганд/рецептор, фермент/субстрат, нуклеиновая кислота/связывающий нуклеиновую кислоту белок, липид/связывающий липид белок, молекулярные партнеры при клеточной адгезии; или любые связывающиеся партнеры или их фрагменты, которые обладают аффинностью в отношении друг к другу.

Родственный глюкагону пептид может быть связан с конъюгируемым остатком благодаря прямому ковалентному связыванию в результате взаимодействия целевых аминокислотных остатков пептида с органическим дериватизирующим агентом, который способен взаимодействовать с выбранными боковыми цепями или N- или C-концевыми остатками таких целевых аминокислот. Реакционноспособными группами пептида или конъюгируемого остатка являются, например, альдегидная группа, аминогруппа, сложноэфирная, тиольная, α-галогенацетильная, малеимидная или гидразиновая группа. Дериватизирующие агенты включают, например, малеимидобензилсульфосукцинимидный сложный эфир (конъюгирование через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимид (через остатки лизина), глутаральдегид, янтарный ангидрид или другие агенты, известные в данной области. Альтернативно, конъюгируемые остатки могут быть связаны с пептидом непосредственно через промежуточные носители, такие как полисахаридные или полипептидные носители. Примеры полисахаридных носителей включают аминодекстран. Примеры подходящих полипептидных носителей включают полилизин, полиглутаминовую кислоту, полиаспарагиновую кислоту, их сополимеры и смешанные полимеры таких аминокислот и других аминокислот, например, серина, чтобы придать требуемые свойства растворимости полученному в результате нагруженному носителю.

Остатки цистеинила, как правило, взаимодействуют с α-галогенацетатами (и соответствующими аминами), такими как хлоруксусная кислота или хлорацетамид, с образованием карбоксиметил или карбоксиамидометил-производных. Остатки цистеинила также дериватизируют взаимодействием с бромтрифторацетоном, альфа-бром-β-(5-имидазоил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, N-алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, п-хлоррутьбензоатом, 2-хлорруть-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом.

Остатки гистидила дериватизируют взаимодействием с диэтилпирокарбонатом при pH 5,5-7,0, так как указанный агент сравнительно специфичен по отношению к боковой цепи гистидила. Также может быть использован пара-бромфенацилбромид; реакцию предпочтительно осуществляют в 0,1М какодилате натрия при pH 6,0.

Остатки лизинила и амино-концевые остатки подвергают взаимодействию с янтарным или другими ангидридами карбоновых кислот. Эффект дериватизации такими агентами заключается в смене заряда остатков лизинила на противоположный. Другие подходящие реагенты для дериватизации альфа-аминосодержащих остатков включают сложные имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборогидрид, тринитробензолсульфоновую кислоту, O-метилизомочевину, 2,4-пентандион и катализируемое трансаминазой взаимодействие с гликосилатом.

Остатки аргинила модифицируют взаимодействием с одним или несколькими обычными реагентами, среди которых фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Дериватизация остатков аргинина требует, чтобы реакция проходила в щелочных условиях из-за высокого значения pK_a функциональной группы гуанидина. Кроме того, такие реагенты могут взаимодействовать с группами лизина, а также эпсилон-аминогруппой аргинина.

Конкретная модификация остатков тирозинила в случае, когда особый интерес представляет введение спектральных меток в остатки тирозинила, может быть осуществлена путем взаимодействия с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометана. Наиболее широко используют N-ацетилимидизол и тетранитрометан для образования формы O-ацетилтирозинила и 3-нитро-производных, соответственно.

Боковые карбоксильные группы (аспартил или глутамил) избирательно модифицируют путем взаимодействия с карбодиимидами (R-N=C=N-R'), где R и R' означают различные алкильные группы, такие как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азоний-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Кроме того, остатки аспартила и глутамила превращаются в остатки аспарагинила и глутаминила при взаимодействии с ионами аммония.

Другие модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серила или треонила, метилирование альфа-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman and Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), дезамидирование аспарагина или глутамина, ацетилирование N-концевого амина и/или амидирование или этерификацию C-концевых карбоксильных групп.

Другой тип ковалентной модификации заключается в химическом или ферментативном связывании гликозидов с пептидом. Сахар (сахара) может быть связан с (a) аргинином и гистидином, (b) свободными карбоксильными группами, (c) свободными сульфгидрильными группами, такими как группы цистеина, (d) свободными гидроксильными группами, такими как гидроксильные группы серина, треонина или гидроксипролина, (e) ароматическими остатками, такими как ароматические остатки тирозина или триптофана, или (f) амидной группой глутамина. Такие способы описаны в WO87/05330, опубликованной 11 сентября 1987, и в Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

Примерами конъюгируемых остатков, которые могут быть связаны с любым из родственных глюкагону пептидов, описанных в настоящем описании, являются, но без ограничения, гетерологичный пептид или полипептид (включая например, белок плазмы), целенаправленное средство, иммуноглобулин или его часть (например, вариабельная область, CDR или Fc-область), диагностическая метка, такая как радиоактивный изотоп, флюорофор или ферментативная метка, полимер, включая водорастворимые полимеры, или другие терапевтические или диагностические средства. В некоторых вариантах осуществления предлагается конъюгат, содержащий родственный глюкагону пептид согласно настоящему изобретению и белок плазмы, где белок плазмы выбран из группы, состоящей из альбумина, трансферина, фибриногена и глобулинов. В некоторых вариантах осуществления белком плазмы в качестве компонента конъюгата является альбумин или трансферин. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит цепь атомов длиной, включающей от 1 до примерно 60 или от 1 до 30 атомов, или более длинную цепь, от 2 до 5 атомов, от 2 до 10 атомов, от 5 до 10 атомов или от 10 до 20 атомов. В некоторых вариантах осуществления все атомы в цепи являются атомами углерода. В некоторых вариантах осуществления атомы в цепи в остове линкера выбраны из группы, состоящей из C, O, N и S. Атомы в цепи и линкеры могут быть выбраны в соответствии с их ожидаемой растворимостью (гидрофильностью), для того чтобы получить более растворимый конъюгат. В некоторых вариантах осуществления линкер обеспечивает функциональную группу, которая подвергается отщеплению ферментом или другим катализатором или в гидролитических условиях, встречающихся в ткани или органе, или клетке-мишени. В некоторых вариантах осуществления длина линкера является достаточно длинной, чтобы уменьшить возможные стерические помехи. Если линкер представляет собой ковалентную связь или пептидную связь, и конъюгат представляет собой полипептид, то полный конъюгат может представлять собой слитый белок. Такие пептидильные линкеры могут быть любой длины. Примеры линкеров составляют в длину примерно от 1 до 50 аминокислот, от 5 до 50, от 3 до 5, от 5 до 10, от 5 до 15 или от 10 до 30 аминокислот. Такие слитые белки, альтернативно, могут быть получены генно-инженерными рекомбинантными способами, известными специалисту в данной области.

Как указано выше, в некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды конъюгируют, например, сливают с иммуноглобулином или его частью (например, вариабельной областью, CDR или Fc-областью). Известные типы иммуноглобулинов (Ig) включают IgG, IgA, IgE, IgD или IgM. Fc-область представляет собой C-концевую область тяжелой цепи Ig, которая ответственна за связывание с Fc-рецепторами, которые обладают такой активностью, как рециклинг (что приводит к пролонгированному времени полужизни), зависимая от антитела опосредованная клетками цитотоксичность (ADCC) и зависимая от комплемента цитотоксичность (CDC).

Например, согласно некоторым определениям, Fc-область тяжелой цепи IgG человека простирается от Cys226 до C-конца тяжелой цепи. «Шарнирная область» обычно простирается от Glu216 до Pro230 IgG1 человека (шарнирные области других изотипов IgG могут быть выровнены с последовательностью IgG1 посредством выравнивания цистеинов, вовлеченных в связывание цистеина). Fc-область IgG включает два константных домена, CH2 и CH3. Домен CH2 Fc-области IgG человека обычно простирается от аминокислоты 231 до аминокислоты 341. Домен CH3 Fc-области IgG человека обычно простирается от аминокислоты 342 до аминокислоты 447. Все указания номеров аминокислот иммуноглобулинов или фрагментов или областей иммуноглобулинов основаны на нумерации, представленной в публикации Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md. В родственном варианте осуществления Fc-область может содержать одну или несколько нативных или модифицированных константных областей из тяжелой цепи иммуноглобулина, отличных от CH1, например, области CH2 и CH3 IgG и IgA, или области CH3 и CH4 IgE.

Подходящие конъюгируемые остатки включают части последовательностей иммуноглобулинов, которые содержат участок связывания FcRn. FcRn, рецептор спасения, ответственен за рециклинг иммуноглобулинов и возвращение их в кровообращение. Область Fc-части IgG, которая связывается с рецептором FcRn, описана на основе данных рентгеновской кристаллографии (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). Главная область контакта Fc с FcRn расположена вблизи места соединения доменов CH2 и CH3. Все контакты Fc-FcRn находятся в пределах одной тяжелой цепи Ig. Главные участки контакта включают остатки аминокислот 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 домена CH2 и остатки аминокислот 385-387, 428 и 433-436 домена CH3.

Некоторые конъюгируемые остатки могут включать или не включать участок (участки) связывания FcγR. FcγR ответственны за ADCC и CDC. Примерами положений в пределах Fc-области, которые осуществляют прямой контакт с FcγR, являются аминокислоты 234-239 (нижняя шарнирная область), аминокислоты 265-269 (петля B/C), аминокислоты 297-299 (петля C'/E) и аминокислоты 327-332 (петля F/G) (Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000). Нижняя шарнирная область IgE также вовлечена в связывание FcRI (Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997). Остатки, вовлеченные в связывание рецептора IgA, описаны Lewis et al. (J. Immunol. 175: 6694-701, 2005). Остатки аминокислот, вовлеченные в связывание рецептора IgE, описаны Sayers с соавторами (J. Biol. Chem. 279(34): 35320-5, 2004).

Модификации аминокислот могут быть осуществлены в Fc-области иммуноглобулина. Такие варианты Fc-области содержат по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в домене CH3 Fc-области (остатки 342-447) и/или по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в домене CH2 Fc-области (остатки 231-341). Мутации, которые, как полагают, придают повышенную аффинность в отношении FcRn, включают T256A, T307A, E380A и N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276: 6591). Другие мутации могут снижать связывание Fc-области с FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB и/или FcγRIIIA без существенного уменьшения аффинности в отношении FcRn. Например, замена Asn в положении 297 Fc-области Ala или другой аминокислотой удаляет высоко консервативный сайт N-гликозилирования и может приводить к пониженной иммуногенности и сопутствующему пролонгированному времени полужизни Fc-области, а также сниженному связыванию с FcγR (Routledge et al. 1995, Transplantation 60: 847; Friend et al. 1999, Transplantation 68: 1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276: 6591). Были осуществлены модификации аминокислот в положениях 233-236 IgG1, которые уменьшают связывание с FcγR (Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2: 77 и Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29: 2613). Некоторые примеры аминокислотных замен описаны в патентах США 7355008 и 7381408, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте.

рПЭГ

В некоторых вариантах осуществления конъюгат согласно изобретению содержит пептид глюкагонового надсемейства, включая родственные глюкагону пептиды, остеокальцин, а также их аналоги, производные и конъюгаты, слитый со вспомогательным пептидом, который способен образовывать расширенную конформацию, сходную с химическим соединением ПЭГ (например, молекулой рекомбинантного ПЭГ (рПЭГ)), таким как пептиды, описанные в публикации международной патентной заявки No. WO2009/023270 и публикации патентной заявки США № US2008/0286808. Молекула рПЭГ не является полиэтиленгликолем. Молекула рПЭГ в некоторых аспектах представляет собой полипептид, содержащий одну или несколько из следующих аминокислот: глицин, серин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, аланин или пролин. В некоторых аспектах рПЭГ представляет собой гомополимер, например, полиглицин, полисерин, полиглутаминовую кислоту, полиаспарагиновую кислоту, полиаланин или полипролин. В других вариантах осуществления рПЭГ содержит два типа повторяющихся аминокислот, например поли(Gly-Ser), поли(Gly-Glu), поли(Gly-Ala), поли(Gly-Asp), поли(Gly-Pro), поли(Ser-Glu) и т.д. В некоторых аспектах рПЭГ содержит три разных типа аминокислот, например поли(Gly-Ser-Glu). В конкретных аспектах рПЭГ увеличивает время полужизни пептида глюкагонового надсемейства или остеокальцина. В некоторых аспектах рПЭГ имеет общий положительный или общий отрицательный заряд. рПЭГ в некоторых аспектах не имеет вторичной структуры. В некоторых вариантах осуществления рПЭГ имеет длину равную или больше 10 аминокислот и в некоторых вариантах осуществления имеет длину примерно от 40 до примерно 50 аминокислот. Вспомогательный пептид в некоторых аспектах слит с N- или C-концом пептида настоящего изобретения посредством пептидной связи или через сайт расщепления протеиназой или встроен в петли пептида настоящего изобретения. рПЭГ в некоторых аспектах содержит аффинную метку или связан с ПЭГ молекулярной массы больше 5 кДа. В некоторых вариантах осуществления рПЭГ увеличивает гидродинамический радиус пептида настоящего изобретения, время полужизни в сыворотке, устойчивость к протеазам или растворимость, и в некоторых аспектах придает пептиду пониженную иммуногенность.

Слитые пептиды - C-концевое удлинение

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид может содержать C-конец или C-концевую аминокислотную последовательность, включающую, но без ограничения: COOH, CONH₂, GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:710), GPSSGAPPPS-CONH₂ (SEQ ID NO:711), удлинение карбоксильного конца оксинтомодулина, KRNRNNIA (SEQ ID NO:714) или KGKKNDWKHNITQ (SEQ ID NO:713). Например, десять концевых аминокислот эксендина-4 (т.е. последовательность SEQ ID NO:710 (GPSSGAPPPS)) связывают с карбоксильным концом родственного глюкагону пептида класса 1, родственного глюкагону пептида класса 2, родственного глюкагону пептида класса 3, родственного глюкагону пептида класса 4 или родственного глюкагону пептида класса 5 согласно настоящему изобретению.

Другим соединением, которое индуцирует потерю массы, является оксинтомодулин, встречающийся в природе пищеварительный гормон, найденный в тонком кишечнике (см. Diabetes 2005; 54: 2390-2395). Оксинтомодулин представляет собой пептид длиной 37 аминокислот (SEQ ID NO:706), который содержит 29 аминокислотную последовательность глюкагона, за которой следует состоящее из 8 аминокислот удлинение карбоксильного конца SEQ ID NO:714 (KRNRNNIA). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления предлагаются пролекарственные производные родственных глюкагону пептидов, которые дополнительно содержат на карбоксильном конце удлинение с последовательностью SEQ ID NO:714 или состоящее из четырех аминокислот удлинение, имеющее последовательность KRNR.

Модификация глюкагона в положении 3

Родственные глюкагону пептиды классов 1-3, описанные в настоящем описании, могут быть модифицированы в положении 3 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа), чтобы сохранить или повысить активность в отношении рецептора глюкагона.

В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, поддержанная или повышенная активность в отношении рецептора глюкагона может быть достигнута путем модификации Gln в положении 3 до аналога глутамина. Например, родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, содержащий аналог глутамина в положении 3, может проявлять примерно 5%, примерно 10%, примерно 20%, примерно 50% или примерно 85% или большую активность нативного глюкагона (SEQ ID NO:701) в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, содержащий аналог глутамина в положении 3, может проявлять примерно 20%, примерно 50%, примерно 75%, примерно 100%, примерно 200% или примерно 500% или большую активность соответствующего глюкагонового пептида, имеющего такую же аминокислотную последовательность, как и последовательность пептида, содержащего аналог глутамина, за исключением модифицированной аминокислоты в положении 3, в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, содержащий аналог глутамина в положении 3, проявляет повышенную активность в отношении рецептора глюкагона, но повышенная активность не превышает 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% активности нативного глюкагона или соответствующего родственного глюкагону пептида, имеющего такую же аминокислотную последовательность, как и последовательность пептида, содержащего аналог глутамина, за исключением модифицированной аминокислоты в положении 3.

В некоторых вариантах осуществления аналог глутамина представляет собой встречающуюся в природе или не встречающуюся в природе аминокислоту, содержащую боковую цепь структуры I, II или III:

структура I

структура II

структура III

где R¹ означает C_0-3алкил или C_0-3гетероалкил; R² означает NHR⁴ или C_1-3алкил; R³ означает C_1-3алкил; R⁴ означает H или C_1-3алкил; X означает NH, O или S; и Y означает NHR⁴, SR³ или OR³. В некоторых вариантах осуществления X означает NH или Y означает NHR⁴. В некоторых вариантах осуществления R¹ означает C_0-2алкил или C₁-гетероалкил. В некоторых вариантах осуществления R² означает NHR⁴ или C₁алкил. В некоторых вариантах осуществления R⁴ означает H или C₁алкил. В примерах вариантов осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, предлагается аминокислота, содержащая боковую цепь структуры I, где R¹ означает CH₂-S, X означает NH, и R² означает CH₃ (ацетамидометилцистеин, C(Acm)); R¹ означает CH₂, X означает NH, и R² означает CH₃ (ацетилдиаминомасляная кислота, Dab(Ac)); R¹ означает C₀алкил, X означает NH, R² означает NHR⁴, и R⁴ означает H (карбамоилдиаминопропановая кислота, Dap(мочевина)); или R¹ означает CH₂-CH₂, X означает NH, и R² означает CH₃ (ацетилорнитин, Om(Ac)). В примерах вариантов осуществления предлагается аминокислота, содержащая боковую цепь структуры II, где R¹ означает CH₂, Y означает NHR⁴, и R⁴ означает CH³ (метилглутамин, Q(Me)). В примерах вариантов осуществления предлагается аминокислота, содержащая боковую цепь структуры III, где R¹ означает CH₂, и R⁴ означает H (метионинсульфоксид, M(O)). В конкретных вариантах осуществления аминокислота в положении 3 заменена Dab(Ac).

Димеры

Что касается родственных глюкагону пептидов класса 1, класса 2 и класса 3, то родственный глюкагону пептид может быть частью димера, тримера или полимера более высокого порядка, содержащего по меньшей мере два, три или более пептидов, связанных линкером, где по меньшей мере один или оба пептида представляют собой родственные глюкагону пептиды. Димер может быть гомодимером или гетеродимером. В некоторых вариантах осуществления линкер выбран из группы, состоящей из бифункционального основанного на тиоле поперечно сшивающего агента и бифункционального основанного на амине поперечно сшивающего агента. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой ПЭГ, например, ПЭГ 5 кДа, ПЭГ 20 кДа. В некоторых вариантах осуществления линкером является дисульфидная связь. Например, каждый мономер димера может содержать остаток Cys (например, расположенный на конце или внутри Cys), и атом серы каждого остатка Cys принимает участие в образовании дисульфидной связи. В некоторых аспектах согласно изобретению мономеры связаны через концевые аминокислоты (например, N-концевую или C-концевую), через внутренние аминокислоты или концевые аминокислоты по меньшей мере одного мономера и внутреннюю аминокислоту по меньшей мере одного другого мономера. В конкретных аспектах мономеры не связаны через N-концевые аминокислоты. В некоторых аспектах мономеры полимеров связаны вместе в ориентации «хвост к хвосту», в случае которой C-концевые аминокислоты каждого мономера связаны вместе. Конъюгируемый остаток может быть ковалентно связан с любым из родственных глюкагону пептидов, описанных в настоящем описании, включая димер, тример или полимер более высокого порядка.

Способы получения родственных глюкагону пептидов

Родственные глюкагону пептиды (и пролекарства) согласно настоящему изобретению могут быть получены стандартными способами синтеза, с использованием методики рекомбинантной ДНК или любыми другими способами получения пептидов и слитых белков. Хотя некоторые не встречающиеся в природе аминокислоты не могут быть экспрессированы с использованием стандартной методики рекомбинантной ДНК, способы их получения известны в данной области. Соединения настоящего изобретения, которые включают непептидные части, могут быть синтезированы с использованием стандартных реакций органической химии в дополнение к стандартным реакциям химии пептидов в случае, когда это приемлемо.

Классы родственных глюкагону пептидов описаны более подробно ниже. Что касается каждого из разделов описания, относящихся к модификациям родственных глюкагону пептидов класса 1, 2, 3, 4 и 5, то их описание относится к части родственного глюкагону пептида (Q) пролекарственного соединения, подробно описанного выше. Таким образом, структурные элементы, описанные для класса родственных глюкагону пептидов, являются структурными элементами Q, которые затем дополнительно модифицируют, чтобы создать пролекарственное соединение, как описано выше.

Родственные глюкагону пептиды класса 1

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, который описан в настоящем описании и в международной патентной заявке № PCT US2009/47437 (поданной 16 июня 2009), публикации международной патентной заявки № WO 2008/086086, опубликованной 17 июля 2008, и в предварительной патентной заявке США № 61/090415, содержание которых включено посредством ссылки во всей своей полноте.

Биологические последовательности, указанные в следующем разделе (SEQ ID NO:801-915), относящемся к родственным глюкагону пептидам класса 1, соответствуют последовательностям SEQ ID NO:1-115 в международной патентной заявке № PCT US2009/47437.

Активность

Глюкагоновые пептиды класса 1 сохраняют активность в отношении рецептора глюкагона по сравнению с нативным глюкагоновым пептидом (SEQ ID NO:801). Например, глюкагоновый пептид может сохранять по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75% от активности, 80% от активности, 85% от активности или 90% от активности нативного глюкагона (вычисляемой в виде обратного отношения EC₅₀ для глюкагонового пептида к EC₅₀ для глюкагона, например, измеряемого по продуцированию цАМФ с использованием анализа, в общем описанного в примере 5). В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 1 обладают такой же или более высокой активностью (термин используется в настоящем описании как синоним термина «эффективность»), чем глюкагон. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновые пептиды, описанные в настоящем описании, проявляют не более чем примерно 100%, 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% активности по сравнению с активностью нативного глюкагонового пептида.

Любой из родственных глюкагону пептидов класса 1, описанных в настоящем описании, может иметь EC₅₀ в отношении рецептора глюкагона человека примерно 100 нМ, 75 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 1 нМ или менее при тестировании на индукцию цАМФ в клетках HEK293, сверхэкспрессирующих рецептор глюкагона, например, с использованием анализа, описанного в примере 5. Обычно пегилированные пептиды будут иметь более высокую EC₅₀ по сравнению с непегилированным пептидом. Например, родственные глюкагону пептиды класса 1, описанные в настоящем описании, в случае, когда они являются непегилированными, могут проявлять активность в отношении рецептора глюкагона, которая составляет по меньшей мере 20% (например, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, 100%, 150%, 200%, 400%, 500% или больше) от активности нативного глюкагона (SEQ ID NO:801) в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 1, описанные в настоящем описании, проявляют указанную в % активность нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона в случае отсутствия гидрофильного остатка, но проявляют пониженную активность в % по сравнению с нативным глюкагоном в отношении рецептора глюкагона в случае, когда он содержит гидрофильный остаток. Например, родственные глюкагону пептиды класса 1, описанные в настоящем описании, в случае, когда они являются пегилированными, могут проявлять активность в отношении рецептора глюкагона, которая составляет по меньшей мере 2% (например, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9% или по меньшей мере 10%) от активности нативного глюкагона. В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 1, описанные в настоящем описании, могут проявлять любую из указанных выше активностей, но составляющую не более чем 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% от активности нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона.

В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 1 проявляют активность, составляющую менее чем примерно 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от активности нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1 и/или больше чем примерно 5-кратную, 10-кратную или 15-кратную селективность в отношении рецептора глюкагона по сравнению с рецептором GLP-1. Например, в некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 1 проявляют активность, составляющую менее 5% от активности нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1 и проявляют более чем 5-кратную селективность в отношении рецептора глюкагона по сравнению с рецептором GLP-1.

Повышенная растворимость

Нативный глюкагон имеет плохую растворимость в водном растворе, особенно при физиологическом pH, и имеет тенденцию к агрегации и преципитации с течением времени. Напротив, родственные глюкагону пептиды класса 1 в некоторых вариантах осуществления проявляют по меньшей мере 2-кратную, 5-кратную или еще более высокую растворимость по сравнению с нативным глюкагоном при pH от 6 до 8, или от 6 до 9, например, при pH 7 через 24 часа при 25°C.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 модифицирован по сравнению с пептидом дикого типа His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO:801), чтобы повысить растворимость пептида в водных растворах, особенно в диапазоне pH примерно от 5,5 до примерно 8,0, сохраняя биологическую активность нативного пептида.

Например, растворимость любого из родственных глюкагону пептидов класса 1, описанных в настоящем описании, может быть дополнительно повышена путем связывания гидрофильного остатка с пептидом. Введение таких групп также увеличивает продолжительность действия, например, как показано при измерении увеличенного времени полужизни в кровообращении. Гидрофильные остатки дополнительно описаны в настоящем описании.

Модификация заряженных остатков

В некоторых вариантах осуществления растворимость повышают добавлением заряда к родственному глюкагону пептиду класса 1 при замене нативных незаряженных аминокислот заряженными аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из лизина, аргинина, гистидина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты, или добавлением заряженных аминокислот к амино или карбоксильному концу пептида.

Согласно некоторым вариантам осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 имеет повышенную растворимость вследствие того факта, что пептид модифицирован заменами и/или добавлениями аминокислот, которые вводят заряженную аминокислоту в C-концевую часть пептида, и в некоторых вариантах осуществления в положение, находящееся на C-конце от положения 27 последовательности SEQ ID NO:801. Необязательно одна, две или три заряженных аминокислоты могут быть введены в C-концевую часть и в некоторых вариантах осуществления со стороны C-конца от положения 27. Согласно некоторым вариантам осуществления нативная аминокислота(ты) в положениях 28 и/или 29 заменена заряженной аминокислотой, и/или от одной до трех заряженных аминокислот добавляют к C-концу пептида, например, после положения 27, 28 или 29. В примерах вариантов осуществления одна, две, три или все заряженные аминокислоты заряжены отрицательно. В других вариантах осуществления одна, две, три или все заряженные аминокислоты заряжены положительно.

В конкретных примерах вариантов осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 может содержать любую одну или две из следующих модификаций: замену N28 на E; замену N28 на D; замену T29 на D; замену T29 на E; инсерцию E после положения 27, 28 или 29; инсерцию D после положения 27, 28 или 29. Например, D28E29, E28E29, E29E30, E28E30, D28E30.

Согласно одному иллюстративному варианту осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:811 или ее аналог, который содержит 1-3 дополнительные модификации аминокислот (описанные в настоящем описании при описании агонистов глюкагона) по сравнению с нативным глюкагоном или его аналогом, являющимся агонистом глюкагона. Последовательность SEQ ID NO:811 представляет собой модифицированный родственный глюкагону пептид класса 1, где остаток аспарагина в положении 28 нативного белка заменен аспарагиновой кислотой. В другом примере варианта осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:838, в которой остаток аспарагина в положении 28 нативного белка заменен глутаминовой кислотой. Другие иллюстративные варианты включают родственные глюкагону пептиды класса 1 с последовательностями SEQ ID NO:824, 825, 826, 833, 835, 836 и 837.

Замена встречающейся в природе аминокислоты в положении 28 и/или 29 заряженными аминокислотами и/или добавление от одной до двух заряженных аминокислот на карбоксильном конце родственного глюкагона пептида класса 1 повышает растворимость и стабильность глюкагоновых пептидов в водных растворах при физиологически соответствующих значениях pH (т.е. pH составляет примерно от 6,5 до примерно 7,5) по меньшей мере в 5 раз и вплоть до 30 раз. Соответственно, глюкагоновые пептиды класса 1 в некоторых вариантах осуществления сохраняют глюкагоновую активность и имеют по меньшей мере 2-кратную, 5-кратную, 10-кратную, 15-кратную, 25-кратную, 30-кратную или более высокую растворимость по сравнению с нативным глюкагоном при данном значении pH примерно от 5,5 до 8, например, pH 7, при измерении через 24 часов при 25°C.

В родственном глюкагону пептиде могут быть осуществлены дополнительные модификации, например, консервативные замены, которые дополнительно описаны в настоящем описании, и которые позволяют сохранить глюкагоновую активность.

Повышенная стабильность

Любой из глюкагоновых пептидов класса 1 может дополнительно иметь повышенную стабильность и/или пониженное разложение, например, по меньшей мере 95% от исходного пептида сохраняется через 24 часа при 25°C. Любой из родственных глюкагону пептидов класса 1, описанных в настоящем описании, может дополнительно иметь повышенную стабильность при pH в диапазоне от 5,5 до 8, например, сохраняется по меньшей мере 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% от исходного пептида через 24 часа при 25°C. В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 1 согласно изобретению имеют повышенную стабильность, так что по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, более чем 95%, до 100%) концентрации пептида или менее чем примерно 25% (например, меньше 20%, меньше 15%, меньше 10%, меньше 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, до 0%) разрушенного пептида регистрируют при 280 нм, используя ультрафиолетовый (УФ) детектор (UV), примерно через 1 или несколько недель (например, примерно 2 недели, примерно 4 недели, примерно 1 месяц, примерно два месяца, примерно четыре месяца, примерно шесть месяцев, примерно восемь месяцев, примерно десять месяцев, примерно двенадцать месяцев) в растворе при температуре по меньшей мере 20°C (например, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, по меньшей мере 27,5°C, по меньшей мере 30°C, по меньшей мере 35°C, по меньшей мере 40°C, по меньшей мере 50°C) и меньше чем 100°C, меньше чем 85°C, меньше чем 75°C или меньше чем 70°C. Родственные глюкагону пептиды класса 1 могут содержать дополнительные модификации, которые изменяют его фармацевтические свойства, например, придают повышенную эффективность, пролонгированное время полужизни в кровообращении, увеличенный срок хранения, сниженное осаждение и агрегацию и/или сниженное разложение, например, уменьшенную частоту расщепления или химическую модификацию после хранения.

В следующих примерах вариантов осуществления любой из вышеуказанных родственных глюкагону пептидов класса 1 может быть дополнительно модифицирован, чтобы повысить стабильность, путем модификации аминокислоты в положении 15 последовательности SEQ ID NO:801, чтобы уменьшить разложение пептида с течением времени, особенно в кислых или щелочных буферах. В примерах вариантов осуществления Asp в положении 15 заменяют Glu, гомо-Glu, цистеиновой кислотой или гомоцистеиновой кислотой.

Альтернативно, любой из родственных глюкагону пептидов класса 1, описанных в настоящем описании, может быть дополнительно модифицирован для повышения стабильности путем модификации аминокислоты в положении 16 последовательности SEQ ID NO:801. В примерах вариантов осуществления Ser в положении 16 заменяют Thr или AIB, или любыми заменами аминокислот, описанными в настоящем описании для родственных глюкагону пептидов класса 1, которые повышают эффективность в отношении рецептора глюкагона. Такие модификации уменьшают расщепление пептидной связи между Asp15-Ser16.

В некоторых вариантах осуществления любой из родственных глюкагону пептидов класса 1, описанных в настоящем описании, может быть дополнительно модифицирован, чтобы уменьшить разложение в различных положениях аминокислот, путем модификации по любому одному, двум, трем или всем четырем положениям 20, 21, 24 или 27. Примеры варианты осуществления включают замену Gln в положении 20 аминокислотами Ser, Thr, Ala или AIB, замену Asp в положении 21 Glu, замену Gln в положении 24 Ala или AIB, замену Met в положении 27 Leu или Nle. Удаление или замена остатков метионина уменьшает разложение вследствие окисления метионина. Удаление или замена Gln или Asn уменьшает разложение вследствие дезаминирования Gln или Asn. Удаление или замена Asp уменьшает разложение, которое происходит вследствие дегидратации Asp с образованием промежуточного циклического сукцинимида с последующей изомеризацией до изоаспартата.

Повышенная эффективность

Согласно другому варианту осуществления предлагаются родственные глюкагону пептиды класса 1, которые имеют повышенную эффективность в отношении рецептора глюкагона, где пептиды содержат модификацию аминокислоты в положении 16 нативного глюкагона (SEQ ID NO:801). В качестве неограничивающего примера такая повышенная эффективность может быть получена благодаря замене встречающегося в природе серина в положении 16 глутаминовой кислотой или другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь длиной в 4 атома, или альтернативно, любой из глутамина, гомоглутаминовой кислоты или гомоцистеиновой кислоты, или заряженной аминокислоты, имеющей боковую цепь, содержащую по меньшей мере один гетероатом (например, N, O, S, P), и имеющей боковую цепь длиной примерно 4 (или 3-5) атома. Замена серина в положении 16 глутаминовой кислотой повышает глюкагоновую активность по меньшей мере в 2 раза, 4 раза, 5 раз и до 10 раз в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 сохраняет селективность в отношении рецептора глюкагона по сравнению с рецепторами GLP-1, например, по меньшей мере 5-кратную, 10-кратную или 15-кратную селективность.

Устойчивость к DPP-IV

В некоторых вариантах осуществления глюкагоновые пептиды класса 1, описанные в настоящем описании, дополнительно модифицированы в положении 1 или 2, чтобы снизить чувствительность к расщеплению дипептидилпептидазой IV. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 1 и/или положении 2 родственного глюкагону пептида заменяют устойчивой к DPP-IV аминокислотой(ами), описанной в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 2 пептидного аналога заменяют аминоизомасляной кислотой. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 2 пептидного аналога заменяют аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-серина, D-аланина, глицина, N-метилсерина и ε-аминомасляной кислоты. В другом варианте осуществления аминокислоту в положении 2 родственного глюкагону пептида класса 1 заменяют аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-серина, глицина и аминоизомасляной кислоты. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 2 не является D-серином.

Снижение глюкагоновой активности после модификации аминокислот в положении 1 и/или положении 2 глюкагонового пептида может быть восстановлено стабилизацией альфа-спиральной структуры в C-концевой части глюкагонового пептида (вблизи аминокислот 12-29). Альфа-спиральная структура может быть стабилизирована, например, путем образования ковалентного или нековалентного внутримолекулярного мостика (например, лактамового мостика между боковыми цепями аминокислот в положениях «i» и «i+4», где i означает целое число от 12 до 25), в результате замены и/или инсерции аминокислот вблизи положений 12-29 с использованием стабилизирующей альфа-спираль аминокислоты (например, α,α-дизамещенной аминокислоты), которая дополнительно описана в настоящем описании.

Модификации в положении 3

Активность рецептора глюкагона может быть снижена путем модификации аминокислоты в положении 3 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа), например, заменой встречающегося в природе глутамина в положении 3 кислой, основной или гидрофобной аминокислотой. Например, замена в положении 3 глутаминовой кислотой, орнитином или норлейцином в значительной степени снижает или устраняет активность рецептора глюкагона.

Поддержание или усиление активности в отношении рецептора глюкагона может быть достигнуто с использованием модификации Gln в положении 3 с получением аналога глутамина, как описано в настоящем описании. Например, агонисты глюкагона могут содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:863, SEQ ID NO:869, SEQ ID NO:870, SEQ ID NO:871, SEQ ID NO:872, SEQ ID NO:873 и SEQ ID NO:874.

Усиление активности GLP-1 C-концевыми амидами и сложными эфирами

Повышенную активность рецептора GLP-1 обеспечивают заменой карбоновой кислоты C-концевой аминокислоты нейтральной группой, такой как амид или сложный эфир. Наоборот, сохранение нативной карбоновой кислоты на C-конце пептида сохраняет относительно более высокую селективность родственного глюкагону пептида класса 1 в отношении рецептора глюкагона по сравнению с рецептором GLP-1 (например, большую примерно в 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 раз).

Дополнительные модификации и комбинации

Могут быть осуществлены дополнительные модификации родственного глюкагону пептида класса 1, которые могут дополнительно повышать растворимость и/или стабильность, и/или глюкагоновую активность. Родственный глюкагону пептид класса 1 может, альтернативно, содержать другие модификации, которые по существу не влияют на растворимость или стабильность, и которые по существу не снижают глюкагоновую активность. В примерах вариантов осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 может содержать, в общем, до 11 или до 12, или до 13, или до 14 модификаций аминокислот по сравнению с нативной последовательностью глюкагона. Например, консервативные или неконсервативные замены, добавления или делеции могут быть осуществлены в любом из положений 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29.

Примеры модификаций родственного глюкагону пептида класса 1 включают, но без ограничения:

(a) неконсервативные замены, консервативные замены, добавления или делеции при сохранении по меньшей мере частичной активности агониста глюкагона, например, консервативные замены в одном или нескольких положениях 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29, замены Tyr в положении 10 на Val или Phe, замены Lys в положении 12 на Arg, замены в одном или нескольких положениях на Ala;

(b) делецию аминокислот в положениях 29 и/или 28 и необязательно в положении 27 при сохранении по меньшей мере частичной активности агониста глюкагона;

(c) модификацию аспарагиновой кислоты в положении 15, например, путем замены глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой кислота, цистеиновой кислотой или гомоцистеиновой кислотой, которая может уменьшать разложение; или модификацию серина в положении 16, например, заменой треонином, AIB, глутаминовой кислотой или другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь длиной 4 атома, или альтернативно, одной из глутамина, гомоглутаминовой кислоты или гомоцистеиновой кислоты, которая вероятно может уменьшать разложение вследствие расщепления связи Asp15-Ser16;

(d) добавление гидрофильного остатка, такого как водорастворимый полимер полиэтиленгликоля, как описано в настоящем описании, например, в положении 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40 или в C-концевой аминокислоте, которое может повышать растворимость и/или время полужизни;

(e) модификацию метионина в положении 27, например, заменой лейцином или норлейцином, чтобы уменьшить окислительное разложение;

(f) модификацию Gln в положении 20 или 24, например, заменой Ser, Thr, Ala или AIB, чтобы уменьшить разложение, которое происходит в результате дезаминирования Gln;

(g) модификацию Asp в положении 21, например, заменой аминокислотой Glu, чтобы уменьшить разложение, которое происходит в результате дегидратации Asp с образованием промежуточного циклического сукцинимида, с последующей изомеризацией до изоаспартата;

(h) модификации в положении 1 или 2, как описано в настоящем описании, которые повышают устойчивость к расщеплению DPP-IV, необязательно в сочетании с внутримолекулярным мостиком, таким как лактамовый мостик между положениями «i» и «i+4», где i означает целое число от 12 до 25, например, 12, 16, 20, 24;

(i) ацилирование или алкилирование глюкагонового пептида, как описано в настоящем описании, которое может повышать активность в отношении рецептора глюкагона и/или рецептора GLP-1, увеличивать время полужизни в кровообращении и/или увеличивать продолжительность действия и/или задерживать начало действия, необязательно в комбинации с добавлением гидрофильного остатка, дополнительно или альтернативно, необязательно в комбинации с модификацией, которая селективно снижает активность по отношению к пептиду GLP-1, например, модификацией Thr в положении 7, такой как замена Thr в положении 7 аминокислотой, у которой отсутствует гидроксильная группа, например, Abu или He; делецию аминокислоты, C-концевой относительно аминокислоты в положении 27 (например, делеция одной или обеих аминокислот в положениях 28 и 29, дающая пептид длиной 27 или 28 аминокислот);

(j) C-концевые удлинения, как описано в настоящем описании;

(k) гомодимеризацию или гетеродимеризацию, как описано в настоящем описании; и

комбинации (a)-(k).

В некоторых вариантах осуществления примеры модификаций родственного глюкагону пептида класса 1 включают по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, выбранную из группы A, и одну или несколько модификаций аминокислот, выбранных из группы B и/или группы C,

где группа A означает:

замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой;

замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты;

замену в положении 28 аминокислотой Asn, Asp или Glu;

замену в положении 28 аминокислотой Asp;

замену в положении 28 аминокислотой Glu;

замену Thr в положении 29 заряженной аминокислотой;

замену Thr в положении 29 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты;

замену в положении 29 аминокислотой Asp, Glu или Lys;

замену в положении 29 аминокислотой Glu;

инсерцию 1-3 заряженных аминокислот после положения 29;

инсерцию после положения 29 Glu или Lys;

инсерцию после положения 29 Gly-Lys или Lys-Lys;

или их комбинацию;

где группа B означает:

замену Asp в положении 15 аминокислотой Glu;

замену Ser в положении 16 аминокислотой Thr или AIB;

и где группа C означает:

замену His в положении 1 ненативной аминокислотой, которая снижает чувствительность глюкагонового пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP-IV),

замену Ser в положении 2 ненативной аминокислотой, которая снижает чувствительность глюкагонового пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP-IV),

замену Lys в положении 12 аминокислотой Arg;

замену Gln в положении 20 аминокислотой Ser, Thr, Ala или AIB;

замену Asp в положении 21 аминокислотой Glu;

замену Gln в положении 24 аминокислотой Ser, Thr, Ala или AIB;

замену Met в положении 27 аминокислотой Leu или Nle;

делецию аминокислот в положениях 27-29;

делецию аминокислот в положениях 28-29;

делецию аминокислот в положениях 29;

или их комбинацию.

В примерах вариантов осуществления Lys в положении 12 заменяют аминокислотой Arg. В других примерах вариантов осуществления аминокислоты в положениях 29 и/или 28 и необязательно в положении 27 делетированы.

В некоторых конкретных вариантах осуществления глюкагоновый пептид содержит (a) модификацию аминокислоты в положении 1 и/или 2, которая придает устойчивость к DPP-IV, например, замену аминокислотой DMIA в положении 1 или AIB в положении 2, (b) внутримолекулярный мостик в области положений 12-29, например, в положениях 16 и 20, или одну или несколько замен аминокислот в положениях 16, 20, 21 и 24 α,α-дизамещенной аминокислотой, необязательно (c) связан с гидрофильным остатком, таким как ПЭГ, например, через Cys в положении 24, 29 или C-концевую аминокислоту, необязательно (d) содержит модификацию аминокислоты в положении 27, которая представляет собой замену Met, например, аминокислотой Nle, необязательно (e) модификации аминокислот в положениях 20, 21 и 24, которые уменьшают разложение, и необязательно (f) связь с последовательностью SEQ ID NO:820. Когда глюкагоновый пептид связан с последовательностью SEQ ID NO:820, аминокислота в положении 29 в некоторых вариантах осуществления представляет собой Thr или Gly. В других конкретных вариантах осуществления глюкагоновый пептид содержит (a) Asp28Glu29 или Glu28Glu29, или Glu29Glu30, или Glu28Glu30, или Asp28Glu30, и необязательно (b) модификацию аминокислоты в положении 16, которая представляет собой замену Ser, например, аминокислотой Thr или AIB, и необязательно (c) модификацию аминокислоты в положении 27, которая представляет собой замену Met, например, аминокислотой Nle, и необязательно (d) модификации аминокислот в положениях 20, 21 и 24, которые уменьшают разложение. В конкретном варианте осуществления глюкагоновый пептид содержит T16, A20, E21, A24, Nle27, D28, E29.

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 содержит аминокислотную последовательность:

Xl-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z (SEQ ID NO:839) с 1-3 модификациями аминокислот,

где X1 и/или X2 означает ненативную аминокислоту, которая уменьшает чувствительность (или повышает устойчивость) глюкагонового пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP-IV),

где Z выбран из группы, состоящей из -COOH (встречающегося в природе C-концевого карбоксилата), -Asn-COOH, Asn-Thr-COOH и Y-COOH, где Y означает 1-2 аминокислоты, и

где внутримолекулярный мостик, предпочтительно ковалентная связь, соединяет боковые цепи аминокислоты в положении i и аминокислоты в положении i+4, где i равно 12, 16, 20 или 24.

В некоторых вариантах осуществления внутримолекулярный мостик представляет собой лактамовый мостик. В некоторых вариантах осуществления аминокислотами в положениях i и i+4 последовательности SEQ ID NO:839 являются Lys и Glu, например, Glu16 и Lys20. В некоторых вариантах осуществления X1 выбран из группы, состоящей из: D-His, N-метил-His, альфа-метил-His, имидазолуксусной кислоты, дезамино-His, гидроксил-His, ацетил-His, гомо-His и альфа,альфа-диметилимидазолуксусной кислоты (DMIA). В других вариантах осуществления X2 выбран из группы, состоящей из: D-Ser, D-Ala, Gly, N-метил-Ser, Val и альфа-аминоизомасляной кислоты (AIB). В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид ковалентно связан с гидрофильным остатком в любом из положений аминокислот 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40, в пределах C-концевого удлинения или с C-концевой аминокислотой. В примерах вариантов осуществления такой гидрофильный остаток ковалентно связан с остатком Lys, Cys, Orn, гомоцистеина или ацилфенилаланина в любом из указанных положений. Примеры гидрофильных остатков включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), например, с молекулярной массой примерно от 1000 дальтон до примерно 40000 дальтон, или примерно от 20000 дальтон до примерно 40000 дальтон.

В других вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 содержит аминокислотную последовательность:

X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z (SEQ ID NO:839),

где X1 и/или X2 означают ненативную аминокислоту, которая уменьшает чувствительность (или повышает устойчивость) глюкагонового пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP-IV),

где в одно, два, три, четыре или больше положений 16, 20, 21 и 24 глюкагонового пептида заменены α,α-дизамещенной аминокислотой, и

где Z выбран из группы, состоящей из -COOH (встречающегося в природе C-концевого карбоксилата), -Asn-COOH, Asn-Thr-COOH и Y-COOH, где Y означает 1-2 аминокислоты.

Примеры дополнительных модификаций аминокислот в указанных выше родственных глюкагону пептидах класса 1 или их аналогах включают замену Thr в положении 7 аминокислотой, у которой отсутствует гидроксильная группа, например, аминомасляной кислотой (Abu), Ile, необязательно в комбинации с заменой или добавлением аминокислоты, содержащей боковую цепь, ковалентно связанную (необязательно через спейсер) с ацильной или алкильной группой, где такая ацильная или алкильная группа не является нативной для встречающейся в природе аминокислоты, замену Lys в положении 12 на Arg; замену Asp в положении 15 на Glu; замену Ser в положении 16 на Thr или AIB; замену Gln в положении 20 аминокислотой Ser, Thr, Ala или AIB; замену Asp в положении 21 аминокислотой Glu; замену Gln в положении 24 аминокислотой Ser, Thr, Ala или AIB; замену Met в положении 27 аминокислотой Leu или Nle; замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой; замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты; замену в положении 28 аминокислотой Asn, Asp или Glu; замену в положении 28 аминокислотой Asp; замену в положении 28 аминокислотой Glu; замену Thr в положении 29 заряженной аминокислотой; замену Thr в положении 29 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты; замену в положении 29 аминокислотой Asp, Glu или Lys; замену в положении 29 аминокислотой Glu; инсерцию 1-3 заряженных аминокислот после положения 29; инсерцию в положении 30 (т.е. после положения 29) Glu или Lys; необязательно с инсерцией в положении 31 Lys; добавление последовательности SEQ ID NO:820 к C-концу, необязательно, где аминокислотой в положении 29 является Thr или Gly; замену или добавление аминокислоты, ковалентно связанной с гидрофильным остатком; или их комбинацию.

Любые из модификаций, описанных выше в отношении агонистов глюкагона класса 1, которые повышают активность рецептора глюкагона, сохраняют частичную активность рецептора глюкагона, повышают растворимость, повышают стабильность или уменьшают разложение, могут быть использованы в отношении глюкагоновых пептидов класса 1 по отдельности или в комбинации. Таким образом, могут быть получены такие родственные глюкагону пептиды класса 1, которые сохраняют по меньшей мере 20% активности нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона, и которые растворимы в концентрации по меньшей мере 1 мг/мл при pH от 6 до 8 или от 6 до 9, (например, pH 7), и необязательно позволяют сохранять по меньшей мере 95% исходного пептида (например, 5% или менее исходного пептида разлагается или расщепляется) через 24 часа при 25°C. Альтернативно, могут быть получены высокоэффективные глюкагоновые пептиды класса 1, которые проявляют по меньшей мере примерно 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% или 10-кратную или более высокую активность нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона, и необязательно растворимы в концентрации по меньшей мере 1 мг/мл при pH от 6 до 8 или от 6 до 9 (например, pH 7), и необязательно обеспечивают сохранение по меньшей мере 95% исходного пептида (например, 5% или менее исходного пептида разлагается или расщепляется) через 24 часа при 25°C. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновые пептиды класса 1, описанные в настоящем описании, могут обладать активностью по меньшей мере любого из указанных выше относительных уровней в отношении рецептора глюкагона, но не более 10000%, 100000% или 1000000% от активности нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона.

Примеры вариантов осуществления родственных глюкагону пептидов класса 1

Согласно некоторым вариантам осуществления нативный глюкагоновый пептид с последовательностью SEQ ID NO:801 модифицируют заменой нативной аминокислоты в положении 28 и/или 29 отрицательно заряженной аминокислотой (например, аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой) и необязательно добавлением отрицательно заряженной аминокислоты (например, аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты) к карбоксильному концу пептида. В альтернативном варианте осуществления нативный глюкагоновый пептид с последовательностью SEQ ID NO:801 модифицируют заменой нативной аминокислоты в положении 29 положительно заряженной аминокислотой (например, лизином, аргинином или гистидином) и необязательно добавлением одной или двух положительно заряженных аминокислот (например, лизина, аргинина или гистидина) на карбоксильном конце пептида. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается аналог глюкагона, имеющий повышенную растворимость и стабильность, где аналог содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:834, при условии, что по меньшей мере одна аминокислота в положении 28 или 29 заменена кислой аминокислотой, и/или дополнительная кислая аминокислота добавлена к карбоксильному концу последовательности SEQ ID NO:834. В некоторых вариантах осуществления кислые аминокислоты независимо выбраны из группы, состоящей из Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается агонист глюкагона, имеющий повышенную растворимость и стабильность, где агонист содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:833, в которой по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 27, 28 или 29 заменена остатком ненативной аминокислоты (т.е. по меньшей мере одна аминокислота, присутствующая в положении 27, 28 или 29 аналога, является кислой аминокислотой, отличной от аминокислоты, присутствующей в соответствующем положении в SEQ ID NO:801). Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается агонист глюкагона, содержащий последовательность SEQ ID NO:833, при условии, что когда аминокислота в положении 28 является аспарагином и аминокислота в положении 29 является треонином, пептид дополнительно содержит одну-две аминокислоты, независимо выбранные из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp или Glu, добавленные к карбоксильному концу глюкагонового пептида.

Сообщалось, что некоторые положения нативного глюкагонового пептида могут быть модифицированы с сохранением по меньшей мере некоторой активности исходного пептида. Соответственно, авторы изобретения ожидают, что одна или больше аминокислот, находящихся в положениях 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29 пептида с последовательностью SEQ ID NO:811, могут быть заменены другой аминокислотой, отличной от аминокислоты, присутствующей в нативном глюкагоновом пептиде, и при этом все еще сохраняется повышенная эффективность, стабильность при физиологическом значении pH и биологическая активность исходного глюкагоного пептида. Например, согласно некоторым вариантам осуществления остаток метионина, присутствующий в положении 27 нативного пептида, связывают с лейцином или норлейцином, чтобы предотвратить окислительное разложение пептида.

В некоторых вариантах осуществления предлагается аналог глюкагона с последовательностью SEQ ID NO:833, где 1-6 аминокислот, выбранных из аминокислот в положениях 1, 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 24 аналога, отличаются от соответствующей аминокислоты в SEQ ID NO:801. Согласно другому варианту осуществления предлагается аналог глюкагона с последовательностью SEQ ID NO:833, где 1-3 аминокислоты, выбранные из положений 1, 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 24 аналога, отличаются от соответствующей аминокислоты в SEQ ID NO:801. В другом варианте осуществления предлагается аналог глюкагона с последовательностью SEQ ID NO:807, SEQ ID NO:808 или SEQ ID NO:834, где 1-2 аминокислоты, выбранные из аминокислот в положениях 1, 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 24 аналога, отличаются от соответствующей аминокислоты в SEQ ID NO:801, и в дополнительном варианте осуществления такие одна-две отличающихся аминокислоты представляют собой консервативные аминокислотные замены по сравнению с аминокислотой, присутствующей в нативной последовательности (SEQ ID NO:801). В некоторых вариантах осуществления предлагается глюкагоновый пептид с последовательностью SEQ ID NO:811 или SEQ ID NO:813, где глюкагоновый пептид дополнительно содержит одну, две или три аминокислотных замены в положениях, выбранных из положений 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27 или 29. В некоторых вариантах осуществления замены в положениях 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 27 или 29 являются консервативными аминокислотными заменами.

В некоторых вариантах осуществления предлагается агонист глюкагона, содержащий пептидный аналог последовательности SEQ ID NO:801, где аналог отличается от последовательности SEQ ID NO:801 наличием другой аминокислоты, отличной от серина в положении 2 и наличием кислой аминокислоты, заменяющей нативную аминокислоту в положении 28 или 29, или кислой аминокислоты, добавляемой к карбоксильному концу пептида с последовательностью SEQ ID NO:801. В некоторых вариантах осуществления кислой аминокислотой является аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота. В некоторых вариантах осуществления предлагается аналог глюкагона с последовательностью SEQ ID NO:809, SEQ ID NO:812, SEQ ID NO:813 или SEQ ID NO:832, где аналог отличается от исходной молекулы заменой в положении 2. Более конкретно, аминокислоту в положении 2 пептидного аналога заменяют аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-серина, аланина, D-аланина, глицина, н-метилсерина и аминоизомасляной кислоты.

В другом варианте осуществления предлагается агонист глюкагона, содержащий пептидный аналог последовательности SEQ ID NO:801, где аналог отличается от последовательности SEQ ID NO:801 наличием другой аминокислоты, отличной от гистидина, в положении 1 и наличием кислой аминокислоты, заменяющей нативную аминокислоту в положении 28 или 29, или кислой аминокислоты, добавляемой к карбоксильному концу пептида с последовательностью SEQ ID NO:801. В некоторых вариантах осуществления кислой аминокислотой является аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота. В некоторых вариантах осуществления предлагается аналог глюкагона с последовательностью SEQ ID NO:809, SEQ ID NO:812, SEQ ID NO:813 или SEQ ID NO:832, где аналог отличается от исходной молекулы заменой в положении 1. Более конкретно, аминокислота в положении 1 пептидного аналога заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из DMIA, D-гистидина, дезаминогистидина, гидроксилгистидина, ацетилгистидина и гомогистидина.

Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный глюкагоновый пептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:809, SEQ ID NO:812, SEQ ID NO:813 и SEQ ID NO:832. В следующем варианте осуществления предлагается глюкагоновый пептид, содержащий последовательность SEQ ID NO:809, SEQ ID NO:812, SEQ ID NO:813 или SEQ ID NO:832, дополнительно содержащую от одной до двух аминокислот, добавленных к C-концу последовательности SEQ ID NO:809, SEQ ID NO:812, SEQ ID NO:813 или SEQ ID NO:832, где дополнительные аминокислоты независимо выбраны из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты или гомоцистеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления дополнительные аминокислоты, добавляемые к карбоксильному концу, выбраны из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp или Glu, или в следующем варианте осуществления дополнительными аминокислотами являются Asp или Glu.

В другом варианте осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность SEQ ID NO:7 или аналог такой последовательности, являющийся агонистом глюкагона. В некоторых вариантах осуществления пептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:808, SEQ ID NO:810, SEQ ID NO:811, SEQ ID NO:812 и SEQ ID NO:813. В другом варианте осуществления пептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:808, SEQ ID NO:810 и SEQ ID NO:811. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность SEQ ID NO:808, SEQ ID NO:810 и SEQ ID NO:811, кроме того содержащую дополнительную аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Asp и Glu, добавленную к C-концу глюкагонового пептида. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность SEQ ID NO:811 или SEQ ID NO:813, и в следующем варианте осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность SEQ ID NO:811.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается агонист глюкагона, содержащий модифицированный глюкагоновый пептид, выбранный из группы, состоящей из:

NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO:834),

NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asp-Thr-R (SEQ ID NO:811) и

NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Glu-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asp-Thr-R (SEQ ID NO:813),

где Xaa в положении 15 означает Asp, Glu, цистеиновую кислоту, гомоглутаминовую кислоту или гомоцистеиновую кислоту, Xaa в положении 28 означает Asn или кислую аминокислоту, и Xaa в положении 29 означает Thr или кислую аминокислоту, и R означает кислую аминокислоту, COOH или CONH₂, при условии, что остаток кислой аминокислоты присутствует в одном из положений 28, 29 или 30. В некоторых вариантах осуществления R означает COOH, и в другом варианте осуществления R означает CONH₂.

Настоящее изобретение также охватывает слитые глюкагоновые пептиды, где второй пептид слит с C-концом глюкагонового пептида для повышения стабильности и растворимости глюкагонового пептида. Более конкретно, слитый глюкагоновый пептид может содержать агонистический аналог глюкагона, содержащий глюкагоновый пептид NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO:834), где R означает кислую аминокислоту или связь, и аминокислотную последовательность SEQ ID NO:820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO:821 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO:822 (KRNR), связанную с аминокислотой на карбоксильном конце глюкагонового пептида. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO:833, SEQ ID NO:807 или SEQ ID NO:808, и дополнительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO:821 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO:822 (KRNR), связанную с аминокислотой на карбоксильном конце глюкагонового пептида. В некоторых вариантах осуществления слитый глюкагоновый пептид содержит SEQ ID NO:802, SEQ ID NO:803, SEQ ID NO:804, SEQ ID NO:805 и SEQ ID NO:806 или их аналог агониста глюкагона и дополнительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO:821 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO:822 (KRNR), связанную с аминокислотой 29 глюкагонового пептида. Согласно некоторым вариантам осуществления слитый пептид дополнительно содержит цепь ПЭГ, связанную с аминокислотой в положении 16, 17, 21, 24, 29, в пределах C-концевого удлинения или с C-концевой аминокислотой, где цепь ПЭГ выбрана из диапазона от 500 до 40000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность SEQ ID NO:820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO:821 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO:822 (KRNR) связана с аминокислотой 29 глюкагонового пептида пептидной связью. В некоторых вариантах осуществления часть, представленная глюкагоновым пептидом, слитого глюкагонового пептида содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:810, SEQ ID NO:811 и SEQ ID NO:813. В некоторых вариантах осуществления часть, представленная глюкагоновым пептидом, слитого глюкагонового пептида содержит последовательность SEQ ID NO:811 или SEQ ID NO:813, где цепь ПЭГ связана в положении 21, 24, 29, в пределах C-концевого удлинения или с C-концевой аминокислотой, соответственно.

В другом варианте осуществления последовательность глюкагонового пептида в слитом пептиде содержит последовательность SEQ ID NO:811, дополнительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO:821 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO:822 (KRNR), связанную с аминокислотой 29 глюкагонового пептида. В некоторых вариантах осуществления слитый глюкагоновый пептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:824, SEQ ID NO:825 и SEQ ID NO:826. Как правило, слитые пептиды настоящего изобретения будут иметь C-концевую аминокислоту со стандартной группой карбоновой кислоты. Однако аналоги таких последовательностей, в которых C-концевая аминокислота имеет амид, заменяющий карбоновую кислоту, также рассматриваются в качестве вариантов осуществления. Согласно некоторым вариантам осуществления слитый глюкагоновый пептид содержит агонистический аналог глюкагона, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:810, SEQ ID NO:811 и SEQ ID NO:813, дополнительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:823 (GPSSGAPPPS-CONH₂), связанную с аминокислотой 29 глюкагонового пептида.

Агонисты глюкагона настоящего изобретения могут быть дополнительно модифицированы, чтобы повысить растворимость и стабильность пептида в водных растворах, сохраняя при этом биологическую активность глюкагонового пептида. Согласно некоторым вариантам осуществления предполагается, что введение гидрофильных групп в одном или нескольких положениях, выбранных из положений 16, 17, 20, 21, 24 и 29 пептида SEQ ID NO:811 или его аналога, являющегося агонистом глюкагона, повышает растворимость и стабильность устойчивого к pH аналога глюкагона. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид SEQ ID NO:810, SEQ ID NO:811, SEQ ID NO:813 или SEQ ID NO:832 модифицируют, чтобы он содержал одну или несколько гидрофильных групп, ковалентно связанных с боковыми цепями аминокислот, присутствующих в положениях 21 и 24 глюкагонового пептида.

Согласно некоторым вариантам осуществления глюкагоновый пептид SEQ ID NO:811 модифицируют, чтобы он содержал одну или несколько аминокислотных замен в положениях 16, 17, 20, 21, 24 и/или 29, где нативная аминокислота заменена аминокислотой, имеющей боковую цепь, подходящую для поперечного сшивания с гидрофильными остатками, включая, например, ПЭГ. В нативном пептиде может быть замена встречающейся в природе аминокислотой или синтетической (не встречающейся в природе) аминокислотой. Синтетические или не встречающиеся в природе аминокислоты относятся к аминокислотам, которые не встречаются в природе in vivo, но которые, тем не менее, могут быть введены в пептидные структуры, описанные в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления предлагается агонист глюкагона с SEQ ID NO:810, SEQ ID NO:811 или SEQ ID NO:813, где последовательность нативного глюкагонового пептида модифицируют, чтобы она содержала встречающуюся в природе или синтетическую аминокислоту по меньшей мере в одном из положений 16, 17, 21, 24, 29, в пределах C-концевого удлинения или в положении C-концевой аминокислоты нативной последовательности, где заменяющая аминокислота дополнительно содержит гидрофильный остаток. В некоторых вариантах осуществления замена осуществлена в положении 21 или 24, и в дополнительном варианте осуществления гидрофильный остаток представляет собой цепь ПЭГ. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид SEQ ID NO:811 имеет замену по меньшей мере одним остатком цистеина, где боковая цепь остатка цистеина дополнительно модифицирована взаимодействующим с тиолом реагентом, включая, например, малеимидогруппу, винилсульфон, 2-пиридилтиогруппу, галогеналкил и галогенацил. Такие взаимодействующие с тиолом реагенты могут содержать карбоксильную, кето, гидроксильную и эфирную группы, а также другие гидрофильные остатки, такие как единицы полиэтиленгликоля. В альтернативном варианте осуществления нативный глюкагоновый пептид имеет замену лизином, и боковую цепь заменяющего остатка лизина дополнительно модифицируют, используя взаимодействующие в амином реагенты, такие как реакционноспособные сложные эфиры (сукцинимидо, ангидрид и т.д.) карбоновых кислот или альдегиды гидрофильных остатков, таких как полиэтиленгликоль. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO:814, SEQ ID NO:815, SEQ ID NO:816, SEQ ID NO:817, SEQ ID NO:818 и SEQ ID NO:819.

Согласно некоторым вариантам осуществления пегилированный глюкагоновый пептид содержит две или несколько цепей полиэтиленгликоля, ковалентно связанных с глюкагоновым пептидом, где общая молекулярная масса цепей глюкагона составляет примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления пегилированный агонист глюкагона содержит пептид SEQ ID NO:806, где цепь ПЭГ ковалентно связана с остатком аминокислоты в положении 21 и в положении 24, и где общая молекулярная масса двух цепей ПЭГ составляет примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон. В другом варианте осуществления пегилированный агонист глюкагона содержит пептид SEQ ID NO:806, где цепь ПЭГ ковалентно связана с остатком аминокислоты в положении 21 и в положении 24, и где общая молекулярная масса двух цепей ПЭГ составляет примерно от 5000 до примерно 20000 дальтон.

Цепь полиэтиленгликоля может быть в форме неразветвленной цепи или может быть разветвленной. Согласно некоторым вариантам осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет среднюю молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 500 до примерно 40000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 500 до примерно 5000 дальтон. В другом варианте осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу примерно от 20000 до примерно 40000 дальтон.

Любой из глюкагоновых пептидов, описанных выше, может быть дополнительно модифицирован, чтобы он содержал ковалентный или нековалентный внутримолекулярный мостик или стабилизирующую альфа-спираль аминокислоту в C-концевой части глюкагонового пептида (положения аминокислот 12-29). Согласно некоторым вариантам осуществления глюкагоновый пептид содержит любую одну или несколько модификаций, обсужденных выше, в дополнение к заменам аминокислот в положениях 16, 20, 21 или 24 (или их комбинации) α,α-дизамещенной аминокислотой, например, AIB. Согласно другому варианту осуществления глюкагоновый пептид содержит любую одну или несколько модификаций, обсужденных выше, в дополнение к внутримолекулярному мостику, например, лактаму, между боковыми цепями аминокислот в положениях 16 и 20 глюкагонового пептида.

Согласно некоторым вариантам осуществления глюкагоновый пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:877, где Xaa в положении 3 означает аминокислоту, содержащую боковую цепь структуры I, II или III:

структура I

структура II

структура III

где R¹ означает C_0-3алкил или C_0-3гетероалкил; R² означает NHR⁴ или C_1-3алкил; R³ означает C_1-3алкил; R⁴ означает H или C_1-3алкил; X означает NH, O или S; и Y означает NHR⁴, SR³ или OR³. В некоторых вариантах осуществления X означает NH или Y означает NHR⁴. В некоторых вариантах осуществления R¹ означает C_0-2алкил или C₁-гетероалкил. В некоторых вариантах осуществления R² означает NHR⁴ или C₁алкил. В некоторых вариантах осуществления R⁴ означает H или C₁алкил. В примерах вариантов осуществления предлагается аминокислота, содержащая боковую цепь структуры I, где R¹ означает CH₂-S, X означает NH, и R² означает CH₃ (ацетамидометилцистеин, C(Acm)); R¹ означает CH₂, X означает NH, и R² означает CH₃ (ацетилдиаминомасляная кислота, Dab(Ac)); R¹ означает C₀алкил, X означает NH, R² означает NHR⁴, и R⁴ означает H (карбамоилдиаминопропановая кислота, Dap(мочевина)); или R¹ означает CH₂-CH₂, X означает NH, и R² означает CH₃ (ацетилорнитин, Om(Ac)). В примерах вариантов осуществления предлагается аминокислота, содержащая боковую цепь структуры II, где R¹ означает CH₂, Y означает NHR⁴, и R⁴ означает CH³ (метилглутамин, Q(Me)). В примерах вариантов осуществления предлагается аминокислота, содержащая боковую цепь структуры III, где R¹ означает CH₂, и R⁴ означает H (метионинсульфоксид, M(O)). В конкретных вариантах осуществления аминокислота в положении 3 заменена Dab(Ac). Например, агонисты глюкагона могут содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:863, SEQ ID NO:869, SEQ ID NO:871, SEQ ID NO:872, SEQ ID NO:873 и SEQ ID NO:874.

В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид представляет собой аналог глюкагонового пептида SEQ ID NO:877. В конкретных аспектах аналог содержит любую из модификаций аминокислот, описанных в настоящем описании, включая, но без ограничения: замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой; замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты; замену в положении 28 аминокислотой Asn, Asp или Glu; замену в положении 28 аминокислотой Asp; замену в положении 28 аминокислотой Glu; замену Thr в положении 29 заряженной аминокислотой; замену Thr в положении 29 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты; замену в положении 29 аминокислотой Asp, Glu или Lys; замену в положении 29 аминокислотой Glu; инсерцию 1-3 заряженных аминокислот после положения 29; инсерцию после положения 29 Glu или Lys; инсерцию после положения 29 Gly-Lys или Lys-Lys; и их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления аналог глюкагонового пептида SEQ ID NO:877 содержит α,α-дизамещенную аминокислоту, такую как AIB, в одном, двух, трех или всех положениях 16, 20, 21 и 24.

В некоторых вариантах осуществления аналог глюкагонового пептида SEQ ID NO:877 содержит одну или несколько из следующих модификаций: замену His в положении 1 ненативной аминокислотой, которая уменьшает чувствительность глюкагонового пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP-IV), замену Ser в положении 2 ненативной аминокислотой, которая уменьшает чувствительность глюкагонового пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP-IV), замену Thr в положении 7 аминокислотой, в которой отсутствует гидроксильная группа, например, Abu или Ile; замену Tyr в положении 10 аминокислотой Phe или Val; замену Lys в положении 12 аминокислотой Arg; замену Asp в положении 15 аминокислотой Glu, замену Ser в положении 16 аминокислотой Thr или AIB; замену Gln в положении 20 аминокислотой Ala или AIB; замену Asp в положении 21 аминокислотой Glu; замену Gln в положении 24 аминокислотой Ala или AIB; замену Met в положении 27 аминокислотой Leu или Nle; делецию аминокислот в положениях 27-29; делецию аминокислот в положениях 28-29; делецию аминокислоты в положении 29; добавление аминокислотной последовательности SEQ ID NO:820 к C-концу, где аминокислота в положении 29 представляет собой Thr или Gly, или их комбинацию.

Согласно конкретным вариантам осуществления глюкагоновый пептид содержит любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:862-867 и 869-874.

В некоторых вариантах осуществления аналог глюкагонового пептида, содержащий SEQ ID NO:877, содержит гидрофильный остаток, например, ПЭГ, ковалентно связанный с аминокислотой в любом из положений 16, 17, 20, 21, 24 и 29 или с C-концевой аминокислотой.

В некоторых вариантах осуществления аналог глюкагонового пептида, включающий SEQ ID NO:877, содержит аминокислоту, имеющую боковую цепь, ковалентно связанную, необязательно через спейсер, с ацильной группой или алкильной группой, где такая ацильная группа или алкильная группа является ненативной для встречающейся в природе аминокислоты. Ацильная группа в некоторых вариантах осуществления представляет собой жирную C4-C30-ацильную группу. В других вариантах осуществления алкильная группа представляет собой C4-C30алкил. В конкретных аспектах ацильная группа или алкильная группа ковалентно связана с боковой цепью аминокислоты в положении 10. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 7 представляет собой Ile или Abu.

Агонист глюкагона может представлять собой пептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:801-919, необязательно с 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительными модификациями, которые сохраняют активность агониста глюкагона. В некоторых вариантах осуществления агонист глюкагона содержит аминокислоты любой из SEQ ID NO:859-919.

Родственные глюкагону пептиды класса 2

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид является родственным глюкагону пептидом класса 2, который описан в настоящем описании и в международной патентной заявке № PCT US2009/47447 (поданной 16 июня 2009), предварительной патентной заявке США № 61/090448 и патентной заявке США № 61/151349, содержимое которых включено в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Биологические последовательности, указанные в следующем разделе (SEQ ID NO:1001-1262), относящиеся к родственным глюкагону пептидам класса 2, соответствуют SEQ ID NO:1-262 в международной патентной заявке № PCT US2009/47447.

Активность

Нативный глюкагон не активирует рецептор GIP и обычно проявляет примерно 1% активности нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1. Модификации в последовательности нативного глюкагона, описанной в настоящем описании, дают родственные глюкагону пептиды класса 2, которые могут проявлять высокую глюкагоновую активность, эквивалентную или более высокую, чем активность нативного глюкагона (SEQ ID NO:1001), высокую активность GIP, эквивалентную или более высокую, чем активность нативного GIP (SEQ ID NO:1004), и/или высокую активность GLP-1, эквивалентную или более высокую, чем активность нативного GLP-1. В этом отношении родственный глюкагону пептид класса 2 может представлять собой либо глюкагоновый пептид, являющийся коагонистом глюкагона/GIP, тройным агонистом глюкагона/GIP/GLP-1, коагонистом GIP/GLP-1 или агонистом GIP, которые дополнительно описаны в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 2, описанные в настоящем описании, имеют EC₅₀ для активирующей активности рецептора GIP, составляющую примерно 100 нМ или меньше, или примерно 75, 50, 25, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нМ или меньше. В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 2 имеют EC₅₀ для активации рецептора глюкагона, составляющую примерно 100 нМ или менее, или примерно 75, 50, 25, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нМ или менее. В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 2 имеют EC₅₀ для активации рецептора GLP-1, составляющую примерно 100 нМ или менее, или примерно 75, 50, 25, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нМ или менее. Активацию рецептора можно измерить в анализах in vitro, измеряя индукцию цАМФ в клетках HEK293, сверхэкспрессирующих рецептор, например, анализируя клетки HEK293, котрансфицированные ДНК, кодирующей рецептор и ген люциферазы, связанный с отвечающим на цАМФ элементом, как описано в примере 5.

В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 2 проявляют по меньшей мере примерно 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175% или 200% или более высокую активность в отношении рецептора GIP по сравнению с нативным GIP (активность GIP). В некоторых вариантах осуществления глюкагоновые пептиды, описанные в настоящем описании, проявляют не более чем 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% активность в отношении рецептора GIP по сравнению с нативным GIP. В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 2 проявляют по меньшей мере примерно 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450% или 500% или более высокую активность в отношении рецептора глюкагона по сравнению с нативным глюкагоном (глюкагоновая активность). В некоторых вариантах осуществления глюкагоновые пептиды, описанные в настоящем описании, проявляют не более чем 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% активность в отношении рецептора глюкагона по сравнению с нативным глюкагоном. В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 2 проявляют по меньшей мере примерно 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175% или 200% или более высокую активность в отношении рецептора GLP-1 по сравнению с нативным GLP-1 (активность GLP-1). В некоторых вариантах осуществления глюкагоновые пептиды, описанные в настоящем описании, проявляют не более чем 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% активность в отношении рецептора GLP-1 по сравнению с нативным GLP-1. Активность родственного глюкагону пептида класса 2 в отношении рецептора по сравнению с нативным лигандом рецептора вычисляют в виде обратного отношения EC₅₀ для родственного глюкагону пептида класса 2 к EC₅₀ для нативного лиганда.

В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 2 проявляют активность как в отношении рецептора глюкагона, так и в отношении рецептора GIP («коагонисты глюкагона/GIP»). Такие родственные глюкагону пептиды класса 2 утрачивают селективность нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона по сравнению с рецептором GIP. В некоторых вариантах осуществления EC₅₀ родственного глюкагону пептида класса 2 в отношении рецептора GIP менее чем примерно в 50 раз, 40 раз, 30 раз или 20 раз отличается (больше или меньше) от его EC₅₀ в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления GIP-активность родственного глюкагону пептида класса 2 менее чем примерно в 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10 или 5 раз отличается (больше или меньше) от его глюкагоновой активности. В некоторых вариантах осуществления отношение EC₅₀ родственного глюкагону пептида класса 2 для рецептора GIP к EC₅₀ родственного глюкагону пептида класса 2 для рецептора глюкагона составляет менее чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах осуществления отношение EC₅₀ для рецептора GIP к EC₅₀ для рецептора глюкагона составляет примерно 1 или менее чем примерно 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах осуществления отношение GIP-активности родственного глюкагону пептида класса 2 к глюкагоновой активности родственного глюкагону пептида класса 2 составляет менее чем примерно 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах осуществления отношение эффективности в отношении рецептора GIP к эффективности в отношении рецептора глюкагона составляет примерно 1 или менее чем примерно 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах осуществления GLP-1-активность значительно снижена или утрачена, например, путем модификации аминокислоты в положении 7, делеции аминокислоты (аминокислот), расположенных с C-концевой стороны от аминокислоты в положении 27 или 28, дающей 27 или 28-аминокислотный пептид, или их комбинации.

В другом аспекте родственные глюкагону пептиды класса 2 проявляют активность в отношении рецепторов глюкагона, GIP и GLP-1 («тройные агонисты глюкагона/GIP/GLP-1»). Такие родственные глюкагону пептиды класса 2 утрачивают селективность нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона по сравнению с рецептором GLP-1 и рецептором GIP. В некоторых вариантах осуществления EC₅₀ родственного глюкагону пептида класса 2 в отношении рецептора GIP менее чем примерно в 50 раз, 40 раз, 30 раз или 20 раз отличается (больше или меньше) от его соответствующих EC₅₀ в отношении рецепторов глюкагона и GLP-1. В некоторых вариантах осуществления GIP-активность родственного глюкагону пептида класса 2 менее чем примерно в 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10 или 5 раз отличается (больше или меньше) от его глюкагоновой активности и GLP-1-активности. В некоторых вариантах осуществления отношение EC₅₀ тройного агониста для рецептора GIP к EC₅₀ тройного агониста для рецептора GLP-1 составляет менее чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах осуществления отношение EC₅₀ для рецептора GIP к EC₅₀ для рецептора GLP-1 составляет примерно 1 или менее чем примерно 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах осуществления отношение GIP-активности тройного агониста к GLP-1-активности тройного агониста составляет менее чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах осуществления отношение эффективности в отношении рецептора GIP к эффективности в отношении рецептора GLP-1 составляет примерно 1 или менее чем примерно 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В родственных вариантах осуществления отношение EC₅₀ тройного агониста для рецептора GIP к EC50 тройного агониста для рецептора глюкагона составляет менее чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах осуществления отношение EC₅₀ для рецептора GIP к EC₅₀ для рецептора глюкагона составляет примерно 1 или менее чем примерно 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах осуществления отношение GIP-активности тройного агониста к глюкагоновой активности тройного агониста составляет менее чем примерно 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах осуществления отношение эффективности в отношении рецептора GIP к эффективности в отношении рецептора глюкагона составляет примерно 1 или менее чем примерно 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах осуществления отношение EC₅₀ тройного агониста для рецептора GLP-1 к EC₅₀ тройного агониста для рецептора глюкагона составляет менее чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах осуществления отношение EC₅₀ для рецептора GLP-1 к EC₅₀ для рецептора глюкагона составляет примерно 1 или менее чем примерно 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах осуществления отношение GLP-1-активности тройного агониста к глюкагоновой активности тройного агониста составляет менее чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах осуществления отношение эффективности в отношении рецептора GLP-1 к эффективности в отношении рецептора глюкагона составляет примерно 1 или менее чем примерно 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2).

В следующем аспекте родственные глюкагону пептиды класса 2 проявляют активность в отношении рецепторов GLP-1 и GIP, но их глюкагоновая активность значительно снижена или утрачена («коагонисты GIP/GLP-1»), например, путем модификации аминокислоты в положении 3. Например, замена в данном положении кислой, основной или гидрофобной аминокислотой (глутаминовой кислотой, орнитином, норлейцином) снижает глюкагоновую активность. В некоторых вариантах осуществления EC₅₀ глюкагонового пептида в отношении рецептора GIP менее чем примерно в 50 раз, 40 раз, 30 раз или 20 раз отличается (больше или меньше) от его EC₅₀ в отношении рецептора GLP-1. В некоторых вариантах осуществления GIP-активность родственного глюкагону пептида класса 2 менее чем примерно в 25, 20, 15, 10 или 5 раз отличается (больше или меньше) от его GLP-1-активности. В некоторых вариантах осуществления такие родственные глюкагону пептиды класса 2 проявляют примерно 10% или меньшую активность нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона, например примерно 1-10% или примерно 0,1-10%, или больше чем примерно 0,1%, но меньше чем примерно 10% активность. В некоторых вариантах осуществления отношение EC₅₀ родственного глюкагону пептида класса 2 для рецептора GIP к EC₅₀ родственного глюкагону пептида класса 2 для рецептора GLP-1 составляет менее чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5, и не менее 1. В некоторых вариантах осуществления отношение GIP-активности родственного глюкагону пептида класса 2 к GLP-1-активности родственного глюкагону пептида класса 2 составляет менее чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5, и не менее 1.

В следующем аспекте родственные глюкагону пептиды класса 2 проявляют активность в отношении рецептора GIP, в котором глюкагоновая активность и GLP-1-активность значительно снижена или утрачена («глюкагоновые пептиды, являющиеся агонистами GIP»), например, в результате модификаций аминокислот в положениях 3 с использованием Glu и 7 с использованием Ile. В некоторых вариантах осуществления такие родственные глюкагону пептиды класса 2 обладают примерно 10% или меньшей активностью нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона, например примерно 1-10% или примерно 0,1-10%, или больше чем примерно 0,1%, 0,5% или 1%, но меньше чем примерно 1%, 5% или 10% активностью. В некоторых вариантах осуществления такие родственные глюкагону пептиды класса 2 также проявляют примерно 10% или меньшую активность нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1, например, примерно 1-10% или примерно 0,1-10%, или большей чем примерно 0,1%, 0,5% или 1%, но меньшей чем примерно 1%, 5% или 10% активностью.

В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид класса 2 не пегилирован, EC₅₀ родственного глюкагону пептида класса 2 для активации рецептора GIP составляет примерно 4, 2, 1 нМ или менее, или аналог обладает по меньшей мере примерно 1%, 2%, 3%, 4% или 5% активностью нативного GIP в отношении рецептора GIP. В родственных вариантах осуществления EC₅₀ непегилированного родственного глюкагону пептида класса 2 для активации рецептора GLP-1 составляет примерно 4, 2, 1 нМ или менее, или он обладает по меньшей мере примерно 1%, 2%, 3%, 4% или 5% активностью нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1. В следующих родственных вариантах осуществления EC₅₀ непегилированного родственного глюкагону пептида класса 2 для активации рецептора глюкагона составляет примерно 4, 2, 1 нМ или менее, или он обладает по меньшей мере примерно 5%, 10%, 15% или 20% активностью нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления непегилированный родственный глюкагону пептид класса 2 обладает менее чем примерно 1% активностью нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона. В других вариантах осуществления непегилированный родственный глюкагону пептид класса 2 обладает менее чем примерно 10%, 5% или 1% активностью нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1.

В вариантах осуществления, в которых родственные глюкагону пептиды класса 2 связаны с гидрофильными остатками, такими как ПЭГ, относительные значения EC₅₀ по отношению к одному или нескольким рецепторам могут быть выше, например, примерно в 10 раз. Например, EC₅₀ пегилированного аналога для активации рецептора GIP составляет примерно 10 нМ или менее, или родственный глюкагону пептид класса 2 обладает по меньшей мере примерно 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% или 0,5% активностью нативного GIP в отношении рецептора GIP. В родственных вариантах осуществления EC₅₀ пегилированного родственного глюкагону пептида класса 2 для активации рецептора GLP-1 составляет примерно 10 нМ или менее, или он обладает по меньшей мере примерно 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% или 0,5% активностью нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1. В следующих родственных вариантах осуществления EC₅₀ пегилированного родственного глюкагону пептида класса 2 для активации рецептора глюкагона составляет примерно 10 нМ или менее, или он обладает по меньшей мере примерно 0,5%, 1%, 1,5% или 2% активностью нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 2 обладает менее чем примерно 1% активностью нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона. В других вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 2 обладает менее чем примерно 10%, 5% или 1% активностью нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1.

Модификации

Модификации, описанные в настоящем описании со ссылкой на родственный глюкагону пептид класса 2, позволяют проводить обработку глюкагона (SEQ ID NO:1001), чтобы создать глюкагоновые пептиды, которые проявляют повышенную GIP-активность, глюкагоновую активность и/или GLP-1-активность. Другие модификации, описанные в настоявшем описании со ссылкой на родственный глюкагону пептид класса 2, продлевают время полужизни, повышают растворимость или повышают стабильность полученного в результате пептида. Другие модификации, описанные в настоящем описании со ссылкой на родственный глюкагону пептид класса 2, не влияют на активность или могут быть осуществлены без утраты требуемой активности или активностей. По отношению к родственному глюкагону пептиду класса 2 могут быть применены любые комбинации, которые служат указанной цели (например, повышению GIP-активности) отдельно или в комбинации. Любая из отдельных или из групп комбинаций по отношению к родственному глюкагону пептиду класса 2, которая придает улучшенные свойства, может быть применена отдельно или в комбинации, например, повышенную GIP и/или GLP-1 активность можно сочетать с повышенным временем полужизни. В родственных вариантах осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более модификаций аминокислот могут представлять собой неконсервативные замены, добавления или делеции. В некоторых вариантах осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более модификаций аминокислот могут представлять собой консервативные замены.

Модификации, которые влияют на активность GIP

Повышенную активность в отношении рецептора GIP обеспечивают путем модификации аминокислоты в положении 1. Например, His в положении 1 заменяют крупной ароматической аминокислотой, необязательно Tyr, Phe, Trp, амино-Phe, нитро-Phe, хлор-Phe, сульфо-Phe, 4-пиридил-Ala, метил-Tyr или 3-амино-Tyr. Комбинация Tyr в положении 1 со стабилизацией альфа-спирали в области, соответствующей аминокислотам 12-29, дает родственный глюкагону пептид класса 2, который активирует рецептор GIP, а также рецептор GLP-1 и рецептор глюкагона. Альфа-спиральная структура может быть стабилизирована, например, в результате образования ковалентного или нековалентного внутримолекулярного мостика или замены и/или инсерции аминокислоты вокруг положений 12-29 стабилизирующей альфа-спираль аминокислотой (например, α,α-дизамещенной аминокислотой).

Повышенную активность в отношении рецептора GIP также обеспечивают путем модификаций аминокислот в положениях 27 и/или 28 и необязательно в положении 29. Например, Met в положении 27 заменяют крупной алифатической аминокислотой, необязательно Leu, Asn в положении 28 заменяют малой алифатической аминокислотой, необязательно Ala, и Thr в положении 29 заменяют малой алифатической аминокислотой, необязательно Gly. Замены LAG в положениях 27-29 обеспечивают повышенную GIP-активность по сравнению с нативной последовательностью MNT в таких положениях.

Повышенную активность в отношении рецептора GIP также обеспечивают путем модификации аминокислоты в положении 12. Например, аминокислоту в положении 12 заменяют крупной алифатической, неполярной аминокислотой, необязательно Ile.

Повышенную активность в отношении рецептора GIP также обеспечивают путем модификации аминокислоты в положениях 17 и/или 18. Например, аминокислоту в положении 17 заменяют полярным остатком, необязательно Gln, и положение 18 заменяют малой алифатической аминокислотой, необязательно Ala. Замена с использованием QA в положениях 17 и 18 дает повышенную GIP-активность по сравнению с нативной последовательностью RR в таких положениях.

Повышенную активность в отношении рецептора GIP обеспечивают путем модификаций, которые дают возможность образования внутримолекулярного мостика между боковыми цепями аминокислот в положениях от 12 до 29. Например, внутримолекулярный мостик может быть образован ковалентной связью между боковыми цепями двух аминокислот в положениях i и i+4 или между положениями j и j+3, или между положениями k и k+7. В примерах вариантов осуществления мостик образуется между положениями 12 и 16, 16 и 20, 20 и 24, 24 и 28, или 17 и 20. В других вариантах осуществления нековалентные взаимодействия, такие как солевые мостики, могут быть образованы между положительно и отрицательно заряженными аминокислотами в указанных положениях.

Любую из модификаций, описанных выше, которая увеличивает активность рецептора GIP, можно использовать отдельно или в комбинации. Комбинации модификаций, которые повышают активность рецептора GIP, обычно обеспечивают более высокую активность GIP, чем любая из таких модификаций отдельно.

Модификации, которые влияют на активность глюкагона

В некоторых вариантах осуществления повышенную глюкагоновую активность обеспечивают путем модификации аминокислоты в положении 16 нативного глюкагона (SEQ ID NO:1001). В качестве неограничивающего примера такую повышенную активность можно получить заменой встречающегося в природе серина в положении 16 глутаминовой кислотой или другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь с длиной в 4 атома, или альтернативно, любой из глутамина, гомоглутаминовой кислоты или гомоцистеиновой кислоты или заряженной аминокислоты, имеющей боковую цепь, содержащую по меньшей мере один гетероатом, (например, N, O, S, P) и длиной боковой цепи примерно в 4 (или 3-5) атомов. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид сохраняет свою исходную селективность в отношении рецептора глюкагона по сравнению с рецепторами GLP-1.

Активность рецептора глюкагона может быть снижена путем модификации аминокислоты в положении 3, например, замены встречающегося в природе глутамина в положении 3 кислой, основной или гидрофобной аминокислотой. Например, замена в положении 3 глутаминовой кислотой, орнитином или норлейцином значительно снижает или устраняет активность рецептора глюкагона.

Поддержание или повышение активности в отношении рецептора глюкагона можно достичь путем модификации Gln в положении 3, с получением аналога глутамина, который описан в настоящем описании. Например, агонисты глюкагона могут содержать любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1243-1248, 1250, 1251 и 1253-1256.

Восстановление глюкагоновой активности, которая была снижена в результате модификаций аминокислот в положениях 1 и 2, обеспечивают путем модификаций, которые стабилизируют альфа-спиральную структуру C-концевой части (аминокислоты 12-29) глюкагонового пептида или его аналога. Например, внутримолекулярный мостик может быть образован ковалентной связью между боковыми цепями двух аминокислот в положениях i и i+4 или между положениями j и j+3, или между положениями k и k+7. В других вариантах осуществления нековалентные взаимодействия, такие как солевые мостики, могут быть образованы между положительно и отрицательно заряженными аминокислотами в указанных положениях. В следующих вариантах осуществления одну или несколько α,α-дизамещенных аминокислот встраивают или используют для замены в такой C-концевой части (аминокислоты 12-29) в положениях, которые восстанавливают требуемую активность. Например, аминокислоты в одном, двух, трех или всех положениях 16, 20, 21 или 24 заменяют α,α-дизамещенной аминокислотой, например, AIB.

Модификации, которые влияют на активность GLP-1

Повышенную активность рецептора GLP-1 обеспечивают заменой остатка карбоновой кислоты C-концевой аминокислоты нейтральной по заряду группой, такой как амид или сложный эфир.

Повышенную активность рецептора GLP-1 также обеспечивают путем стабилизации альфа-спиральной структуры в C-концевой части глюкагона (в области аминокислот 12-29), например, посредством образования внутримолекулярного мостика между боковыми цепями двух аминокислот или замены и/или инсерции аминокислоты в области положений 12-29 стабилизирующей альфа-спираль аминокислотой (например, α,α-дизамещенной аминокислотой), как дополнительно описано в настоящем описании. В примерах вариантов осуществления боковые цепи пар аминокислот 12 и 16, 13 и 17, 16 и 20, 17 и 21, 20 и 24 или 24 и 28 (пары аминокислот, в которых i равно 12, 16, 20, или 24) связаны друг с другом и, таким образом, стабилизируют альфа-спираль глюкагона. В некоторых вариантах осуществления мостик или линкер имеет длину около 8 (или примерно 7-9), в частности, когда мостик находится между положениями i и i+4. В некоторых вариантах осуществления мостик или линкер имеет длину около 6 (или примерно 5-7) атомов, в частности, когда мостик находится между положениями j и j+3.

В некоторых вариантах осуществления внутримолекулярные мостики образуются в результате (a) замены встречающегося в природе серина в положении 16 глутаминовой кислотой или другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь длиной 4 атома, или альтернативно, любой из глутамина, гомоглутаминовой кислоты или гомоцистеиновой кислоты, или заряженной аминокислоты, имеющей боковую цепь, содержащую по меньшей мере один гетероатом (например, N, O, S, P), и с длиной боковой цепи примерно 4 (или 3-5) атомов, и (b) замены встречающегося в природе глутамина в положении 20 другой гидрофильной аминокислотой, имеющей боковую цепь, которая либо заряжена и обладает способностью образовывать водородную связь и имеет длину по меньшей мере примерно 5 (или примерно 4-6) атомов, например лизином, цитруллином, аргинином или орнитином. Боковые цепи таких аминокислот в положениях 16 и 20 могут образовывать солевой мостик или могут быть ковалентно связаны. В некоторых вариантах осуществления две аминокислоты связаны друг с другом с образованием лактамового кольца.

В некоторых вариантах осуществления стабилизацию альфа-спиральной структуры в C-концевой части глюкагонового пептида достигают посредством образования другого внутримолекулярного мостика, отличного от лактамового мостика. Например, подходящие способы образования ковалентных связей включают любой один или несколько из следующих способов: метатезис олефинов, основанную на лантионине циклизацию, образование дисульфидного мостика или образование модифицированного содержащего серу мостика, использование α,ω-диаминоалкановой связки, образование мостиков на основе атомов металлов и другие способы циклизации пептидов, которые используют для стабилизации альфа-спирали.

В следующих вариантах осуществления одну или несколько α,α-дизамещенных аминокислот встраивают или используют для замены в указанной C-концевой части (аминокислоты 12-29) в положениях, которые сохраняют требуемую активность. Например, аминокислоту в одном, двух, трех или всех положениях 16, 20, 21 или 24 заменяют α,α-дизамещенной аминокислотой, например, AIB.

Повышенную активность в отношении рецептора GLP-1 обеспечивают путем модификации аминокислоты в положении 20, как описано в настоящем описании.

Повышенную активность в отношении рецептора GLP-1 обеспечивают добавлением GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1095) или XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1096) к C-концу. GLP-1-активность таких аналогов можно дополнительно повысить путем модификации аминокислоты в положении 18, 28 или 29, или в положении 18 и 29, как описано в настоящем описании.

Дальнейшее небольшое увеличение GLP-1-активности обеспечивают путем модификации аминокислоты в положении 10 с получением крупного ароматического аминокислотного остатка, необязательно Trp.

Пониженную активность в отношении рецептора GLP-1 обеспечивают, например, используя модификацию аминокислоты в положении 7, как описано в настоящем описании.

Эффективность в отношении рецептора GLP-1 можно дополнительно повысить аланиновой заменой нативного аргинина в положении 18.

Любые модификации, описанные выше со ссылкой на родственный глюкагону пептид класса 2, которые повышают активность рецептора GLP-1, можно применять по отдельности или в комбинации. Комбинации модификаций, которые повышают активность рецептора GLP-1, обычно обеспечивают более высокую активность GLP-1, чем любые такие модификации по отдельности. Например, изобретение относится к глюкагоновым пептидам, которые содержат модификации в положении 16, в положении 20 и в C-концевой группе карбоновой кислоты, необязательно с ковалентной связью между аминокислотами в положениях 16 и 20; глюкагоновым пептидам, которые содержат модификации в положении 16 и в C-концевой группе карбоновой кислоты; глюкагоновым пептидам, которые содержат модификации в положениях 16 и 20, необязательно с ковалентной связью между аминокислотами в положениях 16 и 20; и глюкагоновым пептидам, которые содержат модификации в положении 20 и в C-концевой группе карбоновой кислоты.

Модификации, которые повышают устойчивость к DPP-IV

Модификации в положении 1 и/или 2 могут повышать устойчивость пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP IV). Например, в положении 1 и/или положении 2 можно осуществить замену устойчивой к DPP-IV аминокислотой, которая описана в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 2 заменяют N-метилаланином.

Обнаружено, что модификации в положении 2 (например, AIB в положении 2) и в некоторых случаях модификации в положении 1 (например, DMIA в положении 1) могут уменьшать глюкагоновую активность, иногда в значительной степени; неожиданно, такое уменьшение в глюкагоновой активности может быть восстановлено стабилизацией альфа-спиральной структуры в C-концевой части глюкагона (в области аминокислот 12-29), например, посредством образования ковалентной связи между боковыми цепями двух аминокислот, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления ковалентная связь находится между аминокислотами в положениях «i» и «i+4», или положениях «j» и «j+3», например, между положениями 12 и 16, 16 и 20, 20 и 24, 24 и 28, или 17 и 20. В примерах вариантов осуществления такая ковалентная связь представлена лактамовым мостиком между глутаминовой кислотой в положении 16 и лизином в положении 20. В некоторых вариантах осуществления такая ковалентная связь представлена другим внутримолекулярным мостиком, отличным от лактамового мостика, как описано в настоящем описании.

Модификации, которые уменьшают разложение

В следующих примерах вариантов осуществления любой из родственных глюкагону пептидов класса 2 может быть дополнительно модифицирован для повышения стабильности, путем модификации аминокислоты в положении 15 и/или 16 последовательности SEQ ID NO:1001, чтобы уменьшить разложение пептида с течением времени, особенно в кислых или щелочных буферах. Такие модификации уменьшают расщепление пептидной связи Asp15-Ser16. В примерах вариантов осуществления модификация аминокислоты в положении 15 представляет собой делецию или замену Asp глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой, цистеиновой кислотой или гомоцистеиновой кислотой. В других примерах вариантов осуществления модификация аминокислоты в положении 16 представляет собой делецию или замену Ser аминокислотой Thr или AIB. В других примерах вариантов осуществления Ser в положении 16 заменяют глутаминовой кислотой или другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь длиной в 4 атома, или альтернативно, любой из глутамина, гомоглутаминовой кислоты или гомоцистеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления остаток метионина, присутствующий в положении 27 нативного пептида, модифицируют, например, делецией или заменой. Такие модификации могут предотвращать окислительное разложение пептида. В некоторых вариантах осуществления Met в положении 27 заменяют лейцином, изолейцином или норлейцином. В некоторых конкретных вариантах осуществления Met в положении 27 заменяют лейцином или норлейцином.

В некоторых вариантах осуществления Gln в положении 20 и/или 24 модифицируют, например, делецией или заменой. Такие модификации могут уменьшать разложение, которое происходит в результате дезамидирования Gln. В некоторых вариантах осуществления Gln в положении 20 и/или 24 заменяют аминокислотой Ser, Thr, Ala или AIB. В некоторых вариантах осуществления Gln в положении 20 и/или 24 заменяют Lys, Arg, Orn или цитруллином.

В некоторых вариантах осуществления Asp в положении 21 модифицируют, например, делецией или заменой. Такие модификации могут уменьшать разложение, которое происходит в результате дегидратации Asp с образованием промежуточного циклического сукцинимида, с последующей изомеризацией до изоаспартата. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 21 заменяют Glu, гомоглутаминовой кислотой или гомоцистеиновой кислотой. В некоторых конкретных вариантах осуществления аминокислоту в положении 21 заменяют Glu.

Стабилизация альфа-спиральной структуры

Стабилизация альфа-спиральной структуры в C-концевой части родственного глюкагону пептида класса 2 (в области аминокислот 12-29) обеспечивает повышенную GLP-1 и/или GIP активность и восстанавливает глюкагоновую активность, которая была снижена при модификации аминокислот в положениях 1 и/или 2. Альфа-спиральная структура может быть стабилизирована, например, благодаря образованию ковалентного или нековалентного внутримолекулярного мостика или благодаря замене и/или инсерции аминокислоты в области положений 12-29 стабилизирующей альфа-спираль аминокислотой (например, α,α-дизамещенной аминокислотой). Стабилизацию альфа-спиральной структуры агониста GIP можно осуществить, как описано в настоящем описании.

Ацилирование и алкилирование

Согласно некоторым вариантам осуществления глюкагоновые пептиды, описанные в настоящем описании, модифицируют, чтобы они содержали ацильную группу или алкильную группу, например, ацильную или алкильную группу, которая не является нативной для встречающейся в природе аминокислоты, которая описана в настоящем описании. Ацилирование или алкилирование может увеличивать время полужизни глюкагоновых пептидов в кровообращении. Ацилирование или алкилирование преимущественно может задерживать начало действия и/или увеличивать продолжительность действия на рецепторы глюкагона и/или GLP-1 и/или повышать устойчивость к протеазам, таким как DPP-IV, и/или повышать растворимость. Активность в отношении рецепторов глюкагона и/или GLP-1, и/или GIP глюкагонового пептида может сохраняться после ацилирования. В некоторых вариантах осуществления активность ацилированных глюкагоновых пептидов сравнима с активностью неацилированных вариантов глюкагоновых пептидов. Родственные глюкагону пептиды класса 2 могут быть ацилированы или алкилированы в том же положении аминокислоты, в котором связан гидрофильный остаток, или в другом положении аминокислоты, как описано в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к глюкагоновому пептиду, модифицированному, чтобы он содержал ацильную группу или алкильную группу, ковалентно связанную с аминокислотой в положении 10 глюкагонового пептида. Глюкагоновый пептид может дополнительно содержать спейсер между аминокислотой в положении 10 глюкагонового пептида и ацильной группой или алкильной группой. В некоторых вариантах осуществления ацильная группа представлена жирной кислотой или желчной кислотой или ее солью, например, C4-C30 жирной кислотой, C8-C24 жирной кислотой, холевой кислотой, C4-C30алкилом, C8-C24алкилом или алкилом, содержащим стероидный остаток желчной кислоты. Спейсер представляет собой любой остаток с подходящими реакционноспособными группами для связывания с ацильными или алкильными группами. В примерах вариантов осуществления спейсер содержит аминокислоту, дипептид, трипептид, гидрофильный бифункциональный или гидрофобный бифункциональный спейсер. В некоторых вариантах осуществления спейсер выбран из группы, состоящей из: Trp, Glu, Asp, Cys и спейсера, содержащего NH₂(CH₂CH₂O)_n(CH₂)_mCOOH, где m означает любое целое число от 1 до 6, и n означает любое целое число от 2 до 12. Такие ацилированные или алкилированные глюкагоновые пептиды также могут дополнительно содержать гидрофильный остаток, необязательно полиэтиленгликоль. Любой из указанных выше глюкагоновых пептидов может содержать две ацильных группы или две алкильных группы или их комбинацию.

Конъюгаты и слияния

Агонист GIP может быть связан, необязательно ковалентной связью и необязательно через линкер, с конъюгируемым остатком, как описано в настоящем описании.

В других вариантах осуществления вторым пептидом является XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1096), где X выбран из одной из 20 обычных аминокислот, например, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты или глицина. В некоторых вариантах осуществления X означает аминокислоту, например Cys, которая дополнительно содержит гидрофильный остаток, ковалентно связанный с боковой цепью данной аминокислоты. Такие C-концевые удлинения повышают растворимость, а также могут повышать GIP или GLP-1 активность. В некоторых вариантах осуществления, в которых глюкагоновый пептид дополнительно содержит удлинение карбоксильного конца, C-концевая аминокислота удлинения заканчивается амидной группой или сложноэфирной группой, а не группой карбоновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления, например, в глюкагоновых пептидах, которые содержат C-концевое удлинение, треонин в положении 29 нативного глюкагонового пептида заменяют глицином. Например, глюкагоновый пептид, имеющий замену треонина глицином в положении 29 и содержащий C-концевое удлинение GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1095), в четыре раза более эффективен в отношении рецептора GLP-1, чем нативный глюкагон, модифицированный, чтобы он содержал такое же C-концевое удлинение. Такая замена T29G может быть использована вместе с другими модификациями, описанными в настоящем описании, для усиления аффинности глюкагоновых пептидов в отношении рецептора GLP-1. Например, замену T29G можно комбинировать с аминокислотными заменами S16E и N20K, необязательно с лактамовым мостиком между аминокислотами 16 и 20, и необязательно с добавлением цепи ПЭГ, как описано в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления добавляют аминокислоту к C-концу, и дополнительная аминокислота выбрана из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и глицина.

Модификации, которые повышают растворимость

В другом варианте осуществления растворимость любого из глюкагоновых пептидов может быть повышена с использованием замен и/или добавлений аминокислот, которые вводят заряженную аминокислоту в C-концевую часть пептида, предпочтительно в положении, являющемся C-концевым по отношению к положению 27 последовательности SEQ ID NO:1001. Необязательно можно вводить одну, две или три заряженных аминокислоты в C-концевую часть, предпочтительно с C-концевой стороны от положения 27. В некоторых вариантах осуществления нативную аминокислоту (аминокислоты) в положениях 28 и/или 29 заменяют одной или двумя заряженными аминокислотами, и/или в дополнительном варианте осуществления одну-три заряженные аминокислоты также добавляют к C-концу пептида. В примерах вариантов осуществления одна, две или все заряженные аминокислоты являются отрицательно заряженными. В некоторых вариантах осуществления отрицательно заряженной (кислой аминокислотой) является аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота.

Дополнительные модификации, например консервативные замены, могут быть осуществлены в глюкагоновом пептиде, которые все же позволяют ему сохранить GIP активность (и необязательно GLP-1 активность и/или глюкагоновую активность).

Другие модификации

Любые модификации, описанные выше со ссылкой на родственный глюкагону пептид класса 2, которые повышают или понижают активность GIP, которые повышают или понижают активность рецептора глюкагона и которые повышают активность рецептора GLP-1, могут быть использованы по отдельности или в комбинации. Любую из модификаций, описанных выше со ссылкой на родственный глюкагону пептид класса 2, также можно сочетать с другими модификациями, которые придают другие требуемые свойства, такие как повышенная растворимость и/или стабильность, и/или продолжительность действия, которые описаны в настоящем описании по отношению к родственным глюкагону пептидам класса 2. Альтернативно, любую из модификаций, описанных выше со ссылкой на родственные глюкагону пептиды класса 2, можно сочетать с другими модификациями, описанными в настоящем описании со ссылкой на родственные глюкагону пептиды класса 2, которые существенно не влияют на растворимость или стабильность, или активность. Иллюстративные модификации включают, но без ограничения:

(A) повышение растворимости, например, путем введения одной, двух, трех или более заряженных аминокислот в C-концевую часть нативного глюкагона, предпочтительно в положение с C-концевой стороны от положения 27. Такая заряженная аминокислота может быть введена заменой нативной аминокислоты заряженной аминокислотой, например, в положениях 28 или 29, или альтернативно, добавлением заряженной аминокислоты, например, после положения 27, 28 или 29. В примерах вариантов осуществления одна, две, три или все заряженные аминокислоты являются отрицательно заряженными. В других вариантах осуществления одна, две, три или все заряженные аминокислоты являются положительно заряженными. Такие модификации повышают растворимость, например, обеспечивают по меньшей мере 2-кратную, 5-кратную, 10-кратную, 15-кратную, 25-кратную, 30-кратную или более высокую растворимость по сравнению с нативным глюкагоном при данном значении pH, примерно от 5,5 до 8, например при pH 7, в случае измерения через 24 часа при 25°C;

(B) повышение растворимости и продолжительности действия или времени полужизни в кровообращении добавлением гидрофильного остатка, такого как цепь полиэтиленгликоля, как описано в настоящем описании, например в положении 16, 17, 20, 21, 24 или 29, в C-концевом удлинении или к C-концевой аминокислоте пептида;

(C) повышение растворимости и/или продолжительности действия или времени полужизни в кровообращении и/или задержку начала действия с использованием ацилирования или алкилирования глюкагонового пептида, как описано в настоящем описании;

(D) увеличение продолжительности действия или времени полужизни в кровообращении благодаря приданию устойчивости к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP IV) путем модификации аминокислоты в положении 1 или 2, как описано в настоящем описании;

(E) повышение стабильности путем модификации Asp в положении 15, например, делецией или заменой глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой, цистеиновой кислотой или гомоцистеиновой кислотой. Такие модификации могут уменьшать разложение или расщепление при pH в диапазоне от 5,5 до 8, например, сохраняя по меньшей мере 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, до 100% исходного пептида через 24 часа при 25°C. Такие модификации уменьшают расщепление пептидной связи между Asp15-Ser16;

(F) повышение стабильности путем модификации Ser в положении 16, например заменой аминокислотами Thr или AIB. Такие модификации также уменьшают расщепление пептидной связи между Asp15-Ser16;

(G) повышение стабильности путем модификации метионина в положении 27, например, замены лейцином или норлейцином. Такие модификации могут уменьшать окислительное разложение. Стабильность также может быть повышена путем модификации Gln в положении 20 или 24, например, заменой аминокислотой Ser, Thr, Ala или AIB. Такие модификации могут уменьшать разложение, которое происходит в результате дезамидирования Gln. Стабильность может быть повышена модификацией Asp в положении 21, например, заменой аминокислотой Glu. Такие модификации могут уменьшать разложение, которое происходит в результате дегидратации Asp с образованием промежуточного циклического сукцинимида с последующей изомеризацией до изоаспартата;

(H) неконсервативные или консервативные замены, добавления или делеции, которые существенно не влияют на активность, например, консервативные замены в одном или нескольких положениях 2, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29; замену аминокислоты в одном или нескольких таких положениях аминокислотой Ala; делецию аминокислот в одном или нескольких положениях 27, 28 или 29; или делецию аминокислоты 29 необязательно в комбинации с C-концевым амидом или сложным эфиром вместо C-концевой группы карбоновой кислоты; замену Lys в положении 12 аминокислотой Arg; замену Tyr в положении 10 аминокислотой Val или Phe.

Сохранение активности после пегилирования обеспечивают путем добавления GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1095) к C-концу.

Некоторые положения нативного глюкагонового пептида могут быть модифицированы при сохранении по меньшей мере некоторых из активностей исходного пептида. Соответственно, авторы настоящего изобретения ожидали, что одна или несколько аминокислот, находящихся в положениях 2, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29, могут быть заменены другой аминокислотой, отличной от той, которая присутствует в нативном глюкагоновом пептиде, и при этом все еще может быть сохранена активность в отношении рецептора глюкагона.

В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 18 заменяют аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ala, Ser или Thr. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 20 заменяют Ser, Thr, Lys, Arg, Orn, цитруллином или AIB. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 21 заменяют Glu, гомоглутаминовой кислотой или гомоцистеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид содержит 1-10 модификаций аминокислот, выбранных из положений 16, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 27, 28 и 29. В примерах вариантов осуществления модификации представляют собой одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из Gln17, Ala18, Glu21, Ile23, Ala24, Val27 и Gly29. В некоторых вариантах осуществления 1-2 аминокислоты, выбранные из аминокислот в положениях 17-26, отличаются от аминокислот в исходном пептиде. В других вариантах осуществления 1-2 аминокислоты, выбранные из аминокислот в положениях 17-22, отличаются от аминокислот в исходном пептиде. В следующих вариантах осуществления модификации представляют собой Gln17, Ala18, Glu21, Ile23 и Ala24.

В некоторых вариантах осуществления одну или несколько аминокислот добавляют к карбоксильному концу глюкагонового пептида. Аминокислоту обычно выбирают из 20 обычных аминокислот, и в некоторых вариантах осуществления аминокислота имеет амидную группу вместо группы карбоновой кислоты нативной аминокислоты. В примерах вариантов осуществления добавляемая аминокислота выбрана из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и глицина.

Другие модификации, которые не нарушают активность, включают W10 или R20.

В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 2, описанные в настоящем описании, модифицируют посредством укорочения C-конца на один или два аминокислотных остатка, сохраняя при этом сходную активность и эффективность в отношении рецепторов глюкагона, GLP-1 и/или GIP. В связи с этим, аминокислота в положении 29 и/или 28 может быть делетирована.

Примеры вариантов осуществления

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения аналог глюкагона (SEQ ID NO:1001), обладающий активностью агониста GIP, содержит последовательность SEQ ID NO:1001 с (a) модификацией аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP, (b) модификацией, которая стабилизирует альфа-спиральную структуру C-концевой части (аминокислоты 12-29) аналога, и (c) необязательно 1-10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) дополнительными модификациями аминокислот. В некоторых вариантах осуществления аналог проявляет по меньшей мере примерно 1% активности нативного GIP в отношении рецептора GIP или любой другой уровень активности в отношении рецептора GIP, описанный в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления модификация, которая стабилизирует альфа-спиральную структуру, представляет собой модификацию, которая создает или вводит внутримолекулярный мостик, включая, например, ковалентный внутримолекулярный мостик, такой как любой из мостиков, описанных в настоящем описании. Ковалентным внутримолекулярным мостиком в некоторых вариантах осуществления является лактамовый мостик. Лактамовый мостик аналога согласно таким вариантам осуществления может представлять собой лактамовый мостик, который описан в настоящем описании. См., например, описание лактамовых мостиков в разделе «Стабилизация альфа-спиральной структуры». Например, лактамовым мостиком может быть мостик, который расположен между боковыми цепями аминокислот в положениях i и i+4 или между боковыми цепями аминокислот в положениях j и j+3, где i равно 12, 13, 16, 17, 20 или 24, и где j равно 17. В некоторых вариантах осуществления лактамовый мостик может быть расположен между аминокислотами в положениях 16 и 20, где одна из аминокислот в положениях 16 и 20 заменена Glu, а другая аминокислота в положениях 16 и 20 заменена Lys.

В альтернативных вариантах осуществления модификация, которая стабилизирует альфа-спиральную структуру, представляет собой введение одной, двух, трех или четырех α,α-дизамещенных аминокислот в положениях 16, 20, 21 и 24 аналога. В некоторых вариантах осуществления α,α-дизамещенной аминокислотой является AIB. В некоторых аспектах α,α-дизамещенная аминокислота (например, AIB) находится в положении 20, и аминокислота в положении 16 заменена положительно заряженной аминокислотой, такой как, например, аминокислота формулы IV, которая описана в настоящем описании. Аминокислота формулы IV может представлять собой гомо-Lys, Lys, Orn или 2,4-диаминомасляную кислоту (Dab).

В конкретных аспектах изобретения модификация аминокислоты в положении 1 представляет собой замену His аминокислотой, не имеющей имидазольной боковой цепи, например, крупной ароматической аминокислотой (например, Tyr).

В некоторых аспектах аналог глюкагона содержит модификации аминокислот в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29. Например, Met в положении 27 может быть заменен крупной алифатической аминокислотой, необязательно Leu, Asn в положении 28 может быть заменен малой алифатической аминокислотой, необязательно Ala, Thr в положении 29 может быть заменен малой алифатической аминокислотой, необязательно Gly, или возможна комбинация двух или трех вышеуказанных модификаций. В конкретных вариантах осуществления аналог глюкагона содержит Leu в положении 27, Ala в положении 28, и Gly или Thr в положении 29.

В некоторых вариантах осуществления изобретения аналог глюкагона содержит удлинение из 1-21 аминокислоты, находящихся с C-концевой стороны от аминокислоты в положении 29. Удлинение может содержать, например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1095 или 1096. Дополнительно или альтернативно, аналог глюкагона может содержать удлинение, в котором 1-6 аминокислот удлинения являются положительно заряженными аминокислотами. Положительно заряженными аминокислотами могут быть аминокислоты формулы IV, включая, но без ограничения, Lys, гомо-Lys, Orn и Dab.

Аналог глюкагона в некоторых вариантах осуществления ацилирован или алкилирован, как описано в настоящем описании. Например, ацильная или алкильная группа может быть связана с аналогом глюкагона, спейсером или без спейсера, в положении 10 или 40 аналога, как дополнительно описано в настоящем описании. Аналог может быть, дополнительно или альтернативно, модифицирован, чтобы он содержал гидрофильный остаток, как дополнительно описано в настоящем описании. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления аналог содержит любую одну или комбинацию следующих модификаций:

(a) Ser в положении 2 заменен D-Ser, Ala, D-Ala, Gly, N-метил-Ser, AIB, Val или α-амино-N-масляной кислотой;

(b) Tyr в положении 10 заменен Trp, Lys, Orn, Glu, Phe или Val:

(c) связывание ацильной группы с Lys в положении 10;

(d) Lys в положении 12 заменен Arg или Ile;

(e) Ser в положении 16 заменен Glu, Gln, гомоглутаминовой кислотой, гомоцистеиновой кислотой, Thr, Gly или AIB;

(f) Arg в положении 17 заменен Gln;

(g) Arg в положении 18 заменен Ala, Ser, Thr или Gly;

(h) Gln в положении 20 заменен Ser, Thr, Ala, Lys, цитруллином, Arg, Orn или AIB;

(i) Asp в положении 21 заменен Glu, гомоглутаминовой кислотой, гомоцистеиновой кислотой;

(j) Val в положении 23 заменен Ile;

(k) Gln в положении 24 заменен Asn, Ser, Thr, Ala или AIB;

(l) и консервативную замену в любом из положений 2, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 8, 19 20, 21, 24, 27, 28 и 29.

В примерах вариантов осуществления аналог глюкагона (SEQ ID NO:1001), обладающий активностью агониста GIP, содержит следующие модификации:

(a) модификацию аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP,

(b) лактамовый мостик между боковыми цепями аминокислот в положениях i и i+4 или между боковыми цепями аминокислот в положениях j и j+3, где i равно 12, 13, 16, 17, 20 или 24, и где j равно 17,

(c) модификации аминокислоты в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29, например, модификации аминокислот в положении 27 и/или 28, и

(d) 1-9 или 1-6 дополнительных модификаций аминокислот, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 дополнительных модификаций аминокислот,

и EC₅₀ аналога для активации рецептора GIP составляет примерно 10 нМ или менее.

Лактамовый мостик аналога согласно указанным вариантам осуществления может представлять собой лактамовый мостик, который описан в настоящем описании. См., например, описание лактамовых мостиков в разделе «Стабилизация альфа-спиральной структуры». Например, лактамовый мостик может быть между аминокислотами в положениях 16 и 20, где одна из аминокислот в положениях 16 и 20 заменена Glu, а другая аминокислота в положениях 16 и 20 заменена Lys.

Согласно указанным вариантам осуществления аналог может содержать, например, любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1005-1094.

В других примерах вариантов осуществления аналог глюкагона (SEQ ID NO:1001), обладающий активностью агониста GIP, содержит следующие модификации:

(a) модификацию аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP,

(b) одна, две, три или все аминокислоты в положениях 16, 20, 21 и 24 аналога заменены α,α-дизамещенной аминокислотой,

(c) модификации аминокислот в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29, например, модификации аминокислот в положении 27 и/или 28, и

(d) 1-9 или 1-6 дополнительных модификаций аминокислот, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 дополнительных модификаций аминокислот, и EC₅₀ аналога для активации рецептора GIP составляет примерно 10 нМ или менее.

α,α-Дизамещенная аминокислота аналога согласно указанным вариантам осуществления может представлять собой любую α,α-дизамещенную аминокислоту, включая, но без ограничения, аминоизомасляную кислоту (AIB), аминокислоту, дизамещенную одинаковыми или различными группами, выбранными из метила, этила, пропила и н-бутила, или циклооктаном или циклогептаном (например, 1-аминоциклооктан-1-карбоновую кислоту). В некоторых вариантах осуществления α,α-дизамещенной аминокислотой является AIB. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 20 заменена α,α-дизамещенной аминокислотой, например, AIB.

Согласно указанным вариантам осуществления аналог может содержать, например, любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1099-1141, 1144-1164, 1166-1169 и 1173-1178.

В следующих примерах вариантов осуществления аналог глюкагона (SEQ ID NO:1001), обладающий активностью агониста GIP, содержит следующие модификации:

(a) модификацию аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP,

(b) замену аминокислоты Ser в положении 16 аминокислотой формулы IV:

[Формула IV]

где n равно 1-16 или 1-10, или 1-7, или 1-6, или 2-6, каждый из R₁ и R₂ независимо выбран из группы, состоящей из H, C₁-C₁₈алкила, (C₁-C₁₈алкил)OH, (C₁-C₁₈алкил)NH₂, (C₁-C₁₈алкил)SH, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆)циклоалкила, (C₀-C₄алкил)(C₂-C₅гетероцикла), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇ и (C₁-C₄алкил)(C₃-C₉гетероарила), где R₇ означает H или OH, и боковая цепь аминокислоты формулы IV содержит свободную аминогруппу,

(c) замену аминокислоты Gln в положении 20 альфа,альфа-дизамещенной аминокислотой,

(d) модификации аминокислот в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29, например, модификации аминокислот в положении 27 и/или 28, и

(e) 1-9 или 1-6 дополнительных модификаций аминокислот, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 дополнительных модификаций аминокислот,

и EC₅₀ аналога для активации рецептора GIP составляет примерно 10 нМ или менее.

Аминокислота формулы IV аналога согласно указанным вариантам осуществления может представлять собой любую аминокислоту, такую как, например, аминокислота формулы IV, где n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16. В некоторых вариантах осуществления n равно 2, 3, 4 или 5, и в данном случае аминокислотой является Dab, Orn, Lys или гомо-Lys, соответственно.

Альфа,альфа-дизамещенной аминокислотой аналога согласно указанным вариантам осуществления может быть любая альфа,альфа-дизамещенная аминокислота, включая, но без ограничения, аминоизомасляную кислоту (AIB), аминокислоту, дизамещенную одинаковыми или различными группами, выбранными из метила, этила, пропила и н-бутила, или циклооктаном или циклогептаном (например, 1-аминоциклооктан-1-карбоновую кислоту). В некоторых вариантах осуществления альфа,альфа-дизамещенной аминокислотой является AIB.

Согласно указанным вариантам осуществления аналог может содержать, например, любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1099-1165.

В следующих примерах вариантов осуществления аналог глюкагона (SEQ ID NO:1001), обладающий активностью агониста GIP содержит:

(a) модификацию аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP, и

(b) удлинение, имеющее примерно от 1 до примерно 21 аминокислоты, с C-концевой стороны от аминокислоты в положении 29, где по меньшей мере одна из аминокислот удлинения ацилирована или алкилирована,

где EC₅₀ аналога для активации рецептора GIP составляет примерно 10 нМ или менее.

В некоторых вариантах осуществления ацилированная или алкилированная аминокислота представляет собой аминокислоту формулы I, II или III. В более конкретных вариантах осуществления аминокислотой формулы I является Dab, Orn, Lys или гомоLys. Также в некоторых вариантах осуществления удлинение, имеющее примерно от 1 до примерно 21 аминокислоты, содержит аминокислотную последовательность GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1095) или XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1096), где X означает любую аминокислоту, или GPSSGAPPPK (SEQ ID NO:1170), или XGPSSGAPPPK (SEQ ID NO:1171), или XGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO:1172), где X означает Gly или малую алифатическую или неполярную, или слабо полярную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления примерно от 1 до примерно 21 аминокислоты могут содержать последовательности, включающие одну или несколько консервативных замен, по сравнению с последовательностями SEQ ID NO:1095, 1096, 1170, 1171 или 1172. В некоторых вариантах осуществления ацилированная или алкилированная аминокислота находится в положении 37, 38, 39, 40, 41, 42 или 43 удлиненного на C-конце аналога. В некоторых вариантах осуществления ацилированная или алкилированная аминокислота находится в положении 40 удлиненного на C-конце аналога.

В некоторых вариантах осуществления аналог, обладающий активностью агониста GIP, дополнительно содержит модификации аминокислот в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29, например, модификации аминокислот в положении 27 и/или 28.

В любом из указанных выше примерах вариантов осуществления модификация аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP, может представлять собой замену His аминокислотой, не имеющей имидазольной боковой цепи. Модификация аминокислоты в положении 1, например, может представлять собой замену His крупной ароматической аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления крупной ароматической аминокислотой является любая из аминокислот, описанных в настоящем описании, включая, например, Tyr.

Также, в связи с указанными выше примерами вариантов осуществления, модификации аминокислот в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29 могут представлять собой любую из модификаций в таких положениях, описанных в настоящем описании. Например, Met в положении 27 может быть заменен крупной алифатической аминокислотой, необязательно Leu, Asn в положении 28 может быть заменен малой алифатической аминокислотой, необязательно Ala, и/или Thr в положении 29 может быть заменен малой алифатической аминокислотой, необязательно Gly. Альтернативно, аналог может содержать такие модификации аминокислот в положении 27 и/или 28.

Аналог, согласно указанным выше примерам вариантов осуществления, кроме того, может дополнительно содержать 1-9 или 1-6 дополнительных модификаций аминокислот, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 дополнительных модификаций аминокислот, таких как, например, любая из модификаций, описанных в настоящем описании, которая повышает или понижает активность в отношении любого из рецепторов GIP, GLP-1 и глюкагона, повышает растворимость, увеличивает продолжительность действия или время полужизни в кровообращении, задерживает начало действия или повышает стабильность. Аналог, кроме того, может содержать, например, модификацию аминокислоты в положении 12, необязательно, замену аминокислотой Ile, и/или модификации аминокислот в положениях 17 и 18, необязательно замены аминокислотой Q в положении 17 и аминокислотой A в положении 18, и/или добавление к C-концу последовательности GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1095) или XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1096), или последовательностей, содержащих одну или несколько консервативных замен по сравнению с последовательностью SEQ ID NO:1095 или 1096. Аналог может содержать одну или несколько из следующих модификаций:

(i) Ser в положении 2, замененный D-Ser, Ala, D-Ala, Gly, N-метил-Ser, AIB, Val или α-амино-N-масляной кислотой;

(ii) Tyr в положении 10, замененный Trp, Lys, Orn, Glu, Phe или Val;

(iii) связывание ацильной группы с Lys в положении 10;

(iv) Lys в положении 12, замененный Arg;

(v) Ser в положении 16, замененный Glu, Gln, гомоглутаминовой кислотой, гомоцистеиновой кислотой, Thr, Gly или AIB;

(vi) Arg в положении 17, замененный Gln;

(vii) Arg в положении 18, замененный Ala, Ser, Thr или Gly;

(viii) Gln в положении 20, замененный Ala, Ser, Thr, Lys, цитруллином, Arg, Orn или AIB;

(ix) Asp в положении 21, замененный Glu, гомоглутаминовой кислотой, гомоцистеиновой кислотой;

(x) Val в положении 23, замененный Ile;

(xi) Gln в положении 24, замененный Asn, Ala, Ser, Thr или AIB; и

(xii) консервативную замену в любом из положений 2, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 и 29.

Аналог в некоторых вариантах осуществления содержит комбинацию модификаций (i)-(xii). Альтернативно или дополнительно, аналог может содержать модификацию аминокислоты в положении 3 (например, замену аминокислоты Gln на Glu), где аналог обладает менее чем 1% активностью глюкагона в отношении рецептора глюкагона. Альтернативно или дополнительно, аналог может содержать модификацию аминокислоты в положении 7 (например, замену аминокислоты Thr аминокислотой, не имеющей гидроксильной группы, например, Abu или Ile), где аналог обладает менее чем примерно 10% активностью GLP-1 в отношении рецептора GLP-1.

Что касается примеров вариантов осуществления, то аналог может быть ковалентно связан с гидрофильным остатком. В некоторых вариантах осуществления аналог ковалентно связан с гидрофильным остатком в любом положении аминокислот 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40 или на C-конце. В некоторых вариантах осуществления аналог содержит C-концевое удлинение (например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1095) и добавление аминокислоты, содержащей гидрофильный остаток, чтобы гидрофильный остаток был ковалентно связан с аналогом в положении 40.

В некоторых вариантах осуществления гидрофильный остаток ковалентно связан с Lys, Cys, Orn, гомоцистеином или ацетилфенилаланином аналога. Lys, Cys, Orn, гомоцистеин или ацетилфенилаланин могут представлять собой аминокислоту, которая является нативной для последовательности глюкагона (SEQ ID NO:1001) или может представлять собой аминокислоту, которой заменяют нативную аминокислоту в SEQ ID NO:1001. В некоторых вариантах осуществления, в которых гидрофильный остаток связан с Cys, связь с гидрофильным остатком может содержать структуру

или .

Что касается аналогов, содержащих гидрофильный остаток, то гидрофильным остатком может быть любой из остатков, описанных в настоящем описании. См., например, описание в разделе «Связывание гидрофильных остатков». В некоторых вариантах осуществления гидрофильным остатком является полиэтиленгликоль (ПЭГ). ПЭГ в некоторых вариантах осуществления имеет молекулярную массу примерно от 1000 дальтон до примерно 40000 дальтон, например примерно от 20000 дальтон до примерно 40000 дальтон.

Что касается примеров вариантов осуществления, то аналог может содержать модифицированную аминокислоту, в которой боковая цепь ковалентно связана с ацильной или алкильной группой (например, ацильной или алкильной группой, которая не является нативной для встречающейся в природе аминокислоты). Ацилированный или алкилированный аналог может соответствовать ацилированным или алкилированным пептидам, описанным в разделе «Ацилирование и алкилирование». В некоторых вариантах осуществления ацильная группа представляет собой C4-C30 жирную ацильную группу, такую как, например, C10 жирная ацильная или алкильная группа, C12 жирная ацильная или алкильная группа, C14 жирная ацильная или алкил группа, C16 жирная ацильная или алкильная группа, C18 жирная ацильная или алкильная группа, C20 ацильная или алкильная группа или C22ацильная или алкильная группа. Ацильная или алкильная группа может быть ковалентно связана с любой аминокислотой аналога, включая, но без ограничения, аминокислоту в положении 10 или 40 или C-концевую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления аналог содержит C-концевое удлинение (например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1095) и добавление аминокислоты, содержащей ацильную или алкильную группу, так что ацильная или алкильная группа ковалентно связана с аналогом в положении 40. В некоторых вариантах осуществления ацильная или алкильная группа ковалентно связана с боковой цепью аминокислоты формулы I, II или III, например, остатка Lys. Ацильная или алкильная группа может быть ковалентно связана с аминокислотой, которая является нативной для последовательности глюкагона (SEQ ID NO:1001) или может быть связана с аминокислотой, которая добавлена к последовательности SEQ ID NO:1001 или к последовательности SEQ ID NO:1001, за которой следует последовательность SEQ ID NO:1095 (на N- или C-конце), или может быть связана с аминокислотой, заменяющей нативную аминокислоту, например Tyr в положении 10 последовательности SEQ ID NO:1001.

В указанных выше примерах вариантов осуществления, в которых аналог содержит ацильную или алкильную группу, аналог может быть связан с ацильной или алкильной группой через спейсер, как описано в настоящем описании. Спейсер может иметь длину, например, равную длине 3-10 атомов, и может представлять собой, например, аминокислоту (например, 6-аминокапроновую кислоту, любую аминокислоту, описанную в настоящем описании), дипептид (например, Ala-Ala, βAla-βAla, Leu-Leu, Pro-Pro, γGlu-γGlu), трипептид или гидрофильный или гидрофобный бифункциональный спейсер. В некоторых аспектах общая длина спейсера и ацильной или алкильной группы равна длине примерно 14-28 атомов. В некоторых вариантах осуществления аминокислотным спейсером не является γ-Glu. В некоторых вариантах осуществления дипептидным спейсером не является γ-Glu-γ-Glu.

В следующих примерах вариантов осуществления аналог глюкагона, обладающий активностью агониста GIP, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую любой из последовательностей SEQ ID NO:1227, 1228, 1229 или 1230, которая дополнительно содержит следующие модификации:

(a) необязательно модификацию аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP,

(b) удлинение, состоящее примерно из 1-21 аминокислоты, расположенных с C-концевой стороны от аминокислоты в положении 29, где по меньшей мере одна из аминокислот удлинения ацилирована или алкилирована, и

(d) до 6 дополнительных модификаций аминокислот,

где EC₅₀ аналога для активации рецептора GIP составляет примерно 10 нМ или менее.

В некоторых аспектах ацилированная или алкилированная аминокислота представляет собой аминокислоту формулы I, II или III. В более конкретных вариантах осуществления аминокислотой формулы I является Dab, Orn, Lys или гомоLys. Также в некоторых вариантах осуществления примерно от 1 до примерно 21 аминокислоты составляют аминокислотную последовательность GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1095) или XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1096), где X означает любую аминокислоту, или GPSSGAPPPK (SEQ ID NO:1170), или XGPSSGAPPPK (SEQ ID NO:1171), или XGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO:1172), где X означает Gly или малую алифатическую или неполярную или слабо полярную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления примерно от 1 до примерно 21 аминокислоты могут составлять последовательности, содержащие одну или несколько консервативных замен, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO:1095, 1096, 1170, 1171 или 1172. В некоторых вариантах осуществления ацилированная или алкилированная аминокислота находится в положении 37, 38, 39, 40, 41, 42 или 43 удлиненного на C-конце аналога. В некоторых вариантах осуществления ацилированная или алкилированная аминокислота находится в положении 40 удлиненного на C-конце аналога.

В любых указанных выше примерах вариантов осуществления аминокислота в положении 1, которая придает активность агониста GIP, может представлять собой аминокислоту, не имеющую имидазольной боковой цепи. Аминокислотой в положении 1 может быть, например, крупная ароматическая аминокислота. В некоторых вариантах осуществления крупной ароматической аминокислотой является любая аминокислота, описанная в настоящем описании, включая, например, Tyr.

Аналог согласно указанным выше примерам вариантов осуществления, кроме того, может содержать 1-6 дополнительных модификаций аминокислот, таких как, например, любая из модификаций, описанных в настоящем описании, которая повышает или понижает активность в отношении рецепторов GIP, GLP-1 и глюкагона, повышает растворимость, увеличивает продолжительность действия или время полужизни в кровообращении, задерживает начало действия или повышает стабильность.

В некоторых аспектах аналоги глюкагона, описанные в приведенном выше примере варианта осуществления, содержат дополнительные модификации аминокислот в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29. Модификации в таких положениях могут представлять собой любые модификации, описанные в настоящем описании для указанных положений. Например, что касается SEQ ID NO:1227, 1228, 1229 или 1230, то аминокислота в положении 27 может быть заменена крупной алифатической аминокислотой (например, Leu, Ile или норлейцином) или Met, аминокислота в положении 28 может быть заменена другой малой алифатической аминокислотой (например, Gly или Ala) или Asn, и/или аминокислота в положении 29 может быть заменена другой малой алифатической аминокислотой (например, Ala или Gly) или Thr. Альтернативно, аналог может содержать такие модификации аминокислот в положении 27 и/или 28.

Аналог, кроме того, может содержать одну или несколько из следующих дополнительных модификаций:

(i) аминокислотой в положении 2 является любая аминокислота, выбранная из D-Ser, Ala, D-Ala, Gly, N-метил-Ser, AIB, Val или α-амино-N-масляной кислоты;

(ii) аминокислотой в положении 10 является Tyr, Trp, Lys, Orn, Glu, Phe или Val;

(iii) связывание ацильной группы с Lys в положении 10;

(iv) аминокислотой в положении 12 является Ile, Lys или Arg;

(v) аминокислотой в положении 16 является любая из Ser, Glu, Gln, гомоглутаминовой кислоты, гомоцистеиновой кислоты, Thr, Gly или AIB;

(vi) аминокислотой в положении 17 является Gln или Arg;

(vii) аминокислотой в положении 18 является любая из Ala, Arg, Ser, Thr или Gly;

(viii) аминокислотой в положении 20 является любая из Ala, Ser, Thr, Lys, цитруллина, Arg, Orn или AIB, или другая альфа,альфа-дизамещенная аминокислота;

(ix) аминокислотой в положении 21 является любая из Glu, Asp, гомоглутаминовой кислоты, гомоцистеиновой кислоты;

(x) аминокислотой в положении 23 является Val или Ile;

(xi) аминокислотой в положении 24 является любая из Gln, Asn, Ala, Ser, Thr или AIB; и

(xii) одна или несколько консервативных замен в любом из положений 2, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 и 29.

Аналог в некоторых вариантах осуществления содержит комбинацию модификаций (i)-(xii). Альтернативно или дополнительно, аналог может содержать модификацию аминокислоты в положении 3 (например, аминокислотную замену Gln на Glu), где аналог обладает менее чем 1% активностью глюкагона в отношении рецептора глюкагона. Альтернативно или дополнительно, аналог может содержать модификацию аминокислоты в положении 7 (например, аминокислотную замену Thr аминокислотой, не имеющей гидроксильной группы, например, Abu или Ile), где аналог обладает примерно 10% активностью GLP-1 в отношении рецептора GLP-1.

Что касается примеров вариантов осуществления, то аналог может быть ковалентно связан с гидрофильным остатком. В некоторых вариантах осуществления аналог ковалентно связан с гидрофильным остатком в любом положении аминокислот 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40 или на C-конце. В некоторых вариантах осуществления аналог содержит гидрофильный остаток, ковалентно связанный с аналогом в положении 24.

В некоторых вариантах осуществления гидрофильный остаток ковалентно связан с Lys, Cys, Orn, гомоцистеином или ацетилфенилаланином аналога. Lys, Cys, Orn, гомоцистеин или ацетилфенилаланин могут представлять собой аминокислоту, которая является нативной для последовательности SEQ ID NO:1001, 1227, 1228, 1229 или 1230, или может представлять собой заменяющую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления, в которых гидрофильный остаток связан с Cys, связь может содержать структуру

или .

Что касается аналогов, содержащих гидрофильный остаток, то гидрофильным остатком может быть любой из остатков, описанных в настоящем описании. См., например, описание в разделе «Связывание гидрофильных остатков». В некоторых вариантах осуществления гидрофильным остатком является полиэтиленгликоль (ПЭГ). ПЭГ в некоторых вариантах осуществления имеет молекулярную массу примерно от 1000 дальтон до примерно 40000 дальтон, например примерно от 20000 дальтон до примерно 40000 дальтон.

Что касается примеров вариантов осуществления, то аналог может содержать модифицированную аминокислоту в С-концевом удлинении, в которой боковая цепь ковалентно связана с ацильной или алкильной группой. Ацилированный или алкилированный аналог может соответствовать ацилированным или алкилированным пептидам, описанным в разделе «Ацилирование и алкилирование». В некоторых вариантах осуществления ацильная группа представляет собой C4-C30 жирную ацильную группу, такую как, например, C10 жирная ацильная или алкильная группа, C12 жирная ацильная или алкильная группа, C14 жирная ацильная или алкильная группа, C16 жирная ацильная или алкильная группа, C18 жирная ацильная или алкильная группа, C20ацильная или алкильная группа или C22ацильная или алкильная группа. Ацильная или алкильная группа может быть ковалентно связана с любой аминокислотой аналога, включая, но без ограничения, аминокислоту в положении 10 или 40 или C-концевую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления ацильная или алкильная группа ковалентно связана с боковой цепью аминокислоты формулы I, II или III, например, остатка Lys. Ацильная или алкильная группа ковалентно связана с аминокислотой, которая является нативной для последовательности SEQ ID NO:1001, 1227, 1228, 1229 или 1230, или она может быть связана с заменяющей аминокислотой. Ацильная или алкильная группа ковалентно связана аминокислотой, которая является нативной для последовательности SEQ ID NO:1095, 1096, 1171 или 1172, или она может быть связана с заменяющей аминокислотой.

В указанных выше примерах вариантов осуществления, в которых аналог содержит ацильную или алкильную группу, аналог может быть связан с ацильной или алкильной группой через спейсер, как описано в настоящем описании. Спейсер может иметь длину, например, равную длине 3-10 атомов, и может представлять собой, например, аминокислоту (например, 6-аминокапроновую кислоту, любую аминокислоту, описанную в настоящем описании), дипептид (например, Ala-Ala, βAla-βAla, Leu-Leu, Pro-Pro, γGlu-γGlu), трипептид или гидрофильный или гидрофобный бифункциональный спейсер. В некоторых аспектах общая длина спейсера и ацильной или алкильной группы равна длине примерно 14-28 атомов. В некоторых вариантах осуществления аминокислотным спейсером не является γ-Glu. В некоторых вариантах осуществления дипептидным спейсером не является γ-Glu-γ-Glu.

В некоторых очень конкретных вариантах осуществления аналог согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1099-1141, 1144-1164, 1166, 1192-1207, 1209-1221 и 1223, или выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1167-1169, 1173-1178 и 1225.

Кроме того, конкретные примеры аналогов согласно изобретению включают, но без ограничения, любые аналоги, перечисленные в таблицах 1-3.

В следующих примерах вариантов осуществления аналог глюкагона, обладающий активностью агониста GIP, содержит ацильную или алкильную группу (например, ацильную или алкильную группу, которая не является нативной по отношению к встречающейся в природе аминокислоте), где ацильная или алкильная группа связана со спейсером, и где (i) спейсер связан с боковой цепью аминокислоты в положении 10 аналога; или (ii) аналог содержит удлинение из 1-21 аминокислоты, расположенных с C-концевой стороны от аминокислоты в положении 29, и спейсер связан с боковой цепью аминокислоты, соответствующей одному из положений 37-43 относительно последовательности SEQ ID NO:1001, где EC₅₀ аналога для активации рецептора GIP составляет примерно 10 нМ или менее.

В таких вариантах осуществления аналог может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1001 с (i) модификацией аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP, (ii) модификациями аминокислот в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29, (iii) имеющую по меньшей мере один из признаков:

(A) аналог содержит лактамовый мостик между боковыми цепями аминокислот в положениях i и i+4 или между боковыми цепями аминокислот в положениях j и j+3, где i равно 12, 13, 16, 17, 20 или 24, и где j равно 17;

(B) одна, две, три или все аминокислоты в положениях 16, 20, 21 и 24 аналога заменены α,α-дизамещенной аминокислотой; или

(C) аналог содержит (i) замену аминокислоты Ser в положении 16 аминокислотой формулы IV:

ФормулаIV

где n равно 1-7, где каждый из R1 и R2 независимо выбран из группы, состоящей из H, C₁-C₁₈алкила, (C₁-C₁₈алкил)OH, (C₁-C₁₈алкил)NH₂, (C₁-C₁₈алкил)SH, (C₀-C₄алкил)(C₃-C₆)циклоалкила, (C₀-C₄алкил)(C₂-C₅гетероцикла), (C₀-C₄алкил)(C₆-C₁₀арил)R₇ и (C₁-C₄алкил)(C₃-C₉гетероарила), где R₇ означает H или OH, и боковая цепь аминокислоты формулы IV содержит свободную аминогруппу; и (ii) замену аминокислоты Gln в положении 20 альфа,альфа-дизамещенной аминокислотой;

и (iv) до 6 дополнительных модификаций аминокислот.

Альфа,альфа-дизамещенной аминокислотой аналога согласно указанным вариантам осуществления может быть любая альфа,альфа-дизамещенная аминокислота, включая, но без ограничения, аминоизомасляную кислоту (AIB), аминокислоту, дизамещенную одинаковыми или различными группами, выбранными из метила, этила, пропила и н-бутила, или циклооктаном или циклогептаном (например, 1-аминоциклооктан-1-карбоновую кислоту). В некоторых вариантах осуществления альфа,альфа-дизамещенной аминокислотой является AIB.

Аминокислота формулы IV аналога согласно указанным вариантам осуществления может быть любой аминокислотой, такой как, например, аминокислота формулы IV, где n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16. В некоторых вариантах осуществления n равно 2, 3, 4 или 5, и в данном случае аминокислота представляет собой Dab, Orn, Lys или гомоLys, соответственно.

В любых указанных выше примерах вариантов осуществления модификация аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP, может представлять собой замену His аминокислотой, не имеющей имидазольной боковой цепи. Модификация аминокислоты в положении 1 может представлять собой, например, замену His крупной ароматической аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления крупной ароматической аминокислотой является любая из аминокислот, описанных в настоящем описании, включая, например, Tyr.

Также, что касается указанных выше примеров вариантов осуществления, то модификации аминокислот в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29 могут быть любыми модификациями в таких положениях, описанными в настоящем описании. Например, Met в положении 27 может быть заменен крупной алифатической аминокислотой, необязательно Leu, Asn в положении 28 может быть заменен малой алифатической аминокислотой, необязательно Ala, и/или Thr в положении 29 может быть заменен малой алифатической аминокислотой, необязательно Gly. Альтернативно, аналог может содержать такие модификации аминокислот в положении 27 и/или 28.

Аналог согласно указанным выше примерам вариантов осуществления, кроме того, может содержать 1-9 или 1-6 дополнительных модификаций аминокислот, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 дополнительных модификаций аминокислот, таких как, например, любая из модификаций, описанных в настоящем описании, которая повышает или понижает активность по отношению к любому из рецепторов GIP, GLP-1 и глюкагона, повышает растворимость, увеличивает продолжительность действия или время полужизни в кровообращении, задерживает начало действия или повышает стабильность. Аналог может дополнительно содержать, например, модификацию аминокислоты в положении 12, необязательно, замену аминокислотой Ile, и/или модификации аминокислот в положениях 17 и 18, необязательно замену аминокислотой Q в положении 17 и аминокислотой A в положении 18, и/или добавление к C-концу последовательности GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1095) или XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1096) или последовательностей, содержащих одну или несколько консервативных замен, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO:1095 или 1096. Аналог может содержать одну или несколько из следующих модификаций:

(i) Ser в положении 2, замененный D-Ser, Ala, D-Ala, Gly, N-метил-Ser, AIB, Val или α-амино-N-масляной кислотой;

(ii) Tyr в положении 10, замененный Trp, Lys, Orn, Glu, Phe или Val;

(iii) связывание ацильной группы с Lys в положении 10;

(iv) Lys в положении 12, замененный Arg;

(v) Ser в положении 16, замененный Glu, Gln, гомоглутаминовой кислотой, гомоцистеиновой кислотой, Thr, Gly, Lys или AIB;

(vi) Arg в положении 17, замененный Gln;

(vii) Arg в положении 18, замененный Ala, Ser, Thr или Gly;

(viii) Gln в положении 20, замененный Ala, Ser, Thr, Lys, цитруллином, Arg, Orn или AIB;

(ix) Asp в положении 21, замененный Glu, гомоглутаминовой кислотой, гомоцистеиновой кислотой;

(x) Val в положении 23, замененный Ile;

(xi) Gln в положении 24, замененный Asn, Ala, Ser, Thr или AIB; и

(xii) консервативные замены в любом из положений 2, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 и 29.

Аналог в некоторых вариантах осуществления содержит комбинации модификаций (i)-(xii). Альтернативно или дополнительно, аналог может содержать модификацию аминокислоты в положении 3 (например, аминокислотную замену Gln на Glu), где аналог обладает менее чем 1% активностью глюкагона в отношении рецептора глюкагона. Альтернативно или дополнительно, аналог может содержать модификацию аминокислоты в положении 7 (например, аминокислотную замену Thr аминокислотой, не имеющей гидроксильной группы, например, Abu или Ile), делецию аминокислоты (аминокислот), расположенных с C-концевой стороны от аминокислоты в положении 27 или 28, с получением 27 или 28-аминокислотного пептида, или их комбинацию, где аналог обладает примерно 10% активностью GLP-1 в отношении рецептора GLP-1.

Что касается примеров вариантов осуществления, то аналог может быть ковалентно связан с гидрофильным остатком. В некоторых вариантах осуществления аналог ковалентно связан с гидрофильным остатком в любом положении аминокислот 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40 или на C-конце. В некоторых вариантах осуществления аналог содержит C-концевое удлинение (например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1095) и добавление аминокислоты, содержащей гидрофильный остаток, так что гидрофильный остаток ковалентно связан с аналогом в положении 40.

В некоторых вариантах осуществления гидрофильный остаток ковалентно связан с Lys, Cys, Orn, гомоцистеином или ацетилфенилаланином аналога. Lys, Cys, Orn, гомоцистеин или ацетилфенилаланин могут представлять собой аминокислоту, которая является нативной для последовательности глюкагона (SEQ ID NO:1001), или может представлять собой аминокислоту, которой заменяют нативную аминокислоту в SEQ ID NO:1001. В некоторых вариантах осуществления, в которых гидрофильный остаток связан с Cys, связь может содержать структуру:

или .

Что касается аналогов, содержащих гидрофильный остаток, то гидрофильным остатком может быть любой из остатков, описанных в настоящем описании. См., например, описание в разделе «Связывание гидрофильных остатков». В некоторых вариантах осуществления гидрофильным остатком является полиэтиленгликоль (ПЭГ). ПЭГ в некоторых вариантах осуществления имеет молекулярную массу примерно от 1000 дальтон до примерно 40000 дальтон, например примерно от 20000 дальтон до примерно 40000 дальтон.

В примерах вариантов осуществления, в которых аналог содержит ацильную или алкильную группу, которая связана с аналогом через спейсер, где спейсером может быть любой спейсер, как описано в настоящем описании. Спейсер, например, может иметь длину, равную длине 3-10 атомов, и может представлять собой, например, аминокислоту (например, 6-аминокапроновую кислоту, любую аминокислоту, описанную в настоящем описании), дипептид (например, Ala-Ala, βAla-βAla, Leu-Leu, Pro-Pro, γGlu-γGlu), трипептид или гидрофильный или гидрофобный бифункциональный спейсер. В некоторых аспектах общая длина спейсера и ацильной или алкильной группы равна длине примерно 14-28 атомов. В некоторых вариантах осуществления аминокислотным спейсером не является γ-Glu. В некоторых вариантах осуществления дипептидным спейсером не является γ-Glu-γ-Glu.

Ацильная или алкильная группа представляет собой любую ацильную или алкильную группу, как описано в настоящем описании, такую как ацильная или алкильная группа, которая не является нативной для встречающейся в природе аминокислоты. Ацильная или алкильная группа в некоторых вариантах осуществления представляет собой C4-C30 жирную ацильную группу, такую как, например, C10 жирная ацильная или алкильная группа, C12 жирная ацильная или алкильная группа, C14 жирная ацильная или алкильная группа, C16 жирная ацильная или алкильная группа, C18 жирная ацильная или алкильная группа, C20 ацильная или алкильная группа или C22 ацильная или алкильная группа, или C4-C30 алкильную группу. В конкретных вариантах осуществления ацильная группа представляет собой C12-C18 жирную ацильную группу (например, C14 или C16 жирную ацильную группу).

В некоторых вариантах осуществления удлинение примерно из 1-21 аминокислоты, расположенных с C-концевой стороны от аминокислоты в положении 29 аналога, содержит аминокислотную последовательность GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1095) или XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1096), где X означает любую аминокислоту, или GPSSGAPPPK (SEQ ID NO:1170) или XGPSSGAPPPK (SEQ ID NO:1171) или XGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO:1172), где X означает Gly или малую алифатическую или неполярную или слабо полярную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления примерно от 1 до примерно 21 аминокислоты могут составлять последовательности, содержащие одну или несколько консервативных замен по сравнению с SEQ ID NO:1095, 1096, 1170, 1171 или 1172. В некоторых вариантах осуществления ацилированная или алкилированная аминокислота находится в положении 37, 38, 39, 40, 41, 42 или 43 удлиненного на C-конце аналога. В некоторых вариантах осуществления ацилированная или алкилированная аминокислота находится в положении 40 удлиненного на C-конце аналога.

Агонистом GIP может быть пептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей, например, SEQ ID NO:1005-1094, необязательно с 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительными модификациями, которые сохраняют активность агониста GIP. В некоторых вариантах осуществления агонист GIP содержит аминокислоты любой из SEQ ID NO:1099-1262.

Родственные глюкагону пептиды класса 3

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 3, который описан в настоящем описании и в международной патентной заявке № PCT/US2009/47438 (поданной 16 июня 2009), в публикации международной патентной заявки № WO 2008/101017, опубликованной 21 августа 2008, и в предварительной патентной заявке США № 61/090412 и патентной заявке США № 61/177476, содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Некоторые из биологических последовательностей, указанных в следующем разделе (SEQ ID NO:1-656), относящиеся к родственным глюкагону пептидам класса 3, соответствуют SEQ ID NO:1-656 в международной патентной заявке № PCT/US2009/47438.

Активность

Родственным глюкагону пептидом класса 3 может быть пептид, который проявляет повышенную активность в отношении рецептора глюкагона, и в следующих вариантах осуществления проявляет повышенную биофизическую стабильность и/или растворимость в воде. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 утрачивает селективность нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона в сравнении с рецептором GLP-1 и, таким образом, представляет собой коагонист указанных двух рецепторов. Выбранные модификации аминокислот в родственном глюкагону пептиде класса 3 могут регулировать относительную активность пептида в отношении рецептора GLP-1 в сравнении с рецептором глюкагона. Таким образом, родственный глюкагону пептид класса 3 может быть коагонистом глюкагона/GLP-1, который обладает более высокой активностью в отношении рецептора глюкагона в сравнении с рецептором GLP-1, коагонистом глюкагона/GLP-1, который обладает приблизительно эквивалентной активностью по отношению к обоим рецепторам, или коагонистом глюкагона/GLP-1, который обладает более высокой активностью в отношении рецептора GLP-1 в сравнении с рецептором глюкагона. Последняя категория коагониста может быть сконструирована таким образом, чтобы он проявлял небольшую или не проявлял активности в отношении рецептора глюкагона, и при этом все еще сохранял способность активировать рецептор GLP-1 с такой же или более высокой эффективностью, чем нативный GLP-1. Любой из таких коагонистов также может содержать модификации, которые придают повышенную биофизическую стабильность и/или растворимость в воде.

Могут быть осуществлены модификации родственного глюкагону пептида класса 3, чтобы получить глюкагоновый пептид, обладающий по меньшей мере примерно от 1% (включая по меньшей мере примерно 1,5%, 2%, 5%, 7%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%) до примерно 200% или более высокой активностью в отношении рецептора GLP-1 по сравнению с нативным GLP-1 и по меньшей мере примерно от 1% (включая примерно 1,5%, 2%, 5%, 7%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%) до примерно 500% или более высокой активностью в отношении рецептора глюкагона по сравнению с нативным глюкагоном. Аминокислотная последовательность нативного глюкагона представляет собой SEQ ID NO:1, аминокислотная последовательность GLP-1 (7-36)амида представляет собой SEQ ID NO:52, и аминокислотная последовательность GLP-1(7-37)кислоты представляет собой SEQ ID NO:50. В примерах вариантов осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 может проявлять по меньшей мере 10% активность нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона и по меньшей мере 50% активность нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1, или по меньшей мере 40% активность нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона и по меньшей мере 40% активность нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1, или по меньшей мере 60% активность нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона и по меньшей мере 60% активность нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1.

Селективность родственного глюкагону пептида класса 3 в отношении рецептора глюкагона в сравнении с рецептором GLP-1 может быть описана как относительное соотношение глюкагоновой/GLP-1-активности (активность пептида в отношении рецептора глюкагона в сравнении с нативным глюкагоном, деленная на активность пептида в отношении рецептора GLP-1 в сравнении с нативным GLP-1). Например, родственный глюкагону пептид класса 3, который проявляет 60% активность нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона и 60% активность нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1 имеет отношение 1:1 глюкагоновой/GLP-1-активности. Примеры отношения глюкагоновой/GLP-1-активности включают примерно 1:1, 1,5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 или 10:1, или примерно 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2 или 1:1,5. В качестве примера отношение глюкагоновой/GLP-1-активности 10:1 указывает на 10-кратную селективность в отношении рецептора глюкагона по сравнению с рецептором GLP-1. Подобным образом, отношение GLP-1/глюкагоновой активности 10:1 указывает на 10-кратную селективность в отношении рецептора GLP-1 в сравнении с рецептором глюкагона.

В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 3 проявляют активность, составляющую примерно 10% или менее от активности нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона, например примерно 1-10%, или примерно 0,1-10% или более чем примерно 0,1%, но менее чем примерно 10%, проявляя при этом по меньшей мере 20% активность GLP-1 в отношении рецептора GLP-1. Например, примеры родственных глюкагону пептидов класса 3, описанных в настоящем описании, обладают активностью, составляющей примерно 0,5%, примерно 1% или примерно 7% от активности нативного глюкагона, проявляя при этом по меньшей мере 20% активность GLP-1 в отношении рецептора GLP-1.

Родственный глюкагону пептид класса 3 может представлять собой глюкагоновый пептид с повышенной или пониженной активностью в отношении рецептора глюкагона или рецептору GLP-1 или обоим рецепторам. Родственный глюкагону пептид класса 3 может представлять собой глюкагоновый пептид с измененной селективностью в отношении рецептора глюкагона в сравнении с рецептором GLP-1.

Таким образом, как описано в настоящем описании, предлагаются высокоэффективные, родственные глюкагону пептиды класса 3, которые также обладают повышенной растворимостью и/или стабильностью. Пример высокоэффективного родственного глюкагону пептида класса 3 проявляет активность, составляющую по меньшей мере примерно 200% от активности нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона, и необязательно растворим в концентрации по меньшей мере 1 мг/мл при pH от 6 до 8 или от 6 до 9, или от 7 до 9 (например, pH 7), и необязательно обеспечивает сохранение по меньшей мере 95% исходного пептида (например, 5% или менее исходного пептида разлагается или расщепляется) через 24 часа при 25°C. В качестве другого примера иллюстративный родственный глюкагону пептид класса 3 проявляет активность, составляющую более чем примерно 40% или более чем примерно 60% от активности по отношению к обоим рецепторам глюкагона и GLP-1 (с соотношением примерно от 1:3 до 3:1 или примерно от 1:2 до 2:1) необязательно растворим в концентрации по меньшей мере 1 мг/мл при pH от 6 до 8 или от 6 до 9, или от 7 до 9 (например, pH 7), и необязательно позволяет сохраняться по меньшей мере 95% исходного пептида через 24 часа при 25°C. Другой пример родственного глюкагону пептида класса 3 проявляет активность, составляющую примерно 175% или больше от активности нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона и примерно 20% или менее от активности нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1, необязательно растворим в концентрации по меньшей мере 1 мг/мл при pH от 6 до 8 или от 6 до 9, или от 7 до 9 (например, pH 7), и необязательно позволяет сохраняться по меньшей мере 95% исходного пептида через 24 часа при 25°C. Еще один пример родственного глюкагону пептида класса 3 проявляет активность, составляющую примерно 10% или менее от активности нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона и по меньшей мере примерно 20% от активности нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1, необязательно растворим в концентрации по меньшей мере 1 мг/мл при pH от 6 до 8 или от 6 до 9, или от 7 до 9 (например, pH 7), и необязательно позволяет сохраняться по меньшей мере 95% исходного пептида через 24 часа при 25°C. Еще один пример родственного глюкагону пептида класса 3 проявляет активность, составляющую примерно 10% или менее, но больше 0,1%, 0,5% или 1% от активности нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона и по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% или больше от активности нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1, необязательно растворим в концентрации по меньшей мере 1 мг/мл при pH от 6 до 8 или от 6 до 9, или от 7 до 9 (например, pH 7), и необязательно позволяет сохраняться по меньшей мере 95% исходного пептида через 24 часа при 25°C. В некоторых вариантах осуществления такие родственные глюкагону пептиды класса 3 сохраняют по меньшей мере 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 встречающихся в природе аминокислот в соответствующих положениях нативного глюкагона (например, имеют 1-7, 1-5 или 1-3 модификации по сравнению с встречающимся в природе глюкагоном).

Модификации, влияющие на активность глюкагона

Повышенную активность в отношении рецептора глюкагона обеспечивают путем модификации аминокислоты в положении 16 нативного глюкагона (SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 является агонистом глюкагона, который был модифицирован по сравнению с пептидом дикого типа His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO:1), чтобы повысить эффективность пептида в отношении рецептора глюкагона. Встречающийся в природе серин в положении 16 нативного глюкагона (SEQ ID NO:1) может быть заменен выбранной кислой аминокислотой, чтобы повысить эффективность глюкагона в отношении его способности стимулировать синтез цАМФ в подтвержденном анализе на модели in vitro (см. пример 5). Более конкретно, такая замена повышает эффективность аналога по меньшей мере в 2 раза, 4 раза, 5 раз и до 10 раз в отношении рецептора глюкагона. Такая замена также повышает активность аналога в отношении рецептора GLP-1 по меньшей мере в 5 раз, 10 раз или 15 раз в сравнении с нативным глюкагоном, но при этом сохраняется селективность в отношении рецептора глюкагона в сравнении с рецептором GLP-1.

В качестве неограничивающего примера такая повышенная эффективность может быть получена путем замены встречающегося в природе серина в положении 16 глутаминовой кислотой или другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь длиной в 4 атома, или альтернативно, любой из глутамина, гомоглутаминовой кислоты или гомоцистеиновой кислоты или заряженной аминокислоты, имеющей боковую цепь, содержащую по меньшей мере один гетероатом (например, N, O, S, P) и с длиной боковой цепи примерно в 4 (или 3-5) атомов. Согласно некоторым вариантам осуществления остаток серина в положении 16 нативного глюкагона заменяют на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, глутамина, гомоглутаминовой кислоты, гомоцистеиновой кислоты, треонина или глицина. Согласно некоторым вариантам осуществления остаток серина в положении 16 нативного глюкагона заменен на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, глутамина, гомоглутаминовой кислоты и гомоцистеиновой кислоты, и в некоторых вариантах осуществления остаток серина заменен глутаминовой кислотой.

В некоторых вариантах осуществления обладающий повышенной эффективностью родственный глюкагону пептид класса 3 включает пептид SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или аналог агониста глюкагона SEQ ID NO:5. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается родственный глюкагону пептид класса 3, обладающий повышенной эффективностью в отношении рецептора глюкагона в сравнении с глюкагоном дикого типа, где пептид содержит последовательность SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, и где глюкагоновый пептид сохраняет свою селективность в отношении рецептора глюкагона в сравнении с рецепторами GLP-1. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 3, обладающий повышенной специфичностью в отношении рецептора глюкагона, включает пептид SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или его аналог, являющийся агонистом глюкагона, где аминокислота на карбоксильном конце сохраняет свою нативную группу карбоновой кислоты. Согласно некоторым вариантам осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 содержит последовательность NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH (SEQ ID NO:10), где пептид проявляет примерно в пять раз повышенную эффективность в отношении рецептора глюкагона в сравнении с нативным глюкагоном, судя по измерениям в анализе цАМФ in vitro, описанном в примере 5.

Активность рецептора глюкагона может быть снижена, сохранена или повышена путем модификации аминокислоты в положении 3, например, замены встречающегося в природе глутамина в положении 3. В некоторых вариантах осуществления показано, что замена аминокислоты в положении 3 кислой, основной или гидрофобной аминокислотой (глутаминовой кислотой, орнитином, норлейцином) по существу снижает или устраняет активность рецептора глюкагона. Аналоги с заменами, например, глутаминовой кислотой, орнитином или норлейцином, обладают активностью, составляющей примерно 10% или менее от активности нативного глюкагон в отношении рецептора глюкагона, например примерно 1-10%, или примерно 0,1-10%, или более чем примерно 0,1%, но менее чем примерно 10%, проявляя при этом активность, составляющую по меньшей мере 20% от активности GLP-1 в отношении рецептора GLP-1. Например, примеры аналогов, описанных в настоящем описании, обладают примерно 0,5%, примерно 1% или примерно 7% активностью нативного глюкагона, проявляя при этом по меньшей мере 20% активности GLP-1 в отношении рецептора GLP-1. В частности, любые из родственных глюкагону пептидов класса 3, включая аналоги глюкагона, аналоги агониста глюкагона, коагонисты глюкагона и молекулы коагонистов глюкагона/GLP-1, описанные в настоящем описании, могут быть модифицированы, чтобы содержать модификацию в положении 3, например, Gln заменяют на Glu, чтобы получить пептид с высокой селективностью, например, десятикратной селективностью в отношении рецептора GLP-1 по сравнению с селективностью в отношении рецептора глюкагона.

В другом варианте осуществления встречающийся в природе глутамин в положении 3 любого из глюкагоновых пептидов класса 3 может быть заменен аналогом глутамина без существенной потери активности в отношении рецептора глюкагона, и в некоторых случаях с повышением активности в отношении рецептора глюкагона, как описано в настоящем описании. В конкретных вариантах осуществления аминокислоту в положении 3 заменяют на Dab(Ac). Например, агонисты глюкагона могут содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:595, SEQ ID NO:601 SEQ ID NO:603, SEQ ID NO:604, SEQ ID NO:605 и SEQ ID NO:606.

Обнаружено, что модификации в положении 2 (например, AIB в положении 2) и в некоторых случаях модификации в положении 1 могут уменьшать глюкагоновую активность. Такое уменьшение глюкагоновой активности может быть восстановлено путем стабилизации альфа-спирали в C-концевой части глюкагона, например, способами, описанными в настоящем описании, например, с помощью ковалентной связи между боковыми цепями аминокислот в положениях «i» и «i+4», например, 12 и 16, 16 и 20 или 20 и 24. В некоторых вариантах осуществления такая ковалентная связь представлена лактамовым мостиком между глутаминовой кислотой в положении 16 и лизином в положении 20. В некоторых вариантах осуществления такая ковалентная связь представлена другим внутримолекулярным мостиком, отличным от лактамового мостика. Например, подходящие способы образования ковалентных связей включают любой один или несколько из следующих способов: метатезис олефинов, основанную на лантионине циклизацию, образование дисульфидного мостика или образование модифицированного, содержащего серу мостика, использование α,ω-диаминоалкановой связки, образование мостиков на основе атомов металлов и другие способы циклизации пептидов.

Модификации, влияющие на активность GLP-1

Повышенную активность в отношении рецептора GLP-1 обеспечивают, заменяя карбоновую кислоту C-концевой аминокислоты нейтральной по заряду группой, такой как амид или сложный эфир. В некоторых вариантах осуществления такие родственные глюкагону пептиды класса 3 содержат последовательность SEQ ID NO:20, в которой находящаяся на карбоксильном конце аминокислота имеет амидную группу вместо группы карбоновой кислоты, встречающейся в нативной аминокислоте. Такие родственные глюкагону пептиды класса 3 обладают высокой активностью в отношении как рецептора глюкагона, так и рецептора GLP-1 и, таким образом, действуют в качестве коагонистов для обоих рецепторов. Согласно некоторым вариантам осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 представляет собой коагонист рецепторов глюкагона и GLP-1, где пептид содержит последовательность SEQ ID NO:20, где аминокислотой в положении 28 является Asn или Lys, и аминокислотой в положении 29 является Thr-амид.

Повышенную активность в отношении рецептора GLP-1 обеспечивают путем модификаций, которые стабилизируют альфа-спираль в C-концевой части глюкагона (например, в области остатков 12-29).

В некоторых вариантах осуществления такие модификации обеспечивают возможность образования внутримолекулярного мостика между боковыми цепями двух аминокислот, которые разделены тремя промежуточными аминокислотами (т.е. аминокислоты в положении «i» и аминокислоты в положении «i+4», где i означает любое целое число от 12 до 25), двумя промежуточными аминокислотами, т.е. аминокислоты в положении «j» и аминокислоты в положении «j+3», где j означает любой целое число от 12 до 27, или шестью промежуточными аминокислотами, т.е. аминокислоты в положении «k» и аминокислоты в положении «k+7», где k означает любой целое число от 12 до 22. В примерах вариантов осуществления мостик или линкер имеет длину примерно 8 (или примерно 7-9) атомов и образуется между боковыми цепями аминокислот в положениях 12 и 16, или в положениях 16 и 20, или в положениях 20 и 24, или в положениях 24 и 28. Боковые цепи двух аминокислот могут быть связаны друг с другом нековалентными связями, например водородными связями, ионными взаимодействиями, такими как образование солевых мостиков, или ковалентными связями.

Согласно некоторым вариантам осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 проявляет активность коагониста рецепторов глюкагона/GLP-1 и содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:11, 47, 48 и 49. В некоторых вариантах осуществления боковые цепи ковалентно связаны друг с другом, и в некоторых вариантах осуществления две аминокислоты связаны друг с другом с образованием лактамового кольца.

Согласно некоторым вариантам осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 содержит последовательность SEQ ID NO:45, где по меньшей мере одно лактамовое кольцо образовано между боковыми цепями пары аминокислот, выбранной из группы, состоящей из пар аминокислот 12 и 16, 16 и 20, 20 и 24 или 24 и 28. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 включает аналог глюкагонового пептида SEQ ID NO:20, где пептид содержит внутримолекулярный лактамовый мостик, образованный между аминокислотами в положениях 12 и 16 или между аминокислотами в положениях 16 и 20. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 содержит последовательность SEQ ID NO:20, где внутримолекулярный лактамовый мостик образован между аминокислотами в положениях 12 и 16, между аминокислотами в положениях 16 и 20 или между аминокислотами в положениях 20 и 24, и аминокислотой в положении 29 является глицин, где последовательность SEQ ID NO:29 связана с C-концевой аминокислотой SEQ ID NO:20. В следующем варианте осуществления аминокислотой в положении 28 является аспарагиновая кислота.

В некоторых конкретных вариантах осуществления стабилизацию альфа-спиральной структуры в C-концевой части родственного глюкагону пептида класса 3 осуществляют через образование другого внутримолекулярного мостика, отличного от лактамового мостика. Например, подходящие способы образования ковалентных связей включают любой один или несколько из следующих способов: метатезис олефинов, основанную на лантионине циклизацию, образование дисульфидного мостика или образование модифицированного, содержащего серу мостика, использование α,ω-диаминоалкановой связки, образование мостиков на основе атомов металлов и другие способы циклизации пептидов, которые используют для стабилизации альфа-спирали.

Кроме того, повышенную активность в отношении рецептора GLP-1 можно достичь путем стабилизации альфа-спиральной структуры в C-концевой части глюкагонового пептида (в области аминокислот 12-29) с помощью целенаправленного введения одной или нескольких α,α-дизамещенных аминокислот в положениях, которые сохраняют требуемую активность. Такие пептиды могут быть описаны в настоящем описании как пептиды, не имеющие внутримолекулярного мостика. В некоторых аспектах стабилизацию альфа-спирали осуществляют таким образом без введения внутримолекулярного мостика, такого как солевой мостик или ковалентная связь. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в одном, двух, трех, четырех или более положениях 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 или 29 глюкагонового пептида заменяют α,α-дизамещенной аминокислотой. Например, замена в положении 16 родственного глюкагону пептида класса 3 аминоизомасляной кислотой (AIB) усиливает GLP-1-активность в отсутствие солевого мостика или лактама. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в одном, двух, трех или более положениях 16, 20, 21 или 24 заменяют на AIB.

Повышенная активность в отношении рецептора GLP-1 может быть достигнута путем модификации аминокислоты в положении 20. В некоторых вариантах осуществления глутамин в положении 20 заменяют другой гидрофильной аминокислотой, имеющей боковую цепь, которая либо заряжена, либо обладает способностью к образованию водородной связи и имеет длину по меньшей мере примерно 5 (или примерно 4-6) атомов, например лизин, цитруллин, аргинин или орнитин.

Повышенная активность в отношении рецептора GLP-1 обнаруживается в случае родственных глюкагону пептидов класса 3, содержащих C-концевое удлинение SEQ ID NO:26. GLP-1-активность таких родственных глюкагону пептидов класса 3, содержащих SEQ ID NO:26, может быть дополнительно увеличена путем модификации аминокислоты в положении 18, 28 или 29, или в положении 18 и 29, как описано в настоящем описании.

Дальнейшее небольшое увеличение GLP-1-активности обеспечивают путем модификации аминокислоты в положении 10 с получением Trp.

Комбинации модификаций, которые повышают активность рецептора GLP-1, могут обеспечивать более высокую GLP-1 активность, чем любая из таких модификаций отдельно. Например, родственные глюкагону пептиды класса 3 могут содержать модификации в положении 16, в положении 20 и по C-концевой группе карбоновой кислоты, необязательно с ковалентной связью между аминокислотами в положениях 16 и 20; могут содержать модификации в положении 16 и по C-концевой группе карбоновой кислоты; могут содержать модификации в положениях 16 и 20, необязательно с ковалентной связью между аминокислотами в положениях 16 и 20; или могут содержать модификации в положении 20 и по C-концевой группе карбоновой группы; необязательно при условии, что аминокислота в положении 12 не является Arg; или необязательно при условии, что аминокислота в положении 9 не является Glu.

Модификации, влияющие на растворимость

Добавление гидрофильных остатков

Родственные глюкагону пептиды класса 3 могут быть дополнительно модифицированы, чтобы повысить растворимость и стабильность пептида в водных растворах при физиологическом pH, сохраняя при этом высокую биологическую активность по сравнению с нативным глюкагоном. Гидрофильные остатки, которые обсуждается в настоящем описании, могут быть связаны с родственным глюкагону пептидом класса 3, как дополнительно обсуждается в настоящем описании.

Согласно некоторым вариантам осуществления введение гидрофильных групп в положениях 17, 21, и 24 родственного глюкагону пептида класса 3, содержащего SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, как предполагается, повышает растворимость и стабильность высокоэффективного аналога глюкагона в растворах с физиологическим pH. Введение таких групп также увеличивает продолжительность действия, например, измеряемую по пролонгированному времени полужизни в кровообращении.

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:19, где боковая цепь аминокислотного остатка в одном из положений 16, 17, 21 или 24 указанного родственного глюкагону пептида класса 3 дополнительно содержит цепь полиэтиленгликоля, имеющего молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 500 до примерно 40000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 500 до примерно 5000 дальтон. В другом варианте осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу примерно от 10000 до примерно 20000 дальтон. В следующих примерах вариантов осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу примерно от 20000 до примерно 40000 дальтон.

Подходящие гидрофильные остатки включают любые водорастворимые полимеры, известные в данной области, включая гидрофильные остатки, описанные в настоящем описании, гомо или сополимеры ПЭГ и монометил-замещенный полимер ПЭГ (мПЭГ). Согласно некоторым вариантам осуществления гидрофильная группа содержит цепь полиэтиленгликоля (ПЭГ). Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 содержит последовательность SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:7, где цепь ПЭГ ковалентно связана с боковыми цепями аминокислот, присутствующих в положениях 21 и 24 родственного глюкагону пептида класса 3, и находящаяся на карбоксильном конце аминокислота родственного глюкагону пептида класса 3 имеет группу карбоновой кислоты. Согласно некоторым вариантам осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет среднюю молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 500 до примерно 10000 дальтон.

Согласно некоторым вариантам осуществления пегилированный родственный глюкагону пептид класса 3 содержит две или более цепей полиэтиленгликоля, ковалентно связанных с родственным глюкагону пептидом класса 3, где общая молекулярная масса глюкагоновых цепей составляет примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления пегилированный агонист глюкагона содержит пептид, состоящий из SEQ ID NO:5, или аналог агониста глюкагона с SEQ ID NO:5, где цепь ПЭГ ковалентно связана с аминокислотным остатком в положении 21 и в положении 24, и где суммарная молекулярная масса двух цепей ПЭГ составляет примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон.

Заряженный C-конец

Растворимость родственного глюкагону пептида класса 3, содержащего последовательность SEQ ID NO:20, может быть дополнительно повышена, например, путем введения одной, двух, трех или более заряженных аминокислот в C-концевую часть глюкагонового пептида SEQ ID NO:20, предпочтительно в положении, находящемся с C-концевой стороны от положения 27. Такая заряженная аминокислота может быть введена путем замены нативной аминокислоты заряженной аминокислотой, например, в положениях 28 или 29, или альтернативно, добавлением заряженной аминокислоты, например, после положения 27, 28 или 29. В примерах вариантов осуществления одна, две, три или все заряженные аминокислоты являются отрицательно заряженными. Могут быть осуществлены дополнительные модификации, например, консервативные замены в родственном глюкагону пептиде класса 3, которые все еще позволяют сохранить глюкагоновую активность. В некоторых вариантах осуществления предлагается аналог родственного глюкагону пептида класса 3 с SEQ ID NO:20, где аналог отличается от SEQ ID NO:20 1-2 аминокислотными заменами в положениях 17-26, и в некоторых вариантах осуществления аналог отличается от пептида с SEQ ID NO:20 аминокислотной заменой в положении 20.

Ацилирование/алкилирование

Согласно некоторым вариантам осуществления глюкагоновый пептид модифицируют, чтобы он содержал ацильную или алкильную группу, например, C4-C30ацильную или алкильную группу. В некоторых аспектах ацильная группа или алкильная группа не встречается в природе на аминокислоте. В конкретных аспектах ацильная или алкильная группа не является нативной для любой встречающейся в природе аминокислоты. Ацилирование или алкилирование может увеличивать время полужизни в кровообращении и/или задерживать начало и/или удлинять продолжительность действия и/или повышать устойчивость к протеазам, таким как DPP-IV. Активность в отношении рецептора глюкагона и рецептора GLP-1 родственных глюкагону пептидов класса 3 сохраняется, если не увеличивается в значительной степени после ацилирования. Кроме того, эффективность ацилированных аналогов сравнима с эффективностью неацилированных вариантов родственных глюкагону пептидов класса 3, если по существу не увеличена.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к родственному глюкагону пептиду класса 3, модифицированному таким образом, чтобы содержать ацильную группу или алкильную группу, ковалентно связанную с аминокислотой в положении 10 глюкагонового пептида. Глюкагоновый пептид может дополнительно содержать спейсер между аминокислотой в положении 10 родственного глюкагону пептиду класса 3 и ацильной группой или алкильной группой. Любой из указанных выше родственных глюкагону пептидов класса 3 может содержать две ацильных группы или две алкильных группы или их комбинацию.

В конкретном аспекте изобретения ацилированный родственный глюкагону пептид класса 3 содержит любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:534-544 и 546-549.

C-концевое укорочение

В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 3, описанные в настоящем описании, дополнительно модифицируют, используя укорочение или делецию одной или двух аминокислот на C-конце глюкагонового пептида (т.е. в положениях 29 и/или 28), не оказывая влияния на активность и/или эффективность в отношении рецепторов глюкагона и GLP-1. В связи с этим, родственный глюкагону пептид класса 3 может содержать аминокислоты 1-27 или 1-28 нативного глюкагонового пептида (SEQ ID NO:1), необязательно с одной или несколькими модификациями, описанными в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления укороченный родственный глюкагону пептид класса 3 содержит SEQ ID NO:550 или SEQ ID NO:551. В другом варианте осуществления укороченный пептид, являющийся агонистом глюкагона, содержит SEQ ID NO:552 или SEQ ID NO:553.

C-концевое удлинение

Согласно некоторым вариантам осуществления родственные глюкагону пептиды класса 3, описанные в настоящем описании, модифицируют добавлением второго пептида к карбоксильному концу глюкагонового пептида, например, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 или SEQ ID NO:28. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 3, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68 и SEQ ID NO:69, ковалентно связывают пептидной связью со вторым пептидом, где второй пептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 и SEQ ID NO:28. В следующем варианте осуществления в родственных глюкагону пептидах класса 3, которые содержат C-концевое удлинение, треонин в положении 29 нативного глюкагонового пептида заменяют глицином. Родственный глюкагону пептид класса 3, имеющий замену треонина глицином в положении 29 и содержащий удлинение на карбоксильном конце в виде SEQ ID NO:26, в четыре раза более эффективен в отношении рецептора GLP-1, чем нативный глюкагон, модифицированный, чтобы содержать на карбоксильном конце удлинение в виде SEQ ID NO:26. Эффективность в отношении рецептора GLP-1 может быть дополнительно повышена аланиновой заменой нативного аргинина в положении 18.

Соответственно, родственный глюкагону пептид класса 3 может иметь на карбоксильном конце удлинение в виде SEQ ID NO:27 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO:28. Согласно некоторым вариантам осуществления родственный глюкагону пептид класса 3, содержащий SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:20, дополнительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO:28, связанную с аминокислотой 29 глюкагонового пептида. Более конкретно, родственный глюкагону пептид класса 3 содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15, и дополнительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO:28, связанную с аминокислотой 29 глюкагонового пептида. Более конкретно, глюкагоновый пептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:55 и SEQ ID NO:56, и дополнительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26 (GPSSGAPPPS) или SEQ ID NO:29, связанную с аминокислотой 29 родственного глюкагону пептида класса 3. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 содержит последовательность SEQ ID NO:64.

Другие модификации

Любую из модификаций, описанных выше для родственных глюкагону пептидов класса 3, которая повышает или понижает активность в отношении рецептора глюкагона и которая повышает активность в отношении рецептора GLP-1, можно использовать отдельно или в комбинации. Комбинации модификаций, которые повышают активность рецептора GLP-1, обычно обеспечивают более высокую активность GLP-1, чем любые такие модификации по отдельности. Любую из модификаций, описанных выше, также можно сочетать с другими модификациями, описанными в настоящем описании со ссылкой на родственные глюкагону пептиды класса 3, которые придают другие требуемые свойства, такие как повышенная растворимость и/или стабильность и/или продолжительность действия. Альтернативно, любую из модификаций, описанных выше, можно комбинировать с другими модификациями, описанными в настоящем описании со ссылкой на родственные глюкагону пептиды класса 3, которые существенно не влияют на растворимость или стабильность или активность. Примеры модификаций включают, но без ограничения:

(A) повышение растворимости, например, путем введения одной, двух, трех или больше заряженных аминокислот в C-концевую часть нативного глюкагона, предпочтительно в положение с C-концевой стороны от положения 27. Такая заряженная аминокислота может быть введена заменой нативной аминокислоты заряженной аминокислотой, например, в положениях 28 или 29, или альтернативно, добавлением заряженной аминокислоты, например, после положения 27, 28 или 29. В примерах вариантов осуществления одна, две, три или все заряженные аминокислоты являются отрицательно заряженными. В других вариантах осуществления одна, две, три или все заряженные аминокислоты являются положительно заряженными. Такие модификации повышают растворимость, например, обеспечивают по меньшей мере 2-кратную, 5-кратную, 10-кратную, 15-кратную, 25-кратную, 30-кратную или более высокую растворимость по сравнению с нативным глюкагоном при данном значении pH, примерно от 5,5 до 8, например при pH 7, в случае измерения через 24 часа при 25°С;

(B) повышение растворимости и продолжительности действия или времени полужизни в кровообращении добавлением гидрофильного остатка, такого как цепь полиэтиленгликоля, как описано в настоящем описании, например в положении 16, 17, 20, 21, 24 или 29 или к C-концевой аминокислоте пептида;

(C) повышение стабильности путем модификации аспарагиновой кислоты в положении 15, например, делецией или заменой глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой, цистеиновой кислотой или гомоцистеиновой кислотой. Такие модификации могут уменьшать разложение или расщепление при pH в диапазоне от 5,5 до 8, особенно в кислых или щелочных буферах, например, сохраняя по меньшей мере 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% исходного пептида через 24 часа при 25°C;

(D) повышение стабильности модификацией метионина в положении 27, например, путем замены лейцином или норлейцином. Такие модификации могут снижать окислительное разложение. Стабильность также может быть повышена модификацией Gln в положении 20 или 24, например, путем замены на Ser, Thr, Ala или AIB. Такие модификации могут уменьшать разложение, которое происходит в результате дезамидирования Gln. Стабильность может быть повышена модификацией Asp в положении 21, например, в путем замены на Glu. Такие модификации могут уменьшать разложение, которое происходит вследствие дегидратации Asp с образованием промежуточного циклического сукцинимида, с последующей изомеризацией до изоаспартата;

(E) повышение устойчивости к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP IV) путем модификации аминокислоты в положении 1 или 2 устойчивыми к DPP-IV аминокислотами, описанными в настоящем описании, включая модификацию аминокислоты в положении 2 N-метилаланином;

(F) консервативные или неконсервативные замены, добавления или делеции, которые не влияют на активность, например, консервативные замены в одном или нескольких положениях 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29; делеции в одном или нескольких положениях 27, 28 или 29; или делеция аминокислоты 29, необязательно в комбинации с C-концевым амидом или сложным эфиром вместо C-концевой группы карбоновой кислоты;

(G) добавление C-концевых удлинений, как описано в настоящем описании;

(H) увеличение времени полужизни в кровообращении и/или увеличение продолжительности действия и/или задержка начала действия, например, путем ацилирования или алкилирования глюкагонового пептида, как описано в настоящем описании;

(I) гомодимеризацию или гетеродимеризацию, как описано в настоящем описании.

Другие модификации включают замену His в положении 1 крупной ароматической аминокислотой (например, Tyr, Phe, Trp или амино-Phe); замену Ser в положении 2 на Ala; замену Tyr в положении 10 на Val или Phe; замену Lys в положении 12 на Arg; замену Asp в положении 15 на Glu; замену Ser в положении 16 на Thr или AIB.

Родственные глюкагону пептиды класса 3 с GLP-1-активностью, которые содержат неконсервативную замену His в положении 1 крупной ароматической аминокислотой (например, Tyr) могут сохранять GLP-1 активность, при условии, что альфа-спираль стабилизирована внутримолекулярным мостиком, например, таким как любой их мостиков, описанных в настоящем описании.

Конъюгаты и слияния

Родственный глюкагону пептид класса 3 может быть связан необязательно ковалентной связью и необязательно через линкер с конъюгируемым остатком.

Родственный глюкагону пептид класса 3 также может быть частью слитого пептида или белка, где второй пептид или полипептид слит с концом, например карбоксильным концом родственного глюкагону пептида класса 3.

Более конкретно, слитый родственный глюкагону пептид класса 3 может включать агонист глюкагона SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10 и дополнительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO:27 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO:28 (KRNR), связанную с аминокислотой 29 глюкагонового пептида. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность SEQ ID NO:26 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO:27 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO:28 (KRNR) связана с аминокислотой 29 родственного глюкагону пептида класса 3 пептидной связью. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что в слитых пептидах родственного глюкагону пептида класса 3, содержащих пептид C-концевого удлинения эксендин-4 (например, SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:29), замена нативного остатка треонин в положении 29 глицином сильно увеличивает активность в отношении рецептора GLP-1. Такую аминокислотную замену можно использовать в комбинации с другими модификациями, описанными в настоящем описании со ссылкой на родственные глюкагону пептиды класса 3, чтобы повысить аффинность аналогов глюкагона в отношении рецептора GLP-1. Например, замену T29G можно сочетать с аминокислотными заменами S16E и N20K, необязательно с лактамовым мостиком между аминокислотами 16 и 20, и необязательно с добавлением цепи ПЭГ, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 содержит последовательность SEQ ID NO:64. В некоторых вариантах осуществления часть слитого глюкагонового пептида в виде родственного глюкагону пептида класса 3 выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, где цепь ПЭГ, когда она присутствует в положениях 17, 21, 24 или на C-концевой аминокислоте, или в обоих положениях 21 и 24, выбрана по молекулярной массе из диапазона от 500 до 40000 дальтон. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления фрагмент, представленный родственным глюкагону пептидом класса 3, выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:63, где цепь ПЭГ выбрана по молекулярной массе из диапазона от 500 до 5000. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 представляет собой слитый пептид, содержащий последовательность SEQ ID NO:55 и SEQ ID NO:65, где пептид SEQ ID NO:65 связан с карбоксильным концом SEQ ID NO:55.

Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительная химическая модификация родственного глюкагону пептида класса 3 SEQ ID NO:10 придает повышенную эффективность в отношении рецептора GLP-1 в точке, в которой относительная активность в отношении рецепторов глюкагона и GLP-1 фактически эквивалентны. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 содержит концевую аминокислоту, имеющую амидную группу вместо группы карбоновой кислоты, которая присутствует в нативной аминокислоте. Относительная активность родственного глюкагону пептида класса 3 в отношении соответствующих рецепторов глюкагона и GLP-1 может быть скорректирована дополнительными модификациями родственного глюкагону пептида класса 3, с получением аналогов, проявляющих активность, составляющую примерно от 40% до примерно 500% или более от активности нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона и примерно от 20% до примерно 200% или более от активности нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1, например 50-кратное, 100-кратное или большее увеличение в сравнении с нормальной активностью глюкагона в отношении рецептора GLP-1. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновые пептиды, описанные в настоящем описании, проявляют активность, составляющую примерно до 100%, 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% от активности нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновые пептиды, описанные в настоящем описании, проявляют активность, составляющую примерно до 100%, 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% от активности нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1.

Примеры вариантов осуществления

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается аналог глюкагона, содержащий последовательность SEQ ID NO:55, где указанный аналог отличается от SEQ ID NO:55 1-3 аминокислотами, выбранными из аминокислот в положениях 1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 24, 27, 28 и 29, и указанный глюкагоновый пептид проявляет активность, составляющую по меньшей мере 20% от активности нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается коагонист рецепторов глюкагона/GLP-1, содержащий последовательность: NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO:33), где Xaa в положении 15 выбрана из группы аминокислот, состоящей из Asp, Glu, цистеиновой кислоты, гомоглутаминовой кислоты и гомоцистеиновой кислоты, Xaa в положении 16 выбрана из группы аминокислот, состоящей из Ser, Glu, Gln, гомоглутаминовой кислоты и гомоцистеиновой кислоты, Xaa в положении 20 является Gln или Lys, Xaa в положении 24 является Gln или Glu, Xaa в положении 28 является Asn, Lys или кислой аминокислотой, Xaa в положении 29 является Thr, Gly или кислой аминокислотой, и R означает COOH или CONH₂, при условии, что когда аминокислотой в положении 16 является серин, в положении 20 находится Lys, или альтернативно, когда аминокислотой в положении 16 является серин, в положении 24 находится Glu, и либо в положении 20, либо в положении 28 находится Lys. В некоторых вариантах осуществления коагонист рецепторов глюкагона/GLP-1 содержит последовательность SEQ ID NO:33, в которой аминокислотой в положении 28 является аспарагиновая кислота, и аминокислотой в положении 29 является глутаминовая кислота. В другом варианте осуществления аминокислотой в положении 28 является нативный аспарагин, аминокислотой в положении 29 является глицин, и аминокислотная последовательность SEQ ID NO:29 или SEQ ID NO:65 ковалентно связана с карбоксильным концом SEQ ID NO:33.

В некоторых вариантах осуществления предлагается коагонист, содержащий последовательность SEQ ID NO:33, в которой дополнительная кислая аминокислота добавлена к карбоксильному концу пептида. В следующем варианте осуществления аминокислота на карбоксильном конце аналога глюкагона имеет амид вместо группы карбоновой кислоты природной аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления аналог глюкагона содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43 и SEQ ID NO:44.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается аналог глюкагонового пептида SEQ ID NO:33, где указанный аналог отличается от SEQ ID NO:33 1-3 аминокислотами, выбранными из аминокислот в положениях 1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21 и 27, при условии, что когда аминокислотой в положении 16 является серин, либо в положении 20 находится лизин, либо образуется лактамовый мостик между аминокислотой в положении 24 и любой из аминокислот в положении 20 или положении 28. Согласно некоторым вариантам осуществления аналог отличается от SEQ ID NO:33 1-3 аминокислотами, выбранными из аминокислот в положениях 1, 2, 3, 21 и 27. В некоторых вариантах осуществления аналог глюкагонового пептида SEQ ID NO:33 отличается от такой последовательности 1-2 аминокислотами, или в некоторых вариантах осуществления одной аминокислотой, выбранной из аминокислот в положениях 1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21 и 27, при условии, что когда аминокислотой в положении 16 является серин, либо аминокислота в положении 20 является лизином, либо образуется лактамовый мостик между аминокислотой в положении 24 и аминокислотой либо в положении 20, либо в положении 28.

Согласно другому варианту осуществления предлагается относительно избирательный агонист рецептора GLP-1, содержащий последовательность NH₂-His-Ser-Xaa-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO:53), где Xaa в положении 3 выбрана из группы аминокислот, состоящей из Glu, Orn или Nle, Xaa в положении 15 выбрана из группы аминокислот, состоящей из Asp, Glu, цистеиновой кислоты, гомоглутаминовой кислоты и гомоцистеиновой кислоты, Xaa в положении 16 выбрана из группы аминокислот, состоящей из Ser, Glu, Gln, гомоглутаминовой кислоты и гомоцистеиновой кислоты, Xaa в положении 20 означает Gln или Lys, Xaa в положении 24 означает Gln или Glu, Xaa в положении 28 означает Asn, Lys или кислую аминокислоту, Xaa в положении 29 означает Thr, Gly или кислую аминокислоту, и R означает COOH, CONH₂, SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:29, при условии, что когда аминокислотой в положении 16 является серин, в положении 20 находится Lys, или альтернативно, когда аминокислотой в положении 16 является серин, в положении 24 находится Glu, и либо в положении 20, либо в положении 28 находится Lys. В некоторых вариантах осуществления аминокислотой в положении 3 является глутаминовая кислота. В некоторых вариантах осуществления кислой аминокислотой, используемой для замены в положении 28 и/или 29, является аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид, включая пептид-коагонист, содержит последовательность SEQ ID NO:33, кроме того, содержащую дополнительную кислую аминокислоту, добавляемую к карбоксильному концу пептида. В следующем варианте осуществления аминокислота на карбоксильном конце аналога глюкагона имеет амид вместо группы карбоновой кислоты природной аминокислоты.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается коагонист рецепторов глюкагона/GLP-1, содержащий модифицированный глюкагоновый пептид, выбранный из группы, состоящей из: NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO:34), где Xaa в положении 15 выбрана из группы аминокислот, состоящей из Asp, Glu, цистеиновой кислоты, гомоглутаминовой кислоты и гомоцистеиновой кислоты, Xaa в положении 16 выбрана из группы аминокислот, состоящей из Ser, Glu, Gln, гомоглутаминовой кислоты и гомоцистеиновой кислоты, Xaa в положении 20 означает Gln или Lys, Xaa в положении 24 означает Gln или Glu, и Xaa в положении 28 означает Asn, Asp или Lys, R означает COOH или CONH₂, Xaa в положении 29 означает Thr или Gly, и R означает COOH, CONH₂, SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:29, при условии, что когда аминокислотой в положении 16 является серин, в положении 20 находится Lys, или альтернативно, когда аминокислотой в положении 16 является серин, в положении 24 находится Glu, и либо в положении 20, либо в положении 28 находится Lys. В некоторых вариантах осуществления R означает CONH₂, Xaa в положении 15 означает Asp, Xaa в положении 16 выбрана из группы аминокислот, состоящей из Glu, Gln, гомоглутаминовой кислоты и гомоцистеиновой кислоты, Xaa в положениях 20 и 24 означают Gln, Xaa в положении 28 означает Asn или Asp, и Xaa в положении 29 означает Thr. В некоторых вариантах осуществления Xaa в каждом из положений 15 и 16 означают Glu, Xaa в каждом из положений 20 и 24 означают Gln, Xaa в положении 28 означает Asn или Asp, Xaa в положении 29 означает Thr, и R означает CONH₂.

Сообщалось, что некоторые положения нативного глюкагонового пептида могут быть модифицированы с сохранением при этом по меньшей мере такой же активности, как и активность исходного пептида. Соответственно, авторы настоящего изобретения полагают, что одна или несколько аминокислот, находящихся в положениях 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29 пептида SEQ ID NO:11, могут быть заменены другой аминокислотой, отличной от аминокислоты, присутствующей в нативном глюкагоновом пептиде, и при этом все еще сохранять активность в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления остаток метионина, присутствующий в положении 27 нативного пептида изменяют, получая лейцин или норлейцин, чтобы предотвратить окислительное разложение пептида. В другом варианте осуществления аминокислота в положении 20 заменена на Lys, Arg, Orn или цитруллин, и/или аминокислота в положении 21 заменена на Glu, гомоглутаминовую кислоту или гомоцистеиновую кислоту.

В некоторых вариантах осуществления предлагается аналог глюкагона SEQ ID NO:20, в котором 1-6 аминокислот, выбранных из аминокислот в положениях 1, 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 27, 28 или 29 аналога, отличаются от соответствующей аминокислоты в SEQ ID NO:1, при условии, что когда аминокислотой в положении 16 является серин, в положении 20 находится Lys, или альтернативно, когда в положении 16 находится серин, в положении 24 находится Glu, и либо в положении 20, либо в положении 28 находится Lys. Согласно другому варианту осуществления предлагается аналог глюкагона SEQ ID NO:20, где 1-3 аминокислоты, выбранные из аминокислот в положениях 1, 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 27, 28 или 29 аналога, отличаются от соответствующей аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления предлагается аналог глюкагона SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:11, где 1-2 аминокислоты, выбранные из аминокислот в положениях 1, 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 20 или 21 аналога отличаются от соответствующей аминокислоты SEQ ID NO:1, и в следующем варианте осуществления одна-две отличающихся аминокислоты представляют собой консервативные аминокислотные замены по сравнению с аминокислотами, присутствующими в нативной последовательности глюкагона (SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления предлагается глюкагоновый пептид с SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 или SEQ ID NO:15, где глюкагоновый пептид дополнительно содержит одну, две или три аминокислотных замены в положениях, выбранных из положений 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 27 или 29. В некоторых вариантах осуществления замены в положениях 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 27 или 29 являются консервативными аминокислотными заменами.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается коагонист рецепторов глюкагона/GLP-1, содержащий вариант последовательности SEQ ID NO:33, где 1-10 аминокислот, выбранных из аминокислот в положениях 16, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 27, 28 и 29 варианта, соответственно, отличаются от соответствующей аминокислоты в SEQ ID NO:1. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается вариант последовательности SEQ ID NO:33, и такой вариант отличается от SEQ ID NO:33 одной или несколькими аминокислотными заменами, выбранными из группы, состоящей из Gln17, Ala18, Glu21, Ile23, Ala24, Val27 и Gly29. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается коагонист рецепторов глюкагона/GLP-1, содержащий варианты последовательности SEQ ID NO:33, где 1-2 аминокислоты, выбранные из аминокислот в положениях 17-26 варианта, отличаются от соответствующей аминокислоты в SEQ ID NO:1. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается вариант последовательности SEQ ID NO:33, и такой вариант отличается от последовательности SEQ ID NO:33 аминокислотной заменой, выбранной из группы, состоящей из Gln17, Ala18, Glu21, Ile23 и Ala24. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения предлагается вариант последовательности SEQ ID NO:33, и такой вариант отличается от последовательности SEQ ID NO:33 аминокислотной заменой в положении 18, где используемая для замены аминокислота выбрана из группы, состоящей из Ala, Ser, Thr и Gly. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения предлагается вариант последовательности SEQ ID NO:33, и такой вариант отличается от последовательности SEQ ID NO:33 аминокислотной заменой Ala в положении 18. Такие варианты соответствуют SEQ ID NO:55. В другом варианте осуществления предлагается коагонист рецепторов глюкагона/GLP-1, содержащий варианты последовательности SEQ ID NO:33, в которых 1-2 аминокислоты, выбранные из аминокислот в положениях 17-22 варианта, отличаются от соответствующей аминокислоты в SEQ ID NO:1, и в следующем варианте осуществления изобретения предлагается вариант последовательности SEQ ID NO:33, и такой вариант отличается от SEQ ID NO:33 1 или 2 аминокислотными заменами в положениях 20 и 21. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается коагонист рецепторов глюкагона/GLP-1, содержащий последовательность: NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Xaa-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO:51), где Xaa в положении 15 означает Asp, Glu, цистеиновую кислоту, гомоглутаминовую кислоту или гомоцистеиновую кислоту, Xaa в положении 16 означает Ser, Glu, Gln, гомоглутаминовую кислоту или гомоцистеиновую кислоту, Xaa в положении 20 означает Gln, Lys, Arg, Orn или цитруллин, Xaa в положении 21 означает Asp, Glu, гомоглутаминовую кислоту или гомоцистеиновую кислоту, Xaa в положении 24 означает Gln или Glu, Xaa в положении 28 означает Asn, Lys или кислую аминокислоту, Xaa в положении 29 означает Thr или кислую аминокислоту, и R означает COOH или CONH₂. В некоторых вариантах осуществления R означает CONH₂. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается коагонист рецепторов глюкагона/GLP-1, содержащий вариант SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 или SEQ ID NO:49, где вариант отличается от указанной последовательности аминокислотной заменой в положении 20. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная замена для положения 20 выбрана из группы, состоящей из Lys, Arg, Orn или цитруллина.

В некоторых вариантах осуществления предлагается агонист глюкагона, содержащий аналог пептида SEQ ID NO:34, где аналог отличается от SEQ ID NO:34 наличием другой аминокислоты, отличной от серина в положении 2. В некоторых вариантах осуществления остаток серина заменен аминоизомасляной кислотой, D-аланином, и в некоторых вариантах осуществления остаток серина заменен аминоизомасляной кислотой. Такие модификации подавляют расщепление дипептидилпептидазой IV, сохраняя при этом присущую исходному соединению эффективность (например, по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95% или более от эффективности исходного соединения). В некоторых вариантах осуществления растворимость аналога повышают, например, путем введения одной, двух, трех или более заряженных аминокислот в C-концевую часть нативного глюкагона, предпочтительно в положении, находящемся с C-концевой стороны от положения 27. В примерах вариантов осуществления одна, две, три или все заряженные аминокислоты являются отрицательно заряженными. В другом варианте осуществления аналог дополнительно содержит кислую аминокислоту, заменяющую нативную аминокислоту в положении 28 или 29, или кислую аминокислоту, добавленную к карбоксильному концу пептида SEQ ID NO:34.

В некоторых вариантах осуществления аналоги глюкагона, описанные в настоящем описании, дополнительно модифицируют в положении 1 или 2, чтобы уменьшить чувствительность к расщеплению дипептидилпептидазой IV. В некоторых вариантах осуществления предлагается аналог глюкагона SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 или SEQ ID NO:15, где аналог отличается от исходной молекулы заменой в положении 2 и проявляет пониженную чувствительность (т.е. устойчивость) к расщеплению дипептидилпептидазой IV. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 2 пептидного аналога заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-серина, D-аланина, валина, амино-н-масляной кислоты, глицина, N-метилсерина и аминоизомасляной кислоты. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 2 пептидного аналога заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-серина, D-аланина, глицина, N-метилсерина и аминоизомасляной кислоты. В другом варианте осуществления аминокислота в положении 2 пептидного аналога пептид заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-серина, глицина, N-метилсерина и аминоизомасляной кислоты. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 2 не является D-серином. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:22.

В некоторых вариантах осуществления предлагается аналог глюкагона SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 или SEQ ID NO:15, где аналог отличается от исходной молекулы заменой в положении 1 и проявляет пониженную чувствительность (т.е. устойчивость) к расщеплению дипептидилпептидазой IV. Более конкретно, аминокислота в положении 1 пептидного аналога заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-гистидина, альфа,альфа-диметилимидазолуксусной кислоты (DMIA), N-метилгистидина, альфа-метилгистидина, имидазолуксусной кислоты, дезаминогистидина, гидроксилгистидина, ацетилгистидина и гомогистидина. В другом варианте осуществления предлагается агонист глюкагона, включающий пептидный аналог SEQ ID NO:34, где аналог отличается от SEQ ID NO:34 наличием другой аминокислоты, отличной от гистидина в положении 1. В некоторых вариантах осуществления растворимость аналог повышена, например, путем введения одной, двух, трех или более заряженных аминокислот в C-концевую часть нативного глюкагона, предпочтительно в положении, находящемся с C-концевой стороны от положения 27. В примерах вариантов осуществления одна, две, три или все заряженные аминокислоты являются отрицательно заряженными. В другом варианте осуществления аналог дополнительно содержит кислую аминокислоту, заменяющую нативную аминокислоту в положении 28 или 29, или кислую аминокислоту, добавляемую к карбоксильному концу пептида SEQ ID NO:34. В некоторых вариантах осуществления кислой аминокислотой является аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота.

В некоторых вариантах осуществления коагонист рецепторов глюкагона/GLP-1 содержит последовательность SEQ ID NO:20, кроме того, содержащую дополнительное удлинение на карбоксильном конце в виде одной аминокислоты или пептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 и SEQ ID NO:28. В варианте осуществления, в котором добавляют одну аминокислоту к карбоксильному концу SEQ ID NO:20, аминокислота обычно выбрана из 20 обычных аминокислот, и в некоторых вариантах осуществления добавляемая на карбоксильном конце аминокислота имеет амидную группу вместо группы карбоновой кислоты нативной аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления дополнительная аминокислота выбрана из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и глицина.

В альтернативном варианте осуществления предлагается коагонист рецепторов глюкагона/GLP-1, где пептид содержит по меньшей мере одно лактамовое кольцо, образованное между боковой цепью остатка глутаминовой кислоты и остатка лизина, где остаток глутаминовой кислоты и остаток лизина разделены тремя аминокислотами. В некоторых вариантах осуществления аминокислота на карбоксильном конце несущего лактам глюкагонового пептида имеет амидную группу вместо группы карбоновой кислоты нативного аминокислота. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления предлагается коагонист глюкагона и GLP-1, содержащий модифицированный глюкагоновый пептид, выбранный из группы, состоящей из:

NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO:66);

NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO:67);

NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO:68);

NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Xaa-R (SEQ ID NO:69);

NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-R (SEQ ID NO:16);

NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Thr-R (SEQ ID NO:17);

NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Thr-R (SEQ ID NO:18),

где Xaa в положении 28 означает n, Xaa в положении 29 означает Thr или Gly, R выбран из группы, состоящей из COOH, CONH₂, глутаминовой кислоты аспарагиновой кислоты, глицина, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 и SEQ ID NO:28, и лактамовый мостик образован между Lys в положении 12 и Glu в положении 16 для SEQ ID NO:66, между Glu в положении 16 и Lys в положении 20 для SEQ ID NO:67, между Lys в положении 20 и Glu в положении 24 для SEQ ID NO:68, между Glu в положении 24 и Lys в положении 28 для SEQ ID NO:69, между Lys в положении 12 и Glu в положении 16 и между Lys в положении 20 и Glu в положении 24 для SEQ ID NO:16, между Lys в положении 12 и Glu в положении 16 и между Glu в положении 24 и Lys в положении 28 для SEQ ID NO:17, и между Glu в положении 16 и Lys в положении 20 и между Glu в положении 24 и Lys в положении 28 для SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления R выбран из группы, состоящей из COOH, CONH₂, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, глицина, аминокислотой в положении 28 является Asn, и аминокислотой в положении 29 является треонин. В некоторых вариантах осуществления R означает CONH₂, аминокислотой в положении 28 является Asn, и аминокислотой в положении 29 является треонин. В другом варианте осуществления R выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:29 и SEQ ID NO:65, и аминокислотой в положении 29 является глицин.

В следующем варианте осуществления коагонист рецепторов глюкагона/GLP-1 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:18, где пептид, кроме того, содержит дополнительное удлинение карбоксильного конца в виде одной аминокислоты или пептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 и SEQ ID NO:28. В некоторых вариантах осуществления концевое удлинение содержит последовательность SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:29 или SEQ ID NO:65, и глюкагоновый пептид содержит последовательность SEQ ID NO:55. В некоторых вариантах осуществления коагонист рецепторов глюкагона/GLP-1 содержит последовательность SEQ ID NO:33, где аминокислотой в положении 16 является глутаминовая кислота, аминокислотой в положении 20 является лизин, аминокислотой в положении 28 является аспарагин, и аминокислотная последовательность SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:29 связана с карбоксильным концом SEQ ID NO:33.

В варианте осуществления, в котором добавляют одну аминокислоту к карбоксильному концу SEQ ID NO:20, аминокислота обычно выбрана из 20 обычных аминокислот, и в некоторых вариантах осуществления аминокислота имеет амидную группу вместо группы карбоновой кислоты нативной аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления дополнительная аминокислота выбрана из группы, состоящей из глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты и глицина. В вариантах осуществления, в которых аналог агониста глюкагона дополнительно содержит удлинение карбоксильного конца, аминокислота на карбоксильном конце удлинения в некоторых вариантах осуществления заканчивается амидной группой или сложноэфирной группой, а не группой карбоновой кислоты.

В другом варианте осуществления коагонист рецепторов глюкагона/GLP-1 содержит последовательность: NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Xaa-CONH₂ (SEQ ID NO:19), где Xaa в положении 30 означает любую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления Xaa выбрана из 20 обычных аминокислот, и в некоторых вариантах осуществления аминокислота является глутаминовой кислотой, аспарагиновой кислотой или глицином. Растворимость такого пептида может быть дополнительно повышена ковалентным связыванием цепи ПЭГ с боковой цепью аминокислоты в положении 17, 21, 24 или 30 SEQ ID NO:19. В следующем варианте осуществления пептид содержит дополнительное удлинение на карбоксильном конце пептида, выбранное из группы, состоящей из SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 и SEQ ID NO:28. Согласно некоторым вариантам осуществления коагонист рецепторов глюкагона/GLP-1 содержит SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31 и SEQ ID NO:32.

Могут быть осуществлены дополнительные сайт-специфичные модификации внутри последовательности глюкагона SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 и SEQ ID NO:64 с получением набора агонистов глюкагонов, которые обладают различной степенью агонизма GLP-1. Соответственно, были получены и охарактеризованы пептиды, которые обладают фактически идентичной эффективностью in vitro в отношении каждого рецептора. Подобным образом, идентифицированы и охарактеризованы пептиды с эффективностью, избирательно повышенной в десять раз в отношении каждого из двух рецепторов. Как указано выше, замена остатка серина в положении 16 глутаминовой кислотой повышает эффективность нативного глюкагона в отношении обоих рецепторов глюкагона и GLP-1, но сохраняет примерно десятикратную селективность в отношении рецептора глюкагона. Кроме того, замена нативного глутамина в положении 3 глутаминовой кислотой (SEQ ID NO:22) создает аналог глюкагона, который проявляет примерно десятикратную селективность в отношении рецептора GLP-1.

Растворимость пептидов-коагонистов глюкагона/GLP-1 может быть дополнительно повышена в водных растворах при физиологическом pH с сохранением при этом высокой биологической активности по сравнению с нативным глюкагоном путем введения гидрофильных групп в положениях 16, 17, 21, и 24 пептида, или при добавлении одной модифицированной аминокислоты (т.е. аминокислоты, модифицированной, чтобы содержать гидрофильную группу) на карбоксильном конце пептида-коагониста глюкагона/GLP-1. Согласно некоторым вариантам осуществления гидрофильная группа содержит цепь полиэтилена (ПЭГ). Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 или SEQ ID NO:18, где цепь ПЭГ ковалентно связана с боковой цепью аминокислоты в положении 16, 17, 21, 24, 29 или с C-концевой аминокислотой глюкагонового пептида, при условии, что когда пептид содержит SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:13, цепь полиэтиленгликоля ковалентно связана с остатком аминокислоты в положении 17, 21 или 24, когда пептид содержит SEQ ID NO:14 или SEQ ID NO:15, цепь полиэтиленгликоля ковалентно связана с остатком аминокислоты в положении 16, 17 или 21, и когда пептид содержит SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 или SEQ ID NO:18, цепь полиэтиленгликоля ковалентно связана с остатком аминокислоты в положении 17 или 21.

В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:13, где цепь ПЭГ ковалентно связана с боковой цепью аминокислоты в положении 17, 21, 24 или с C-концевой аминокислотой глюкагонового пептида, и аминокислота на карбоксильном конце пептида имеет амидную группу вместо группы карбоновой кислоты нативной аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления пептид-коагонист рецепторов глюкагона/GLP-1 содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:19, где цепь ПЭГ ковалентно связана с боковой цепью аминокислоты в положении 17, 21 или 24 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:19, или в положении 16, 17 или 21 SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15, или в положении 17 или 21 SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:18 глюкагонового пептида. В другом варианте осуществления пептид-коагонист рецепторов глюкагона/GLP-1 содержит последовательность SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:19, где цепь ПЭГ ковалентно связана с боковой цепью аминокислоты в положении 17, 21 или 24 или с C-концевой аминокислотой глюкагонового пептида.

Согласно некоторым вариантам осуществления и при условии ограничений, описанных в предыдущих абзацах, пептид-коагонист глюкагона модифицируют, чтобы он содержал одну или несколько аминокислотных замен в положениях 16, 17, 21, 24 или 29 или в положении C-концевой аминокислоты, где нативную аминокислоту заменяют аминокислотой, имеющей боковую цепь, подходящую для поперечного сшивания с гидрофильными остатками, включая например, ПЭГ. Нативный пептид может иметь замену встречающейся в природе аминокислотой или синтетической (не встречающейся в природе) аминокислотой. Синтетические или не встречающиеся в природе аминокислоты относятся к аминокислотам, которые не встречаются в природе in vivo, но которые, тем не менее, могут быть введены в пептидные структуры, описанные в настоящем описании. Альтернативно, аминокислота, имеющая боковую цепь, подходящую для поперечного сшивания с гидрофильными остатками, включая, например, ПЭГ, может быть добавлена к карбоксильному концу любого из аналогов глюкагона, описанных в настоящем описании. Согласно некоторым вариантам осуществления аминокислотную замену проводят в пептиде-коагонисте рецепторов глюкагона/GLP-1 в положении, выбранном из группы, состоящей из положений 16, 17, 21, 24 или 29, заменяя нативную аминокислоту аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лизина, цистеина, орнитина, гомоцистеина и ацетилфенилаланина, где заменяющая аминокислота дополнительно содержит цепь ПЭГ, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:19, дополнительно модифицируют, чтобы он содержал цепь ПЭГ, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты в положении 17 или 21 глюкагонового пептида. В некоторых вариантах осуществления пегилированный коагонист рецепторов глюкагона/GLP-1 дополнительно содержит последовательность SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 или SEQ ID NO:29.

В другом варианте осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность SEQ ID NO:55 или SEQ ID NO:56, дополнительно содержащую C-концевое удлинение SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:29 или SEQ ID NO:65, связанное с C-концевой аминокислотой SEQ ID NO:55 или SEQ ID NO:56, и необязательно дополнительно содержащую цепь ПЭГ, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты в положении 17, 18, 21, 24 или 29 или с C-концевой аминокислотой пептида. В другом варианте осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность SEQ ID NO:55 или SEQ ID NO:56, где цепь ПЭГ ковалентно связана с боковой цепью аминокислоты в положении 21 или 24 глюкагонового пептида, и пептид дополнительно содержит C-концевое удлинение SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:29.

В другом варианте осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность SEQ ID NO:55 или SEQ ID NO:33, или SEQ ID NO:34, где дополнительная аминокислота добавлена к карбоксильному концу SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:34, и цепь ПЭГ ковалентно связана с боковой цепью добавляемой аминокислоты. В следующем варианте осуществления пегилированный аналог глюкагона, кроме того, содержит C-концевое удлинение SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:29, связанное с C-концевой аминокислотой SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:34. В другом варианте осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность SEQ ID NO:19, где цепь ПЭГ ковалентно связана с боковой цепью аминокислоты в положении 30 глюкагонового пептида, и пептид дополнительно содержит C-концевое удлинение SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:29, связанное с C-концевой аминокислотой SEQ ID NO:19.

Цепь полиэтиленгликоля может быть в форме неразветвленной цепи или может быть разветвленной. Согласно некоторым вариантам осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет среднюю молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 500 до примерно 10000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет среднюю молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон. В альтернативном варианте осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет среднюю молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 10000 до примерно 20000 дальтон. Согласно некоторым вариантам осуществления пегилированный глюкагоновый пептид содержит две или более цепей полиэтиленгликоля, ковалентно связанных с глюкагоновым пептидом, где общая молекулярная масса глюкагоновых цепей составляет примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления пегилированный агонист глюкагона содержит пептид, состоящий из SEQ ID NO:5, или аналог агониста глюкагона SEQ ID NO:5, где цепь ПЭГ ковалентно связана с аминокислотным остатком в положении 21 и в положении 24, и где объединенная молекулярная масса двух цепей ПЭГ составляет примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон.

В некоторых примерах вариантов осуществления глюкагоновый пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, имеющую до десяти модификаций аминокислот, и содержит аминокислоту в положении 10, которая ацилирована или алкилирована. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 10 ацилирована или алкилирована C4-C30 жирной кислотой. В некоторых аспектах аминокислота в положении 10 содержит ацильную группу или алкильную группу, которая не является нативной для встречающейся в природе аминокислоты.

В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид, содержащий аминокислоту в положении 10, которая ацилирована или алкилирована, имеет стабилизированную альфа-спираль. Соответственно, в некоторых аспектах глюкагоновый пептид содержит ацильную или алкильную группу, которая описана в настоящем описании, и внутримолекулярный мостик, например, ковалентный внутримолекулярный мостик (например, лактамовый мостик) между боковыми цепями аминокислоты в положении i и аминокислоты в положении i+4, где i равно 12, 16, 20 или 24. Альтернативно или дополнительно, глюкагоновый пептид содержит ацильную или алкильную группу, которая описана в настоящем описании, и аминокислоты в одном, двух, трех или более положениях 16, 20, 21 и/или 24 глюкагонового пептида заменена α,α-дизамещенной аминокислотой, например, AIB. В некоторых случаях ненативный глюкагоновый пептид содержит Glu в положении 16 и Lys в положении 20, где необязательно лактамовый мостик связывает Glu и Lys, и необязательно глюкагоновый пептид дополнительно содержит одну или несколько модификаций, выбранных из группы, состоящей из: Gln в положении 17, Ala в положении 18, Glu в положении 21, Ile в положении 23 и Ala в положении 24.

Также в любом из вариантов осуществления, в которых глюкагоновый пептид содержит аминокислоту в положении 10, которая ацилирована или алкилирована, глюкагоновый пептид может дополнительно содержать C-концевой амид вместо C-концевого альфа-карбоксилата.

В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид, содержащий ацильную или алкильную группу, которая описана в настоящем описании, дополнительно содержит аминокислотную замену в положении 1, в положении 2 или в положениях 1 и 2, где аминокислотная замена (замены) придают устойчивость к протеазе DPP-IV. Например, His в положении 1 может быть заменен аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из: D-гистидина, альфа,альфа-диметилимидазолуксусной кислоты (DMIA), N-метилгистидина, альфа-метилгистидина, имидазолуксусной кислоты, дезаминогистидина, гидроксилгистидина, ацетилгистидина и гомогистидина. Альтернативно или дополнительно, Ser в положении 2 может быть заменен аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из: D-серина, аланина, D-аланина, валина, глицина, N-метилсерина, N-метилаланина и аминоизомасляной кислоты. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 2 не является D-серином.

Глюкагоновый пептид, содержащий аминокислоту в положении 10, которая ацилирована или алкилирована, как описано в настоящем описании, может содержать любую аминокислотную последовательность, которая по существу родственна SEQ ID NO:1. Например, глюкагоновый пептид содержит SEQ ID NO:1, включающую до 10 модификаций аминокислот (например, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 модификаций). В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность ацилированного или алкилированного глюкагонового пептида более чем на 25% идентична последовательности SEQ ID NO:1 (например, больше чем на 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или почти на 100% идентична последовательности SEQ ID NO:1). В некоторых конкретных вариантах осуществления глюкагоновый пептид представляет собой пептид, который содержит SEQ ID NO:55, в которой аминокислота в положении 10 ацилирована или алкилирована, как описано в настоящем описании. Глюкагоновый пептид может иметь любую из SEQ ID NO:55, 55 с 1 или 2 модификациями аминокислот, 2-4, 9-18, 20, 23-25, 33, 40-44, 53, 56, 61, 62, 64, 66-514 и 534.

Ацильная или алкильная группа согласно указанным вариантам осуществления может представлять собой любую ацильную или алкильную группу, описанную в настоящем описании. Например, ацильной группой может быть C4-C30 (например, C8-C24) жирная ацильная группа, и алкильной группой может быть C4-C30 (например, C8-C24) алкильная группа.

Аминокислота, с которой ацильная или алкильная группа связана, может представлять собой любую аминокислоту, описанную в настоящем описании, например, аминокислоту формулы I (например, Lys), формулы II и формулы III.

В некоторых вариантах осуществления ацильная группа или алкильная группа непосредственно связана с аминокислотой в положении 10. В некоторых вариантах осуществления ацильная или алкильная группа связана с аминокислотой в положении 10 через спейсер, такой как, например, спейсер, который имеет длину от 3 до 10 атомов, например, аминокислота или дипептид. Спейсеры, подходящие для целей связывания ацильной или алкильной группы, описаны в настоящем описании.

Согласно некоторым вариантам осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 может представлять собой аналог любого из вышеуказанных родственных глюкагону пептидов класса 3, которые описаны в настоящем описании, и такой аналог проявляет агонистическую активность в отношении рецептора GIP. Уровень активности аналога в отношении рецептора глюкагона, рецептора GLP-1 и рецептора GIP, эффективность в отношении каждого из таких рецепторов и селективность в отношении каждого из таких рецепторов могут соответствовать показателям для родственных глюкагону пептидам класса 2, описанным в настоящем описании. См. описание в подразделе, озаглавленном «Активность», в разделе, посвященном родственным глюкагону пептидам класса 2.

В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагается аналог глюкагонового пептида, и такой аналог проявляет агонистическую активность в отношении рецептора GIP. Аналог в некоторых вариантах осуществления имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, содержащую по меньшей мере одну модификацию аминокислоты (необязательно, вплоть до 15 модификаций аминокислот), и удлинение из 1-21 аминокислоты, расположенное с C-концевой стороны от аминокислоты в положении 29 аналога.

В некоторых аспектах аналоги содержат по меньшей мере одну модификацию аминокислоты и до 15 модификаций аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 модификаций аминокислот, до 10 модификаций аминокислот). В некоторых вариантах осуществления аналоги содержат по меньшей мере одну модификацию аминокислоты и до 10 модификаций аминокислот и дополнительные консервативные модификации аминокислот. Консервативные модификации аминокислот описаны в настоящем описании.

В некоторых аспектах по меньшей мере одна из модификаций аминокислот придает стабилизированную альфа-спиральную структуру в C-концевой части аналога. Модификации, которые обеспечивают стабилизированную альфа-спиральную структуру, описаны в настоящем описании. См., например, описание в разделе, озаглавленном «Стабилизация альфа-спирали/внутримолекулярные мостики». В некоторых аспектах аналог содержит внутримолекулярный мостик (например, ковалентный внутримолекулярный мостик, нековалентный внутримолекулярный мостик) между боковыми цепями двух аминокислот аналога. В некоторых аспектах внутримолекулярный мостик связывает боковые цепи аминокислот в положениях i и i+4, где i равно 12, 13, 16, 17 20 или 24. В других аспектах внутримолекулярный мостик соединяет боковые цепи аминокислот в положениях j и j+3, где j равно 17, или в положениях k и k+7, где k означает любое целое число от 12 до 22. В некоторых вариантах осуществления внутримолекулярный мостик является ковалентным внутримолекулярным мостиком, например, лактамовым мостиком. В конкретных аспектах лактамовый мостик соединяет боковые цепи аминокислот в положениях 16 и 20. В конкретных аспектах одна из аминокислот в положениях 16 и 20 является положительно заряженной аминокислотой, а другая аминокислота является отрицательно заряженной аминокислотой. Например, аналог может содержать лактамовый мостик, связывающий боковые цепи Glu в положении 16 и Lys в положении 20. В других аспектах отрицательно заряженная аминокислота и положительно заряженная аминокислота образуют солевой мостик. В этом случае внутримолекулярный мостик является нековалентным внутримолекулярным мостиком.

В конкретных аспектах модификацией аминокислоты, которая обеспечивает стабилизацию альфа-спирали, является инсерция или замена аминокислоты последовательности SEQ ID NO:1 α,α-дизамещенной аминокислотой. α,α-Дизамещенные аминокислоты, подходящие для целей стабилизации альфа-спирали, описаны в настоящем описании и включают, например, AIB. В некоторых аспектах одна, две, три или более аминокислот в положениях 16, 20, 21 и 24 последовательности SEQ ID NO:1 заменяют α,α-дизамещенной аминокислотой, например, AIB. В конкретных вариантах осуществления аминокислотой в положении 16 является AIB.

Аналог, который проявляет агонистическую активность в отношении рецептора GIP, может содержать дополнительные модификации, такие как любая из модификаций, описанных в настоящем описании. Например, модификации аминокислот могут повышать или понижать активность в отношении одного или обоих рецепторов: рецептора GLP-1 и рецептора глюкагона. Модификации аминокислот могут повышать стабильность пептида, например повышать устойчивость к разложению протеазой DPP-IV, стабилизировать связь между аминокислотами 15 и 16. Модификации аминокислот могут повышать растворимость пептида и/или изменять время действия аналога в отношении любого из рецепторов GIP, глюкагона и GLP-1. Комбинация любого из указанных типов модификаций может присутствовать в аналогах, которые проявляют агонистическую активность в отношении рецептора GIP.

Соответственно, в некоторых аспектах аналог содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 с одной или несколькими из следующих аминокислот: Gln в положении 17, Ala в положении 18, Glu в положении 21, Ile в положении 23 и Ala или Cys в положении 24, или их консервативными аминокислотными заменами. В некоторых аспектах аналог содержит C-концевой амид вместо C-концевого альфа-карбоксилата. В некоторых вариантах осуществления аналог содержит аминокислотную замену в положении 1, положении 2 или положениях 1 и 2, и такие замены обеспечивают устойчивость к протеазе DPP-IV. Подходящие аминокислотные замены описаны в настоящем описании. Например, DMIA в положении 1 и/или d-Ser или AIB в положении 2. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 2 не является D-серином.

Дополнительно или альтернативно, аналог может содержать одну или комбинацию следующих модификаций: (a) Ser в положении 2, замененный Ala; (b) Gln в положении 3, замененный Glu или аналогом глутамина; (c) Thr в положении 7, замененный Ile; (d) Tyr в положении 10, замененный Trp или аминокислотой, содержащей ацильную или алкильную группу, которая не является нативной для встречающейся в природе аминокислоты; (e) Lys в положении 12, замененный Ile; (f) Asp в положении 15, замененный Glu; (g) Ser в положении 16, замененный Glu; (h) Gln в положении 20, замененный Ser, Thr, Ala, AIB; (i) Gln в положении 24, замененный Ser, Thr, Ala, AIB; (j) Met в положении 27, замененный Leu или Nle; (k) Asn в положении 29, замененный заряженной аминокислотой, необязательно, Asp или Glu; и (l) Thr в положении 29, замененный Gly или заряженной аминокислотой, необязательно, Asp или Glu.

В некоторых аспектах аналог не содержит модификации аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP. В некоторых аспектах аминокислота в положении 1 не является крупной ароматической аминокислотой, например, Tyr. В некоторых вариантах осуществления аминокислотой в положении 1 является аминокислота, содержащая имидазольное кольцо, например, His, аналоги His. В некоторых вариантах осуществления аналог не является любым из соединений, описанных в патентной заявке США № 61/151349. В некоторых аспектах аналог содержит любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:657-669.

Что касается аналогов, которые проявляют агонистическую активность в отношении рецептора GIP, то аналог содержит удлинение из 1-21 аминокислоты (например, 5-19, 7-15, 9-12 аминокислот). Удлинение аналога может содержать любую аминокислотную последовательность, при условии, что удлинение состоит из 1-21 аминокислоты. В некоторых аспектах удлинение состоит из 7-15 аминокислот, и в других аспектах удлинение состоит из 9-12 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления удлинение содержит (i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26 или 674, (ii) аминокислотную последовательность, которая имеет высокую идентичность последовательности (например, по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:26 или 674, или (iii) аминокислотную последовательность по (i) или (ii) с одной или несколькими консервативными модификациями аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна из аминокислот удлинения ацилирована или алкилирована. Аминокислота, содержащая ацильную или алкильную группу может находиться в любом положении удлинения аналога. В некоторых вариантах осуществления ацилированная или алкилированная аминокислота удлинения находится в одном из положений 37, 38, 39, 40, 41 или 42 (согласно нумерации в SEQ ID NO:1) аналога. В некоторых вариантах осуществления ацилированная или алкилированная аминокислота находится в положении 40 аналога.

В примерах вариантов осуществления ацильная или алкильная группа представляет собой ацильную или алкильную группу, которая не является нативной для встречающейся в природе аминокислоты. Например, ацильная или алкильная группа может представлять собой C4-C30 (например, C12-C18) жирную ацильную группу или C4-C30 (например, C12-C18) алкил. Ацильной или алкильной группой может быть любая группа, обсуждаемая в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления ацильная или алкильная группа непосредственно связана с аминокислотой, например, с боковой цепью аминокислоты. В других вариантах осуществления ацильная или алкильная группа связана с аминокислотой через спейсер (например, аминокислоту, дипептид, трипептид, гидрофильный бифункциональный спейсер, гидрофобный бифункциональный спейсер). В некоторых аспектах спейсер имеет 3-10 атомов в длину. В некоторых вариантах осуществления аминокислотным спейсером не является γ-Glu. В некоторых вариантах осуществления дипептидным спейсером не является γ-Glu-γ-Glu.

Также в примерах вариантов осуществления аминокислота, с которой связана ацильная или алкильная группа, может быть любой из аминокислот, описанных в настоящем описании, включая, например, аминокислоту формулы I, II или III. Аминокислотой, которая ацилирована или алкилирована, может быть, например, Lys. Подходящие аминокислоты, содержащие ацильную или алкильную группу, а также подходящие ацильные группы и алкильные группы описаны в настоящем описании. См., например, описания в разделах, озаглавленных «Ацилирование и алкилирование».

В других вариантах осуществления 1-6 аминокислот (например, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5 аминокислот) удлинения являются положительно заряженными аминокислотами, например, аминокислотами формулы IV, такими как, например, Lys. Как используется в настоящем описании, термин «положительно заряженная аминокислота» относится к любой аминокислоте, встречающейся в природе или не встречающейся в природе, имеющей положительный заряд на атоме своей боковой цепи при физиологическом pH. В некоторых аспектах положительно заряженные аминокислоты находятся в любом из положений 37, 38, 39, 40, 41, 42 и 43. В конкретных вариантах осуществления положительно заряженная аминокислота находится в положении 40.

В других случаях, удлинение ацилировано или алкилировано, как описано в настоящем описании, и содержит 1-6 положительно заряженных аминокислот, как описано в настоящем описании.

В следующих вариантах осуществления аналоги, которые проявляют агонистическую активность в отношении рецептора GIP, содержат (i) последовательность SEQ ID NO:1 по меньшей мере с одной модификацией аминокислоты, (ii) удлинение из 1-21 аминокислоты (например, от 5 до 18, от 7 до 15, от 9 до 12 аминокислот) с C-концевой стороны от аминокислоты в положении 29 аналога, и (iii) аминокислоту, содержащую ацильную или алкильную группу, которая не является нативной для встречающейся в природе аминокислоты, которая находится вне C-концевого удлинения (например, в любом из положений 1-29). В некоторых вариантах осуществления аналог содержит ацилированную или алкилированную аминокислоту в положении 10. В конкретных аспектах ацильной или алкильной группой является C4-C30 жирная ацильная или C4-C30 алкильная группа. В некоторых вариантах осуществления ацильная или алкильная группа связана через спейсер, например, аминокислоту, дипептид, трипептид, гидрофильный бифункциональный спейсер, гидрофобный бифункциональный спейсер). В некоторых аспектах аналог содержит модификацию аминокислоты, которая стабилизирует альфа-спираль, такую как солевой мостик между Glu в положении 16 и Lys в положении 20, или альфа,альфа-дизамещенную аминокислоту в любом одном, двух, трех или более положениях 16, 20, 21 и 24. В конкретных аспектах аналог дополнительно содержит модификации аминокислот, которые придают устойчивость к протеазе DPP-IV, например, DMIA в положении 1, AIB в положении 2. Аналоги, содержащие дополнительные модификации аминокислот, рассмотрены в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления аналоги, обладающие активностью в отношении рецептора GIP, проявляют активность, составляющую по меньшей мере 0,1% (например, по меньшей мере 0,5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15% или 20%) от активности нативного GIP в отношении рецептора GIP. В некоторых вариантах осуществления аналоги проявляют активность, составляющую более чем 20% (например, более чем 50%, более чем 75%, более чем 100%, более чем 200%, более чем 300%, более чем 500%) от активности нативного GIP в отношении рецептора GIP. В некоторых вариантах осуществления аналог проявляет заметную агонистическую активность в отношении одного или обоих рецепторов GLP-1 и глюкагона. В некоторых аспектах селективность в отношении таких рецепторов (рецептора GIP и рецептора GLP-1 и/или рецептора глюкагона) находится в пределах 1000-кратной селективности. Например, селективность в отношении рецептора GLP-1 аналогов, обладающих активностью в отношении рецептора GIP, может быть менее чем 500-кратной, 100-кратной (в пределах 50-кратной, в пределах 25-кратной, в пределах 15-кратной, в пределах 10-кратной) селективностью в отношении рецептора GIP и/или рецептора глюкагона.

В конкретных аспектах аналог содержит структуры любой из SEQ ID NO:657-669.

Согласно некоторым вариантам осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 содержит аминокислотную последовательность нативного глюкагона (SEQ ID NO:1), имеющую следующие модификации: AIB в положении 2, Glu в положении 3, Lys в положении 10, Glu в положении 16, Gln в положении 17, Ala в положении 18, Lys в положении 20, Glu в положении 21, Ile в положении 23, Ala в положении 24; где Lys в положении 10 ацилирован C14-C16 жирной кислотой, и где C-концевой карбоксилат заменен амидом. В конкретном варианте осуществления такой родственный глюкагону пептид класса 3 связан своей N-концевой аминокислотой с дипептидом D-Lys-саркозин.

Согласно некоторым вариантам осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 содержит, по существу состоит или состоит из любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:70-514, 517-534 или 554, необязательно с 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительными модификациями, которые сохраняют активность агониста GLP-1 и/или агониста глюкагона. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 содержит аминокислоты любой из SEQ ID NO:562-684 и 1701-1776. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 содержит любые из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1801-1921.

Родственные глюкагону пептиды класса 4

В некоторых вариантах осуществления родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 4 (см., например, международную патентную заявку (PCT) № PCT/US2008/080973, включенную в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте).

Все биологические последовательности, указанные в следующем разделе (SEQ ID NO:1301-1371) соответствуют SEQ ID NO:1-71 в международной патентной заявке № PCT/US2008/080973.

Активность

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагаются родственные глюкагону пептиды класса 4 (в дальнейшем называемые «пептидами класса 4»). В некоторых аспектах предлагается пептид класса 4, который обладает активностью антагониста глюкагона. Антагонисты глюкагона могут быть использованы в любых ситуациях, когда требуется подавление агонизма глюкагона. Наиболее безотлагательным и очевидным использованием может быть применение при лечении диабета, при котором, как показано на доклинических моделях гипергликемии, антагонизм глюкагона приводит к снижению уровня глюкозы в крови. Антагонисты глюкагона могут быть дополнительно модифицированы, чтобы повысить биофизическую стабильность и/или растворимость соединений в воде, сохраняя при этом антагонистическую активность исходного соединения. В некоторых аспектах пептид класса 4 определяют как абсолютный антагонист глюкагона.

Термин «антагонист глюкагона» относится к соединению, которое нейтрализует активность глюкагона или препятствует функционированию глюкагона. Например, антагонист глюкагона дает по меньшей мере 60% ингибирование (например, по меньшей мере 70% ингибирование) и предпочтительно по меньшей мере 80% ингибирование максимального ответа, достигаемого глюкагоном в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления антагонист глюкагона обеспечивает по меньшей мере 90% ингибирование максимального ответа, достигаемого глюкагоном в отношении рецептора глюкагона. В конкретном варианте осуществления антагонист глюкагона дает 100% ингибирование максимального ответа, достигаемого глюкагоном в отношении рецептора глюкагона. Дополнительно антагонист глюкагона в концентрации примерно 1 мкМ проявляет менее чем примерно 20% от максимальной агонистической активности, достигаемой глюкагоном в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления антагонист глюкагона проявляет менее чем примерно 10% от максимальной агонистической активности, достигаемой глюкагоном в отношении рецептора глюкагона. В конкретном варианте осуществления антагонист глюкагона проявляет менее чем примерно 5% от максимальной агонистической активности, достигаемой глюкагоном в отношении рецептора глюкагона. В следующем конкретном варианте осуществления антагонист глюкагона проявляет 0% от максимальной агонистической активности, достигаемой глюкагоном в отношении рецептора глюкагона.

Термин «абсолютный антагонист глюкагона» означает антагонист глюкагона, который не вызывает какой-либо регистрируемой стимуляции активности рецептора глюкагона или GLP-1, как измерено по продуцированию цАМФ с использованием подтвержденного анализа на модели in vitro (см., например, PCT/US2008/080973). Например, абсолютный антагонист глюкагона проявляет активность, составляющую менее чем примерно 5% (например, менее чем примерно 4%, менее чем примерно 3%, менее чем примерно 2%, менее чем примерно 1%, примерно 0%) от максимальной агонистической активности, достигаемой глюкагоном в отношении рецептора глюкагона и проявляет активность, составляющую менее чем примерно 5% (например, менее чем примерно 4%, менее чем примерно 3%, менее чем примерно 2%, менее чем примерно 1%, и примерно 0%) от максимальной агонистической активности, достигаемой GLP-1 в отношении рецептора GLP-1.

Соответственно, в некоторых аспектах предлагаются пептиды класса 4, которые проявляют активность абсолютного антагониста глюкагона. Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист глюкагона проявляет активность, которая уменьшает индуцированное рецептором глюкагона продуцирование цАМФ в максимальном случае по меньшей мере на 50%, когда рецептор глюкагона одновременно подвергается контакту с 0,8 нМ глюкагона и антагонистом глюкагона, как измерено по продуцированию цАМФ в анализе in vitro. В некоторых вариантах осуществления антагонист глюкагона снижает индуцированное рецептором глюкагона продуцирование цАМФ максимально по меньшей мере на 80%.

Полагают, что пептиды класса 4 являются подходящими для любого применения, которое было описано выше для антагонистов глюкагона. Соответственно, пептиды класса 4, описанные в настоящем описании, можно применять для лечения гипергликемии или лечения других метаболических заболеваний, которые возникают в результате высоких уровней глюкагона в крови или высоких уровней глюкозы в крови. Согласно некоторым вариантам осуществления пациентом, которого можно лечить с применением пептидов класса 4, описанных в настоящем описании, является домашнее животное, и в другом варианте осуществления пациентом, которого можно лечить, является человек. Исследования свидетельствуют, что отсутствие подавления глюкагона у пациентов с диабетом вносит вклад в развитие постпрандиальной гипергликемии, отчасти из-за повышенного гликогеноза. Анализ глюкозы в крови в ходе перорального теста на толерантность к глюкозе (ПТТГ), и в присутствии или отсутствии индуцированной соматостатином подавления глюкагона, показал значительное увеличение уровня глюкозы у субъектов с более высокими уровнями глюкагона. Соответственно, пептиды класса 4 настоящего изобретения можно применять для лечения гипергликемии, и как предполагают, они полезны при лечении диабета различных типов, включая сахарный диабет типа I, сахарный диабет типа II или гестационный диабет, либо инсулинозависимый, либо инсулиннезависимый, и для уменьшения осложнений диабета, включая нефропатию, ретинопатию и заболевание сосудов.

В некоторых вариантах осуществления десять концевых аминокислот эксендина-4 (т.е. последовательность SEQ ID NO:1319 (GPSSGAPPPS)) связаны с карбоксильным концом пептида класса 4. Предполагается, что такие слитые белки обладают фармакологической активностью для подавления аппетита и индуцирования потери массы/поддержания массы. Согласно некоторым вариантам осуществления пептиды класса 4, описанные в настоящем описании, могут быть дополнительно модифицированы, чтобы они включали аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1319 (GPSSGAPPPS), связанную с аминокислотой 24 пептида класса 4 с последовательностью SEQ ID NO:1342, и могут быть введены пациентам, для индуцирования потери массы или способствовать поддержанию массы. Более конкретно, пептид класса 4, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1302, SEQ ID NO:1303, SEQ ID NO:1304 SEQ ID NO:1305, SEQ ID NO:1306, SEQ ID NO:1307, SEQ ID NO:1308, SEQ ID NO:1336, SEQ ID NO:1339, SEQ ID NO:1340 SEQ ID NO:1341, SEQ ID NO:1342, SEQ ID NO:1343 и SEQ ID NO:1344, и дополнительно содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1319 (GPSSGAPPPS), связанную с аминокислотой 24 пептида класса 4, применяют для подавления аппетита и индукции потери массы/поддержания массы. В некоторых вариантах осуществления вводимый пептид класса 4 содержит последовательность SEQ ID NO:1346 или SEQ ID NO:1347.

Такие способы снижения аппетита или стимуляции потери массы тела, как предполагают, полезны при снижении массы тела, предотвращении прироста массы или лечении ожирения в различных случаях, включая индуцированное лекарственными средствами ожирение, и для уменьшения осложнений, ассоциированных с ожирением, включая заболевание сосудов (болезнь коронарных артерий, инсульт, заболевание периферических сосудов, ишемически-реперфузионный синдром и т.д.), гипертензию, появление диабета типа II, гиперлипидемию и скелетно-мышечные заболевания.

Пептиды класса 4 согласно изобретению можно вводить отдельно или в комбинации с другими противодиабетическими средствами или средствами против ожирения. Противодиабетические средства, известные в данной области или проходящие испытания, включают инсулин, сульфонилмочевины, такие как толбутамид (ориназа), ацетогексамид (димелор), толазамид (толиназа), хлорпропамид (диабинез), глипизид (глюкотрол), глибурид (диабета, микроназа, глиназа), глимепирид (амарил) или гликлазид (диамикрон); меглитиниды, такие как репаглинид (прандин) или натеглинид (старликс); бигуаниды, такие как метформин (глюкофаж) или фенформин; тиазолидиндионы, такие как росиглитазон (авандия), пиоглитазон (актос) или троглитазон (резулин) или другие ингибиторы PPARγ; ингибиторы альфа-глюкозидазы, которые ингибируют усвоение углеводов, такие как миглитол (глисет), акарбоза (прекоза/глюкобай); эксенатид (байетта) или прамлинтид; ингибиторы дипептидилпептидазы-4 (DPP-4), такие как вилдаглиптин или ситаглиптин; ингибиторы SGLT (натрий-зависимого переносчика глюкозы 1); или ингибиторы FBP-азы (фруктоза-1,6-бисфосфатазы).

Средства против ожирения, известные в данной области или проходящие испытания, включают средства подавления аппетита, включая стимуляторы фенетиламинного типа, фентермин (необязательно с фенфлурамином или дексфенфлурамином), диэтилпропион (Tenuate®), фендиметразин (Prelu-2®, Bontril®), бензфетамин (Didrex®), сибутрамин (Meridia®, Reductil®); римонабант (Acomplia®), другие антагонисты рецептора каннабиноидов; оксинтомодулин; гидрохлорид флуоксетина (прозак); кунекса (топирамат и фентермин), экскалия (бупропион и зонисамид) или контрав (бупропион и налтрексон); или ингибиторы липазы, подобные ксеникалу (орлистат) или цетилистату (также известному как ATL-962) или GT 389-255.

Пептиды класса 4 настоящего изобретения также можно вводить пациентам, страдающим от катаболического истощения. Установлено, что более половины пациентов со злокачественными опухолями испытывают катаболическое истощение, которое характеризуется непреднамеренной и прогрессирующей потерей массы, слабостью и низким содержанием жира и мышечной ткани. Синдром в равной мере распространен среди пациентов со СПИДом, а также может иметь место в случае бактериальных и паразитических заболеваний, ревматоидного артрита и хронических заболеваний кишечника, печени, легких и сердца. Синдром обычно ассоциирован с анорексией и может проявляться в виде состояния при старении или в результате физической травмы. Катаболическое истощение является симптомом, который снижает качество жизни, ухудшает лежащее в основе состояние и является основной причиной смерти. Авторы настоящего изобретения полагают, что пептиды класса 4, описанные в настоящем описании, можно вводить пациентам для лечения катаболического истощения.

Фармацевтические композиции, содержащие пептиды класса 4, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть составлены и введены пациентам с использованием стандартных фармацевтически приемлемых носителей и путей введения, известных специалистам в данной области. Соответственно, настоящее описание также охватывает фармацевтические композиции, содержащие один или несколько пептидов класса 4, раскрытых в настоящем изобретении, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтические композиции могут содержать пептиды класса 4 в качестве единственного фармацевтически активного компонента, или пептиды класса 4 можно сочетать с одним или несколькими дополнительными активными средствами. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается композиция, содержащая пептид класса 4 настоящего изобретения и соединение, которое активирует рецептор GLP-1 (такое как GLP-1, аналог GLP-1, аналог эксендина-4 или их производные). Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается композиция, содержащая пептид класса 4 настоящего изобретения и инсулин или аналог инсулина. Альтернативно, может быть получена композиция, предлагаемая для индуцирования потери массы или предотвращения прироста массы, которая содержит последовательность SEQ ID NO:1342, дополнительно содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1319 (GPSSGAPPPS), связанную с аминокислотой 24 SEQ ID NO:1342, и пептид против ожирения. Подходящие пептиды против ожирения включают пептиды, описанные в патентах США 5691309, 6436435 или в патентной заявке США 20050176643, и включают, но без ограничения, GLP-1, GIP (желудочный ингибирующий полипептид), MP1, PYY, MC-4, лептин.

Структура пептидов класса 4

В некоторых вариантах осуществления предлагаются родственные глюкагону пептиды класса 4, где встречающаяся в норме аспарагиновая кислота в положении девять (глюкагона, SEQ ID NO:1301) была заменена глутаминовой кислотой или основанным на цистеиновой кислоте производным. Более конкретно, делеция первой аминокислоты (дез-His) и замена аспарагиновой кислоты в положении 9 глутаминовой кислотой в некоторых аспектах дает пептид класса 4. Родственные глюкагону пептиды класса 4, имеющие в качестве заместителей сульфоновую кислоту, при замене аминокислоты в положении девять глюкагона, демонстрируют эффективность, подобную основанным на карбоновой кислоте аминокислотам, но с некоторыми важными отличиями в отношении физических свойств, таких как растворимость. При замене гомоцистеиновой кислотой (hCysSO₃) изостерической глутаминовой кислоты в положении девять в обычном des-His, Glu9-пептиде класса 4, сохраняется активность частичного антагониста и слабого агониста.

В некоторых вариантах осуществления предлагается пептид класса 4, в котором первые две-пять аминокислот удалены, и аминокислота в положении 9 (согласно нумерации в SEQ ID NO:1301) заменена hCys(SO₃), гомоглутаминовой кислотой, β-гомоглутаминовой кислотой или алкилкарбоксилатным производным цистеина, имеющим структуру:

где X₅ означает C₁-C₄алкил, C₂-C₄алкенил или C₂-C₄алкинил, с получением соединения, которое действует как гормональный антагонист, который является высокоспецифичным, эффективным и не имеющим примеси агонистических свойств.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 4, который содержит глюкагоновый пептид, модифицированный по сравнению с последовательностью дикого типа SEQ ID NO:1301 делецией двух-пяти аминокислотных остатков на N-конце и заменой остатка аспарагиновой кислоты в положении девять нативного белка глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой, β-гомоглутаминовой кислотой, производным цистеина на основе сульфоновой кислоты или алкилкарбоксилатным производным цистеина, имеющим структуру:

,

где X₅ означает C₁-C₄алкил, C₂-C₄алкенил или C₂-C₄алкинил.

В одном конкретном варианте осуществления пептид класса 4, содержащий делецию двух-пяти аминокислотных остатков на N-конце и замену Asp в положении 9 нативного глюкагона, дополнительно модифицируют, используя до трех модификаций аминокислот. Например, пептид класса 4 может содержать одну, две или три консервативных модификаций аминокислот. Альтернативно или дополнительно, пептид класса 4 может содержать одну или несколько модификаций аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:

A) замены одной или двух аминокислот в положениях 10, 20 и 24 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1301) или N- или C-концевой аминокислоты пептида класса 4 аминокислотой, ковалентно связанной с ацильной группой или алкильной группой через сложноэфирную, простую эфирную, тиоэфирную, амидную или алкиламинную связь;

B) замены одной или двух аминокислот в положениях 16, 17, 20, 21 и 24 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1301) или N- или C-концевой аминокислоты пептида класса 4 аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из: Cys, Lys, орнитина, гомоцистеина и ацетилфенилаланина (Ac-Phe), где аминокислота из группы ковалентно связана с гидрофильным остатком;

C) добавления аминокислоты, ковалентно связанной с гидрофильным остатком, к N- или C-концу пептида класса 4;

D) замены Asp в положении 15 (согласно нумерации в SEQ ID NO:1301) цистеиновой кислотой, глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой и гомоцистеиновой кислотой;

E) замены Ser в положении 16 (согласно нумерации в SEQ ID NO:1301) цистеиновой кислотой, глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой и гомоцистеиновой кислотой;

F) замены на AIB в одном или нескольких положениях 16, 20, 21 и 24 согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1301;

G) делеции аминокислоты в положении 29 или аминокислот в положениях 28 и 29 согласно нумерации в SEQ ID NO:1301;

H) замены любой одной или обеих аминокислот: Asn в положении 28 и Thr в положении 29 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1301) заряженными аминокислотами; и/или добавления одной или двух заряженных аминокислот к C-концу SEQ ID NO:1301;

I) замены Met в положении 27 (согласно нумерации в SEQ ID NO:1301) на Leu или норлейцин;

J) добавления пептида, имеющего любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:19-21 и 53, к C-концу SEQ ID NO:1301; где аминокислотой в положении 29 (согласно нумерации в SEQ ID NO:1301) является Thr или Gly; и

K) замены C-концевого карбоксилата амидом или сложным эфиром.

В конкретном варианте осуществления пептид класса 4 содержит модификацию аминокислоты по п. A, B или C, которые описаны выше, или их комбинацию. В другом конкретном варианте осуществления пептид класса 4 дополнительно содержит модификацию аминокислоты по любому из D-K, как описано выше, или их комбинацию, в дополнение к модификации (модификациям) аминокислоты по A, B, и/или C.

В некоторых вариантах осуществления пептид класса 4 содержит глюкагоновый пептид, где первые 5 аминокислот были удалены с N-конца, и оставшаяся N-концевая аминогруппа заменена гидроксильной группой («аналог PLA6»), с получением пептида SEQ ID NO:1339. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что замена фенилаланина фенилмолочной кислотой в аналогах пептида класса 4, в которых делетированы первые пять аминокислот и имеется замена глутаминовой кислоты в положении 9 (в сравнении с нативным глюкагоном), дополнительно повышает эффективность таких аналогов пептидов класса 4.

В некоторых вариантах осуществления пептид класса 4 с SEQ ID NO:1339 дополнительно модифицируют заменой остатка аспарагиновой кислоты в положении четыре (положение 9 нативного глюкагона) аминокислотой общей структуры:

где X₆ означает C₁-C₃алкил, C₂-C₃алкенил или C₂-C₃алкинил, и в некоторых вариантах осуществления X₆ означает C₁-C₃алкил, и в другом варианте осуществления X₆ означает C₂алкил. В некоторых вариантах осуществления пептид класса 4 содержит глюкагоновый пептид, где первые 5 аминокислот удалены с N-конца и остаток аспарагиновой кислоты в положении четыре (положение 9 нативного глюкагона) заменен цистеиновой кислотой или гомоцистеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления пептид класса 4 содержит глюкагоновый пептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1339, SEQ ID NO:1307 и SEQ ID NO:1308. В некоторых вариантах осуществления пептид класса 4 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1308, где аминокислотой в положении четыре является гомоцистеиновая кислота.

В другом варианте осуществления пептид класса 4 с SEQ ID NO:1339 дополнительно модифицируют заменой остатка аспарагиновой кислоты в положении четыре (положение 9 нативного глюкагона) глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой, β-гомоглутаминовой кислотой или алкилкарбоксилатным производным цистеина, имеющим структуру:

,

где X₅ означает C₁-C₄алкил, C₂-C₄алкенил или C₂-C₄алкинил. В конкретном варианте осуществления X₅ означает C₁ или C₂алкил.

Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что при замене N-концевого фенилаланина на PLA в дез-1-5-аналоге глюкагона (т.е. аналоге глюкагона, имеющего первые пять делетированных аминокислот), дополнительная замена нативного остатка аспарагиновой кислоты в положении четыре (положении 9 нативного глюкагона) не требуется, чтобы получить аналог, который проявляет абсолютный антагонизм. Такой результат является неожиданным в свете данных известного уровня техники, по которым нативный остаток аспарагиновой кислоты в положении четыре должен быть заменен, чтобы получить высоко эффективные и сильнодействующие антагонисты аналогов глюкагона (2-29). Использование замены PLA повышает относительную эффективность Asp9-аналога до уровня, сравнимого с Glu9 и hCys(SO₃H)9-аналогами.

Замена остатка фенилаланина другими аналогами фенилаланина, включая 3,4-2F-фенилаланин (3,4-2F-Phe), 2-нафтилаланин (2-Nal), N-ацилфенилаланин (Ac-Phe), альфа-метилгидрокоричную кислоту (MCA) и бензилмалоновую кислоту (BMA), не действует так эффективно, как замена PLA.

Замена PLA в других участках, отличных от положения шесть (согласно нумерации аминокислот нативного глюкагона), включая замену в положениях 4 и 5, показала, что аналог PLA6 является значительно более эффективным антагонистом, чем аналоги глюкагона, имеющие немного удлиненный N-конец. Настоящее изобретение также охватывает аналоги, в которых N-концевая аминогруппа заменена ацилированными и алкилированными «O-концевыми» пептидами.

Кроме того, замена PLA6 не только повышает эффективность антагониста, но также играет важную роль в пегилировании. PLA6-аналоги могут быть избирательно пегилированы без восстановления агонизма глюкагона. В отсутствие замены PLA пегилирование аналога неожиданно индуцирует агонизм глюкагона. Такой агонизм глюкагона не наблюдается в случае пегилированных PLA6-аналогов. Исследовали несколько участков для пегилирования, включая положения 3, 6 и 19 (положения 8, 11 и 19 нативного глюкагона) и положение N-концевого аминокислотного остатка. В некоторых вариантах осуществления пегилирование осуществляют в положении 19 (положение 24 нативного глюкагона), так как указанный участок проявляет наиболее эффективный и избирательный антагонизм глюкагона.

В некоторых вариантах осуществления пептид класса 4 содержит общую структуру A-B-C, где A выбран из группы, состоящей из:

(i) фенилмолочной кислоты (PLA);

(ii) оксипроизводного PLA;

(iii) пептида из 2-6 аминокислот, в котором две последовательных аминокислоты пептида связаны сложноэфирной или простой эфирной связью;

B означает аминокислоты от i до 26 последовательности SEQ ID NO:1301, где i равно 3, 4, 5, 6 или 7, необязательно содержащей одну или несколько модификаций аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:

(iv) замены Asp в положении 9 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1301) Glu, производным Cys на основе сульфоновой кислоты, гомоглутаминовой кислотой, β-гомоглутаминовой кислотой или алкилкарбоксилатным производным цистеина, имеющим структуру:

,

где X₅ означает C₁-C₄алкил, C₂-C₄алкенил или C₂-C₄алкинил.

(v) замены одной или двух аминокислот в положениях 10, 20 и 24 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1301) аминокислотой, ковалентно связанной с ацильной или алкильной группой, сложноэфирной, простой эфирной, тиоэфирной, амидной или алкиламинной связью;

(vi) замены одной или двух аминокислот в положениях 16, 17, 20, 21 и 24 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1301) аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из: Cys, Lys, орнитина, гомоцистеина и ацетилфенилаланина (Ac-Phe), где аминокислота из группы ковалентно связана с гидрофильным остатком;

(vii) замены Asp в положении 15 (согласно нумерации в SEQ ID NO:1301) цистеиновой кислотой, глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой и гомоцистеиновой кислотой;

(viii) замены Ser в положении 16 (согласно нумерации в SEQ ID NO:1301) цистеиновой кислотой, глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой и гомоцистеиновой кислотой;

(ix) замены на AIB в одном или нескольких положениях 16, 20, 21 и 24 согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1301;

и C выбран из группы, состоящей из:

(x) X;

(xi) X-Y;

(xii) X-Y-Z; и

(xiii) X-Y-Z-R10,

где X означает Met, Leu или Nle; Y означает Asn или заряженную аминокислоту; Z означает Thr, Gly, Cys, Lys, орнитин (Orn), гомоцистеин, ацетилфенилаланин (Ac-Phe) или заряженную аминокислоту; где R10 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO:1319-1321 и 1353; и

(xiv) любой из (x)-(xiii), где C-концевой карбоксилат заменен амидом.

В конкретном аспекте пептид класса 4 содержит оксипроизводное PLA. Как используется в настоящем описании, «оксипроизводное PLA» относится к соединению, содержащему модифицированную структуру PLA, в которой гидроксильная группа заменена на O-R₁₁, где R₁₁ означает химический остаток. В данном случае, оксипроизводным PLA может быть, например, сложный эфир PLA или простой эфир PLA.

Способы получения оксипроизводных PLA известны в данной области. Например, когда оксипроизводным является сложный эфир PLA, сложный эфир может быть образован путем взаимодействия гидроксила PLA с карбонилом, несущим нуклеофил. Нуклеофилом может быть любой подходящий нуклеофил, включая, но без ограничения, амин или гидроксил. Соответственно, сложный эфир PLA может содержать структуру формулы IV:

Формула IV

где R7 означает сложный эфир, образованный взаимодействием гидроксила PLA с карбонилом, несущим нуклеофил.

Карбонилом, несущим нуклеофил (который взаимодействует с гидроксилом PLA с образованием сложного эфира), может быть, например, карбоновая кислота, производное карбоновой кислоты или активированный сложный эфир карбоновой кислоты. Производным карбоновой кислоты может быть, но без ограничения, ацилхлорид, ангидрид кислоты, амид, сложный эфир или нитрил. Активированным сложным эфиром карбоновой кислоты может быть, например, N-гидроксисукцинимид (NHS), тозилат (Tos), карбодиимид или гексафторфосфат. В некоторых вариантах осуществления карбодиимид представляет собой 1,3-дициклогексилкарбодиимид (DCC), 1,1'-карбонилдиимидазол (CDI), гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) или 1,3-диизопропилкарбодиимид (DICD). В некоторых вариантах осуществления гексафторфосфат выбран из группы, состоящей из гексафторфосфата бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)фосфония (BOP), гексафторфосфата бензотриазол-1-илокситрипирролидинофосфония (PyBOP), гексафторфосфата 2-(1H-7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (HATU) и гексафторфосфата о-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилурония (HBTU).

Способы получения простых эфиров путем взаимодействия с гидроксильной группой (например, гидроксилом PLA) также известны в данной области. Например, гидроксильная группа PLA может быть подвергнута взаимодействию с галогенированным алкилом или тозилированным алкиловым спиртом с образованием простой эфирной связи.

Обычно химический остаток R₁₁ представляет собой остаток, который не снижает активность пептида класса 4. В некоторых вариантах осуществления химический остаток повышает активность, стабильность и/или растворимость пептида класса 4.

В конкретном варианте осуществления химический остаток, связанный с PLA кислородсодержащей связью (например, через сложноэфирную или простую эфирную связь), представляет собой полимер (например, полиалкиленгликоль), углевод, аминокислоту, пептид или липид, например, жирную кислоту или стероид.

В конкретном варианте осуществления химическим остатком является аминокислота, которая необязательно является частью пептида, так что формула IV представляет собой депсипептид. Таким образом, PLA может находиться в другом положении, отличном от N-концевого остатка аминокислоты пептида класса 4, при условии, что пептид класса 4 содержит одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более) аминокислот с N-концевой стороны от остатка PLA. Например, пептид класса 4 может содержать PLA в положении n, где n равно 2, 3, 4, 5 или 6 пептида класса 4.

Аминокислоты, расположенные с N-концевой стороны от остатка PLA, могут быть синтетическими или встречающимися в природе. В конкретном варианте осуществления аминокислоты, которые являются N-концевыми по отношению к PLA, представляют собой встречающиеся в природе аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления аминокислоты, которые являются N-концевыми по отношению к PLA, представляют собой N-концевые аминокислоты нативного глюкагона. Например, пептид класса 4 может содержать на N-конце любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1354-1358, где PLA связан с треонином сложноэфирной связью:

SEQ ID NO:1354	His-Ser-Gln-Gly-Thr-PLA
SEQ ID NO:1355	Ser-Gln-Gly-Thr-PLA
SEQ ID NO:1356	Gln-Gly-Thr-PLA
SEQ ID NO:1357	Gly-Thr-PLA
SEQ ID NO:1358	Thr-PLA

В альтернативном варианте осуществления одна или несколько N-концевых аминокислот могут быть заменены другой аминокислотой, отличной от аминокислоты нативного глюкагона. Например, когда пептид класса 4 содержит PLA в качестве аминокислоты в положении 5 или 6, аминокислотой в положении 1 и/или положении 2 может быть аминокислота, которая уменьшает чувствительность к расщеплению дипептидилпептидазой IV. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления в положении 1 пептида класса 4 находится аминокислота, выбранная из группы, состоящей из D-гистидина, альфа,альфа-диметилимидазолуксусной кислоты (DMIA), N-метилгистидина, альфа-метилгистидина, имидазолуксусной кислоты, дезаминогистидина, гидроксилгистидина, ацетилгистидина и гомогистидина. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления в положении 2 антагонистического пептида находится аминокислота, выбранная из группы, состоящей из D-серина, D-аланина, валина, глицина, N-метилсерина, N-метилаланина и аминоизомасляной кислоты (AIB). Также, например, в случае, когда пептид класса 4 содержит PLA в качестве аминокислоты в положении 4, 5 или 6, аминокислотой в положении 3 пептида класса 4 может быть глутаминовая кислота вместо нативного остатка глутамина нативного глюкагона. В примере варианта осуществления изобретения пептид класса 4 содержит на N-конце любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1359-1361.

Что касается пептидов класса 4, содержащих соединение формулы IV, то полимером может быть любой полимер, при условии, что он может взаимодействовать с гидроксильной группой PLA. Полимером может быть любой полимер, который в природе или в норме содержит карбонил, несущий нуклеофил. Альтернативно, полимер может представлять собой полимер, который дериватизирован таким образом, что содержит карбонил, несущий нуклеофил. Полимер может представлять собой любой дериватизированный полимер, выбранный из: полиамидов, поликарбонатов, полиалкиленов и их производных, включая полиалкиленгликоли, полиалкиленоксиды, полиалкилентерефталаты, полимеров акриловых и метакриловых сложных эфиров, включая поли(метилметакрилат), поли(этилметакрилат), поли(бутилметакрилат), поли(изобутилметакрилат), поли(гексилметакрилат), поли(изодецилметакрилат), поли(лаурилметакрилат), поли(фенилметакрилат), поли(метилакрилат), поли(изопропиларилат), поли(изобутилакрилат) и поли(октадецилакрилат), поливиниловых полимеров, включая поливиниловые спирты, простые поливиниловые эфиры, сложные поливиниловые эфиры, поливинилгалогениды, поли(винилацетат) и поливинилпирролидон, полигликолидов, полисилоксанов, полиуретанов и их сополимеров, целлюлоз, включая алкилцеллюлозу, гидроксиалкилцеллюлозы, простые эфиры целлюлозы, сложные эфиры целлюлозы, нитроцеллюлозы, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксибутилметилцеллюлозу, ацетат целлюлозы, пропионат целлюлозы, ацетат-бутират целлюлозы, ацетат-фталат целлюлозы, карбоксиэтилцеллюлозу, триацетат целлюлозы и натриевую соль сульфата целлюлозы, полипропилена, полиэтилeнов, включая поли(этиленгликоль), поли(этиленоксид) и поли(этилентерефаталат), и полистирола.

Полимером может быть биологически разрушаемый полимер, включая синтетический биологически разрушаемый полимер (например, полимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, полиангидриды, сложные поли(орто)эфиры, полиуретаны, поли(масляную кислоту), поли(валериановую кислоту) и сополимер лактида-капролактона) и природный биологически разрушаемый полимер (например, альгинат и другие полисахариды, включая декстран и целлюлозу, коллаген, их химические производные (имеющие замещения, добавления химических групп, например, алкила, алкилена, гидроксилирование, окисление и другие модификации, обычно осуществляемые специалистами в данной области), альбумин и другие гидрофильные белки (например, зеин и другие проламины и гидрофобные белки), а также их любые сополимеры и смеси. Как правило, такие вещества разрушаются либо в результате ферментативного гидролиза, либо при воздействии воды in vivo, в результате поверхностного или объемного разрушения.

Полимером может быть биоадгезивный полимер, такой как биологически разрушаемый гидрогель, описанный H.S. Sawhney, C.P. Pathak и J.A. Hubbell в публикации Macromolecules, 1993, 26, 581-587, содержание которой включено в настоящее описание, полигиалуроновые кислоты, казеин, желатин, глютин, полиангидриды, полиакриловая кислота, альгинат, хитозан, поли(метилметакрилаты), поли(этилметакрилаты), поли(бутилметакрилат), поли(изобутилметакрилат), поли(гексилметакрилат), поли(изодецилметакрилат), поли(лаурилметакрилат), поли(фенилметакрилат), поли(метилакрилат), поли(изопропилакрилат), поли(изобутилакрилат) и поли(октадецилакрилат).

В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой водорастворимый полимер. Подходящие водорастворимые полимеры известны в данной области и включают, например, поливинилпирролидон, гидроксипропилцеллюлозу (HPC; Klucel), гидроксипропилметилцеллюлозу (HPMC; Methocel), нитроцеллюлозу, гидроксипропилэтилцеллюлозу, гидроксипропилбутилцеллюлозу, гидроксипропилпентилцеллюлозу, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу (Ethocel), гидроксиэтилцеллюлозу, различные алкилцеллюлозы и гидроксиалкилцеллюлозы, различные простые эфиры целлюлозы, ацетатцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, кальцийкарбоксиметилцеллюлозу, сополимеры винилацетат/кротоновая кислота, полигидроксиалкилметакрилат, гидроксиметилметакрилат, сополимеры метакриловой кислоты, полиметакриловую кислоту, полиметилметакрилат, сополимеры малеиновый ангидрид/метилвиниловый эфир, поливиниловый спирт, натрий и кальций-полиакриловую кислоту, полиакриловую кислоту, кислые карбоксиполимеры, карбоксиполиметилен, карбоксивинилполимеры, сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена, сополимер полиметилвинилового эфира и малеинового ангидрида, карбоксиметиламид, сополимер метакрилата натрия-дивинилбензола, полиоксиэтиленгликоли, полиэтиленоксид и их производные, соли и комбинации.

В конкретном варианте осуществления полимером является полиалкиленгликоль, включая, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Углеводом может быть любой углевод, при условии, что он содержит или получен таким образом, чтобы содержать карбонил с уходящей альфа-группой. Углеводом может быть, например, углевод, который был дериватизирован, чтобы он содержал карбонил с уходящей альфа-группой. В данном случае, углевод может представлять собой дериватизированную форму моносахарида (например, глюкозу, галактозу, фруктозу), дисахарида (например, сахарозу, лактозу, мальтозу), олигосахарида (например, раффинозу, стахиозу), полисахарида (крахмал, амилозу, амилопектин, целлюлозу, хитин, каллозу, ламинарин, ксилан, маннан, фукоидан, галактоманн).

Что касается пептидов класса 4, содержащих соединение формулы IV, то липидом может быть любой липид, содержащий карбонил с уходящей альфа-группой. Липидом может быть, например, липид, который дериватизирован таким образом, чтобы содержать карбонил. В связи с этим, липид может представлять собой производное жирной кислоты (например, C4-C30 жирной кислоты, экозаноид, простагландин, лейкотриен, тромбоксан, N-ацилэтаноламин), глицеролипид (например, моно-, ди-, тризамещенные глицерины), глицерофосфолипид (например, фосфатидилхолин, фосфатидилинозитол, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин), сфинголипид (например, сфингозин, церамид), стериновый липид (например, стероид, холестерин), преноловый липид, сахаролипид или поликетид, масло, воск, холестерин, стерин, жирорастворимый витамин, моноглицерид, диглицерид, триглицерид, фосфолипид.

В некоторых вариантах осуществления R7 имеет молекулярную массу примерно 100 кДа или менее, например, примерно 90 кДа или менее, примерно 80 кДа или менее, примерно 70 кДа или менее, примерно 60 кДа или менее, примерно 50 кДа или менее, примерно 40 кДа или менее. Соответственно, R7 может иметь молекулярную массу примерно 35 кДа или менее, примерно 30 кДа или менее, примерно 25 кДа или менее, примерно 20 кДа или менее, примерно 15 кДа или менее, примерно 10 кДа или менее, примерно 5 кДа или менее, или примерно 1 кДа.

В альтернативном варианте осуществления пептид класса 4 содержит в качестве A пептид из 2-6 аминокислот, в котором две следующих друг за другом аминокислоты пептида связаны сложноэфирной или простой эфирной связью. Сложноэфирная или простая эфирная связь может быть, например, между аминокислотами 2 и 3, 3 и 4, 4 и 5 или 5 и 6. Необязательно пептид может быть дополнительно модифицирован ковалентной связью с другим химическим остатком, включая связь с полимером (например, гидрофильным полимером), алкилирование или ацилирование.

Что касается пептида класса 4, содержащего общую структуру A-B-C, то B означает аминокислоты нативного глюкагона, например, аминокислоты от i до 26 последовательности SEQ ID NO:1301, где i равно 3, 4, 5, 6 или 7, необязательно содержащие одну или несколько модификаций аминокислот. В конкретном варианте осуществления B означает аминокислоты 7-26 последовательности SEQ ID NO:1301, необязательно дополнительно модифицированные.

В некоторых вариантах осуществления B модифицирован вплоть до трех модификациями аминокислот. Например, B, который означает нативную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1301, модифицируют одной или несколькими консервативными модификациями аминокислот.

В другом варианте осуществления B содержит одну или несколько модификаций аминокислот, выбранных из группы, состоящей из модификаций (iv)-(ix), как описано в настоящем описании. В конкретном варианте осуществления B содержит одну или обе модификации аминокислот (v) и (vi). В следующем конкретном варианте осуществления B содержит одну или комбинацию модификаций аминокислот, выбранных из группы, состоящей из модификаций (iv), (vii), (viii) и (ix), в добавление к модификациям (v) и (vi).

В другом конкретном варианте осуществления пептид класса 4 содержит одну или несколько заряженных аминокислот на C-конце. Например, Y и/или Z может означать заряженную аминокислоту, например Lys, Arg, His, Asp и Glu. В еще одном варианте осуществления пептид класса 4 содержит от одной до двух заряженных аминокислот (например, Lys, Arg, His, Asp и Glu) с C-концевой стороны от Z. В конкретном аспекте Z, за которым следуют одна-две заряженных аминокислоты, не содержит R10.

Пептид класса 4 в некоторых вариантах осуществления содержит гидрофильный остаток, ковалентно связанный с аминокислотным остатком пептида класса 4, который описан в настоящем описании. Например, пептид класса 4 может содержать гидрофильный остаток, ковалентно связанный с аминокислотой в положении 1, 16, 20, 21 или 24 согласно нумерации в SEQ ID NO:1301. В другом варианте осуществления гидрофильный остаток связан с C-концевой аминокислотой пептида класса 4, которая в некоторых случаях представляет собой 1 или 11 аминокислоту, находящихся с C-концевой стороны от Z. В еще одном варианте осуществления гидрофильный остаток связан с PLA, когда A означает PLA, PLA-Phe или PLA-Thr-Phe, где PLA модифицирована, чтобы содержать гидрофильный остаток. В другом варианте осуществления аминокислоту, содержащую гидрофильный остаток, добавляют к N- или C-концу пептида класса 4. В другом варианте осуществления пептид класса 4 содержит ацильную группу или алкильную группу, как описано в настоящем описании. Например, ацилирование или алкилирование может осуществляться в боковой цепи аминокислоты в положении 10, 20 или 24, согласно нумерации в SEQ ID NO:1301. В альтернативном варианте осуществления ацилирование или алкилирование осуществляется в боковой цепи C-концевой аминокислоты пептида класса 4, которая в некоторых случаях представляет собой 1 или 11 аминокислоту, находящихся с C-концевой стороны от Z. В еще одном варианте осуществления, когда A означает PLA, PLA-Phe или PLA-Thr-Phe, PLA модифицирована, чтобы содержать ацильную или алкильную группу.

Примеры вариантов осуществления

Пептид класса 4 может содержать любые аминокислоты, синтетические или встречающиеся в природе, при условии, что по меньшей мере две следующих друг за другом аминокислоты пептида связаны сложноэфирной или простой эфирной связью. В конкретном варианте осуществления пептид содержит аминокислоты нативного глюкагона. Например, пептид может содержать от j до 6 аминокислот нативного глюкагона (SEQ ID NO:1301), где j равно 1, 2, 3, 4 или 5. Альтернативно, пептид может содержать аминокислотную последовательность, основанную на N-конце SEQ ID NO:1301, с одной или несколькими модификациями аминокислот. Аминокислотой в положении 1 и/или положения 2 может быть аминокислота, которая снижает чувствительность к расщеплению дипептидилпептидазой IV. Например, пептид может содержать в положении 1 пептида класса 4 аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из D-гистидина, альфа,альфа-диметилимидазолуксусной кислоты (DMIA), N-метилгистидина, альфа-метилгистидина, имидазолуксусной кислоты, дезаминогистидина, гидроксилгистидина, ацетилгистидина и гомогистидина. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления аминокислотой в положении 2 антагонистического пептида является аминокислота, выбранная из группы, состоящей из D-серина, D-аланина, валина, глицина, N-метилсерина, N-метилаланина и аминоизомасляной кислоты (AIB). Также, например, аминокислотой в положении 3 пептида класса 4 может быть глутаминовая кислота, в отличие от нативного остатка глутамина нативного глюкагона. Соответственно, пептид класса 4 может содержать аминокислотную последовательность:

Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO:1368);

Xaa₂-Xaa₃-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO:1369) или

Xaa₃-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO:1370);

где Xaa₁ выбрана из группы, состоящей из: His, D-гистидина, альфа,альфа-диметилимидазолуксусной кислоты (DMIA), N-метилгистидина, альфа-метилгистидина, имидазолуксусной кислоты, дезаминогистидина, гидроксилгистидина, ацетилгистидина и гомогистидина; Xaa₂ выбрана из группы, состоящей из: Ser, D-серина, D-аланина, валина, глицина, N-метилсерина, N-метилаланина и аминоизомасляной кислоты (AIB); и Xaa₃ означает Gln или Glu.

Настоящее изобретение также охватывает варианты осуществления, где C-концевая аминокислота пептидов класса 4 имеет амидную группу, замещающую группу карбоновой кислоты, которая присутствует в нативной аминокислоте.

В некоторых вариантах осуществления, где пептид класса 4 пегилирован, пептид класса 4 содержит укороченные глюкагоновые пептиды, в частности, пептиды 6-29, где «N-концевой» аминокислотой является PLA (фенилмолочная кислота). Такие производные глюкагона проявляют уникальные свойства. Они являются более эффективными пептидами, чем пептиды с нативным N-концевым фенилаланином, и они подавляют любой агонизм глюкагона, возникающий в результате пегилирования, иногда наблюдаемый в случае нативного фенилаланина. Наконец, хотя в современной литературе установлено, что замена нативной аспарагиновой кислоты в положении 9 необходима для антагонистической активности, авторы настоящего изобретения обнаружили неожиданный результат, что такая замена больше не требуется в аналогах глюкагона PLA⁶-(6-29).

В некоторых вариантах осуществления аминокислота пептида класса 4 заменена по меньшей мере одним остатком цистеина, где боковая цепь остатка цистеина дополнительно модифицирована взаимодействующим с тиолом реагентом, включая, например, малеимидогруппу, винилсульфон, 2-пиридилтиогруппу, галогеналкил и галогенацил. Такие взаимодействующие с тиолом реагенты могут содержать карбоксил, кетогруппу, гидроксил и группы простого эфира, а также гидрофильные остатки, такие как единицы полиэтиленгликоля. В альтернативном варианте осуществления аминокислота пептида класса 4 заменена лизином, и боковая цепь заменяющего остатка лизина дополнительно модифицирована с использованием взаимодействующих с амином реагентов, таких как активные сложные эфиры (сукцинимидо, ангидрид и т.д.) карбоновых кислот или альдегиды гидрофильных остатков, таких как полиэтиленгликоль. Согласно некоторым вариантам осуществления остаток лизина, соответствующий положению 12 нативного пептида заменен аргинином, и одна лизиновая замена встроена вместо одной из аминокислот, соответствующих положению 1, 16, 17, 20, 21, 24 или 29 нативного пептида, или лизин добавлен к N- или C-концу пептида класса 4.

В другом варианте осуществления остаток метионина, соответствующий положению 27 нативного пептида изменяют, получая лейцин или норлейцин, чтобы предотвратить окислительное разложение пептида.

В некоторых вариантах осуществления пептиды класса 4, описанные в настоящем описании, дополнительно модифицируют укорочением или делецией одной или двух аминокислот на C-конце глюкагонового пептида (т.е. укорочением за счет аминокислоты в положении 29 или в положениях 28 и 29 нативного глюкагона), не оказывая влияния на активность и/или эффективность в отношении рецептора глюкагона. В связи с этим, пептид класса 4, описанный в настоящем описании, может, например, по существу состоять или состоит из аминокислот 1-27, 1-28, 2-27, 2-28, 3-27, 3-28, 4-27, 4-28, 5-27, 5-28, 6-27 или 6-28 нативного глюкагонового пептида (SEQ ID NO:1301) с одной или несколькими модификациями, обеспечивающими активность пептида класса 4, как описано в настоящем описании.

Описанные в настоящее время пептиды класса 4 также включают аминокислотные замены в положениях, которые, как известно, не являются важными для функционирования глюкагонового пептида. В некоторых вариантах осуществления замены являются консервативными аминокислотными заменами в одном, двух или трех положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 2, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 22, 23 или 24 SEQ ID NO:1339. В некоторых вариантах осуществления пептид класса 4 содержит пептид, являющийся производным SEQ ID NO:1342, где глюкагоновый пептид содержит дополнительную аминокислотную замену по сравнению с SEQ ID NO:1342 в одном-трех положениях аминокислот, выбранных из положений 2, 5, 6, 8, 9, 12, 13 и 14. В некоторых вариантах осуществления замены в положениях 2, 5, 6, 8, 9, 12, 13 и 14 SEQ ID NO:1342 представляют собой консервативные аминокислотные замены. В некоторых вариантах осуществления аминокислоты, соответствующие положениям 16, 17, 20, 21, 24 или 29 нативного пептида, и более конкретно, в положении 21 и/или 24 заменены цистеином или лизином, где цепь ПЭГ ковалентно связана с заменяющим остатком цистеина или лизина.

Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный пептид класса 4 содержит две или более цепей полиэтиленгликоля, ковалентно связанных с пептидом, где общая молекулярная масса глюкагоновых цепей составляет примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления пегилированный пептид класса 4 содержит пептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:1312 и SEQ ID NO:1322, где указанный пептид содержит цепь полиэтиленгликоля, связанную с аминокислотами в положениях 11 и 19, и общая молекулярная масса двух цепей ПЭГ составляет примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 4, содержащий модифицированный глюкагоновый пептид, выбранный из группы, состоящей из:

R₁-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R₂ (SEQ ID NO:1309),

R₁-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R₂ (SEQ ID NO:1310),

R₁-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R₂ (SEQ ID NO:1311) и

R₁-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R₂ (SEQ ID NO:1312),

где Xaa в положении 4 означает аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, цистеиновую кислоту или гомоцистеиновую кислоту, Xaa в положении 7 означает Lys или Arg, Xaa в положении 10 означает аспарагиновую кислоту, цистеиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоглутаминовую кислоту и гомоцистеиновую кислоту; Xaa в положении 11 означает Ser, Lys, Cys, Orn, гомоцистеин или ацетилфенилаланин, Xaa в положении 16 означает Asp, Lys, Cys, Orn, гомоцистеин или ацетилфенилаланин, и Xaa в положении 19 означает Gln, Lys, Cys, Orn, гомоцистеин и ацетилфенилаланин, Xaa в положении 22 означает Met, Leu или Nle, R₁ означает OH или NH₂, и R₂ означает COOH или CONH₂, где пептид пегилирован в положении 11 в случае SEQ ID NO:1309, в положении 16 в случае SEQ ID NO:1310, в положении 19 в случае SEQ ID NO:1311 и в положениях 16 и 19 в случае SEQ ID NO:1312, при условии, что если Xaa в положении 4 означает аспарагиновую кислоту, то R₁ означает OH. Согласно некоторым вариантам осуществления пептид содержит последовательность SEQ ID NO:1309, SEQ ID NO:1310 или SEQ ID NO:1311, где R₁ означает OH и R₂ означает CONH₂. В некоторых вариантах осуществления пептид содержит последовательность SEQ ID NO:1309, SEQ ID NO:1310 или SEQ ID NO:1311, где R₁ означает OH, R₂ означает CONH₂, и аминокислота в положении 4 является аспарагиновой кислотой, и в следующем варианте осуществления такие пептиды содержат удлинение на карбоксильном конце, содержащее последовательность SEQ ID NO:1319.

Согласно некоторым вариантам осуществления пептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1309, SEQ ID NO:1310, SEQ ID NO:1313, SEQ ID NO:1314 и SEQ ID NO:1316, где пептид пегилирован в положении 11 в случае SEQ ID NO:1309 и SEQ ID NO:1313, пегилирован в положении 16 в случае SEQ ID NO:1310 и пегилирован в положении 19 в случае SEQ ID NO:1310 и SEQ ID NO:1314. В некоторых вариантах осуществления агонист глюкагона содержит пептид SEQ ID NO:1313 или SEQ ID NO:1314. В некоторых вариантах осуществления C-концевая аминокислота пептидов класса 4, раскрытых в настоящем изобретении, имеет амидную группу вместо группы карбоновой кислоты, которая присутствует в нативной аминокислоте. Согласно некоторым вариантам осуществления пептид класса 4 содержит последовательность SEQ ID NO:1318.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 4, где белок плазмы ковалентно связан с боковой цепью аминокислоты пептида, чтобы повысить растворимость, стабильность и/или улучшить фармакокинетику глюкагонового пептида. Например, сывороточный альбумин может быть ковалентно связан с пептидами класса 4, представленными в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления белок плазмы ковалентно связан с аминокислотой, соответствующей аминокислоте в положении 16, 17, 20, 21, 24 или 29 нативного глюкагонового пептида. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления белок плазмы связан с аминокислотой, соответствующей аминокислоте в положении 16 или 24 нативного глюкагонового пептида, где пептид класса 4 содержит последовательность SEQ ID NO:1303, SEQ ID NO:1304, SEQ ID NO:1305, SEQ ID NO:1306, SEQ ID NO:1307, SEQ ID NO:1308, SEQ ID NO:1309, SEQ ID NO:1311, SEQ ID NO:1312, SEQ ID NO:1322, SEQ ID NO:1323, SEQ ID NO:1324, SEQ ID NO:1325, SEQ ID NO:1326, SEQ ID NO:1327, SEQ ID NO:1328, SEQ ID NO:1336 и SEQ ID NO:1339. В некоторых вариантах осуществления пептид класса 4 содержит пептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:1309, SEQ ID NO:1310, SEQ ID NO:1311 и SEQ ID NO:1312.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 4, где линейная аминокислотная последовательность, представляющая Fc-часть молекулы иммуноглобулина, ковалентно связана с боковой цепью аминокислоты пептида класса 4, раскрытого в настоящем описании, чтобы повысить растворимость, стабильность и/или улучшить фармакокинетику глюкагонового пептида. Например, аминокислотная последовательность, представляющая Fc-часть молекулы иммуноглобулина, может быть ковалентно связана с положением 11, 12, 15, 16, 19, 21 или 24 глюкагонового пептида с последовательностью SEQ ID NO:1307, SEQ ID NO:1339 или аналога глюкагона. В некоторых вариантах осуществления Fc-пептид ковалентно связан с положением 11 или 19 пептид класса 4 SEQ ID NO:1306, SEQ ID NO:1307, SEQ ID NO:1308 или SEQ ID NO:1336. Fc-часть обычно выделяют из IgG, но фрагмент Fc-пептида из любого иммуноглобулина может функционировать эквивалентно. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO:1303, SEQ ID NO:1304, SEQ ID NO:1305, SEQ ID NO:1307 SEQ ID NO:1308 и SEQ ID NO:1339, где Fc-часть связана с соответствующим положением 16, 17, 20, 21, 24 или 29 нативного глюкагонового пептида. В некоторых вариантах осуществления пептид класса 4 включает глюкагоновый пептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:1309, SEQ ID NO:1310, SEQ ID NO:1311 и SEQ ID NO:1312, где Fc-пептид связан с боковой цепью аминокислоты, находящейся в положении 11, 16 или 19 последовательности SEQ ID NO:1309, SEQ ID NO:1310, SEQ ID NO:1311, соответственно, и в обоих положениях 11 и 19 в случае SEQ ID NO:1312.

В некоторых вариантах осуществления изобретения пептид класса 4 содержит любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1362, 1364-1367 и 1371.

Модификации для повышения растворимости

Пептиды класса 4 могут быть дополнительно модифицированы, чтобы повысить растворимость пептида в водных растворах при физиологическом pH, при этом в некоторых аспектах с сохранением активности антагониста глюкагона. Введение гидрофильных групп в положениях, соответствующих положениям 1, 16, 17, 20, 21, 24 и 29 нативного пептида или на C-конце, может повышать растворимость полученного в результате пептида класса 4 в растворах, имеющих физиологическое значение pH, сохраняя при этом антагонистическую активность исходных соединений. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления раскрытые в настоящем изобретении пептиды класса 4 дополнительно модифицируют, чтобы они содержали одну или несколько гидрофильных групп, ковалентно связанных с боковыми цепями аминокислот, соответствующих аминокислотам в положениях 1, 16, 17, 20, 21, 24 и 29 нативного глюкагонового пептида, или N- или C-концевых аминокислот. В следующем варианте осуществления боковые цепи аминокислот, соответствующих аминокислотам в положениях 16 и 24 нативного глюкагонового пептида, ковалентно связывают с гидрофильными группами, и в некоторых вариантах осуществления гидрофильной группой является полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что нативный глюкагон может быть модифицирован введением заряда на его карбоксильном конце, чтобы повысить растворимость пептида, сохраняя при этом агонистические свойства пептида. Повышенная растворимость обеспечивает возможность получения и хранения растворов глюкагона при значениях pH, близких к нейтральному. Приготовление растворов глюкагона с относительно нейтральным pH (например, pH примерно от 6,0 до примерно 8,0) повышает долговременную стабильность пептидов класса 4.

Кроме того, авторы изобретении предполагают, что пептиды класса 4, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть подобным образом модифицированы, чтобы повысить их растворимость в водных растворах при относительно нейтральном pH (например, pH примерно от 6,0 до примерно 8,0), сохраняя при этом антагонистические свойства исходного белка. Соответственно, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к пептиду класса 4 SEQ ID NO:1339, который был дополнительно модифицирован по сравнению с нативными аминокислотами, присутствующими в положениях 6-29 глюкагона дикого типа (SEQ ID NO:1301), чтобы добавить заряд пептиду, путем замены нативных незаряженных аминокислот заряженными аминокислотами или добавлением заряженных аминокислот к карбоксильному концу. Согласно некоторым вариантам осуществления от одной до трех незаряженных нативных аминокислот пептида класса 4 SEQ ID NO:1339 заменяют заряженными аминокислотами. В некоторых вариантах осуществления заряженная аминокислота выбрана из группы, состоящей из лизина, аргинина, гистидина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. Более конкретно, авторы изобретения обнаружили, что замена встречающейся в норме аминокислоты в соответствующем положении 28 и/или 29 по сравнению с нативным глюкагоном заряженными аминокислотами и/или добавление от одной до двух заряженных аминокислот на карбоксильном конце пептида класса 4 повышает растворимость и стабильность пептидов класса 4 в водных растворах при физиологически значимых значениях pH (т.е. pH примерно от 6,5 до примерно 7,5). Соответственно, предполагается, что такие модификации пептида класса 4, раскрытые в настоящем изобретении, оказывают сходное влияние на растворимость в водных растворах, в частности, в диапазоне pH примерно от 5,5 до примерно 8,0, сохраняя при этом биологическую активность исходного пептида.

Согласно некоторым вариантам осуществления пептид класса 4 с SEQ ID NO:1339 модифицируют заменой нативной аминокислоты в соответствующем положении 28 и/или 29 по сравнению с нативным глюкагоном отрицательно заряженной аминокислотой (например, аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой) и необязательно добавлением отрицательно заряженной аминокислоты (например, аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты) к карбоксильному концу пептида. В альтернативном варианте осуществления пептид класса 4 с SEQ ID NO:1339 модифицируют заменой нативной аминокислоты в соответствующем положении 29 по сравнению с нативным глюкагоном положительно заряженной аминокислотой (например, лизином, аргинином или гистидином) и необязательно добавлением одной или двух положительно заряженных аминокислот (например, лизина, аргинина или гистидина) к карбоксильному концу пептида. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 4, обладающий повышенной растворимостью и стабильностью, где пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1341, при условии что по меньшей мере одна аминокислота в положении 23 или 24 SEQ ID NO:1341 заменена кислой аминокислотой, и/или дополнительная кислая аминокислота добавлена к карбоксильному концу SEQ ID NO:1341. В некоторых вариантах осуществления кислые аминокислоты независимо выбраны из группы, состоящей из Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 4, обладающий повышенной растворимостью и стабильностью, где антагонист содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1341, SEQ ID NO:1342, SEQ ID NO:1343 или SEQ ID NO:1344, где по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 23 или 24 заменена ненативным аминокислотным остатком (т.е. по меньшей мере одна аминокислота, присутствующая в положении 23 или 24 аналога, является кислой аминокислотой, отличающейся от аминокислоты, присутствующей в соответствующем положении в SEQ ID NO:1307). Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается агонист глюкагона, содержащий последовательность SEQ ID NO:1341 или 1342, при условии, что если аминокислотой в положении 23 является аспарагин и аминокислотой в положении 24 является треонин, то пептид дополнительно содержит одну-две аминокислоты, независимо выбранных из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp или Glu, добавленных к карбоксильному концу пептида класса 4.

В другом варианте осуществления растворимость пептида класса 4 SEQ ID NO:1342 может быть повышена ковалентным связыванием гидрофильного остатка с остатком аминокислоты в положении 11, 12, 15, 16, 19 или 24, и в некоторых вариантах осуществления гидрофильный остаток связан с аминокислотой в положении 11, 16 или 19, и в следующем варианте осуществления гидрофильный остаток связан с аминокислотой 19. В некоторых вариантах осуществления гидрофильным остатком является белок плазмы или Fc-часть иммуноглобулина, и в альтернативном варианте осуществления гидрофильный остаток представляет собой цепь гидрофильного углеводорода. В некоторых вариантах осуществления гидрофильным остатком является полиэтиленгликоль, имеющий молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон. В другом варианте осуществления гидрофильным остатком является полиэтиленгликоль, имеющий молекулярную массу по меньшей мере примерно 20000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полиэтиленом пептид класса 4 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1309, SEQ ID NO:1310, SEQ ID NO:1311, SEQ ID NO:1312, SEQ ID NO:1343, SEQ ID NO:1344 или SEQ ID NO:1345.

Модификации для повышения стабильности

Последовательность Asp-Ser в положении 15-16 нативного глюкагона идентифицирована как однозначно нестабильный дипептид, который приводит к преждевременному химическому расщеплению нативного гормона в водных буферах. Например, при выдерживании в 0,01н. HCl при 37°C в течение 2 недель более чем 50% нативного глюкагона может быть подвергнуто расщеплению на фрагменты. Два высвобождаемых при расщеплении пептида 1-15 и 16-29 утрачивают глюкагон-подобную биологическую активность и, соответственно, создают ограничение для предварительного приготовления водного препарата глюкагона и родственных ему аналогов. Обнаружено, что избирательная химическая замена Asp в положении 15 нативного глюкагонового пептида на Glu фактически исключает химическое расщепление пептидной связи 15-16.

Соответственно, предполагается, что пептиды класса 4 настоящего изобретения могут быть подобным образом модифицированы, чтобы уменьшить их чувствительность к преждевременному химическому расщеплению в водных буферах. Согласно некоторым вариантам осуществления пептиды класса 4, описанные в настоящем описании, могут быть дополнительно модифицированы, чтобы повысить их стабильность в водных растворах, заменой нативной аспарагиновой аминокислоты, находящейся в положении 15 нативного глюкагонового пептида, аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из цистеиновой кислоты, глутаминовой кислоты, гомоглутаминовой кислоты и гомоцистеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам осуществления остаток аспарагиновой кислоты в положении 10 пептида класса 4 SEQ ID NO:1339 может быть заменен аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из цистеиновой кислоты, глутаминовой кислоты, гомоглутаминовой кислоты и гомоцистеиновой кислоты, и в некоторых вариантах осуществления нативная аспарагиновая кислота в положении 10 SEQ ID NO:1339 заменена глутаминовой кислотой. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 4, обладающий повышенной стабильностью в водных растворах, где антагонист содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1336, SEQ ID NO:1340 и SEQ ID NO:1342. В следующем варианте осуществления пептид класса 4 амидирован.

Согласно некоторым вариантам осуществления повышенная стабильность в виде пониженного разложения пептида класса 4, описанного в настоящем описании, также может быть достигнута заменой серина в положении 16 (согласно нумерации нативного глюкагона) глутаминовой кислотой, цистеиновой кислотой, гомоглутаминовой кислотой или гомоцистеиновой кислотой. В конкретном варианте осуществления серин в положении 16 (согласно нумерации последовательности нативного глюкагона) заменяют глутаминовой кислотой. В более конкретном аспекте пептид класса 4, содержащий такую модификацию, содержит C-концевой карбоксилат и не амидирован.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 4, содержащий глюкагоновый пептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:1307, SEQ ID NO:1336, SEQ ID NO:1339, SEQ ID NO:1340, SEQ ID NO:1341, SEQ ID NO:1342, SEQ ID NO:1343 и SEQ ID NO:1344, дополнительно модифицированных с использованием одной или нескольких дополнительных аминокислотных замен в положениях, соответствующих положениям 11, 12, 15, 16, 19 и/или 24 нативного глюкагонового пептид, где аминокислотные замены включают замены аминокислотой, имеющей боковую цепь, подходящую для поперечного сшивания с гидрофильными остатками, включая, например, ПЭГ. Замена в пептиде может быть осуществлена с использованием встречающейся в природе аминокислоты или синтетической (не встречающейся в природе) аминокислоты. Синтетические или не встречающиеся в природе аминокислоты относятся к аминокислотам, которые не встречаются в природе in vivo, но которые, тем не менее, могут быть введены в пептидные структуры, описанные в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления предлагается пептид класса 4, где пептид содержит последовательность SEQ ID NO:1307, SEQ ID NO:1336, SEQ ID NO:1339, SEQ ID NO:1340, SEQ ID NO:1341, SEQ ID NO:1342, SEQ ID NO:1343 и SEQ ID NO:1344 и дополнительно содержит цепь полиэтиленгликоля, связанную с соответствующим положением 21 или 24 нативного глюкагонового пептида. В следующем варианте осуществления C-конец пептида класса 4 модифицируют, чтобы заменить группу карбоновой кислоты амидной группой.

Слитые пептиды и конъюгаты

Настоящее изобретение также охватывает слитые пептиды пептида класса 4, где второй пептид слит с C-концом пептида класса 4. Более конкретно слитый пептид может содержать пептид класса 4 SEQ ID NO:1344, который дополнительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1319 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO:1320 (Lys Arg Asn Arg Asn Asn He Ala) или SEQ ID NO:1321 (Lys Arg Asn Arg), связанную с C-концевой аминокислотой пептида класса 4. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность SEQ ID NO:1319 (GPSSGAPPPS) связана с аминокислотой 24 пептида класса 4 SEQ ID NO:1342 пептидной связью. В другом варианте осуществления слитый пептид содержит пептид класса 4 SEQ ID NO:1307, SEQ ID NO:1336, SEQ ID NO:1339, SEQ ID NO:1340, SEQ ID NO:1341 или SEQ ID NO:1343, который дополнительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1319 (GPSSGAPPPS), связанную с аминокислотой 24 пептида класса 4. В другом варианте осуществления слитый пептид содержит пептид класса 4 SEQ ID NO:1307, SEQ ID NO:1336, SEQ ID NO:1337, SEQ ID NO:1338, SEQ ID NO:1339, SEQ ID NO:1341 или SEQ ID NO:1343, который дополнительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1320, SEQ ID NO:1321 или SEQ ID NO:1353, связанную с аминокислотой 24 пептида класса 4. В некоторых вариантах осуществления слитый пептид пептида класса 4 содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1346 и SEQ ID NO:1347. В следующем варианте осуществления C-конец слитого пептида модифицирован, чтобы заменить группу карбоновой кислоты амидной группой.

В некоторых вариантах осуществления предлагается слитый пептид пептида класса 4, где часть слитого пептида, представленная пептидом класса 4, выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:1303, SEQ ID NO:1304, SEQ ID NO:1305, SEQ ID NO:1306, SEQ ID NO:1307, SEQ ID NO:1308, SEQ ID NO:1309, SEQ ID NO:1311, SEQ ID NO:1312, SEQ ID NO:1313, SEQ ID NO:1314, SEQ ID NO:1315, SEQ ID NO:1310, SEQ ID NO:1316, SEQ ID NO:1317, SEQ ID NO:1318 и SEQ ID NO:1339, и последовательность SEQ ID NO:1319 слита с карбоксильным концом части, представленной пептидом класса 4, и где цепь ПЭГ, если она присутствует, выбрана из диапазона от 500 до 40000 дальтон. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления фрагмент, представленный пептидом класса 4, выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO:1313, SEQ ID NO:1314, SEQ ID NO:1315, SEQ ID NO:1316, SEQ ID NO:1346 и SEQ ID NO:1347, где цепь ПЭГ выбрана из диапазона примерно от 500 до примерно 5000 дальтон, и более конкретно, в некоторых вариантах осуществления цепь ПЭГ имеет молекулярную массу примерно 1000 дальтон. В следующем варианте осуществления C-конец модифицирован, чтобы заменить группу карбоновой кислоты амидной группой.

Пептид класса 4 дополнительно может содержать от одной до двух заряженных аминокислот, добавленных к карбоксильному концу. В некоторых вариантах осуществления, где от одной до двух заряженных аминокислот добавлено к карбоксильному концу SEQ ID NO:1344, аминокислоты являются отрицательно заряженными аминокислотами, включая, например, глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления пептид класса 4 содержит последовательность SEQ ID NO:1342, где по меньшей мере одно из соответствующих положений 27 и 28 относительно нативного глюкагонового пептида содержит аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты, и где последовательность SEQ ID NO:1342 необязательно модифицирована, что она имела добавление от одной до двух отрицательно заряженных аминокислот, добавленных к карбоксильному концу. В некоторых вариантах осуществления отрицательно заряженными аминокислотами являются глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота.

Пептиды класса 4, раскрытые в настоящем изобретении, можно комбинировать с другими активными средствами, включая например, инсулин, для лечения заболеваний или состояний, которые характеризуются избыточной активностью глюкагона. В некоторых вариантах осуществления пептиды класса 4, которые были модифицированы ковалентным связыванием с цепью ПЭГ, имеющей молекулярную массу больше 10000 дальтон, можно вводить вместе с инсулином, чтобы помочь поддерживать стабильные уровни глюкозы в крови у диабетиков. Пептиды класса 4 настоящего изобретения можно вводить вместе с инсулином в виде одной композиции, вводить одновременно в виде отдельных растворов или, альтернативно, инсулин и пептид класса 4 можно вводить в разное время относительно друг друга. В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую инсулин, и композицию, содержащую пептид класса 4, вводят с интервалом в 12 часов. Конкретное отношение пептида класса 4 к вводимому инсулину отчасти будет зависеть от определения уровней глюкагона у пациента, и может быть определено при обычном экспериментировании.

Димерные пептиды

Настоящее изобретение также охватывает мультимеры модифицированных пептидов класса 4, описанных в настоящем описании. Два или более модифицированных пептидов класса 4 можно связать вместе, используя стандартные связующие агенты и способы, известные специалистам в данной области. Например, димеры могут быть образованы между двумя модифицированными пептидами класса 4 путем использования бифункциональных тиольных поперечно сшивающих агентов и бифункциональных аминных поперечно сшивающих агентов, в частности, в случае пептидов класса 4, в которых осуществлена замена (например, в положениях 11, 16 или 19) остатками цистеина, лизина, орнитина, гомоцистеина или ацетилфенилаланина (например, SEQ ID NO:1309, SEQ ID NO:1310, SEQ ID NO:1311 и SEQ ID NO:1312). Димер может быть гомодимером или, альтернативно, может быть гетеродимером. В некоторых вариантах осуществления димер образован между двумя пептидами класса 4, независимо выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO:1308, SEQ ID NO:1309, SEQ ID NO:1310, SEQ ID NO:1311, SEQ ID NO:1312, SEQ ID NO:1345, SEQ ID NO:1346 или SEQ ID NO:1347, где два пептида связаны друг с другом линкером, который связан с положением 11 каждого пептида, положением 16 каждого пептида или положением 19 каждого пептида, или любой их комбинацией. В некоторых вариантах осуществления связь представляет собой дисульфидную связь между остатками Cys 11-Cys 11 или Cys 19-Cys 19 или Cys 11-Cys 19 соответствующих пептидов класса 4.

Подобным образом, димер может быть образован между двумя пептидами класса 4, независимо выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO:1303, SEQ ID NO:1304, SEQ ID NO:1305, SEQ ID NO:1306, SEQ ID NO:1307, SEQ ID NO:1308, SEQ ID NO:1309, SEQ ID NO:1310, SEQ ID NO:1311, SEQ ID NO:1312, SEQ ID NO:1336, SEQ ID NO:1337, SEQ ID NO:1338, SEQ ID NO:1339 и SEQ ID NO:1342, где связь образуется между аминокислотами в положениях, независимо выбранных из положений 16, 21 и 24 относительно нативного глюкагонового пептида.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается димер пептидов класса 4, содержащий два пептида класса 4, каждый из которых имеет последовательность SEQ ID NO:1346, где два антагониста связаны друг с другом дисульфидной связью через аминокислоту в положении 25. В другом варианте осуществления предлагается димер пептидов класса 4, содержащий два пептида класса 4, каждый из которых имеет последовательность SEQ ID NO:1347, где два антагониста связаны друг с другом дисульфидной связью через аминокислоту в положении 35. В некоторых вариантах осуществления димер образуется их пептидов класса 4 SEQ ID NO:1346 и SEQ ID NO:1347, где аминокислотой в положении 10 является глутаминовая кислота.

В некоторых вариантах осуществления димер включает гомодимер в виде слитого пептида пептидов класса 4, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO:1307, SEQ ID NO:1308, SEQ ID NO:1336, SEQ ID NO:1337, SEQ ID NO:1340, SEQ ID NO:1339, NO:1340, SEQ ID NO:1341, SEQ ID NO:1342 и фармацевтически приемлемых солей указанных пептидов класса 4. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается димер, содержащий первый пептид класса 4, связанный со вторым пептидом класса 4 линкером, где первый и второй пептиды димера независимо выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO:1307, SEQ ID NO:1308, SEQ ID NO:1336, SEQ ID NO:1337, SEQ ID NO:1339, SEQ ID NO:1340, SEQ ID NO:1341 и SEQ ID NO:1342 и фармацевтически приемлемых солей указанных глюкагоновых полипептидов. В другом варианте осуществления первый и второй пептиды класса 4 в димере независимо выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO:1307, SEQ ID NO:1308, SEQ ID NO:1336 и SEQ ID NO:1339.

В другом варианте осуществления димер включает гомодимер пептида класса 4, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO:1323, SEQ ID NO:1324, SEQ ID NO:1325, SEQ ID NO:1326, SEQ ID NO:1327, SEQ ID NO:1328, SEQ ID NO:1329, SEQ ID NO:1330, SEQ ID NO:1331. В другом варианте осуществления предлагается димер пептида класса 4, где первый и второй пептиды в димере содержат аминокислотную последовательность, независимо выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1323, SEQ ID NO:1324, SEQ ID NO:1325, SEQ ID NO:1326, SEQ ID NO:1327 и SEQ ID NO:1328. В другом варианте осуществления димер включает гомодимер пептида класса 4, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO:1309, SEQ ID NO:1311 и SEQ ID NO:1312, где пептид дополнительно содержит цепь полиэтиленгликоля, ковалентно связанную с положением 11 или 19 глюкагонового пептида.

Родственный глюкагону пептид класса 4 может содержать любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1301-1371, необязательно имеющих до 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных модификаций, которые сохраняют активность антагониста глюкагона.

Родственные глюкагону пептиды класса 5

В некоторых вариантах осуществления родственным глюкагону пептидом является родственный глюкагону пептид класса 5 (см., например, международную патентную заявку (PCT) № PCT/US2008/081333, включенную в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте).

Все биологические последовательности, указанные в следующем разделе (SEQ ID NO:1401-1518), соответствуют последовательностям SEQ ID NO:1-118 в международной патентной заявке № PCT/US2008/081333.

Активность

В некоторых аспектах родственный глюкагону пептид класса 5 (в дальнейшем называемый «пептидом класса 5») может быть антагонистом глюкагона/агонистом GLP-1. Антагонисты глюкагона/агонисты GLP-1 используют в любых ситуациях, когда требуется подавление агонизма глюкагона и при этом также требуется одновременная стимуляция активности GLP-1. Например, активность антагониста глюкагона вместе со стимуляцией GLP-1 можно использовать при лечении диабета, при котором, как показано на доклинических моделях гипергликемии, антагонизм глюкагона приводит к снижению уровня глюкозы в крови, и активность GLP-1 ассоциирована с продуцированием инсулина. Соединения, проявляющие активность GLP-1, как известно, также могут быть полезны при лечении ожирения и предотвращения прироста массы.

В некоторых аспектах полагают, что пептиды класса 5 являются подходящими для любого применения, которое было описано выше для других антагонистов глюкагона/агонистов GLP-1. Указанные две активности по отдельности, как было показано, служат в высокой степени необходимыми свойствами в случае лечения метаболического синдрома, особенно диабета и ожирения. Активность антагониста глюкагона может быть полезна в любой ситуации, когда требуется подавление агонизма глюкагона. Наличие агонизма GLP-1 дополнительно подавляет эндогенную секрецию глюкагона из поджелудочной железы, стимулируя при этом синтез и секрецию инсулина. Два фармакологических эффекта действуют синергетическим образом, нормализуя метаболические отклонения. Соответственно, пептиды класса 5 можно использовать при лечении гипергликемии или лечении других метаболических заболеваний, которые возникают в результате высоких уровней глюкагона в крови или высоких уровней глюкозы в крови. Согласно некоторым вариантам осуществления пациентом, которого можно лечить с применением антагонистов глюкагона/агонистов GLP-1, таких как пептиды класса 5, описанные в настоящем описании, является домашнее животное, и в другом варианте осуществления пациентом, которого можно лечить, является человек. Исследования свидетельствуют, что отсутствие подавления глюкагона у пациентов с диабетом вносит вклад в развитие постпрандиальной гипергликемии, отчасти из-за повышенного гликогеноза. Анализ глюкозы в крови в ходе перорального теста на толерантность к глюкозе (ПТТГ), и в присутствии или отсутствии индуцированного соматостатином подавления глюкагона, показал значительное увеличение уровня глюкозы у субъектов с более высокими уровнями глюкагона. Соответственно, антагонисты глюкагона/агонисты GLP-1 или пептиды класса 5, описанные в настоящем описании, можно применять для лечения гипергликемии, и как предполагают, они могут быть полезны при лечении диабета различных типов, включая сахарный диабет типа I, сахарный диабет типа II или гестационный диабет, либо инсулинозависимый, либо инсулиннезависимый, и для уменьшения осложнений диабета, включая нефропатию, ретинопатию и заболевание сосудов.

Такие способы снижения аппетита или стимуляции потери массы тела, как предполагают, могут быть полезны для снижения массы тела, предотвращения прироста массы или лечения ожирения в различных случаях, включая индуцированное лекарственными средствами ожирение, и для уменьшения осложнений, ассоциированных с ожирением, включая заболевание сосудов (болезнь коронарных артерий, инсульт, заболевание периферических сосудов, ишемически-реперфузионный синдром и т.д.), гипертензию, появление диабета типа II, гиперлипидемию и скелетно-мышечные заболевания.

Фармацевтические композиции, содержащие пептиды класса 5, могут быть составлены и введены пациентам с использованием стандартных фармацевтически приемлемых носителей и путей введения, известных специалистам в данной области. Соответственно, настоящее изобретение также охватывает фармацевтические композиции, содержащие один или несколько пептидов класса 5, раскрытых в настоящем изобретении, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтические композиции могут содержать пептиды класса 5 в качестве единственного фармацевтически активного компонента, или пептиды класса 5 можно комбинировать с одним или несколькими дополнительными активными средствами. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается композиция, содержащая пептид класса 5 и инсулин или аналог инсулина. Альтернативно, предлагается композиция для индуцирования потери массы или предотвращения прироста массы, которая содержит последовательность SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451, дополнительно содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1421 (GPSSGAPPPS) или SEQ ID NO:1450, связанную с аминокислотой 24 SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451, и пептид против ожирения. Подходящие пептиды против ожирения включают пептиды, описанные в патентах США 5691309, 6436435 или в патентной заявке США 20050176643.

Структура пептида класса 5

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 5, содержащий глюкагоновый пептид, который был модифицирован делецией первых 1-5 аминокислотных остатков (например, первой аминокислоты, первых двух аминокислот, первых трех аминокислот, первых четырех аминокислот, первых пяти аминокислот) с N-конца, и в котором осуществлена стабилизация альфа-спиральной структуры в C-концевой части соединения (в области аминокислот в положениях 12-29 согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа, SEQ ID NO:1401), например, путем связывания боковых цепей пар аминокислот, выбранных из аминокислот в положениях 12 и 16, 16 и 20, 20 и 24, и 24 и 28 (относительно последовательности нативного глюкагонового пептида), друг с другом водородными связями или ионными взаимодействиями, такими как образование солевых мостиков, или ковалентными связями. Альтернативно, стабилизацию альфа-спирали в области остатков 12-29 осуществляют путем введения одной или нескольких α,α-дизамещенных аминокислот в положениях, которые сохраняют требуемую активность. В некоторых вариантах осуществления одна, две, три, четыре или более аминокислот в положениях 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) пептида класса 5 или его аналога заменены α,α-дизамещенной аминокислотой. Например, замена аминокислоты в положении 16 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) пептида класса 5 или его аналога аминоизомасляной кислотой (AIB) обеспечивает стабилизированную альфа-спираль в отсутствие солевого мостика или лактама. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в одном, двух, трех или более положениях 16, 20, 21 или 24 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) заменены AIB.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 5, где пептид проявляет агонизм, составляющий по меньшей мере 80% от максимального агонизма, достигаемого нативным GLP-1 в отношении рецептора GLP-1, и проявляет активность антагониста глюкагона, которая уменьшает максимальное индуцированное глюкагоном продуцирование цАМФ, в отношении рецептора глюкагона, составляющую по меньшей мере примерно 50%, на основании измерений продуцирования цАМФ в анализе in vitro. В некоторых вариантах осуществления пептид класса 5 проявляет активность, составляющую по меньшей мере 90% активности нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1, и проявляет активность антагониста глюкагона, которая уменьшает максимальное индуцированное глюкагоном продуцирование цАМФ, в отношении рецептора глюкагона, составляющую по меньшей мере примерно 80%.

Согласно некоторым вариантам осуществления пептид класса 5 содержит производный пептид SEQ ID NO:1402, где пептид содержит дополнительные аминокислотные замены по сравнению с SEQ ID NO:1402 в одном-трех положениях аминокислот, выбранных из положений 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 22 и 24, и проявляет по меньшей мере 90% активности нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1, и проявляет активность антагониста глюкагона, которая уменьшает максимальное индуцированное глюкагоном продуцирование цАМФ, в отношении рецептора глюкагона, составляющую по меньшей мере примерно 80%.

В некоторых вариантах осуществления альфа-спиральная структура в C-концевой части пептида класса 5 (в области аминокислот 12-29 согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) стабилизирована, например, образованием ковалентного или нековалентного внутримолекулярного мостика или заменой и/или инсерцией аминокислот в области положений 12-29 стабилизирующей альфа-спираль аминокислотой (например, α,α-дизамещенной аминокислотой). В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в одном, двух, трех, четырех или более положениях 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) пептида класса 5 или его аналога заменяют α,α-дизамещенной аминокислотой, например, аминоизомасляной кислотой (AIB). Например, замена аминокислоты в положении 16 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) пептида класса 5 или его аналога аминоизомасляной кислотой (AIB) обеспечивает стабилизированную альфа-спираль в отсутствие солевого мостика или лактама.

В некоторых вариантах осуществления пептид класса 5 содержит SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451, и более конкретно, последовательность выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1405, SEQ ID NO:1406, SEQ ID NO:1407, SEQ ID NO:1408, SEQ ID NO:1409, SEQ ID NO:1416, SEQ ID NO:1417, SEQ ID NO:1418, SEQ ID NO:1419, SEQ ID NO:1422, SEQ ID NO:1423, SEQ ID NO:1424 и SEQ ID NO:1425. В следующих вариантах осуществления пептид класса 5 содержит производный пептид SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451, где пептид содержит дополнительную аминокислотную замену по сравнению с SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451 в одном-трех положениях аминокислот, выбранных из положений 1, 2, 5, 6, 8, 9, 12, 13 и 14. В некоторых вариантах осуществления замены в положениях 1, 2, 5, 6, 8, 9, 12, 13 и 14 представляют собой консервативные аминокислотные замены. В некоторых вариантах осуществления треонин в положении 24 SEQ ID NO:1405 или SEQ ID NO:1406 заменен глицином.

Согласно некоторым вариантам осуществления пептид класса 5 представляет собой дополнительную модификацию пептида, где кроме N-концевой делеции модифицирован фенилаланин в положении 6 нативного глюкагонового пептида, например, чтобы он содержал гидроксильную группу вместо N-концевой аминогруппы. В следующем варианте осуществления природная карбоновая кислота C-концевой аминокислоты заменена нейтральной по заряду группой, такой как амид или сложный эфир.

Согласно некоторым вариантам осуществления получены пептиды класса 5, где первые три-пять аминокислот нативного глюкагона были делетированы, аминокислота в положении 9 по сравнению с нативным глюкагоновым пептидом была заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, гомоглутаминовой кислоты, β-гомоглутаминовой кислоты, производного цистеина и сульфоновой кислоты или алкилкарбоксилатного производного цистеина, имеющего структуру:

,

где X₅ означает C₁-C₄алкил, C₂-C₄алкенил или C₂-C₄алкинил, и альфа-спиральная структура в C-концевой части глюкагона (в области аминокислот 12-29 согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) стабилизирована, например, лактамовым мостиком, образованным между боковыми цепями аминокислот 12 и 16 или между аминокислотами 16 и 20 в сравнении с нативным глюкагоновым пептидом. Примеры пар аминокислот, которые способны к ковалентному связыванию с образованием состоящего из семи атомов связывающего мостика, подробно описаны в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления производным цистеина и сульфоновой кислоты является цистеиновая кислота или гомоцистеиновая кислота.

В некоторых вариантах осуществления предлагается пептид класса 5, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1405, SEQ ID NO:1406, SEQ ID NO:1407 или SEQ ID NO:1408, где указанный пептид содержит лактамовое кольцо, образованное между боковыми цепями аминокислот 7 и 11 в случае SEQ ID NO:1405, между положениями 11 и 15 в случае SEQ ID NO:1406, между положениями 15 и 19 в случае SEQ ID NO:1407 и между положениями 19 и 24 в случае SEQ ID NO:1408, где каждая из указанных последовательностей дополнительно модифицирована, чтобы она содержала гидрофильный остаток, ковалентно связанный с пептидом. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления каждый из несущих лактам пептидов класса 5 модифицирован ковалентным связыванием цепи полиэтиленгликоля. Например, в случае пептида класса 5, содержащего SEQ ID NO:1405, пептид пегилирован в положении, выбранном из группы, состоящей из 12, 15, 16, 19 и 24; в случае пептида класса 5, содержащего SEQ ID NO:1406, пептид пегилирован в положении, выбранном из группы, состоящей из 12, 16, 19 и 24; в случае пептида класса 5, содержащего SEQ ID NO:1407, пептид пегилирован в положении, выбранном из группы, состоящей из 11, 12, 16 и 24; в случае пептида класса 5, содержащего SEQ ID NO:1408, пептид пегилирован в положении, выбранном из группы, состоящей из 11, 12, 15 и 16. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 5, содержащий SEQ ID NO:1447 или SEQ ID NO:1448, где пептид пегилирован в положении, выбранном из группы, состоящей из 12, 16, 19 и 24, по сравнению с SEQ ID NO:1447 или SEQ ID NO:1448. В следующем варианте осуществления пептид с SEQ ID NO:1447 или SEQ ID NO:1448 дополнительно модифицирован добавлением последовательности SEQ ID NO:1421 к карбоксильному концу пептида.

Как подробно описано выше, в некоторых аспектах предлагаются пептиды класса 5, где первые пять аминокислот нативного глюкагона делетированы, аминогруппа N-концевой аминокислоты (фенилаланина) заменена гидроксильной группой (т.е. первой аминокислотой является фенилмолочная кислота), и боковые цепи одной или нескольких пар аминокислот, выбранных из аминокислот в положениях 12 и 16, 16 и 20, 20 и 24, и 24 и 28, связаны друг с другом, стабилизируя, таким образом, альфа-спираль пептида класса 5.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 5, содержащий последовательность SEQ ID NO:1402, которая модифицирована заменой остатка серина в положении 11 SEQ ID NO:1402 (положение 16 согласно нумерации аминокислот нативного глюкагона) аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, глутамина, гомоглутаминовой кислоты, гомоцистеиновой кислоты, треонина или глицина. Согласно некоторым вариантам осуществления остаток серина в положении 11 SEQ ID NO:1402 заменен аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, глутамина, гомоглутаминовой кислоты и гомоцистеиновой кислоты, и в некоторых вариантах осуществления остаток серина заменен глутаминовой кислотой. Согласно некоторым вариантам осуществления пептид класса 5 содержит последовательность SEQ ID NO:1438.

В некоторых вариантах осуществления предлагается пептид класса 5, где внутримолекулярный мостик образован между боковыми цепями двух аминокислот, чтобы стабилизировать трехмерную структуру карбоксильного конца пептида SEQ ID NO:1402. Более конкретно, боковые цепи одной или нескольких аминокислотных пар, выбранных из пар аминокислот 7 и 11, 11 и 15, 15 и 19 или 19 и 23 последовательности SEQ ID NO:1402, связаны друг с другом, стабилизируя, таким образом, альфа-спираль в C-концевой части. Две боковых цепи могут быть связаны друг с другом водородными связями, ионными взаимодействиями (такими как образование солевых мостиков) или ковалентными связями. Согласно некоторым вариантам осуществления размер линкера составляет 7-9 атомов, и в некоторых вариантах осуществления размер линкера составляет 8 атомов. В некоторых вариантах осуществления пептид класса 5 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO:1405, SEQ ID NO:1406, SEQ ID NO:1407 и SEQ ID NO:1408. В некоторых вариантах осуществления C-концевая аминокислота пептида класса 5 имеет амидную группу, замещающую группу карбоновой кислоты, которая присутствует в нативной аминокислоте.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 5, где аналог содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1409. В некоторых вариантах осуществления трехмерная структура карбоксильного конца пептида SEQ ID NO:1409 стабилизирована образованием ковалентных связей между боковыми цепями пептида. В некоторых вариантах осуществления боковые цепи аминокислот связаны друг с другом с образованием лактамового кольца. Размер лактамового кольца может варьировать в зависимости от длины боковых цепей аминокислот, и в некоторых вариантах осуществления лактам образован связыванием боковых цепей аминокислоты лизина с боковой цепью глутаминовой кислоты. В некоторых вариантах осуществления C-концевая аминокислота пептидов класса 5 имеет амидную группу, замещающую группу карбоновой кислоты, которая присутствует в нативной аминокислоте.

Порядок амидной связи в лактамовом кольце может быть обратным (например, лактамовое кольцо может быть образовано между боковыми цепями Lys12 и Glu16, или альтернативно, между Glu12 и Lys16). Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается аналог глюкагона SEQ ID NO:1409, где по меньшей мере одно лактамовое кольцо образовано между боковыми цепями пары аминокислот, выбранных из группы, состоящей из пар аминокислот 7 и 11, 11 и 15, 15 и 19 или 19 и 23 SEQ ID NO:1409. В некоторых вариантах осуществления предлагается пептид класса 5, где пептид содержит последовательность SEQ ID NO:1410, причем указанная последовательность дополнительно содержит внутримолекулярный лактамовый мостик, образованный между аминокислотами в положениях 7 и 11, или между аминокислотами в положениях 11 и 15, или между аминокислотами в положениях 15 и 19 SEQ ID NO:1410. В некоторых вариантах осуществления предлагается пептид класса 5, где пептид содержит последовательность SEQ ID NO:1411, причем указанная последовательность дополнительно содержит внутримолекулярный лактамовый мостик, образованный между аминокислотами в положениях 7 и 11 или между аминокислотами в положениях 11 и 15 SEQ ID NO:1411. В некоторых вариантах осуществления пептид класса 5 содержит последовательность SEQ ID NO:1417.

Предлагаются дополнительные пептиды класса 5, содержащие производные SEQ ID NO:1405, где аспарагиновая кислота в положении 10 SEQ ID NO:1405 (положение 15 нативного глюкагона) заменена глутаминовой кислотой, аминокислотой общей структуры:

,

где X₆ означает C₁-C₃алкил, C₂-C₃алкенил или C₂-C₃алкинил, и в некоторых вариантах осуществления X₆ означает C₁-C₃алкил, и в другом варианте осуществления X₆ означает C₂алкил. В некоторых вариантах осуществления предлагается производное пептида класса 5 SEQ ID NO:1409, где аминокислота в положении 10 SEQ ID NO:1409 (положение 15 нативного глюкагона) заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, цистеиновой кислоты, гомоцистеиновой кислоты и гомоглутаминовой кислоты. В следующем варианте осуществления аминокислота в положении 10 SEQ ID NO:1409 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из цистеиновой кислоты или гомоцистеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления предлагается производное пептида класса 5 SEQ ID NO:1406, SEQ ID NO:1407 или SEQ ID NO:1408, где аминокислота в положении 10 SEQ ID NO:1406, SEQ ID NO:1407 или SEQ ID NO:1408 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, цистеиновой кислоты, гомоцистеиновой кислоты и гомоглутаминовой кислоты. В некоторых вариантах осуществления C-концевая аминокислота пептида класса 5 имеет амидную группу, заменяющую группу карбоновой кислоты, которая присутствует в нативной аминокислоте.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота пептида класса 5 заменена по меньшей мере одним остатком цистеина, где боковая цепь остатка цистеина дополнительно модифицирована взаимодействующим с тиолом реагентом, включая например, малеимидогруппу, винилсульфон, 2-пиридилтиогруппу, галогеналкил и галогенацил. Такие взаимодействующие с тиолом реагенты могут содержать карбоксильную, кето, гидроксильную и эфирную группы, а также другие гидрофильные остатки, такие как единицы полиэтиленгликоля. В альтернативном варианте осуществления аминокислота пептида класса 5 заменена лизином, и боковая цепь заменяющего остатка лизина дополнительно модифицирована с использованием взаимодействующих с амином реагентов, таких как активные сложные эфиры (сукцинимидо, ангидрид и т.д.) карбоновых кислот или альдегиды гидрофильных остатков, таких как полиэтиленгликоль. Согласно некоторым вариантам осуществления остаток лизина, соответствующий аминокислоте в положении 7 пептида SEQ ID NO:1405, заменен аргинином, и одна лизиновая замена встроена в одно из положений аминокислот, соответствующих положению 12, 15, 16, 19 и 24 SEQ ID NO:1405.

В другом варианте осуществления остаток метионина, соответствующий положению 22 пептидов класса 5, раскрытых в настоящем изобретении, изменяют, получая лейцин или норлейцин, чтобы предотвратить окислительное разложение пептида.

Кроме того, пептиды класса 5 в некоторых аспектах также включают аминокислотные замены в положениях, которые, как известно, не являются важными для функционирования аналога глюкагона. В некоторых вариантах осуществления замены являются консервативными аминокислотными заменами в одном, двух или трех положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 2, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 22, 23 или 24. В некоторых вариантах осуществления аминокислоты, соответствующие положениям 16, 17, 20, 21, 24 или 29 нативного глюкагонового пептида, и более конкретно, в положении 21 и/или 24 относительно нативного глюкагона, заменены цистеином или лизином, где цепь ПЭГ ковалентно связана с заменяющим остатком цистеина или лизина.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 5, содержащий последовательность, состоящую из SEQ ID NO:1409, дополнительно модифицированной одной или несколькими дополнительными аминокислотными заменами в положениях, соответствующих положениям 11, 12, 15, 16, 19 и/или 24 пептида (включая, например, замены цистеином), где аминокислотная замена включает аминокислоту, имеющую боковую цепь, подходящую для поперечного сшивания с гидрофильным остатком, включая, например, ПЭГ. Нативный глюкагон может иметь замену встречающейся в природе аминокислотой или синтетической (не встречающейся в природе) аминокислотой. Синтетические или не встречающиеся в природе аминокислоты относятся к аминокислотам, которые не встречаются в природе in vivo, но которые, тем не менее, могут быть введены в пептидные структуры, описанные в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления предлагается пептид класса 5, где пептид содержит последовательность SEQ ID NO:1409 и дополнительно содержит цепь полиэтиленгликоля, связанную с положением 16 или 19 пептида. В следующем варианте осуществления C-конец аналога глюкагона модифицируют, чтобы заменить группу карбоновой кислоты амидной группой.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 5, содержащий аналог глюкагона, выбранный из группы, состоящей из:

R₁-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R₂ (SEQ ID NO:1439)

R₁-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R₂ (SEQ ID NO:1413),

R₁-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R₂ (SEQ ID NO:1414) и

R₁-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R₂ (SEQ ID NO:1412),

где Xaa в положении 4 означает аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, цистеиновую кислоту или гомоцистеиновую кислоту, Xaa в положении 10 означает Asp, Glu, цистеиновую кислоту, гомоглутаминовую кислоту и гомоцистеиновую кислоту, Xaa в положении 16 означает Asp, Cys, Orn, гомоцистеин или ацетилфенилаланин, и Xaa в положении 19 означает Gln, Cys, Orn, гомоцистеин и ацетилфенилаланин, Xaa в положении 22 означает Met, Leu или Nle, R₁ означает OH или NH₂, и R₂ означает Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser (SEQ ID NO:1421), Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa (SEQ ID NO:1450; где Xaa означает Cys, Orn, гомоцистеин или ацетилфенилаланин), COOH или CONH₂, где пептид необязательно пегилирован в положении 16 SEQ ID NO:1413, в положении 19 SEQ ID NO:1414 и в положениях 16 и 19 SEQ ID NO:1412. В некоторых вариантах осуществления Thr в положении 24 SEQ ID NO:1412-1414 и 1439 заменен на Gly. Согласно некоторым вариантам осуществления пептид содержит последовательность SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:1414, где R₁ означает OH. Согласно некоторым вариантам осуществления пептид содержит последовательность SEQ ID NO:1413 или SEQ ID NO:1414, где R₁ означает OH, и R₂ означает CONH₂. Согласно некоторым вариантам осуществления пептид содержит последовательность SEQ ID NO:1413 или SEQ ID NO:1414, где R₁ означает OH, R₂ означает CONH₂, и треонин в положении 24 заменен глицином.

В некоторых вариантах осуществления пептид класса 5 дополнительно модифицирован, чтобы он содержал одну или несколько аминокислот нативного GLP-1, путем замены остатка (остатков) нативного глюкагона в соответствующих положениях аминокислот. Например, пептид класса 5 может содержать одну или несколько аминокислотных замен в любом из положений 2, 3, 17, 18, 21, 23 и 24 (согласно нумерации аминокислот нативного глюкагона). В конкретном варианте осуществления пептид класса 5 модифицирован одной или несколькими из следующих аминокислотных замен: Ser2 заменен на Ala, Gln3 заменен на Glu, Arg17 заменен на Gln, Arg в положении 18 заменен на Ala, Asp в положении 21 заменен на Glu, Val в положении 23 заменен на Ile, и Gln в положении 24 заменен на Ala (положения аминокислот соответствуют последовательности нативного глюкагона). В конкретном варианте осуществления пептид класса 5 модифицирован заменой Ser2 на Ala и Gln3 на Glu (согласно нумерации аминокислот нативного глюкагона). В другом конкретном варианте осуществления пептид класса 5 модифицирован с использованием всех следующих аминокислотных замен: Arg17 заменен на Gln, Arg в положении 18 заменен на Ala, Asp в положении 21 заменен на Glu, Val в положении 23 заменен на Ile, и Gln в положении 24 заменен на Ala (нумерация аминокислот согласно последовательности нативного глюкагона). В еще одном конкретном варианте осуществления пептид класса 5 модифицирован, чтобы он содержал только Glu в положении 21 (согласно нумерации в SEQ ID NO:1401). Соответственно, пептид класса 5 может содержать любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1460-1470, 1473-1478, 1480-1488, 1490-1496, 1503, 1504, 1506 и 1514-1518.

Также в настоящем изобретении предлагается пептид класса 5 или его конъюгат, содержащий (1) альфа-спираль, стабилизированную способами, описанными в настоящем описании (например, с помощью внутримолекулярного мостика или введения одной или нескольких альфа,альфа-дизамещенных аминокислот или кислой аминокислоты в положении 16 (согласно нумерации в SEQ ID NO:1401), или их комбинации; (2) C-концевой амид или сложный эфир вместо C-концевого карбоксилата и (3) общую структуру A-B-C,

где A выбран из группы, состоящей из

(i) фенилмолочной кислоты (PLA);

(ii) оксипроизводного PLA и

(iii) пептида из 2-6 аминокислот, в котором две последовательных аминокислоты пептида связаны сложноэфирной или простой эфирной связью;

где B означает аминокислоты от p до 26 SEQ ID NO:1401, где p равно 3, 4, 5, 6 или 7, необязательно содержащей одну или несколько модификаций аминокислот, которые описаны в настоящем описании, включая, например, любую из модификаций, описанных для пептидов класса 5. Например, одна или несколько модификаций могут быть выбраны из группы, состоящей из:

(iv) заменены Asp в положении 9 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1401) Glu, производным Cys на основе сульфоновой кислоты, гомоглутаминовой кислотой, β-гомоглутаминовой кислотой или алкилкарбоксилатным производным цистеина, имеющим структуру:

,

где X₅ означает C₁-C₄алкил, C₂-C₄алкенил или C₂-C₄алкинил.

(v) замены одной или двух аминокислот в положениях 10, 20 и 24 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1401) аминокислотой, ковалентно связанной с ацильной или алкильной группой сложноэфирной, простой эфирной, тиоэфирной, амидной или алкиламинной связью;

(vi) замены одной или двух аминокислот в положениях 16, 17, 20, 21 и 24 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1401) аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из: Cys, Lys, орнитина, гомоцистеина и ацетилфенилаланина (Ac-Phe), где аминокислота из группы ковалентно связана с гидрофильным остатком;

(vii) замены Asp в положении 15 (согласно нумерации в SEQ ID NO:1401) цистеиновой кислотой, глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой и гомоцистеиновой кислотой;

(viii) замены Ser в положении 16 (согласно нумерации в SEQ ID NO:1401) цистеиновой кислотой, глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой и гомоцистеиновой кислотой;

(ix) замены Arg в положении 17 на Gln, замены Arg в положении 18 на Ala, замены Asp в положении 21 на Glu, замены Val в положении 23 на Ile, и замены Gln в положении 24 на Ala (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1401);

(x) замены Ser в положении 16 на Glu, замены Gln в положении 20 на Glu, или замены Gln в положении 24 на Glu (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1401);

где C (в общей структуре A-B-C) выбран из группы, состоящей из:

(vii) X;

(viii) X-Y;

(ix) X-Y-Z;

(x) X-Y-Z-R10,

где X означает Met, Leu или Nle; Y означает Asn или заряженную аминокислоту; Z означает Thr, Gly, Cys, Lys, орнитин (Orn), гомоцистеин, ацетилфенилаланин (Ac-Phe) или заряженную аминокислоту; где R10 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO:1421, 1426, 1427 и 1450.

В конкретном аспекте пептид содержит оксипроизводное PLA. Как используется в настоящем описании, «оксипроизводное PLA» относится к соединению, содержащему модифицированную структуру PLA, в которой гидроксильная группа заменена на O-R₁₁, где R₁₁ означает химический остаток. Следовательно, оксипроизводным PLA может быть, например, сложный эфир PLA или простой эфир PLA.

Способы получения оксипроизводных PLA известны в данной области. Например, когда оксипроизводным является сложный эфир PLA, сложный эфир может быть образован путем взаимодействия гидроксила PLA с карбонилом, несущим нуклеофил. Нуклеофилом может быть любой подходящий нуклеофил, включая, но без ограничения, амин или гидроксил. Соответственно, сложный эфир PLA может содержать структуру формулы IV:

Формула IV

где R7 означает сложный эфир, образованный путем взаимодействия гидроксила PLA с карбонилом, несущим нуклеофил.

Карбонилом, несущим нуклеофил (который взаимодействует с гидроксилом PLA с образованием сложного эфира), может быть, например, карбоновая кислота, производное карбоновой кислоты или активированный сложный эфир карбоновой кислоты. Производным карбоновой кислоты может быть, но без ограничения, ацилхлорид, ангидрид кислоты, амид, сложный эфир или нитрил. Активированным сложным эфиром карбоновой кислоты может быть, например, N-гидроксисукцинимид (NHS), тозилат (Tos), карбодиимид или гексафторфосфат. В некоторых вариантах осуществления карбодиимид представляет собой 1,3-дициклогексилкарбодиимид (DCC), 1,1'-карбонилдиимидазол (CDI), гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) или 1,3-диизопропилкарбодиимид (DICD). В некоторых вариантах осуществления гексафторфосфат выбран из группы, состоящей из гексафторфосфата бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)фосфония (BOP), гексафторфосфата бензотриазол-1-илокситрипирролидинофосфония (PyBOP), гексафторфосфата 2-(1H-7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (HATU) и гексафторфосфата о-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилурония (HBTU).

Способы получения простых эфиров путем взаимодействия с гидроксильной группой (например, гидроксилом PLA) также известны в данной области. Например, гидроксильная группа PLA может быть подвергнута взаимодействию с галогенированным алкилом или тозилированным алкиловым спиртом с образованием простой эфирной связи.

В конкретном варианте осуществления химический остаток, связанный с PLA кислородсодержащей связью (например, через сложноэфирную или простую эфирную связь), представляет собой полимер (например, полиалкиленгликоль), углевод, аминокислоту, пептид или липид, например жирную кислоту или стероид.

В конкретном варианте осуществления химическим остатком является аминокислота, которая необязательно является частью пептида, так что формула IV представляет собой депсипептид. Таким образом, PLA может находиться в другом положении, отличном от N-концевого остатка аминокислоты пептида, так что пептид содержит одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или больше) аминокислот с N-концевой стороны от остатка PLA. Например, пептид может содержать PLA в положении n, где n равно 2, 3, 4, 5 или 6, пептида.

Аминокислоты, расположенные с N-концевой стороны от остатка PLA, могут быть синтетическими или встречающимися в природе. В конкретном варианте осуществления аминокислоты, которые являются N-концевыми по отношению к PLA, представляют собой встречающиеся в природе аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления аминокислоты, которые являются N-концевыми по отношению к PLA, представляют собой N-концевые аминокислоты нативного глюкагона. Например, пептид может содержать на N-конце любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1452-1456, где PLA связан с треонином сложноэфирной связью:

SEQ ID NO:1452	His-Ser-Gln-Gly-Thr-PLA
SEQ ID NO:1453	Ser-Gln-Gly-Thr-PLA
SEQ ID NO:1454	Gln-Gly-Thr-PLA
SEQ ID NO:1455	Gly-Thr-PLA
SEQ ID NO:1456	Thr-PLA

В альтернативном варианте осуществления одна или несколько N-концевых аминокислот могут быть заменены другой аминокислотой, отличной от аминокислоты нативного глюкагона. Например, когда пептид содержит PLA в качестве аминокислоты в положении 5 или 6, аминокислотой в положении 1 и/или положении 2 может быть аминокислота, которая уменьшает чувствительность к расщеплению дипептидилпептидазой IV. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления в положении 1 пептида находится аминокислота, выбранная из группы, состоящей из D-гистидина, альфа,альфа-диметилимидазолуксусной кислоты (DMIA), N-метилгистидина, альфа-метилгистидина, имидазолуксусной кислоты, дезаминогистидина, гидроксилгистидина, ацетилгистидина и гомогистидина. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления, в положении 2 антагонистического/агонистического пептида находится аминокислота, выбранная из группы, состоящей из D-серина, D-аланина, валина, глицина, N-метилсерина, N-метилаланина и аминоизомасляной кислоты (AIB). Также, например, в случае, когда пептид содержит PLA в качестве аминокислоты в положении 4, 5 или 6, аминокислотой в положении 3 пептида может быть глутаминовая кислота в противоположность нативному остатку глутамина нативного глюкагона. В примере варианта осуществления изобретения пептид содержит на N-конце любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1457-1459.

Что касается пептидов, содержащих соединение формулы IV, то полимером может быть любой полимер, при условии, что он может взаимодействовать с гидроксильной группой PLA. Полимером может быть полимер, который в природе или в норме содержит карбонил, несущий нуклеофил. Альтернативно, полимер может представлять собой полимер, который дериватизирован таким образом, чтобы он содержал карбонил, несущий нуклеофил. Полимер может представлять собой любой дериватизированный полимер, выбранный из: полиамидов, поликарбонатов, полиалкиленов и их производных, включая, полиалкиленгликоли, полиалкиленоксиды, полиалкилентерефталаты, полимеры акриловых и метакриловых сложных эфиров, включая поли(метилметакрилат), поли(этилметакрилат), поли(бутилметакрилат), поли(изобутилметакрилат), поли(гексилметакрилат), поли(изодецилметакрилат), поли(лаурилметакрилат), поли(фенилметакрилат), поли(метилакрилат), поли(изопропиларилат), поли(изобутилакрилат) и поли(октадецилакрилат), поливиниловых полимеров, включая поливиниловые спирты, простые поливиниловые эфиры, сложные поливиниловые эфиры, поливинилгалогениды, поли(винилацетат) и поливинилпирролидон, полигликолидов, полисилоксанов, полиуретанов и их сополимеров, целлюлоз, включая алкилцеллюлозу, гидроксиалкилцеллюлозы, простые эфиры целлюлозы, сложные эфиры целлюлозы, нитроцеллюлозы, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксибутилметилцеллюлозу, ацетат целлюлозы, пропионат целлюлозы, ацетат-бутират целлюлозы, ацетат-фталат целлюлозы, карбоксиэтилцеллюлозу, триацетат целлюлозы и натриевую соль сульфата целлюлозы, полипропилена, полиэтилeнов, включая поли(этиленгликоль), поли(этиленоксид) и поли(этилентерефаталат), и полистирола.

Полимером может быть биологически разрушаемый полимер, включая синтетический биологически разрушаемый полимер (например, полимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, полиангидриды, сложные поли(орто)эфиры, полиуретаны, поли(масляная кислота), поли(валериановая кислота) и сополимер лактида-капролактона) и природный биологически разрушаемый полимер, например альгинат и другие полисахариды, включая декстран и целлюлозу, коллаген, их химические производные (имеющие замещения, добавления химических групп, например, алкила, алкилена, гидроксилирование, окисление и другие модификации, обычно осуществляемые специалистами в данной области), альбумин и другие гидрофильные белки (например, зеин и другие проламины и гидрофобные белки), а также их любые сополимеры и смеси. В общем, такие вещества разрушаются либо в результате ферментативного гидролиза, либо при воздействии воды in vivo, в результате поверхностного или объемного разрушения.

Полимером может быть биоадгезивный полимер, такой как биологически разрушаемый гидрогель, описанный H.S. Sawhney, C.P. Pathak и J. A. Hubbell в публикации Macromolecules, 1993, 26, 581-587, содержание которой включено в настоящее описание, полигиалуроновые кислоты, казеин, желатин, глютин, полиангидриды, полиакриловая кислота, альгинат, хитозан, поли(метилметакрилаты), поли(этилметакрилаты), поли(бутилметакрилат), поли(изобутилметакрилат), поли(гексилметакрилат), поли(изодецилметакрилат), поли(лаурилметакрилат), поли(фенилметакрилат), поли(метилакрилат), поли(изопропилакрилат), поли(изобутилакрилат) и поли(октадецилакрилат).

В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой водорастворимый полимер. Подходящие водорастворимые полимеры известны в данной области и включают, например, поливинилпирролидон, гидроксипропилцеллюлозу (HPC; Klucel), гидроксипропилметилцеллюлозу (HPMC; Methocel), нитроцеллюлозу, гидроксипропилэтилцеллюлозу, гидроксипропилбутилцеллюлозу, гидроксипропилпентилцеллюлозу, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу (Ethocel), гидроксиэтилцеллюлозу, различные алкилцеллюлозы и гидроксиалкилцеллюлозы, различные простые эфиры целлюлозы, ацетат целлюлозы, карбоксиметилцеллюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, кальцийкарбоксиметилцеллюлозу, сополимеры винилацетат/кротоновая кислота, полигидроксиалкилметакрилат, гидроксиметилметакрилат, сополимеры метакриловой кислоты, полиметакриловую кислоту, полиметилметакрилат, сополимеры малеиновый ангидрид/метилвиниловый эфир, поливиниловый спирт, натрий и кальций-полиакриловую кислоту, полиакриловую кислоту, кислые карбоксиполимеры, карбоксиполиметилен, карбоксивинилполимеры, сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена, сополимер полиметилвинилового эфира и малеинового ангидрида, карбоксиметиламид, сополимер метакрилата натрия-дивинилбензола, полиоксиэтиленгликоли, полиэтиленоксид и их производные, соли и комбинации.

В конкретном варианте осуществления полимером является полиалкиленгликоль, включая, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Углеводом может быть любой углевод, при условии, что он содержит или получен таким образом, что содержит карбонил с уходящей альфа-группой. Углеводом может быть, например, углевод, который был дериватизирован таким образом, что содержит карбонил с уходящей альфа-группой. Поэтому углевод может представлять собой дериватизированную форму моносахарида (например, глюкозу, галактозу, фруктозу), дисахарида (например, сахарозу, лактозу, мальтозу), олигосахарида (например, раффинозу, стахиозу), полисахарида (крахмал, амилозу, амилопектин, целлюлозу, хитин, каллозу, ламинарин, ксилан, маннан, фукоидан, галактоманн).

Липидом может быть любой липид, содержащий карбонил с уходящей альфа-группой. Липидом может быть, например, липид, который дериватизирован таким образом, что он содержит карбонил. В связи с этим липид может представлять собой производное жирной кислоты (например, C4-C30 жирной кислоты, экозаноид, простагландин, лейкотриен, тромбоксан, N-ацилэтаноламин), глицеролипид (например, моно-, ди-, тризамещенные глицерины), глицерофосфолипид (например, фосфатидилхолин, фосфатидилинозитол, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин), сфинголипид (например, сфингозин, церамид), стериновый липид (например, стероид, холестерин), преноловый липид, сахаролипид или поликетид, масло, воск, холестерин, стерин, жирорастворимый витамин, моноглицерид, диглицерид, триглицерид, фосфолипид.

В некоторых вариантах осуществления R7 имеет молекулярную массу примерно 100 кДа или менее, например, примерно 90 кДа или менее, примерно 80 кДа или менее, примерно 70 кДа или менее, примерно 60 кДа или менее, примерно 50 кДа или менее, примерно 40 кДа или менее. Соответственно, R7 может иметь молекулярную массу примерно 35 кДа или менее, примерно 30 кДа или менее, примерно 25 кДа или менее, примерно 20 кДа или менее, примерно 15 кДа или менее, примерно 10 кДа или менее, примерно 5 кДа или менее, или примерно 1 кДа.

В альтернативном варианте осуществления пептид, содержащий общую структуру A-B-C, содержит в качестве A пептид из 2-6 аминокислот, в котором две следующих друг за другом аминокислоты пептида A связаны сложноэфирной или простой эфирной связью. Сложноэфирная или простая эфирная связь может быть, например, между аминокислотами 2 и 3, 3 и 4, 4 и 5 или 5 и 6. Необязательно пептид A может быть дополнительно модифицирован ковалентной связью с другим химическим остатком, включая связь с полимером (например, гидрофильным полимером), алкилирование или ацилирование.

В конкретном варианте осуществления описанный выше пептид класса 5, содержащий PLA, модифицируют, чтобы он содержал оксипроизводное PLA, такое как, например, сложный эфир PLA или простой эфир PLA. Например, пептид класса 5 может содержать любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1402, 1405-1420, 1422-1425, 1432-1436, 1438, 1439, 1445, 1446, и 1451, где PLA связана сложноэфирной или простой эфирной связью с аминокислотой, пептидом, полимером, ацильной группой или алкильной группой. Аминокислота, пептид, полимер, ацильная группа или алкильная группа могут быть любыми, описанными в настоящем описании. В случае, когда PLA связана сложноэфирной связью с аминокислотой или пептидом, пептид класса 5 можно считать депсипептидом.

Также в другом конкретном варианте осуществления описанный выше пептид класса 5, в котором отсутствует PLA, модифицируют, чтобы он содержал по меньшей мере одну сложноэфирную связь или простую эфирную связь между двумя следующими друг за другом аминокислотами, которые являются N-концевыми по отношению к аминокислоте в положении 7 (согласно нумерации нативного глюкагона). В конкретном варианте осуществления пептид класса 5 содержит по меньшей мере одну сложноэфирную или простую эфирную связь между двумя следующими друг за другом аминокислотами. В более конкретном варианте осуществления пептид класса 5 содержит 6 N-концевых аминокислот последовательности SEQ ID NO:1401 и две следующих друг за другом аминокислоты из 6 N-концевых аминокислот связаны сложноэфирной или простой эфирной связью.

Пептид A может содержать любые аминокислоты, синтетические или встречающиеся в природе, при условии, что по меньшей мере две следующих друг за другом аминокислоты связаны сложноэфирной или простой эфирной связью. В конкретном варианте осуществления пептид A содержит аминокислоты нативного глюкагона. Аминокислотой в положении 1 и/или положении 2 может быть аминокислота, которая уменьшает чувствительность к расщеплению дипептидилпептидазой IV. Например, пептид A может содержать в положении 1 аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из D-гистидина, альфа,альфа-диметилимидазолуксусной кислоты (DMIA), N-метилгистидина, альфа-метилгистидина, имидазолуксусной кислоты, дезаминогистидина, гидроксилгистидина, ацетилгистидина и гомогистидина. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления аминокислотой в положении 2 пептида A является аминокислота, выбранная из группы, состоящей из D-серина, D-аланина, валина, глицина, N-метилсерина, N-метилаланина и аминоизомасляной кислоты (AIB). Также, например, аминокислотой в положении 3 пептида A может быть глутаминовая кислота, в противоположность нативному остатку глутамина нативного глюкагона. Соответственно, пептид общей структуры A-B-C может содержать аминокислотную последовательность:

Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO:1507);

Xaa₂-Xaa₃-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO:1508) или

Xaa₃-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO:1509),

где Xaa₁ выбрана из группы, состоящей из: His, D-гистидина, альфа,альфа-диметилимидазолуксусной кислоты (DMIA), N-метилгистидина, альфа-метилгистидина, имидазолуксусной кислоты, дезаминогистидина, гидроксилгистидина, ацетилгистидина и гомогистидина; Xaa₂ выбрана из группы, состоящей из: Ser, D-серина, D-аланина, валина, глицина, N-метилсерина, N-метилаланина и аминоизомасляной кислоты (AIB); и Xaa₃ означает Gln или Glu.

В некоторых вариантах осуществления B модифицирован таким образом, что содержит до трех модификаций аминокислот. Например, B, который представляет нативную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1401, модифицируют одной или несколькими консервативными модификациями аминокислот.

В другом варианте осуществления B содержит одну или несколько модификаций аминокислот, выбранных из группы, состоящей из модификаций (iv)-(x), как описано в настоящем описании. В конкретном варианте осуществления B содержит одну или обе модификации аминокислот (v) и (vi). В следующем конкретном варианте осуществления B содержит одну или комбинацию модификаций аминокислот, выбранных из группы, состоящей из модификаций (iv), (vii), (viii), (ix) и (x), в добавление к модификациям (v) и (vi).

Как описано в настоящем описании, пептид, имеющий общую структуру A-B-C, может содержать одну или несколько заряженных аминокислот на C-конце, например, в виде Y и/или Z, как указано в настоящем описании. Альтернативно или дополнительно, пептид, имеющий общую структуру A-B-C, может дополнительно содержать одну-две заряженных аминокислоты, C-концевых по отношению к Z, когда C содержит X-Y-Z. Заряженной аминокислотой может быть, например, одна из следующих аминокислот: Lys, Arg, His, Asp и Glu. В конкретном варианте осуществления Y является Asp.

В некоторых вариантах осуществления пептид, имеющий общую структуру A-B-C, содержит гидрофильный остаток, ковалентно связанный с остатком аминокислоты в положении 1, 16, 20, 21 или 24 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1401) или с N- или C-концевым остатков пептида, имеющего общую структуру A-B-C. В конкретном варианте осуществления гидрофильный остаток связан с остатком Cys пептида, имеющего общую структуру A-B-C. В связи с этим, аминокислота в положении 16, 21, 24 или 29 нативного глюкагона (SEQ ID NO:1401) может быть заменена остатком Cys. Альтернативно, остаток Cys, содержащий гидрофильный остаток, может быть добавлен к C-концу пептида, имеющего общую структуру A-B-C, к положению 30 или положению 40, например, когда пептид, имеющий общую структуру A-B-C, содержит C-концевое удлинение (положения согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1401). Альтернативно, гидрофильный остаток может быть связан с PLA пептида, имеющего общую структуру A-B-C, через остаток гидроксила PLA. Гидрофильным остатком может быть любой из гидрофильных остатков, описанных в настоящем описании, включая, например, полиэтиленгликоль.

В конкретном аспекте пептид, имеющий общую структуру A-B-C, содержит стабилизированную альфа-спираль благодаря введению внутримолекулярного мостика. В некоторых вариантах осуществления внутримолекулярным мостиком является лактамовый мостик. Лактамовый мостик может быть между аминокислотами в положениях 9 и 12, аминокислотами в положениях 12 и 16, аминокислотами в положениях 16 и 20, аминокислотами в положениях 20 и 24 или аминокислотами в положениях 24 и 28 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1401). В конкретном варианте осуществления аминокислоты в положениях 12 и 16 или в положениях 16 и 20 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1401) связаны лактамовым мостиком. Рассматриваются и другие положения лактамового мостика.

Дополнительно или альтернативно, пептид, имеющий общую структуру A-B-C, может содержать альфа,альфа-дизамещенную аминокислоту, например, в любом из положений 16, 20, 21 или 24 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1401). В некоторых вариантах осуществления альфа,альфа-дизамещенной аминокислотой является AIB. В конкретном аспекте AIB находится в положении 16 (согласно нумерации в SEQ ID NO:1401).

Альтернативно или дополнительно, пептид, имеющий общую структуру A-B-C, может быть модифицирован, чтобы он содержал кислую аминокислоту в положении 16 (согласно нумерации в SEQ ID NO:1401), и такая модификация повышает стабильность альфа-спирали. Кислой аминокислотой в некоторых вариантах осуществления является аминокислота, содержащая сульфоновую кислоту в боковой цепи или карбоновую кислоту в боковой цепи. В более конкретном варианте осуществления кислая аминокислота выбрана из группы, состоящей из Glu, Asp, гомоглутаминовой кислоты, производного Cys и сульфоновой кислоты, цистеиновой кислоты, гомоцистеиновой кислоты, Asp и алкилированного производного Cys, имеющего структуру

,

где X₅ означает C₁-C₄алкил, C₂-C₄алкенил или C₂-C₄алкинил.

В конкретном варианте осуществления пептид класса 5 может содержать любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1460-1470, 1473-1478, 1480-1488, 1490-1496, 1503, 1504, 1506 и 1514-1518, или содержать аминокислотную последовательность любого из пептидов 2-6, указанных в таблице 13, пептидов 1-8, указанных в таблице 14, и пептидов 2-6, 8 и 9, указанных в таблице 15.

В некоторых вариантах осуществления пептид, имеющий общую структуру A-B-C, представляет собой пептид класса 5. В конкретном варианте осуществления пептид проявляет агонизм, составляющий по меньшей мере примерно 50% от максимального агонизма, достигаемого нативным GLP-1 в отношении рецептора GLP-1, и дает по меньшей мере примерно 50% ингибирование максимального ответа, достигаемого нативным глюкагоном в отношении рецептора глюкагона. В другом конкретном варианте осуществления пептид проявляет агонизм, составляющий по меньшей мере примерно 55%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95% или примерно 100% от максимального агонизма, достигаемого нативным GLP-1 в отношении рецептора GLP-1. Альтернативно или дополнительно, пептид может вызывать по меньшей мере примерно 55%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95% или примерно 100% ингибирование максимального ответа, достигаемого нативным глюкагоном в отношении рецептора глюкагона.

В некоторых вариантах осуществления предлагается пептид класса 5 или его конъюгат, содержащий:

(1) модификации, которые придают активность антагониста глюкагона активность, включая но без ограничения:

(a) замену Phe в положении 6 на PLA (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа), необязательно с делецией от 1 до 5 аминокислот с N-конца глюкагона дикого типа; или

(b) делецию 2-5 аминокислот с N-конца глюкагона дикого типа; необязательно с заменой Asp в положении 9 глюкагона дикого типа глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой или производным цистеина и сульфоновой кислоты (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа); и

(2) модификации, которые придают активность агониста GLP-1, включая, но без ограничения:

(a) инсерцию или замену α,α-дизамещенной аминокислотой в области аминокислот 12-29 глюкагона дикого типа, например, в одном, двух, трех, четырех или более положениях 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа); или

(b) введение внутримолекулярного мостика в области аминокислот 12-29 глюкагона дикого типа, например, солевого мостика или лактамового мостика или другого типа ковалентной связи; или

(c) замену аминокислоты в одном или нескольких положениях 2, 3, 17, 18, 21, 23 или 24 (согласно нумерации аминокислот нативного глюкагона) соответствующей аминокислотой GLP-1, например, Ser2 заменяют на Ala, Gln3 заменяют на Glu, Arg17 заменяют на Gln, Arg в положении 18 заменяют на Ala, Asp в положении 21 заменяют на Glu, Val в положении 23 заменен на Ile и/или Gln в положении 24 заменяют на Ala; или

(d) другие модификации, которые стабилизируют альфа-спиральную структуру в области положений аминокислот 12-29 согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа; и

(3) другие модификации, которые повышают активность агониста GLP-1, например,

(a) C-концевой амид или сложный эфир вместо C-концевого карбоксилата;

и необязательно

(4) одну или несколько из следующих модификаций:

(a) ковалентное связывание с гидрофильным остатком, таким как полиэтиленгликоль, например, на N-конце или в положении 6, 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40 или с C-концевой аминокислотой; и/или

(b) ацилирование или алкилирование; и необязательно

(5) одну или несколько из следующих дополнительных модификаций:

(a) ковалентное связывание аминокислот с N-концом, например, 1-5 аминокислот с N-концом, необязательно сложноэфирной связью с PLA в положении 6 (согласно нумерации глюкагона дикого типа), необязательно вместе с модификациями в положении 1 или 2, например, как описано в настоящем описании, которые повышают устойчивость к расщеплению DPP-IV;

(b) делецию аминокислот в положениях 29 и/или 28, и необязательно в положении 27 (согласно нумерации глюкагона дикого типа);

(c) ковалентное связывание аминокислот с C-концом;

(d) неконсервативные замены, консервативные замены, добавления или делеции с сохранением требуемой активности, например, консервативные замены в одном или нескольких положениях 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29, замену Tyr в положении 10 на Val или Phe, замену Lys в положении 12 на Arg, замену аминокислоты в одном или нескольких из указанных положений на Ala;

(e) модификацию аспарагиновой кислоты в положении 15, например, заменой глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой, цистеиновой кислотой или гомоцистеиновой кислотой, которые могут уменьшать разложение; или модификацию серина в положении 16, например, заменой треонином, AIB, глутаминовой кислотой или другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь длиной 4 атома, или альтернативно, любой одной из следующих аминокислот: глутамином, гомоглутаминовой кислотой или гомоцистеиновой кислотой, которые также могут уменьшать разложение вследствие расщепления связи Asp15-Ser16;

(f) модификацию метионина в положении 27, например, заменой лейцином или норлейцином, чтобы уменьшить окислительное разложение;

(g) модификацию Gln в положении 20 или 24, например, заменой на Ala или AIB, чтобы уменьшить разложение, которое происходит вследствие дезамидирования Gln;

(h) модификацию Asp в положении 21, например, заменой на Glu, чтобы уменьшить разложение, которое происходит в результате дегидратации Asp с образованием промежуточного циклического сукцинимида, с последующей изомеризацией до изоаспартата;

(j) гомодимеризацию или гетеродимеризацию, как описано в настоящем описании; и

(k) комбинации указанных выше модификаций.

Следует понимать, что любую из модификаций в пределах одного и того же класса можно комбинировать вместе и/или комбинировать модификации разных классов. Например, модификации (1)(a) можно комбинировать с (2)(a) и (3); (1)(a) можно комбинировать с (2)(b), например лактамовым мостиком или солевым мостиком, и (3); (1)(a) можно комбинировать с (2)(c) и (3); (1)(b) можно комбинировать с (2) (a) и (3); (1)(b) можно комбинировать с (2)(b), например, лактамовым мостиком или солевым мостиком, и (3); (1)(b) можно комбинировать с (2)(c) и (3); любую из указанных выше модификаций можно комбинировать с (4)(a) и/или (4)(b); и любую из указанных выше модификаций можно комбинировать с любыми модификациями (5)-(5)(k).

В примерах вариантов осуществления замену α,α-дизамещенной аминокислотой AIB осуществляют в одном, двух, трех или всех положениях 16, 20, 21 или 24 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа).

В примерах вариантов осуществления внутримолекулярный мостик является солевым мостиком.

В других примерах вариантов осуществления внутримолекулярный мостик представляет ковалентную связь, например, лактамовый мостик. В некоторых вариантах осуществления лактамовый мостик образован между аминокислотами в положениях 9 и 12, аминокислотами в положениях 12 и 16, аминокислотами в положениях 16 и 20, аминокислотами в положениях 20 и 24 или аминокислотами в положениях 24 и 28 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:1401). В примерах вариантов осуществления ацилирование или алкилирование осуществляют в положении 6, 10, 20 или 24 или на N-конце или C-конце (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) SEQ ID NO:1401.

В примерах вариантов осуществления модификации включают:

(i) замену Asp в положении 15 (согласно нумерации в SEQ ID NO:1401) цистеиновой кислотой, глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой и гомоцистеиновой кислотой;

(ii) замену Ser в положении 16 (согласно нумерации в SEQ ID NO:1401) цистеиновой кислотой, глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой и гомоцистеиновой кислотой;

(iii) замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой;

(iv) замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты;

(v) замену в положении 28 на Asn, Asp или Glu;

(vi) замену в положении 28 на Asp;

(vii) замену в положении 28 на Glu;

(viii) замену Thr в положении 29 заряженной аминокислотой;

(ix) замену of Thr в положении 29 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты;

(x) замену в положении 29 на Asp, Glu или Lys;

(xi) замену в положении 29 на Glu;

(xii) инсерцию 1-3 заряженных аминокислот после положения 29;

(xiii) инсерцию после положения 29 Glu или Lys;

(xiv) инсерцию после положения 29 Gly-Lys или Lys-Lys;

или их комбинации.

Любую из модификаций, описанных выше, которые повышают активность агониста рецептора GLP-1, активность антагониста рецептора глюкагона, растворимость пептида и/или стабильность пептида, можно использовать по отдельности или в комбинации.

Модификация для повышения стабильности

Согласно некоторым вариантам осуществления пептиды класса 5, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть дополнительно модифицированы, чтобы они содержали аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1421 (GPSSGAPPPS) или SEQ ID NO:1450, связанную аминокислотой на карбоксильном конце (положение 24) пептида класса 5, и введены пациентам, чтобы индуцировать потерю массы или помочь в поддержании массы. Более конкретно, пептид класса 5, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1405, SEQ ID NO:1406, SEQ ID NO:1407, SEQ ID NO:1408, SEQ ID NO:1409, SEQ ID NO:1412, SEQ ID NO:1413, SEQ ID NO:1414, SEQ ID NO:1416, SEQ ID NO:1417, SEQ ID NO:1418, SEQ ID NO:1419, SEQ ID NO:1422, SEQ ID NO:1423, SEQ ID NO:1424 и SEQ ID NO:1425, и дополнительно содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1421 (GPSSGAPPPS) или SEQ ID NO:1450, связанную с аминокислотой на карбоксильном конце (положение 24) пептида или пептида класса 5, применяют для подавления аппетита и индукции потери массы/поддержанию массы. В некоторых вариантах осуществления вводимый пептид или пептид класса 5 содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1416, SEQ ID NO:1417, SEQ ID NO:1418 и SEQ ID NO:1419, и дополнительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1421 (GPSSGAPPPS), связанную с аминокислотой на карбоксильном конце (положение 24) пептида класса 5. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение пептида или пептида класса 5, содержащего последовательность SEQ ID NO:1445 или SEQ ID NO:1446.

Соответственно, предполагается, что пептиды класса 5, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть модифицированы подобным образом, чтобы уменьшить их чувствительность к преждевременному химическому расщеплению в водных буферах. Согласно некоторым вариантам осуществления пептиды класса 5, описанные в настоящем описании, могут быть дополнительно модифицированы, чтобы повысить их стабильность в водных растворах, заменой нативной аспарагиновой аминокислоты, находящейся в соответствующем положении 15 нативного глюкагона, аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из цистеиновой кислоты, глутаминовой кислоты, гомоглутаминовой кислоты и гомоцистеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам осуществления остаток аспарагиновой кислоты в положении 10 пептид класса 5 SEQ ID NO:1405, SEQ ID NO:1406, SEQ ID NO:1407 или SEQ ID NO:1408, может быть заменен аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из цистеиновой кислоты, глутаминовой кислоты, гомоглутаминовой кислоты и гомоцистеиновой кислоты, и в некоторых вариантах осуществления нативная аспарагиновая кислота в положении 10 SEQ ID NO:1405, SEQ ID NO:1406, SEQ ID NO:1407 или SEQ ID NO:1408 заменена глутаминовой кислотой. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 5, обладающий повышенной стабильностью в водных растворах, где антагонист содержит модифицированную последовательность SEQ ID NO:1409, где модификация включает замену Asp в положении 10 SEQ ID NO:1409 на Glu. В некоторых вариантах осуществления предлагается пептид класса 5, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1422, SEQ ID NO:1423, SEQ ID NO:1424 и SEQ ID NO:1425. В некоторых вариантах осуществления пептид класса 5 амидирован.

Последовательность Asp-Ser в положении 15-16 нативного глюкагона идентифицирована как однозначно нестабильный дипептид, который приводит к преждевременному химическому расщеплению нативного гормона в водных буферах. Например, при выдерживании в 0,01н. HCl при 37°C в течение 2 недель более чем 50% нативного глюкагона может быть подвергнуто расщеплению на фрагменты. Два высвобождаемых при расщеплении пептида 1-15 и 16-29 утрачивают глюкагон-подобную биологическую активность и следовательно создают ограничение для предварительного приготовления водного препарата глюкагона и родственных ему аналогов. Обнаружено, что избирательная химическая замена Asp в положении 15 нативного глюкагонового пептида на Glu фактически исключает химическое расщепление пептидной связи 15-16.

В следующих примерах вариантов осуществления любое из указанных выше соединений может быть дополнительно модифицировано, чтобы повысить стабильность, путем модификации аминокислоты, соответствующей положению 15 или 16 нативного глюкагона, чтобы уменьшить разложение пептида с течением времени, особенно в кислых или щелочных буферах.

Модификация для повышения растворимости

Пептид класса 5 может быть дополнительно модифицирован, чтобы повысить растворимость пептида в водных растворах при физиологическом pH, при этом в некоторых аспектах с сохранением активности антагониста глюкагона и активности агониста GLP-1. Введение гидрофильных групп в положениях, соответствующих положениям 12, 15, 16, 19 и 24 пептида SEQ ID NO:1405, или в положениях 12, 16, 19 или 24 пептида SEQ ID NO:1406 может повысить растворимость полученных в результате пептидов в растворах, имеющих физиологическое значение pH, сохраняя при этом активность антагониста глюкагона и агониста GLP исходных соединений. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления описанный в настоящем описании пептид класса 5, который дополнительно модифицирован, что он содержит одну или несколько гидрофильных групп, ковалентно связанных с боковыми цепями аминокислот, соответствующих аминокислотам в положениях 12, 15, 16, 19 и 24 пептида SEQ ID NO:1405 или SEQ ID NO:1406. В следующем варианте осуществления боковые цепи аминокислот, соответствующих аминокислотам в положениях 16 и 19 SEQ ID NO:1405 или SEQ ID NO:1406, ковалентно связаны с гидрофильными группами, и в некоторых вариантах осуществления гидрофильной группой является полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Родственные глюкагону пептиды класса 5 могут быть модифицированы введением заряда на его карбоксильном конце, чтобы повысить растворимость пептида, сохраняя при этом агонистические свойства пептида. Повышенная растворимость обеспечивает возможность получения и хранения растворов глюкагона при значениях pH, близких к нейтральному. Приготовление растворов глюкагона с относительно нейтральным pH (например, pH примерно от 6,0 до примерно 8,0) повышает долговременную стабильность пептидов класса 5.

Авторы настоящего изобретения предполагают, что пептиды класса 5, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть избирательно модифицированы, чтобы повысить их растворимость в водных растворах при относительно нейтральных значениях pH (например, pH примерно от 6,0 до примерно 8,0), и в некоторых случаях с сохранением активности антагониста глюкагона и GLP-1. Соответственно, некоторые варианты относятся к антагонисту глюкагона/GLP-1 SEQ ID NO:1405, SEQ ID NO:1406, SEQ ID NO:1407 или SEQ ID NO:1408, который был дополнительно модифицирован по сравнению с нативными аминокислотами, присутствующими в положениях 6-29 глюкагона дикого типа (SEQ ID NO:1401), чтобы добавить заряд пептиду, путем замены нативных незаряженных аминокислот заряженными аминокислотами или добавлением заряженных аминокислот к карбоксильному концу. Согласно некоторым вариантам осуществления от одной до трех незаряженных нативных аминокислот пептидов класса 5, раскрытых в настоящем изобретении, заменяют заряженными аминокислотами. В некоторых вариантах осуществления заряженная аминокислота выбрана из группы, состоящей из лизина, аргинина, гистидина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. Более конкретно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что замена встречающейся в норме аминокислоты, соответствующей аминокислоте в положении 28 и/или 29 (относительно нативного глюкагона), заряженными аминокислотами и/или добавлением от одной до двух заряженных аминокислот на карбоксильном конце пептида повышают растворимость и стабильность пептида класса 5 в водных растворах при физиологически значимых pH (т.е. при pH примерно от 6,5 до примерно 7,5). Соответственно, такие модификации пептидов класса 5, как предполагают, оказывают сходное влияние на растворимость в водных растворах, особенно при pH в диапазоне примерно от 5,5 до примерно 8,0, сохраняя при этом биологическую активность исходного пептида.

Согласно некоторым вариантам осуществления пептид класса 5 с SEQ ID NO:1405, SEQ ID NO:1406, SEQ ID NO:1407 или SEQ ID NO:1408 модифицируют заменой нативной аминокислоты в положении 23 и/или 24 указанных последовательностей отрицательно заряженной аминокислотой (например, аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой) и необязательно добавлением отрицательно заряженной аминокислоты (например, аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты) к карбоксильному концу пептида. В альтернативном варианте осуществления пептид класса 5, содержащий SEQ ID NO:1405, SEQ ID NO:1406, SEQ ID NO:1407 или SEQ ID NO:1408, модифицируют заменой нативной аминокислоты в положении 24 SEQ ID NO:1405, SEQ ID NO:1406, SEQ ID NO:1407 или SEQ ID NO:1408 положительно заряженной аминокислотой (например, лизином, аргинином или гистидином) и необязательно добавлением одной или двух положительно заряженных аминокислот (например, лизина, аргинина или гистидина) на карбоксильном конце пептида. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 5, обладающий повышенной растворимостью и стабильностью, где аналог содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451, при условии, что по меньшей мере одна из аминокислот в положении 23 или 24 SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451 заменена кислой аминокислотой и/или дополнительная кислая аминокислота добавлена к карбоксильному концу SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451. В некоторых вариантах осуществления кислые аминокислоты независимо выбраны из группы, состоящей из Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 5, обладающий повышенной растворимостью и стабильностью, где антагонист содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1416, SEQ ID NO:1417, SEQ ID NO:1418 или SEQ ID NO:1419. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается агонист глюкагона, содержащий последовательность SEQ ID NO:1416 или SEQ ID NO:1417. В некоторых вариантах осуществления пептид класса 5 содержит последовательность SEQ ID NO:1420.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пептид класса 5, содержащий последовательность SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451. В некоторых вариантах осуществления аминокислотой в положении 4 SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451 является аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, гомоглутаминовая кислота, цистеиновая кислота или гомоцистеиновая кислота, и в некоторых вариантах осуществления аминокислотой в положении 4 является аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, цистеиновая кислота или гомоцистеиновая кислота, и в следующем варианте осуществления аминокислотой в положении 4 SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451 является аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, и в некоторых вариантах осуществления аминокислотой в положении 4 SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451 является аспарагиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления предлагается пептид класса 5, содержащий последовательность SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451, где аминокислотой в положении 4 ID NO:1415 является аспарагиновая кислота, и аминокислотой в положении 10 SEQ ID NO:1415 является глутаминовая кислота. В следующем варианте осуществления C-концевая аминокислота SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451 модифицирована, чтобы заменить нативную группу карбоновой кислоты нейтральной по заряду группой, такой как амид или сложный эфир.

Слияния пептидов класса 5

В следующем варианте осуществления аминокислота на карбоксильном конце пептида класса 5, описанного в настоящем описании, ковалентно связана со вторым пептидом, содержащим последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1421, 1426, 1427 и 1450. Например, в некоторых вариантах осуществления пептид класса 5 с SEQ ID NO:1415, SEQ ID NO:1451, SEQ ID NO:1405, SEQ ID NO:1406, SEQ ID NO:1407, SEQ ID NO:1408, SEQ ID NO:1412, SEQ ID NO:1413, SEQ ID NO:1414, SEQ ID NO:1416, SEQ ID NO:1417, SEQ ID NO:1418, SEQ ID NO:1419, SEQ ID NO:1422, SEQ ID NO:1423, SEQ ID NO:1424 и SEQ ID NO:1425 ковалентно связан со вторым пептидом, содержащим последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1421 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO:1426 (KRNRNNIA), SEQ ID NO:1427 (KRNR) и SEQ ID NO:1450 (GPSSGAPPPSX).

В некоторых вариантах осуществления предлагается димер пептида класса 5, содержащий две последовательности, независимо выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO:1405, SEQ ID NO:1406, SEQ ID NO:1407, SEQ ID NO:1408, SEQ ID NO:1409, SEQ ID NO:1422, SEQ ID NO:1423, SEQ ID NO:1424 и SEQ ID NO:1425, который дополнительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1421 (GPSSGAPPPS), связанную с аминокислотой на карбоксильном конце пептида класса 5.

В некоторых вариантах осуществления пептиды класса 5 дополнительно модифицируют укорочением или делецией одной или двух аминокислот на C-конце пептида (т.е. укорочением аминокислоты в положении 29 или в положениях 28 и 29 нативного глюкагона). Предпочтительно укорочение не влияет на активность (например, антагонизм глюкагона/агонизм GLP-1) пептида класса 5.

Конъюгаты пептидов класса 5

Также предлагаются конъюгаты пептидов класса 5, в которых глюкагоновый пептид связан необязательно ковалентной связью и необязательно через линкер с конъюгируемым остатком.

В вариантах осуществления, где пептид класса 5 содержит цепь полиэтиленгликоля, цепь полиэтиленгликоля может быть в форме неразветвленной цепи или может быть разветвленной. Согласно некоторым вариантам осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет среднюю молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 500 до примерно 10000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет среднюю молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет среднюю молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет среднюю молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 1000 до примерно 2000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет среднюю молекулярную массу примерно 1000 дальтон.

В некоторых вариантах осуществления пегилированный пептид класса 5 содержит пептид, состоящий из последовательности SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451, где цепь полиэтиленгликоля связана с аминокислотой, выбранной из аминокислот в положениях 11, 12, 15, 16, 19 и 24 SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451, и молекулярная масса цепи ПЭГ составляет примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления пегилированный пептид класса 5 содержит пептид, состоящий из последовательности SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451, где цепь полиэтиленгликоля связана с аминокислотой в положении 16 или 19 SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451, и молекулярная масса цепи ПЭГ составляет примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон. В следующем варианте осуществления модифицированный пептид класса 5 содержит две или более цепей полиэтиленгликоля, ковалентно связанных с пептидом, где общая молекулярная масса глюкагоновых цепей составляет примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления пептид класса 5 содержит последовательность SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451, где цепь полиэтиленгликоля связана с аминокислотой в положениях 16 и 19 SEQ ID NO:1415 или SEQ ID NO:1451, и общая молекулярная масса двух цепей ПЭГ составляет примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон.

Родственный глюкагону пептид класса 5 может содержать любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1401-1518, необязательно с 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительными модификациями, которые сохраняют активность антагониста глюкагона и агониста GLP-1.

Способы применения

Пептиды глюкагонового надсемейства

Как правило, пролекарства, содержащие пептид глюкагонового надсемейства или родственный глюкагону пептид, такой как пептид класса 1, 2, 3, 4 или 5, можно применять для любой цели, для которой используют пептиды глюкагонового надсемейства и родственные глюкагону пептиды (см., например, подробное описание выше). Например, полагают, что раскрытые биологически активные пролекарственные пептидные аналоги являются подходящими для любого применения, ранее описанного для соответствующего исходного биологически активного пептида. Соответственно, пролекарственные аналоги родственных глюкагону пептидов, описанные в настоящем описании, можно применять для лечения гипогликемии, гипергликемии, диабета или других метаболических заболеваний, которые возникают в результате высоких/низких уровней глюкагона в крови или высоких/низких уровней глюкозы в крови. Согласно некоторым вариантам осуществления пациентом, подвергаемым лечению с применением пролекарства, раскрытого в настоящем описании, является домашнее животное, и в другом варианте осуществления пациентом, подвергаемым лечению, является человек.

В некоторых вариантах осуществления пролекарства применяют для уменьшения или подавления аппетита, уменьшения потребления пищи, индукции потери массы или для оказании помощи в поддержании массы. Такие способы снижения аппетита или стимуляции потери массы тела, как предполагают, полезны при снижении массы тела, предотвращении прироста массы или лечении ожирения в различных случаях, включая индуцированное лекарственными средствами ожирение, и для уменьшения осложнений, ассоциированных с ожирением, включая заболевание сосудов (болезнь коронарных артерий, инсульт, заболевание периферических сосудов, ишемически-реперфузионный синдром и т.д.), гипертензию, появление диабета типа II, гиперлипидемию и скелетно-мышечные заболевания.

В других вариантах осуществления пролекарства применяют вместе с парентеральным введением питательных веществ недиабетическим пациентам в условиях стационара, например, пациентам, получающим парентеральное питание или полное парентеральное питание. Неограничивающие примеры включают оперируемых пациентов, пациентов в коме, пациентов с заболеваниями пищеварительного тракта или с нефункционирующим желудочно-кишечным трактом (например, вследствие хирургического удаления, блокады или нарушенной всасывающей способности, болезни Крона, язвенного колита, непроходимости желудочно-кишечного тракта, фистулы желудочно-кишечного тракта, острого панкреатита, ишемического заболевания кишечника, радикальной операции на желудочно-кишечном тракте, некоторых врожденных аномалий желудочно-кишечного тракта, длительной диареи или синдрома короткой кишки вследствие операции), пациентов в состоянии шока и пациентов, претерпевающих процессы выздоровления, часто получающих парентеральное введение углеводов, наряду с различными сочетаниями липидов, электролитов, минералов, витаминов и аминокислот. Пролекарство пептида глюкагонового надсемейства и парентеральную композицию питательных веществ можно вводить одновременно, в разных временных точках, до или после друг друга, при условии, что пролекарство пептида глюкагонового надсемейства оказывает требуемый биологический эффект в период времени, когда парентеральная композиция питательных веществ переваривается. Например, парентеральное питание можно вводить 1, 2 или 3 раза в сутки, тогда как пролекарство пептида глюкагонового надсемейства вводят один раз через день, три раза в неделю, два раза в неделю, один раз в неделю, один раз каждые 2 недели, один раз каждые 3 недели или один раз в месяц.

Метаболический синдром, также известный как метаболический синдром X, синдром резистентности к инсулину или синдром Ривена, является расстройством, которым поражено более 50 миллионов американцев. Метаболический синдром обычно характеризуется сочетанием по меньшей мере трех или более из следующих факторов риска: (1) абдоминальное ожирение (избыточная жировая ткань в брюшной полости и вокруг нее), (2) атерогенная дислипидемия (жировые расстройства крови, включая высокие уровни триглицеридов, низкие уровни холестерина ЛВП и высокие уровни холестерина ЛНП, которые увеличивают накопление бляшек в стенках артерий), (3) повышенное кровяное давление, (4) резистентность к инсулину или непереносимость глюкозы, (5) протромботическое состояние (например, высокий уровень фибриногена или ингибитора активатора плазминогена 1 в крови), и (6) провоспалительное состояние (например, повышенный уровень C-реактивного белка в крови). Другие факторы риска могут включать старение, нарушение гормонального баланса и генетическую предрасположенность.

Метаболический синдром ассоциирован с повышенным риском коронарной болезни сердца и других расстройств, связанных с накоплением бляшек в сосудах, таких как инсульт и заболевание периферических сосудов, называемое атеросклеротическим сердечно-сосудистым заболеванием (ASCVD). У пациентов с метаболическим синдромом можно наблюдать прогрессирование от состояния резистентности к инсулину на его ранних стадиях до полностью развившегося диабета типа II с повышенным риском последующего ASCVD. Не имея намерения вдаваться в какую-либо конкретную теорию, полагают, что во взаимосвязь между резистентностью к инсулину, метаболическим синдромом и сосудистым заболеванием может быть вовлечен один или несколько действующих совместно патогенных механизмов, включая нарушенную стимулируемую инсулином вазодилатацию, ассоциированное с резистентностью к инсулину уменьшение доступности NO вследствие повышенного окислительного стресса и аномалии в уровне гормонов адипоцитов, таких как адипонектин (Lteif and Mather, Can. J. Cardiol. 20 (suppl. B): 66B-76B (2004)).

Согласно панели лечения взрослых национальной образовательной программы по холестерину 2001 (ATP III), любые три из следующих признаков, имеющихся у одного человека, удовлетворяют критериям метаболического синдрома: (a) абдоминальное ожирение (окружность талии более 102 см у мужчин и более 88 см у женщин); (b) триглицериды в сыворотке (150 мг/дл или выше); (c) холестерин ЛВП (40 мг/дл или ниже у мужчин и 50 мг/дл или ниже у женщин); (d) кровяное давление (130/85 или выше); и (e) уровень глюкозы натощак (110 мг/дл или выше). Согласно Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) человек, имеющий высокие уровни инсулина (повышенный уровень глюкозы в крови натощак или только повышенный уровень глюкозы после приема пищи) по меньшей мере с двумя из следующих критериев, удовлетворяют критериям метаболического синдрома: (a) абдоминальное ожирение (отношение талии к бедрам выше 0,9, индекс массы тела по меньшей мере 30 кг/м² или измерение талии более 37 дюймов (92,5 см); (b) панель холестерина показывает уровень триглицеридов, составляющий по меньшей мере 150 мг/дл или уровень холестерина ЛВП ниже 35 мг/дл; (c) кровяное давление 140/90 или выше или лечение по поводу высокого кровяного давления) (Mathur, Ruchi, «Metabolic Syndrome», ed. Shiel, Jr., William C., MedicineNet.com, May 11, 2009).

В указанных в настоящем описании целях, если человек удовлетворяет критериям любого одного или обоих наборов критериев согласно панели лечения взрослых Национальной образовательной программы по холестерину 2001 или ВОЗ, то такого человека считают страдающим метаболическим синдромом.

Не вдаваясь в какую-либо конкретную теорию, полагают, что глюкагоновые пептиды, описанные в настоящем описании, могут быть полезны при лечении метаболического синдрома. Соответственно, изобретение относится к способу профилактики или лечения метаболического синдрома или уменьшения одного, двух, трех или более факторов риска у субъекта, включающему введение субъекту глюкагонового пептида, описанного в настоящем описании, в количестве, эффективном для профилактики или лечения метаболического синдрома или его факторов риска.

Неалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD) относится к широкому спектру заболеваний печени в диапазоне от простой жировой печени (стеатоза) до неалкогольного стеатогепатита (NASH) и до цирроза (необратимого, углубленного рубцевания печени). Все стадии NAFLD в совокупности дают накопление жира (жировую инфильтрацию) в клетках печени (гепатоцитах). Простая жировая печень представляет собой аномальное накопление определенного типа жира, триглицерида, в клетках печени без воспаления или рубцевания. В случае NASH накопление жира ассоциировано с различной степенью воспаления (гепатита) и рубцевания (фиброза) печени. Воспалительные клетки могут разрушать клетки печени (гепатоклеточный некроз). В терминах «стеатогепатит» и «стеатонекроз» часть «стеато» относится к жировой инфильтрации, гепатит относится к воспалению печени, и некроз относится к разрушению клеток печени. NASH, в конечном счете, может приводить к рубцеванию печени (фиброзу) и затем к необратимому глубокому рубцеванию (циррозу). Цирроз, который вызван NASH, является последней и наиболее тяжелой стадией в спектре NAFLD (Mendler, Michel, «Fatty Liver: Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) and Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH)», ed. Schoenfield, Leslie J., MedicineNet.com, August 29, 2005).

Алкогольное заболевание печени или индуцированное алкоголем заболевание печени охватывает болезни печени, связанные или вызванные избыточным потреблением алкоголя: жировую печень (стеатоз), хронический или острый гепатит и цирроз. Алкогольный гепатит может быть в диапазоне от умеренного гепатита с аномальными результатами лабораторных тестов, которые являются показателем заболевания, до тяжелой дисфункции печени с осложнениями, такими как желтуха (желтая кожа вследствие задержки билирубина), печеночная энцефалопатия (неврологическая дисфункция, вызванная печеночной недостаточностью), асциты (накопление жидкости в брюшной полости), кровоточащий варикоз пищевода (варикозные вены в пищеводе), аномальное свертывание крови и кома. Гистологически алкогольный гепатит имеет характерный вид с баллонирующей дегенерацией гепатоцитов, воспалением с нейтрофилами и иногда тельцами Маллори (аномальная агрегация клеточных белков промежуточных филаментов). Анатомически цирроз характеризуется широко распространенными узелками в печени с фиброзом (Worman, Howard J., «Alcoholic Liver Disease», вебсайт медицинского центра Колумбийского университета).

Не вдаваясь в какую-либо конкретную теорию, полагают, что родственные глюкагону пептиды класса 2 и класса 3, описанные в настоящем описании, полезны при лечении алкогольного заболевания печени, NAFLD или любой его стадии, включая, например, стеатоз, стеатогепатит, гепатит, воспаление печени, NASH, цирроз или их осложнения. Соответственно, в изобретении предлагается способ профилактики или лечения алкогольного заболевания печени, NAFLD, или любой его стадии у субъекта, включающий введение субъекту глюкагонового пептида класса 2 или класса 3, описанного в настоящем описании, в количестве, эффективном для профилактики или лечения алкогольного заболевания печени, NAFLD или любой его стадии. Такие способы лечения включают уменьшение одного, двух, трех или более следующих признаков: содержания жира в печени, возникновения или прогрессирования цирроза, возникновения гепатоклеточной карциномы, признаков воспаления, например аномальных уровней ферментов печени (например, аспартатаминотрансферазы AST и/или аланинаминотрансферазы ALT, или LDH), повышенных уровней ферритина в сыворотке, повышенных уровней билирубина в сыворотке и/или признаков фиброза, например, повышенных уровней TGF-бета. В предпочтительных вариантах осуществления глюкагоновые пептиды класса 2 или класса 3 применяют для лечения пациентов, имеющих заболевание, прогрессирующее дальше простой жировой печени (стеатоза), и имеющие признаки воспаления или гепатита. Такие способы могут приводить, например, к уменьшению уровней AST и/или ALT.

Показано, что GLP-1 и эксендин-4 обладают некоторым нейропротекторным действием. Изобретение также относится к применению пептидов глюкагонового надсемейства для лечения нейродегенеративных заболеваний, включая, но без ограничения, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз, другие связанные с демиелинизацией расстройства, старческую деменцию, подкорковую деменцию, атеросклеротическую деменцию, ассоциированную со СПИДом деменцию или другие деменции, злокачественную опухоль центральной нервной системы, травматическое повреждение головного мозга, повреждение спинного мозга, инсульт или ишемию головного мозга, церебральный васкулит, эпилепсию, болезнь Хантингтона, синдром Туретта, синдром Гийена-Барре, болезнь Вильсона, болезни Пика, нейровоспалительные расстройства, энцефалит, энцефаломиелит или менингит вирусного, грибкового или бактериального происхождения или другие инфекции центральной нервной системы, прионовые болезни, мозжечковую атаксию, мозжечковую дегенерацию, синдромы спиноцеребеллярной дегенерации, атаксию Фридрейха, атаксию телеангиэктазии, спинальную дисмиотрофию, прогрессирующий супрануклеарный паралич, дистонию, спастичность мышц, тремор, пигментную дегенерацию сетчатки, стриатонигральную дегенерацию, митохондриальные энцефаломиопатии, нейрональный цероид-липофусциноз, печеночные энцефалопатии, почечные энцефалопатии, метаболические энцефалопатии, индуцированные токсинами энцефалопатии и индуцированное излучением повреждение головного мозга.

Соответственно, изобретение относится к способу профилактики или лечения нейродегенеративных заболеваний или уменьшения одного, двух, трех или более факторов риска у субъекта, включающему введение субъекту глюкагонового пептида, описанного в настоящем описании, в количестве, эффективном для профилактики или лечения нейродегенеративного заболевания или его факторов риска.

Способ лечения согласно настоящему изобретению включает стадии введения описанных в настоящем описании пролекарств пациенту с использованием любого стандартного пути введения, включая парентеральный, такой как внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный или внутримышечный пути, интратекальный, трансдермальный, ректальный, пероральный, назальный пути или введение посредством ингаляции. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят подкожно или внутримышечно, необязательно в депо форме или в виде части композиции замедленного высвобождения.

Композиции и комбинации

Пролекарства согласно изобретению можно вводить отдельно или в комбинации со вторым средством, таким как противодиабетическое средство или средство против ожирения. В некоторых аспектах пролекарство вводят в комбинации со вторым пролекарством или представителем глюкагонового надсемейства, включая, например, родственный глюкагону пептид. В некоторых вариантах осуществления пролекарство вводят в комбинации с противодиабетическим средством, включая, но без ограничения, инсулин, сульфонилмочевины, такие как толбутамид (ориназа), ацетогексамид (димелор), толазамид (толиназа), хлорпропамид (диабинез), глипизид (глюкотрол), глибурид (диабета, микроназа, глиназа), глимепирид (амарил) или гликлазид (диамикрон); меглитиниды, такие как репаглинид (прандин) или натеглинид (старликс); бигуаниды, такие как метформин (глюкофаж) или фенформин; тиазолидиндионы, такие как росиглитазон (авандия), пиоглитазон (актос) или троглитазон (резулин), или другие ингибиторы PPARγ; ингибиторы альфа-глюкозидазы, которые ингибируют усвоение углеводов, такие как миглитол (глисет), акарбоза (прекоза/глюкобай); эксенатид (байетта) или прамлинтид; ингибиторы дипептидилпептидазы-4 (DPP-4), такие как вилдаглиптин или ситаглиптин; ингибиторы SGLT (натрий-зависимого переносчика глюкозы 1); или ингибиторы FBP-азы (фруктоза-1,6-бисфосфатазы).

Средства против ожирения, известные в данной области или проходящие испытания, включают, но без ограничения, средства подавления аппетита, включая стимуляторы фенетиламинного типа, фентермин (необязательно с фенфлурамином или дексфенфлурамином), диэтилпропион (Tenuate®), фендиметразин (Prelu-2^®, Bontril^®), бензфетамин (Didrex®), сибутрамин (Meridia^®, Reductil^®); римонабант (Acomplia®), другие антагонисты рецептора каннабиноидов; оксинтомодулин; гидрохлорид флуоксетина (прозак); кунекса (топирамат и фентермин), экскалия (бупропион и зонисамид) или контрав (бупропион и налтрексон); или ингибиторы липазы, подобные ксеникалу (орлистату) или цетилистату (также известному как ATL-962), или GT 389-255.

Пролекарства согласно настоящему изобретению также можно вводить пациентам, страдающим от катаболического истощения. Установлено, что более половины пациентов со злокачественными опухолями испытывают катаболическое истощение, которое характеризуется непреднамеренной и прогрессирующей потерей массы, слабостью и низким содержанием жира и мышечной ткани. Синдром в равной мере распространен среди пациентов со СПИДом, а также может иметь место в случае бактериальных и паразитических болезней, ревматоидного артрита и хронических заболеваний кишечника, печени, легких и сердца. Синдром обычно ассоциирован с анорексией и может проявляться в виде состояния при старении или в результате физической травмы. Катаболическое истощение является симптомом, который снижает качество жизни, ухудшает лежащее в основе состояние и является основной причиной смерти.

Фармацевтические композиции, содержащие пролекарства, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть составлены и введены пациентам с использованием стандартных фармацевтически приемлемых носителей и путей введения, известных специалистам в данной области. Соответственно, настоящее изобретение охватывает фармацевтические композиции, содержащие одно или несколько пролекарств, раскрытых в настоящем изобретении, или их фармацевтически приемлемую соль в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит пролекарство в концентрации 1 мг/мл при pH примерно от 4,0 до примерно 7,0 в фосфатной буферной системе. Фармацевтические композиции могут содержать пролекарство в виде только одного фармацевтически активного компонента или пролекарства можно комбинировать с одним или несколькими дополнительными активными средствами. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается композиция, содержащая пролекарство согласно настоящему изобретению. Альтернативно, предлагается композиция для индуцирования потери массы или может быть предложена композиция для предотвращения увеличения массы, которая содержит пролекарство и пептид против ожирения. Подходящие пептиды против ожирения включают пептиды, описанные в патентах США 5691309, 6436435 или в патентной заявке США 20050176643.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается фармацевтическая композиция, содержащая любое из новых пролекарств, раскрытых в настоящем изобретении, предпочтительно стерильное и предпочтительно с уровнем очистки по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или эксципиент. Такие композиции могут содержать пролекарственное производное биологически активного пептида, раскрытое в настоящем изобретении, где образующийся в результате активный пептид присутствует в концентрации по меньшей мере 0,5 мг/мл, 1 мг/мл, 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 6 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл, 9 мг/мл, 10 мг/мл, 11 мг/мл, 12 мг/мл, 13 мг/мл, 14 мг/мл, 15 мг/мл, 16 мг/мл, 17 мг/мл, 18 мг/мл, 19 мг/мл, 20 мг/мл, 21 мг/мл, 22 мг/мл, 23 мг/мл, 24 мг/мл, 25 мг/мл или выше. Такие композиции могут содержать пролекарственное производное биологически активного пептида класса 1, 2 или 3, как раскрыто в настоящем изобретении, где образующийся в результате активный пептид присутствует в концентрации по меньшей мере A, где A равно 0,001 мг/мл, 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,5 мг/мл, 1 мг/мл, 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 6 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл, 9 мг/мл, 10 мг/мл, 11 мг/мл, 12 мг/мл, 13 мг/мл, 14 мг/мл, 15 мг/мл, 16 мг/мл, 17 мг/мл, 18 мг/мл, 19 мг/мл, 20 мг/мл, 21 мг/мл, 22 мг/мл, 23 мг/мл, 24 мг/мл, 25 мг/мл или выше. В других вариантах осуществления такие композиции могут содержать активный пептид класса 1, 2 или 3 в концентрации не более B, где B равно 30 мг/мл, 25 мг/мл, 24 мг/мл, 23, мг/мл, 22 мг/мл, 21 мг/мл, 20 мг/мл, 19 мг/мл, 18 мг/мл, 17 мг/мл, 16 мг/мл, 15 мг/мл, 14 мг/мл, 13 мг/мл, 12 мг/мл, 11 мг/мл 10 мг/мл, 9 мг/мл, 8 мг/мл, 7 мг/мл, 6 мг/мл, 5 мг/мл, 4 мг/мл, 3 мг/мл, 2 мг/мл, 1 мг/мл или 0,1 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления композиции могут содержать родственный глюкагону пептид класса 1, 2 или 3 в диапазоне концентраций от A до B мг/мл, например, от 0,001 до 30,0 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат водные растворы, которые стабилизированы и необязательно хранятся в разных емкостях. Соединения согласно настоящему изобретению можно использовать согласно некоторым вариантам осуществления для получения заблаговременно приготовленных растворов, готовых для инъекции. В других вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат лиофилизированный порошок. Фармацевтические композиции могут быть дополнительно упакованы в виде части набора, который содержит одноразовое устройство для введения композиции пациенту. Емкости или наборы могут иметь этикетки, на которых указано хранение при температуре окружающей среды или в холодильнике.

Предполагается, что в случае всех терапевтических способов, фармацевтических композиций, наборов и других сходных вариантов осуществления, описанных в настоящем описании, пролекарственные соединения включают все их фармацевтически приемлемые соли.

В некоторых вариантах осуществления предлагается набор с устройством для введения композиции пролекарства пациенту. Набор может дополнительно содержать множество емкостей, например флаконов, пробирок, бутылочек и подобных. Предпочтительно, наборы также будут включать инструкции по применению. Согласно некоторым вариантам осуществления устройством в наборе является устройство для дозирования аэрозоля, где композицию предварительно упаковывают в аэрозольное устройство. В другом варианте осуществления набор содержит шприц и иглу, и в некоторых вариантах осуществления композиция пролекарства предварительно упакована в шприц.

Фармацевтические препараты родственных глюкагону пептидов класса 1, 2 и 3

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается фармацевтическая композиция, содержащая глюкагоновый пептид согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция может содержать любой фармацевтически приемлемый ингредиент, включая, например, подкислители, добавки, адсорбенты, аэрозольные пропелленты, средства для вытеснения воздуха, подщелачивающие средства, средства, предотвращающие слеживание, антикоагулянты, противомикробные консерванты, антиоксиданты, антисептики, основы, связующие средства, буферные средства, хелатирующие агенты, средства для покрытия, красители, десиканты, детергенты, разбавители, дезинфицирующие средства, дезинтегрирующие средства, диспергирующие средства, средства, повышающие растворимость, красители, смягчители, эмульгаторы, стабилизаторы эмульсий, наполнители, пленкообразующие средства, усилители вкуса и запаха, корригенты, усилители текучести, гелеобразующие средства, гранулирующие средства, гигроскопические вещества, лубриканты, мукоадгезивные средства, основы для мазей, мази, маслянистые наполнители, органические основы, основы для пастилок, пигменты, пластификаторы, глянцующие средства, консерванты, комплексообразователи, средства для проникновения в кожу, солюбилизирующие средства, растворители, стабилизаторы, основы для суппозитория, поверхностно-активные средства, поверхностно-активные вещества, суспендирующие средства, подсластители, терапевтические средства, загустители, средства для тоничности, средства для токсичности, средства, повышающие вязкость, абсорбирующие воду средства, смешиваемые с водой сорастворители, смягчающие воду средства или увлажнители.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит любой или комбинацию следующих компонентов: аравийскую камедь, ацесульфам калия, ацетилтрибутилцитрат, ацетилтриэтилцитрат, агар, альбумин, спирт, дегидратированный спирт, денатурированный спирт, разбавленный спирт, триоксипальмитиновую кислоту, альгиновую кислоту, алифатические сложные полиэфиры, оксид алюминия, гидроксид алюминия, стеарат алюминия, амилопектин, α-амилозу, аскорбиновую кислоту, аскорбилпальмитат, аспартам, бактериостатическую воду для инъекции, бентонит, бентонитовую пасту, бензалконийхлорид, бензетонийхлорид, бензойную кислоту, бензиловый спирт, бензилбензоат, бронопол, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, бутилпарабен, натрийбутилпарабен, альгинат кальция, аскорбат кальция, карбонат кальция, цикламат кальция, двухосновный водный фосфат кальция, двухосновный дегидрат фосфата кальция, трехосновный фосфат кальция, пропионат кальция, силикат кальция, собрат кальция, стеарат кальция, сульфат кальция, полугидрат сульфата кальция, масло канолы, карбомер, диоксид углерода, кальцийкарбоксиметилцеллюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, β-каротин, каррагинан, касторовое масло, гидрогенизированное касторовое масло, катионогенный эмульгирующий воск, ацетат целлюлозы, ацетатфталат целлюлозы, этилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, порошкообразную целлюлозу, силикатизированную микрокристаллическую целлюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, цетостеариловый спирт, цетримид, цетиловый спирт, хлоргексидин, хлорбутанол, хлоркрезол, холестерин, ацетат хлоргексидина, глюконат хлоргексидина, гидрохлорид хлоргексидина, хлордифторэтан (HCFC), хлордифторметан, хлорфторуглероды (CFC), хлорфеноксиэтанол, хлороксиленол, твердые вещества кукурузного сиропа, безводную лимонную кислоту, моногидрат лимонной кислоты, масло какао, красители, кукурузное масло, хлопковое масло, крезол, м-крезол, о-крезол, п-крезол, натрийкроскармелозу, кросповидон, цикламовую кислоту, циклодекстрины, декстраты, декстрин, декстрозу, безводную декстрозу, диазолидинилмочевину, дибутилфталат, дибутилсебакат, диэтаноламин, диэтилфталат, дифторэтан (HFC), диметил-β-циклодекстрин, соединения типа циклодекстрина, такие как каптизол®, диметиловый эфир, диметилфталат, двухосновный эдентат калия, двухосновный эдентат натрия, гидрофосфат натрия, докузат кальция, докузат калия, докузат натрия, додецилгаллат, додецилтриметиламмонийбромид, эдентат кальция-динатрия, эдетовую кислоту, эглумин, этиловый спирт, этилцеллюлозу, этилгаллат, этиллаурат, этилмальтол, этилолеат, этилпарабен, этилпарабен калия, этилпарабен натрия, этилванилин, фруктозу, жидкую фруктозу, молотую фруктозу, апирогенную фруктозу, порошкообразную фруктозу, фумаровую кислоту, желатин, глюкозу, жидкую глюкозу, смеси глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, глицерин, глицерилбегенат, глицерилмоноолеат, глицерилмоностеарат, самоэмульгируемый глицерилмоностеарат, глицерилпальмитостеарат, глицин, гликоли, гликофурол, гуаровую камедь, гептафторпропан (HFC), гексадецилтриметиламмонийбромид, сироп с высоким содержанием фруктозы, сывороточный альбумин человека, углеводороды (HC), разбавленную хлористоводородную кислоту, гидрогенизированное растительное масло типа II, гидроксиэтилцеллюлозу, 2-гидроксиэтил-β-циклодекстрин, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу с низкой степенью замещения, 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин, гидроксипропилметилцеллюлозу, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, имидомочевину, индигокармин, ионообменники, оксиды железа, изопропиловый спирт, изопропилмиристат, изопропилпальмитат, изотоничный раствор соли, каолин, молочную кислоту, лактит, лактозу, ланолин, ланолиновые спирты, безводный ланолин, лецитин, алюмосиликат магния, карбонат магния, нормальный карбонат магния, безводный карбонат магния, гидроксид/карбонат магния, гидроксид магния, лаурилсульфат магния, оксид магния, силикат магния, стеарат магния, трисиликат магния, безводный трисиликат магния, яблочную кислоту, солод, мальтит, раствор мальтита, мальтодекстрин, мальтол, мальтозу, маннит, триглицериды со средней длиной цепи, меглюмин, ментол, метилцеллюлозу, метилметакрилат, метилолеат, метилпарабен, метилпарабен калия, метилпарабен натрия, микрокристаллическую целлюлозу и натрийкарбоксиметилцеллюлозу, минеральное масло, легкое минеральное масло, минеральное масло и ланолиновые спирты, масло, оливковое масло, моноэтаноламин, монтмориллонит, октилгаллат, олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, парафин, арахисовое масло, вазелин, вазелин и ланолиновые спирты, фармацевтическую глазурь, фенол, ожиженный фенол, феноксиэтанол, феноксипропанол, фенилэтиловый спирт, ацетат фенилртути, борат фенилртути, нитрат фенилртути, полакрилин, полакрилин калия, полоксамер, полидекстрозу, полиэтиленгликоль, полиэтиленоксид, полиакрилаты, блок-сополимеры полиэтилена-полиоксипропилена, полиметкарилаты, простые алкиловые эфиры полиоксиэтилена, полиоксиэтиленовые производные касторового масла, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитола и жирной кислоты, стеараты полиоксиэтилена, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, альгинат калия, бензоат калия, бикарбонат калия, бисульфит калия, хлорид калия, цитрат калия, безводный цитрат калия, гидрофосфат калия, метабисульфит калия, одноосновный фосфат калия, пропионат калия, сорбат калия, повидон, пропанол, пропионовую кислоту, пропиленкарбонат, пропиленгликоль, альгинат пропиленгликоля, пропилгаллат, пропилпарабен, пропилпарабен калия, пропилпарабен натрия, протаминсульфат, рапсовое масло, раствор Рингера, сахарин, сахарин аммония, сахарин кальция, сахарин натрия, сафлоровое масло, сапонин, сывороточные белки, кунжутное масло, коллоидный кремнезем, коллоидный диоксид кремния, альгинат натрия, аскорбат натрия, бензоат натрия, бикарбонат натрия, бисульфит натрия, хлорид натрия, безводный цитрат натрия, дегидрат цитрата натрия, хлорид натрия, цикламат натрия, эдентат натрия, додецилсульфат натрия, лаурилсульфат натрия, метабисульфит натрия, двухосновный фосфат натрия, одноосновный фосфат натрия, трехосновный фосфат натрия, безводный пропионат натрия, пропионат натрия, сорбат натрия, гликолят крахмала натрия, стеарилфумарат натрия, сульфит натрия, сорбиновую кислоту, сложные эфиры сорбитана (сложные эфиры сорбитана и жирной кислоты), сорбит, раствор сорбита 70%, соевое масло, спермацетовый воск, крахмал, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, пептизированный крахмал, стерилизуемый кукурузный крахмал, стеариновую кислоту, очищенную стеариновую кислоту, стеариловый спирт, сахарозу, сахара, прессуемый сахар, кондитерский сахар, сахарные шарики, инвертированный сахар, Sugartab, Sunset Yellow FCF, синтетический парафин, тальк, винную кислоту, тартразин, тетрафторэтан (HFC), масло какао, тимеросал, диоксид титана, альфа-токоферол, токофериоацетат, кислый альфа-токоферилсукцинат, бета-токоферол, дельта-токоферол, гамма-токоферол, трагакантовую камедь, триацетин, трибутилцитрат, триэтаноламин, триэтилцитрат, триметил-β-циклодекстрин, триметилтетрадециламмонийбромид, трис-буфер, трехосновный эденат натрия, ванилин, гидрогенизированное растительное масло типа I, воду, мягкую воду, жесткую воду, не содержащую диоксида углерода воду, апирогенную воду, воду для инъекций, стерильную воду для ингаляций, стерильную воду для инъекций, стерильную воду для промывания, воски, анионогенный эмульгирующий воск, карнаубский воск, катионогенный эмульгирующий воск, воск на основе цетилового сложного эфира, микрокристаллический воск, неионогенный эмульгирующий воск, воск для суппозитория, белый воск, желтый воск, белый вазелин, ланолин, ксантановую камедь, ксилит, зеин, пропионат цинка, соли цинка, стеарат цинка или любой эксципиент, описанный в руководстве Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, A.H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000), которое включено в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте. В публикации Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E.W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980), которая включена посредством ссылки во всей своей полноте, описаны различные компоненты, используемые для составления фармацевтически приемлемых композиций, и известные способы их получения. За исключением случаев, когда какое-либо обычное средство не совместимо с фармацевтическими композициями, использование таких средств в фармацевтических композициях рассматривается. Дополнительные активные ингредиенты также могут быть включены в композиции.

Фармацевтические препараты, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть составлены в виде препаратов кратковременного действия, быстрого высвобождения, длительного действия или длительного высвобождения, как описано ниже. Фармацевтические препараты также могут быть составлены для немедленного высвобождения, контролируемого высвобождения или для замедленного высвобождения. Настоящие композиции могут дополнительно содержать, например, мицеллы или липосомы или некоторые другие инкапсулированные формы, или могут быть введены в форме с длительным высвобождением, чтобы обеспечить эффект пролонгированного хранения и/или доставки. Описанные фармацевтические препараты можно вводить согласно любой схеме, включая, например, введение ежедневно (1 раз в сутки, 2 раза в сутки, 3 раза в сутки, 4 раза в сутки, 5 раз в сутки, 6 раз в сутки), каждые двое суток, каждые трое суток, каждые четверо суток, каждые пять суток, каждые шесть суток, еженедельно, один раз в две недели, один раз в три недели, ежемесячно или один раз в два месяца.

В некоторых вариантах осуществления указанный выше компонент (компоненты) может присутствовать в фармацевтической композиции в любой концентрации, такой как, например, по меньшей мере концентрация A, где A равно 0,0001% масс./об., 0,001% масс./об., 0,01% масс./об., 0,1% масс./об., 1% масс./об., 2% масс./об., 5% масс./об., 10% масс./об., 20% масс./об., 30% масс./об., 40% масс./об., 50% масс./об., 60% масс./об., 70% масс./об., 80% масс./об. или 90% масс./об.. В некоторых вариантах осуществления указанный выше компонент (компоненты) может присутствовать в фармацевтической композиции в любой концентрации, такой как, например, концентрация не более чем концентрация B, где B равно 90% масс./об., 80% масс./об., 70% масс./об., 60% масс./об., 50% масс./об., 40% масс./об., 30% масс./об., 20% масс./об., 10% масс./об., 5% масс./об., 2% масс./об., 1% масс./об., 0,1% масс./об., 0,001% масс./об. или 0,0001%. В других вариантах осуществления указанный выше компонент (компоненты) может присутствовать в фармацевтической композиции в любом диапазоне концентраций, таком как, например, примерно от A до примерно B. В некоторых вариантах осуществления A равно 0,0001%, и B равно 90%.

Фармацевтические композиции могут быть составлены таким образом, чтобы достичь физиологически совместимое значение pH. В некоторых вариантах осуществления pH фармацевтической композиция может составлять по меньшей мере 5, по меньшей мере 5,5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 6,5, по меньшей мере 7, по меньшей мере 7,5, по меньшей мере 8, по меньшей мере 8,5, по меньшей мере 9, по меньшей мере 9,5, по меньшей мере 10, или по меньшей мере 10,5, вплоть до pH 11 включительно, в зависимости от препарата и пути введения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции могут содержать средства для буферов, чтобы достичь физиологически совместимого pH. Буферные средства могут включать любые соединения, способные создавать буфер с требуемым pH, такой как, например, фосфатные буферы (например, PBS), триэтаноламин, трис, бицин, TAPS, трицин, HEPES, TES, MOPS, PIPES, какодилат, MES и другие. В некоторых вариантах осуществления сила буфера составляет по меньшей мере 0,5 мМ, по меньшей мере 1 мМ, по меньшей мере 5 мМ, по меньшей мере 10 мМ, по меньшей мере 20 мМ, по меньшей мере 30 мМ, по меньшей мере 40 мМ, по меньшей мере 50 мМ, по меньшей мере 60 мМ, по меньшей мере 70 мМ, по меньшей мере 80 мМ, по меньшей мере 90 мМ, по меньшей мере 100 мМ, по меньшей мере 120 мМ, по меньшей мере 150 мМ, или по меньшей мере 200 мМ. В некоторых вариантах осуществления сила буфера составляет не больше 300 мМ (например, не больше 200 мМ, не больше 100 мМ, не больше 90 мМ, не больше 80 мМ, не больше 70 мМ, не больше 60 мМ, не больше 50 мМ, не больше 40 мМ, не больше 30 мМ, не больше 20 мМ, не больше 10 мМ, не больше 5 мМ, не больше 1 мМ).

Пролекарственные соединения, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть получены стандартными способами синтеза, с использованием методики рекомбинантной ДНК или любых других способов получения пептидов и слитых белков. Хотя некоторые неприродные аминокислоты не могут быть экспрессированы при использовании стандартной методики рекомбинантной ДНК, способы их получения известны в данной области. Соединения согласно настоящему изобретению, которые включают непептидные части, могут быть синтезированы с использованием стандартных реакций органической химии в дополнение к стандартным реакциям химии пептидов, когда это приемлемо.

ПРИМЕРЫ

Общий протокол пегилирования: (Cys-малеимидо)

Обычно родственный глюкагону пептид, содержащий Cys, растворяют в забуференном фосфатом солевом растворе (5-10 мг/мл) и добавляют 0,01 метилендиаминтетрауксусную кислоту (10-15% общего объема). Добавляют избыток (2-кратный) малеимидометокси-ПЭГ-реагента (Dow) и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре, осуществляя мониторинг протекания реакции высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Через 8-24 часа реакционную смесь подкисляют и наносят на препаративную колонку с обращенной фазой для очистки с использованием смеси 0,1% тетрафторуксусная кислота (ТФУ)/ацетонитрил в градиентном режиме. Соответствующие фракции объединяли и подвергали лиофилизации, с получением требуемых пегилированных производных.

ПРИМЕР 1

Определение времени полурасщепления дипептида (в PBS) на модельном пептиде

Модельный гексапептид (HSRGTF-NH₂; SEQ ID NO:715) использовали в качестве модели для определения времени полужизни различных дипептидов, связанных с гексапептидом амидной связью. Сборку гексапептида осуществляли на синтезаторе пептидов. Чтобы подтвердить полноту синтеза и наличие удлиняемого N-конца, связанную с пептидом смолу подвергали расщеплению фтористоводородной кислотой (HF) и анализировали. Затем Boc-защищенный саркозин и лизин последовательно вводили в связанный со смолой пептид, с получением пептида A (дипептид+модельный пептид). Пептид A отщепляли, используя HF, и очищали препаративной ВЭЖХ.

Препаративная очистка с использованием ВЭЖХ

Очистку осуществляли, используя анализ ВЭЖХ на колонке с диоксидом кремния Vydac C18 размером 1×25 см (размер частиц 5 мкм, размер пор 300 Ǻ). Использовали следующее оборудование: насос Waters Associates: модель 600, инжектор: модель 717 и УФ-детектор: модель 486. Для всех образцов использовали длину волны 230 нм. Растворитель A содержал 10% CH₃CN/0,1% ТФУ в дистиллированной воде, и растворитель B содержал 0,1% ТФУ в CH₃CN. Использовали линейный градиент (0-100% B, 2 часа). Скорость потока составляла 10 мл/мин, и размер фракций составлял 4 мл. Примерно из 150 мг неочищенного пептида обычно получали 30 мг очищенного пептида (выход примерно 20%).

Пептид A растворяли в концентрации 1 мг/мл в забуференном фосфатом солевом растворе (PBS) (pH 7,4). Затем его инкубировали при 37°C на водяной бане. Образцы для анализа собирали в разных временных точках (5 часов, 8 часов, 24 часа, 31 час, 47 часов) и гасили таким же объемом 0,1% ТФУ. ВЭЖХ использовали для мониторинга реакции расщепления. Данные качественно оценивали жидкостной хроматографией-масс-спектрометрией (ЖХ-МС) и количественно анализировали с использованием компьютерной программы Peak Simple Chromatography для ВЭЖХ, с получением времени удерживания и относительной площади пиков для пролекарственной модификации.

Анализ с использованием масс-спектрометрии

Масс-спектры получали, используя квадрупольный масс-спектрометр с электроспреем Sciex API-III со стандартным источником ионов для ионизации электрораспылением (ESI). Использовали следующие условия ионизации: ESI в режиме анализа положительных ионов; напряжение распыления ионов 3,9 кВ; потенциал на выходе 60В. В качестве газа для распыления и экранирования использовали азот со скоростью потока 0,9 л/мин. Масс-спектры регистрировали от 600 до 1800 томпсонов (Th) (единица измерения m/z) с шагом 0,5 Th и временем выдержки 2 мсек. Образец (примерно 1 мг/мл) растворяли в 50% водном ацетонитриле с 1% уксусной кислотой и вводили с использованием внешнего шприцевого насоса со скоростью 5 мкл/мин.

Когда пептиды анализировали в растворе PBS с использованием ESI-МС, их сначала обессоливали, используя наконечник для твердофазной экстракции ZipTip, содержащий 0,6 мкл смолы C4, согласно инструкциям, предоставленным производителем (Millipore Corporation, Billerica, MA, см. http://www.millipore.com/catalogue.nsf/docs/C5737).

Анализ с использованием ВЭЖХ

Анализ ВЭЖХ осуществляли, используя систему для хроматографии Beckman System Gold, используя УФ-детектор при 214 нм и колонку C8 Vydac 150 мм×4,6 мм. Скорость потока составляла 1 мл/мин. Растворитель A содержал 0,1% ТФУ в дистиллированной воде, и растворитель B содержал 0,1% ТФУ в 90% CH₃CN. Использовали линейный градиент (от 0% до 30% B за 10 минут). Данные собирали и анализировали, используя компьютерную программу Peak Simple Chromatography.

Начальные скорости расщепления использовали для измерения константы скорости диссоциации соответствующих пролекарств. Концентрацию пролекарства и лекарственного средства оценивали на основании площадей их пиков, «a» и «b», соответственно, для каждой из различных временных точек сбора (см. таблицу 1). Константы скорости диссоциации первого порядка пролекарства определяли, откладывая на графике логарифм концентрации пролекарства в различных временных интервалах. Наклон такого графика дает константу скорости «k». Затем вычисляли время полуразложения различных пролекарств, используя формулу t_1/2=0,693/k.

Таблица 1 Данные ВЭЖХ и ЖХ-МС отщепления пептида A (lys-sar-HSRGTF-NH 2 ) в PBS
	5 час	8 час	24 час	31 час	47 час
Пики ВЭЖХ	a	b	a	b	a	b	a	b	a	b
Время удерживания (мин)	4,3	4,8	4,2	4,7	4,3	4,8	4,3	4,8	4,3	4,8
Молекулярная масса	702	902	702	902	702	902	702	902	702	902
Относительная площадь пика (%)	26,5	73,5	28,9	71,1	28,8	71,2	77,7	22,3	90,0	10,0

Время полуразложения различных пролекарств вычисляли, используя формулу t_1/2=0,693/k, и определили, что время полужизни комбинации lys-sar на модельном пептиде HSRGTF-NH₂ (SEQ ID NO:715) составляло 14,0 часов.

ПРИМЕР 2

Определение времени полуотщепления дипептида (в плазме) на D-модельном пептиде

Другой модельный гексапептид (dHdTdRGdTdF-NH₂, SEQ ID NO:716) использовали в качестве модели для определения времени полужизни дипептидного сочетания в плазме. D-аминокислоты использовали для предотвращения другого ферментативного расщепления модельного пептида, за исключением отщепления пролекарства. Гексапептид синтезировали на автоматическом синтезаторе. Для подтверждения того, что полученный удлиненный N-конец может быть использован для пролекарственной модификации, связанную с пептидом смолу подвергали расщеплению под действием HF, для проверки правильности синтеза. Затем Boc-защищенный саркозин и лизин последовательно вводили в связанный со смолой пептид. Пептид B (дипептид+d-модельный пептид) отщепляли с использованием HF и очищали препаративной ВЭЖХ.

Препаративная очистка с использованием ВЭЖХ:

Очистку осуществляли, используя анализ ВЭЖХ на колонке Vydac C18 с диоксидом кремния 1×25 см (размер частиц 5 мкм, размер пор 300 Å). Использовали следующее оборудование: насос Waters Associates: модель 600, инжектор: модель 717, и УФ-детектор: модель 486. Для всех образцов использовали длину волны 230 нм. Растворитель A содержал 10% CH₃CN/0,1% ТФУ в дистиллированной воде, и растворитель B содержал 0,1% ТФУ в CH₃CN. Использовали линейный градиент (0-100% B, 2 часа). Скорость потока составляла 10 мл/мин, и размер фракций составлял 4 мл. Примерно из 150 мг неочищенного пептида обычно получали 30 мг очищенного пептида (выход примерно 20%).

Пептид B растворяли в концентрации 2 мг/мл в плазме (pH 7,4). Затем его инкубировали при 37°C на водяной бане. Образцы для анализа собирали в разных временных точках (5 часов, 11 часов, 24 часа, 31 час, 48 часов). Образцы обрабатывали 10-кратным объемом 0,1% ТФУ/ACN и центрифугировали при 3000 об./мин. Надосадочную жидкость собирали и разводили равным объемом 0,1% ТФУ/H₂O. ВЭЖХ использовали для мониторинга реакции расщепления. Данные качественно оценивали ЖХ-МС и количественно анализировали с использованием компьютерной программы Peak Simple Chromatography для ВЭЖХ, с получением времени удерживания и относительной площади пиков.

Анализ с использованием масс-спектрометрии

Масс-спектры получали, используя квадрупольный масс-спектрометр с электроспреем Sciex API-III со стандартным источником ионов ESI. Использовали следующие условия ионизации: ESI в режиме анализа положительных ионов; напряжение распыления ионов 3,9 кВ; потенциал на выходе 60 В. В качестве газа для распыления и экранирования использовали азот со скоростью потока 0,9 л/мин. Масс-спектры регистрировали от 600 до 1800 томпсонов с шагом 0,5 Th и временем выдержки 2 мсек. Образец (примерно 1 мг/мл) растворяли в 50% водном ацетонитриле с 1% уксусной кислотой и вводили с использованием внешнего шприцевого насоса со скоростью 5 мкл/мин.

Анализ с использованием ВЭЖХ

Анализ ВЭЖХ осуществляли, используя систему для хроматографии Beckman System Gold, используя УФ-детектор при 214 нм и колонку C8 Vydac 150 мм×4,6 мм. Скорость потока составляла 1 мл/мин. Растворитель A содержал 0,1% ТФУ в дистиллированной воде, и растворитель B содержал 0,1% ТФУ в 90% CH₃CN. Использовали линейный градиент (от 0% до 30% B за 10 минут). Данные собирали и анализировали, используя компьютерную программу Peak Simple Chromatography.

Начальные скорости расщепления использовали для измерения константы скорости диссоциации соответствующих пролекарств. Концентрацию пролекарства и лекарственного средства оценивали на основании площадей их пиков, «a» и «b», соответственно, для каждой из различных временных точек сбора (см. таблицу 2). Константы скорости диссоциации первого порядка пролекарств определяли, откладывая на графике логарифм концентрации пролекарства в различных временных интервалах. Наклон такого графика дает константу скорости «k». Затем вычисляли время полужизни в случае разложения различных пролекарств, используя формулу t_1/2=0,693/k.

Таблица 2 Данные ВЭЖХ и ЖХ-МС отщепления пептида B (lys-sar-dHdTdRGdTdF-NH 2 ) в плазме
	5 час	8 час	24 час	31 час	47 час
Пики ВЭЖХ	a	b	a	b	a	b	a	b	a	b
Время удерживания (мин)	5,7	6,2	5,8	6,3	5,7	6,2	5,7	6,2	5,7	6,2
Молекулярная масса	702	902	702	902	702	902	702	902	702	902
Относительная площадь пика (%)	17,0	83,0	29,2	70,8	60,2	39,8	54,0	46,0	27,6	72,4

Затем вычисляли время полуразложения различных пролекарств, используя формулу t_1/2=0,693/k. Используя указанную формулу, определили, что время полужизни комбинации lys-sar в плазме на модельном пептиде dHdTdRGdTdF-NH2 (SEQ ID NO:716) составляло 18,6 часов.

ПРИМЕР 3

Время полуотщепления различных дополнительных дипептидов, связанных с модельным гексапептидом (HSRGTF-NH₂; SEQ ID NO:715), определяли, используя способы, описанные в примере 1. Данные, полученные в указанных экспериментах, представлены в таблицах 3 и 4.

Таблица 3 Отщепление дипептидов A-B, которые связаны с боковой цепью N-концевого пара-амино-Phe, от модельных гексапептидов в PBS
Соединения	А (аминокислота)	В (аминокислота)	t1/2
1	F	P	58 час
2	гидроксил-F	P	327 час
3	d-F	P	20 час
4	d-F	d-P	39 час
5	G	P	72 час
6	гидроксил-G	P	603 час
7	L	P	62 час
8	трет-L	P	200 час
9	S	P	34 час
10	P	P	97 час
11	К	P	33 час
12	dK	P	11 час
13	E	P	85 час
14	Sar	P	около 1000 час
15	Aib	P	69 мин
16	гидроксил-Aib	P	33 час
17	циклогексан	P	6 мин
18	G	G	нет расщепления

19	гидроксил-G	G	нет расщепления
20	S	N-метил-Gly	4,3 час
21	К	N-метил-Gly	5,2 час
22	Aib	N-метил-Gly	7,1 мин
23	гидроксил-Aib	N-метил-Gly	1,0 час

Таблица 4 Отщепление дипептидов A-B, связанных с различными аминокислотами в положении 1 (X 1 ), от модельного гексапептида (X 1 -SRGTF-NH 2 (SEQ ID NO:732)) в PBS
Соединения	А (аминокислота)	В (амино-кислота)	X1 (амино-кислота)	t1/2
1	F	P	H	Нет расщепления
2	гидроксил-F	P	H	Нет расщепления
3	G	P	H	Нет расщепления
4	гидроксил-G	P	H	Нет расщепления
5	A	P	H	Нет расщепления
6	С	P	H	Нет расщепления
7	S	P	H	Нет расщепления
8	P	P	H	Нет расщепления
9	к	P	H	Нет расщепления
10	E	P	H	Нет расщепления
11	дегидро V	P	H	Нет расщепления
12	P	d-P	H	Нет расщепления
13	d-P	P	H	Нет расщепления
14	Aib	P	H	32 час
15	Aib	d-P	H	20 час
16	Aib	P	d-H	16 час
17	циклогексил-	P	H	5 час
18	циклопропил-	P	H	10 час
19	N-Me-Aib	P	H	>500 час
20	α,α-диэтил-Gly	P	H	46 час
21	Гидроксил-Aib	P	H	61 час
22	Aib	P	A	58 час
23	Aib	P	N-Метил-His	30 час

24	Aib	N-метил-Gly	H	49 мин
25	Aib	N-гексил-Gly	H	10 мин
26	Aib	азетидин-2-карбоновая кислота	H	>500 час
27	G	N-метил-Gly	H	104 час
28	гидроксил-G	N-метил-Gly	H	149 час
29	G	N-гексил-Gly	H	70 час
30	dK	N-метил-Gly	H	27 час
31	dK	N-метил-Ala	H	14 час
32	dK	N-метил-Phe	H	57 час
33	К	N-метил-Gly	H	14 час
34	F	N-метил-Gly	H	29 час
35	S	N-метил-Gly	H	17 час
36	P	N-метил-Gly	H	181 час

ПРИМЕР 4

Синтез глюкагона и аналогов GLP-1

Чтобы исследовать возможность получения биологически активного производного глюкагона и GLP-1, синтезировали различные пептидные аналоги. Стандартный способ коротко описан в настоящем примере, и подробности обсуждаются ниже.

Материалы:

Смолу PAM (смола PAM представляет собой сополимер OCH₂-фенилацетамидометилполистирол-1% дивинилбензол), (100-180 меш, 1% DVB, поперечно сшитый полистирол; нагрузка 0,7-1,0 ммоль/г), Boc-защищенные и Fmoc-замещенные аминокислоты приобретали у Midwest Biotech. Другие реагенты, такие как α-гидроксикислоты, (фенилмолочная кислота и гликолевая кислота) приобретали у Aldrich. Твердофазный синтез пептидов с использованием Boc-защищенных аминокислот осуществляли на синтезаторе пептидов Applied Biosystem 430A. Синтез Fmoc-защищенных аминокислот осуществляли с использованием синтезатора пептидов Applied Biosystems, модель 433. Синтез депсипептидов вручную осуществляли в металлокерамических реакционных сосудах, используя аналогичные способы (Schnolzer, M., et al., (1992) Int. J. Pept. Protein Res. 40(3-4): 180-193).

Синтез пептидов (Boc-аминокислоты/отщепление HF)

Синтез указанных аналогов осуществляли на синтезаторе пептидов Applied Biosystem, модель 430A. Синтетические пептиды конструировали последовательным добавлением аминокислот, и активированные сложные эфиры каждой аминокислоты получали добавлением 1,9 ммоль (3,8 мл 0,5М раствора) 3-(диэтоксифосфорилокси)-3H-бензо[d][1,2,3]триазин-4-она (DEPBT) в ДМФА в картридж, содержащий 2 ммоль Boc-защищенной аминокислоты. Аминокислоты растворяли, барботируя газообразный азот через картридж. В картридж добавляли один миллилитр N,N-диизопропилэтиламина, чтобы вызвать образование сложного эфира. Раствор переносили в реакционный сосуд, содержащий 0,2 ммоль C-концевого остатка, связанного с PAM-смолой, встряхивали несколько раз и давали возможность связаться со смолой в течение 10 минут. После промывки для удаления не вступивших в реакцию реагентов, N-концевую Boc-защитную группу удаляли обработкой трифторукусуной кислотой (ТФУ) в течение 5 минут. Смолу промывали ДМФА и цикл повторяли на протяжении требуемого количества стадий вплоть до сборки цепи. Реакционный сосуд в конце синтеза (обычно 30 аминокислот) содержал примерно 1,2-1,5 г защищенный пептидил-PAM-смолы. Смолу многократно промывали диметилформамидом (ДМФА), обрабатывали трифторуксусной кислотой, для удаления последней трет-Boc-защитной группы, и наконец, промывали еще несколько раз, используя ДМФА, дихлорметан (ДХМ) и сушили.

Пептидил-смолу обрабатывали безводной HF (способ подробно описан ниже в данном разделе), и обычно получали примерно 350 мг (выход около 50%) неочищенного пептида с удаленной защитой.

Синтез пептидов (Fmoc-аминокислоты/отщепление HF)

Данный синтез осуществляли вручную с использованием нескольких аминокислот в выборочных сайтах. В данном случае Fmoc-аминокислоты использовали только для синтеза пролекарств с внутренним серином, в виде части более широкой методики синтеза. В данном случае следует отметить, что хотя в синтезе использовали Fmoc-химию, пептиды всегда были построены на PAM-смоле, которую требовалось обрабатывать HF, для отщепления пептида от твердой подложки. Выход таких пептидов был примерно таким же, как указано выше для синтеза Boc/PAM.

Синтез осуществляли, как описано в предыдущем разделе. В конце стадии связывания пептидил-смолу обрабатывали 20% пиперидином, для удаления N-концевой Fmoc-защитной группы. Смолу многократно промывали ДМФА, и такой многократный цикл повторяли для требуемого количества стадий связывания. Пептидил-смолу по окончании полного синтеза сушили, используя ДХМ, и пептид отщепляли от смолы, используя безводный HF.

Синтез депсипептидов (образование сложного аминоэфира)

В данном случае, пептидил-смола имела α-гидроксил-N-концевое удлинение вместо N-концевого амина, и ацилирование осуществляли по α-гидроксильной группе. Данная реакция занимала больше времени, чем время, необходимое для образования амидной связи, поскольку гидроксильная группа является более слабым нуклеофилом по сравнению с амином. Время реакции обычно составляло 12 часов.

Сначала получали активированные сложные эфиры каждой аминокислоты добавлением 1 ммоль (0,155 мл) диизопропилкарбодиимида (DIC) в картридж, содержащий раствор 2 ммоль Boc-защищенного остатка аминокислоты в 2 мл ДХМ. Такой картридж охлаждали до 10°C в течение 10 минут и в картридж добавляли 0,9 ммоль (244 мг) диметиламинопиридина (DMAP), для ускорения образования сложного эфира. Полученную смесь переносили в реакционный сосуд, содержащий пептидил-смолу, в котором пептид синтезировали. Реакционную смесь в сосуде перемешивали в течение 12 часов.

Пептидил-смолу сушили, используя ДХМ, и синтез требуемого пептида продолжали. Пептидил-смолу по окончании полного синтеза сушили, используя ДХМ, и наконец, обрабатывали безводным HF, с получением требуемого пептида.

Синтез пептида с N-концевым гидроксилом (α-гидроксил-N-концевое удлинение)

В данной реакции свободный амин пептидил-смолы взаимодействует с содержащей α-гидроксил кислотой с образованием α-гидроксил-N-концевого удлинения. В этой связи, использовали две таких содержащих α-гидроксил кислоты, а именно, гликолевую кислоту (OH-глицин) и фенилмолочную кислоту (OH-фенилаланин). Указанные синтезы также осуществляли вручную. Пептиды конструировали добавлением α-гидроксилсодержащей кислоты, и активированные сложные эфиры α-гидроксилсодержащей кислоты получали добавлением 0,9 ммоль DEPBT (270 мг) в картридж, содержащий раствор 1 ммоль Boc-защищенного остатка в 2 мл ДМФА. В картридж добавляли DIEA (N,N-диизопропилэтиламин, 0,5 мл), для ускорения образования сложного эфира. Полученную смесь переносили в реакционный сосуд, содержащий пептидил-смолу, в котором синтезировали пептид. Время реакции составляло 6 часов.

Пептидил-смолу сушили, используя ДХМ, и продолжали синтез требуемого пептида. Пептидил-смолу по окончании полного синтеза сушили, используя ДХМ, и расщепляли безводным HF, с получением свободного пептида.

HF-обработка пептидил-смолы

Пептидил-смолу (от 30 мг до 200 мг) помещали в реакционный сосуд с фторидом водорода (HF) для расщепления. В сосуд добавляли 500 мкл п-крезола в качестве ловушки иона карбония. Сосуд соединяли с системой HF и погружали в смесь метанол/сухой лед. Из сосуда откачивали воздух, используя вакуумный насос, и 10 мл HF перегоняли в реакционный сосуд. Полученную реакционную смесь пептидил-смолы и HF перемешивали в течение одного часа при 0°C, затем устанавливали вакуум и HF быстро откачивали (10-15 мин). Сосуд осторожно вынимали, наполняли примерно 35 мл эфира для осаждения пептида и экстрагирования п-крезола и низкомолекулярных органических защитных групп после обработки HF. Полученную смесь фильтровали, используя тефлоновый фильтр, и дважды повторяли, чтобы удалить весь избыточный крезол. Полученный фильтрат отбрасывали. Осажденный пептид растворяли примерно в 20 мл 10% уксусной кислота (водной). Полученный фильтрат, который содержал требуемый пептид, собирали и подвергали лиофилизации.

Анализ с использованием масс-спектрометрии

Масс-спектры получали, используя квадрупольный масс-спектрометр с электроспреем Sciex API-III со стандартным источником ионов ESI. Использовали следующие условия ионизации: ESI в режиме анализа положительных ионов; напряжение распыления ионов 3,9 кВ; потенциал на выходе 60В. В качестве газа для распыления и экранирования использовали азот со скоростью потока 0,9 л/мин. Масс-спектры регистрировали от 600 до 1800 томпсонов с шагом 0,5 Th и временем выдержки 2 мсек. Образец (примерно 1 мг/мл) растворяли в 50% водном ацетонитриле с 1% уксусной кислотой и вводили с использованием внешнего шприцевого насоса со скоростью 5 мкл/мин.

Когда пептиды анализировали в растворе PBS с использованием ESI-МС, их сначала обессоливали, используя наконечник для твердофазной экстракции ZipTip, содержащий 0,6 мкл смолы C4, согласно инструкциям, предоставленным производителем (Millipore Corporation, Billerica, MA, см. веб-сайт Millipore в Интернете http://www.millipore.com/catalogue.nsf/docs/C5737).

Анализ высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ)

Осуществляли предварительный анализ, используя полученные неочищенные пептиды, в отношении аппроксимации их относительных скоростей превращения в забуференном фосфатом солевом растворе (PBS) (pH 7,2), с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и анализа MALDI. Образцы неочищенного пептида растворяли в PBS-буфере в концентрации 1 мг/мл. Один миллилитр полученного раствора хранили во флаконе для ВЭЖХ объемом 1,5 мл, который затем герметично закрывали и инкубировали при 37°C. Аликвоты по 100 мкл отбирали в различных временных точках, охлаждали до комнатной температуры и анализировали, используя ВЭЖХ.

Анализы ВЭЖХ осуществляли с использованием системы для хроматографии Beckman System Gold, используя УФ-детектор при 214 нм. Анализы ВЭЖХ осуществляли на колонке C18 Vydac 150 мм×4,6 мм. Скорость потока составляла 1 мл/мин. Растворитель A содержал 0,1% ТФУ в дистиллированной воде, и растворитель B содержал 0,1% ТФУ в 90% CH₃CN. Использовали линейный градиент (от 40% до 70% B за 15 минут). Данные собирали и анализировали, используя компьютерную программу Peak Simple Chromatography.

Начальные скорости гидролиза использовали для измерения константы скорости диссоциации соответствующих пролекарств. Концентрацию пролекарства и лекарственного средства оценивали на основании площадей их пиков, соответственно. Константы скорости диссоциации первого порядка пролекарств определяли, откладывая на графике логарифм концентрации пролекарства в различных временных интервалах. Наклон такого графика дает константу скорости «k». Затем вычисляли время полуразложения различных пролекарств, используя формулу t_1/2=0,693/k.

Препаративная очистка с использованием ВЭЖХ

После идентификации пролекарства, имеющего подходящее значение t_1/2, пролекарство очищали. Очистку осуществляли, используя анализ ВЭЖХ на содержащей диоксид кремния колонке Vydac C18 размером 1×25 см (размер частиц 5 мкм, размер пор 300 Ǻ). Использовали следующее оборудование: насос Waters Associates: модель 600, инжектор: модель 717 и УФ-детектор: модель 486. Для всех образцов использовали длину волны 230 нм. Растворитель A содержал 10% CH₃CN/0,1% ТФУ в дистиллированной воде, и растворитель B содержал 0,1% ТФУ в CH₃CN. Использовали линейный градиент (0-100% B, 2 часа). Скорость потока составляла 1,2 мл/мин, и размер фракций составлял 6 мл. Примерно из 350 мг неочищенного пептида обычно получали 80 мг очищенного пептида (выход примерно 23%).

ПРИМЕР 5

Дизайн эксперимента по биоанализу: анализ основанного на люциферазе репортерного гена для регистрации цАМФ

Способность каждого аналога глюкагона и GLP-1 или пролекарства индуцировать цАМФ измеряли в анализе репортерного, основанного на люциферазе светляка. Индуцированное продуцирование цАМФ прямопропорционально связыванию глюкагона или GLP-1 с их рецептором. Для биоанализа использовали клетки HEK293, котрансфицированные рецептором глюкагона или GLP-1, соответственно, и геном люциферазы, связанным с отвечающим на цАМФ элементом.

Клетки лишали сыворотки, культивируя 16 часов в минимальной необходимой среде Дульбекко (Invitrogen, Carlsbad, CA) с добавлением 0,25% бычьей сыворотки для роста (HyClone, Logan, UT), и затем инкубировали с серийными разведениями либо аналогов GLP-1, либо пролекарств в течение 5 часов при 37°C, 5% CO₂ в 96-луночных покрытых поли-D-лизином планшетах «Biocoat» (BD Biosciences, San Jose, CA). В конце инкубации в каждую лунку добавляли 100 мкл реагента - люминесцентного субстрата LucLite (Perkin Elmer, Wellesley, MA). Планшеты недолго встряхивали, инкубировали 10 мин в темноте и выход света измеряли на жидкостно-сцинтилляционном счетчике MicroBeta-1450 (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). Эффективные 50% концентрации (EC₅₀) вычисляли, используя компьютерную программу Origin (OriginLab, Northampton, MA).

ПРИМЕР 6

Биологическая активность основанных на амидах пролекарств родственных глюкагону пептидов

I) GLP-1

C²⁴-GLP-1(7-36)-пептид (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFICWLVKGR; SEQ ID NO:717) собирали на синтезаторе пептидов. Чтобы подтвердить, что полученный удлиненный N-конец может быть использован для пролекарственной модификации, небольшую часть в процентах связанной с пептидом смолы подвергали расщеплению под действием HF, для проверки правильности синтеза. Синтезированный пептид имел массу 3329,8 дальтон. Активность GLP-1 в связывании рецептора определяли в люциферазном анализе рецептора GLP-1, описанном в примере 5.

II) Добавление дипептидов к N-концу GLP

Дипептиды ковалентно связывали с N-концом глюкагона или GLP-1, чтобы исследовать различные тенденции внутримолекулярной циклизации и расщепления благодаря образованию дикетопиперазина (DKP).

Биологически неактивные удлиненные дипептидом аналоги GLP-1 и глюкагона превращались в активное пептидное лекарственное средство при расщеплении амидной связи наряду с образованием DKP. Одно и то же превращение может быть осуществлено с любой из аминокислот, либо саркозином (Sar), либо пролином в качестве аминокислоты «B» в дипептиде A-B аналогов GLP-1. Предложены пролекарства с различным временем полужизни благодаря химической модификации заместителей на альфа-атоме углерода первой (A) и второй (B) аминокислот дипептида формулы I. Например, дипептидный пролекарственный фрагмент, содержащий пролин и аминоизомасляную кислоту (Aib), последовательно вводили в C²⁴-GLP (SEQ ID NO:717), поэтому первый пептид был назван Aib^-1-P⁰,C²⁴GLP(7-36), где первой аминокислотой (аминокислотой «Xaa-1») пептида является аминоизомасляная кислота, и второй аминокислотой (аминокислотой «Xaa⁰») является пролин. Все пептиды, приведенные ниже, будут иметь такую же систематическую номенклатуру. Стереохимия каждого синтезированного соединения представлена L-изомером, если не указано иное, когда для аминокислот указана номером положения в виде верхнего индекса после трехбуквенного кода аминокислоты. Пептид получали синтетически, применяя твердофазный синтез, как описано выше. Синтез подтверждали в ESI-МС-анализе (3479,9 Да).

III) Пегилирование GLP-пролекарства

Пегилирование является способом, применимым для защиты пептидов и снижения клиренса пептида почками. Соответственно, для следующих экспериментов пролекарство Aib^-1-P⁰,C²⁴GLP(7-36) пегилировали малеимидо-функционализированным ПЭГ 40 кДа по -SH-группе 24-Cys Aib^-1-P⁰,C²⁴GLP(7-36) реакцией Михаэля. Пегилированный родственный глюкагону пептид назван 40k ПЭГ-Aib^-1-P⁰,C²⁴GLP(7-36). Полученный пегилированный пептид очищали препаративной ВЭЖХ и подтверждали, используя MALDI-TOF-МС (44000-46000, широкий пик).

IV) Активность GLP-1 в PBS

Чтобы исследовать возможное образование DKP и одновременное восстановление исходного лекарственного средства, 40k ПЭГ-Aib^-1-P⁰,C²⁴GLP(7-36) инкубировали в PBS-буфере при 37°C в течение примерно 10 суток. Образцы собирали в разных временных точках (30 часов, 54 часа, 168 часов, 240 часов). Чтобы исследовать восстановленную активность GLP-1 после расщепления дипептидного пролекарства в результате образования DKP, все собранные образцы анализировали с использованием биоанализа. Более конкретно, активность связывания с рецептором GLP-пролекарств определяли в люциферазном анализе GLP-рецептора, описанном в примере 5.

Таблица 5 Данные биоанализа 40k ПЭГ-Aib -1 -P 0 ,C 24 GLP(7-36) в PBS в разных временных точках
	GLP-STD	GLP-pro-30 час	GLP-pro-54 час	GLP-pro-168 час	GLP-pro-240 час
EC50%	0,20902	1,2079	0,75357	0,37388	0,31436
Отношение EC50%/STD	1	17,31%	27,74%	55,90%	66,49%

Затем вычисляли время полурасщепления исходного лекарственного средства 40k ПЭГ-Aib^-1-P⁰,C²⁴G LP(7-36) в плазме, используя формулу t_1/2=0,693/k, которое, как было определено, составляет 140 часов.

V) Активность GLP-1 в плазме

Чтобы исследовать возможное образование DKP и одновременное восстановление исходного лекарственного средства, dLys^-1-Sar⁰,C²⁴GLP(7-36) инкубировали в плазме при 37°C в течение примерно 30 часов. Образцы собирали в разных временных точках (1 час, 12 часов, 30 часов). Чтобы исследовать восстановленную активность после отщепления дипептида от GLP-1 в результате образования DKP, все собранные образцы анализировали с использованием биоанализа. Более конкретно, активность связывания с рецептором GLP-пролекарств определяли в люциферазном анализе GLP-рецептора, описанном в примере 5.

Таблица 6 Данные биоанализа dLys -1 -Sar 0 ,C 24 GLP(7-36) в плазме в разных временных точках
	GLP-STD	GLP-pro-1 час	GLP-pro-10 час	GLP-pro-30 час
EC50%	0,02039	0,13933	0,03948	0,0233
Отношение EC50%/STD	1	14,63%	51,75%	87,51%

Затем вычисляли время полурасщепления исходного лекарственного средства dLys^-1-Sar⁰,C²⁴GLP(7-36) в плазме, используя формулу t_1/2=0,693/k, которое, как было определено, составляет 10 часов.

ПРИМЕР 7

Влияние in vivo пролекарств пептидов глюкагонового надсемейства на мышей

Мышам с индуцированным питанием ожирением (DIO) внутрибрюшинно инъецировали однократную недельную дозу пептида глюкагонового надсемейства (SEQ ID NO:1-684, 1701-1776, 1801-1921). Мышей взвешивали ежедневно (N=8) после следующих начальных инъекций: только наполнителя или пептида глюкагонового надсемейства в дозе примерно 0,5 нмоль/кг, 3 нмоль/кг, 10 нмоль/кг, 15 нмоль/кг или 70 нмоль/кг, или пролекарственного производного пептида глюкагонового надсемейства, в котором дипептид связан с N-концом пептида глюкагонового надсемейства амидной связью, где дипептид представляет собой Aib^-1 Pro⁰, Aib^-1 dPro⁰, Lys^-1 Sar⁰, dAla^-1 Pro⁰, Ac-Aib^-1 Pro⁰, Lys^-1(X) Sar⁰ (X означает цепь ПЭГ 1 кДа, связанную с боковой цепью Lys), Lys^-1 (Y) Sar⁰ (Y означает трет-бутилглицин, связанный с боковой цепью Lys), dLys^-1 Sar⁰, dLys^-1Gly(N-гексил)⁰ или dLys^-1 F(N-Me)⁰ (вводимых в дозе примерно 0,5 нмоль/кг, 3 нмоль/кг, 10 нмоль/кг, 15 нмоль/кг или 70 нмоль/кг).

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во временной точке 0 минут. Уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках -60, 0, 15, 30, 60 и 120 минут. Массу тела, потребление пищи, уровень глюкозы в крови и состав тела измеряли в 0 и 1 день.

ПРИМЕР 8

Потеря массы, индуцированная у мышей, которым вводили аналоги глюкагона

Мышам с индуцированным потреблением пищи ожирением (DIO) внутрибрюшинно инъецировали однократную недельную дозу 15 или 70 нмоль/кг аналога глюкагона. Мышей ежедневно взвешивали (N=8) после начальной инъекции следующих средств: только наполнителя ▼, пептида A глюкагонового надсемейства («пептида A») в дозе 15 нмоль/кг или 70 нмоль/кг или пролекарственного производного пептида A, в котором дипептид связан с N-концом пептида A амидной связью, где дипептид представляет собой Aib^-1Pro⁰ (вводимый в дозе 15 нмоль/кг (○) или 70 нмоль/кг (●), Aib^-1dPro⁰ (вводимый в дозе 70 нмоль/кг , Lys^-1Sar⁰ (вводимый в дозе 70 нмоль/кг (♦), dAla^-1Pro⁰ (вводимый в дозе 70 нмоль/кг или Ac-Aib^-1Pro^-1 (вводимый в дозе 70 нмоль/кг (■). Результаты эксперимента показаны на фиг.1. Следует обратить внимание, что соединение Ac-Aib^-1 Pro⁰-пептид A не способно к расщеплению с образованием дикетопиперазина, хотя соединение проявляет некоторый уровень активности выше, чем уровень, наблюдаемый в случае наполнителя. По-видимому, это является следствием низкой остаточной активности пролекарства. Пептид A является пегилированным аналогом глюкагона, содержащим 7 замен по сравнению с нативным глюкагоном (SEQ ID NO:701), C-концевой амид и пегилирование малеимидо-функционализированным ПЭГ 40 кДа.

Фиг.2 представляет собой график, показывающий изменение массы тела у мышей с индуцированным потреблением пищи ожирением (DIO), которым внутрибрюшинно инъецировали однократную недельную дозу 0,5, 3, 15 или 70 нмоль/кг либо только наполнителя (♦), либо пептида A (в дозе 0,5 ▲, 3 , 15 ▼ или 70 нмоль/кг/сутки) либо Lys^-1Sar⁰-пептида A (в дозе 0,5 , 3 , 15 или 70 нмоль/кг/сутки). Во всех дозах два лекарственных средства, по-видимому, дают сходный эффект, и, следовательно, польза от добавления дипептидного пролекарственного элемента, по-видимому, является минимальной. Вероятно, это является следствием ферментативного отщепления дипептида и быстрой активации введенного пролекарства.

ПРИМЕР 9

Тест на толерантность к глюкозе с использованием пролекарственных аналогов глюкагона

Мышам с ожирением, индуцированным потреблением пищи, (DIO) (N=8) внутрибрюшинно инъецировали дозу 15 или 70 нмоль/кг одного из следующих средств:

(A) пептид A (в дозе 15 или 70 нмоль/кг/сутки),

(B) Lys^-1Sar⁰-пептид A (в дозе 15 или 70 нмоль/кг/сутки), или

(C) dLys^-1Sar⁰-пептид A (в дозе 15 или 70 ■ нмоль/кг/сутки).

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во временной точке 0 минут. Уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках -60, 0, 15, 30, 60 и 120 минут. На фиг.3 представлены данные, полученные в данном эксперименте.

Фиг.4 представляет собой график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у мышей DIO (N=8), которым внутрибрюшинно во временной точке -15 минут инъецировали либо только наполнитель (▲), либо дозу 2 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) Lys^-1Sar⁰-пептид A (■),

(B) Lys^-1(X),Sar⁰-пептид A (▲) (X означает цепь ПЭГ 1 кДа, связанную с боковой цепью Lys),

(C) Lys^-1(Y),Sar⁰-пептид A (♦) (Y означает трет-бутилглицин, связанный с боковой цепью Lys),

(D) dLys^-1Sar⁰-пептид A .

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во временной точке 0 минут. Уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках -15, 0, 15, 30, 60 и 120 минут.

Фиг.5 представляет собой график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у мышей DIO (N=8), которым сначала инъецировали родственный глюкагону пептид, а затем раствор глюкозы. Мышам внутрибрюшинно во временной точке -15 минут инъецировали либо наполнитель (▼), либо дозу 20 нмоль/кг dLys^-1Sar⁰-пептида A , либо дозу 0,67 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) Lys^-1Sar⁰-пептид A (■),

(B) Lys^-1(X),Sar⁰-пептид A (▼) (X означает цепь ПЭГ 1 кДа, связанную с боковой цепью Lys),

C) Lys^-1(Y),Sar⁰-пептид A (♦) (Y означает трет-бутилглицин, связанный с боковой цепью Lys).

Данные, представленные на фиг.3-5, показывают, что дипептид Lys^-1,Sar⁰ не может действовать подобно пролекарственному элементу в случае связывания с N-концом. Однако модификация аминокислот дипептида, в частности замена D-аминокислотой (dLys^-1) сохраняет соединение неактивным (по-видимому, благодаря предотвращению ферментативного расщепления). Затем пролекарство может быть активировано на основании структуры и стереохимии дипептидного пролекарственного элемента и силы нуклеофила. Как показано на фиг.5, даже при намного более высокой дозе (доза 20 нмоль/кг по сравнению с дозой 0,67 нмоль/кг) dLys^-1Sar⁰-пептид A обеспечивает пролекарственный эффект.

ПРИМЕР 10

Мышам с ожирением, индуцированным потреблением пищи, (DIO) (N=8) внутрибрюшинно инъецировали дозу 15 или 70 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) пептид A (в дозе 15 или 70 ▲ нмоль/кг/сутки),

(B) dLys^-1Sar⁰-пептид A (в дозе 15 или 70 ■ нмоль/кг/сутки), или

(C) Lys^-1Sar⁰-пептид A (в дозе 15 или 70 нмоль/кг/сутки),

во временной точке -60 мин. В точках 0 мин и 24 часа внутрибрюшинно инъецировали 25% раствор глюкозы в физиологическом растворе в дозе 1,5 г на кг массы тела. Уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках -60, 0, 15, 30, 60 и 120 минут. Массу тела, потребление пищи, уровень глюкозы в крови и состав тела измеряли в 0 и 1 день, используя N=8 мышей DIO на группу с начальной средней массой тела 55 г. Фиг.6 представляет собой график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у мышей DIO (N=8), которым внутрибрюшинно во временной точке -60 минут инъецировали либо только наполнитель (▼), либо дозу 15 или 70 нмоль/кг соединений, описанных выше.

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во временной точке 0 минут и спустя 24 часа). Указанные уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках -60, 0, 15, 30, 60 и 120 минут от момента первого введения раствора глюкозы (т.е. с временной точкой 0 минут).

Фиг.7 представляет собой график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у мышей DIO (N=8), которым внутрибрюшинно во временной точке -60 минут инъецировали либо только наполнитель (▼), либо дозу 15 или 70 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) пептид A (в дозе 15 или 70 ▲ нмоль/кг/сутки),

(B) dLys^-1Sar⁰-пептид A (в дозе 15 или 70 нмоль/кг/сутки), или

(C) Lys^-1Sar⁰-пептид A (в дозе 15 ♦ или 70 ■ нмоль/кг/сутки).

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во временной точке 0 минут и спустя 24 часа. Указанные уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках 0, 15, 30, 60 и 120 минут от момента введения второго раствора глюкозы через 24 часа.

На фиг.8 представлены данные, показывающие потерю массы у мышей DIO (N=8), которым внутрибрюшинно инъецировали указанные соединения в дозе либо 15, либо 70 нмоль/кг. Указанные массы тела определяли через 7 суток после введения соединений.

ПРИМЕР 11

Мышам с ожирением, индуцированным потреблением пищи, (DIO) (N=8) внутрибрюшинно инъецировали только наполнитель или пролекарственный пептид в дозе 15 нмоль/кг в точках 24, 8, 4 или 1 час до стимуляции глюкозой с использованием инъекции 25% глюкозы в физиологическом растворе в дозе 1,5 г/кг массы тела. Указанные уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках 0, 15, 30, 60 и 120 минут от момента стимуляции раствором глюкозы. Результаты данного исследования показаны на фиг.9, и свидетельствуют, что оба пептида Lys^-1Sar⁰-пептид A (фиг.9A) и dLys^-1Sar⁰-пептид A (фиг.9B) уменьшают уровни глюкозы в крови по сравнению с контрольным наполнителем. Сравнение результатов для двух пролекарств свидетельствует о различии в эффективностях мониторинга начальных уровней глюкозы в крови по сравнению с периодом времени, когда пролекарство циркулировало. У мышей, которым вводили «d»-стереоизомер начальный контроль глюкозы в крови (т.е. в ранней временной точке) был слабым, когда пролекарство вводили за один час до стимуляции, и лучше при введении задолго до стимуляции (например, наилучший начальный контроль был, когда пролекарство вводили во временных точках 8 и 24 часа). Данное исследование подтверждает вывод о том, что пролекарства, содержащие «d»-стереоизомер остаются в неактивной форме в течение более длительного периода времени, чем пролекарства, содержащие «l»-стереоизомер.

ПРИМЕР 12

Три пролекарства пептида B глюкагонового надсемейства («пептида B») и пептида C глюкагонового надсемейства («пептида C») синтезировали согласно следующим способам:

1) dK-Sar-пептид C, где dK означает D-изоформу Lys, Sar означает саркозин, и пептид C является аналогом глюкагона, содержащим 8 замен по сравнению с нативным глюкагоном (SEQ ID NO:701), C-концевой амид и пегилирование ПЭГ 40 кДа, функционализированным йодацетилом.

Последовательность пептида собирали, используя твердофазный синтез пептидов. После связывания и удаления защиты последнего остатка His, связанную с пептидом смолу подвергали взаимодействию с 5-кратным избытком Boc-саркозина, DEPBT и DIEA в ДМФА при комнатной температуре в течение 6 часов. Реакцию контролировали, используя реакцию с нингидрином. После завершения связывания смолу 3 раза промывали ДМФА и ДХМ, соответственно. Boc-защиту удаляли, используя ТФУ. Смолу промывали ДХМ, ДМФА и нейтрализовали DIEA. Связанный со смолой пептид затем подвергали взаимодействию с 5-кратным количеством Boc-dLys, DEPBT и DIEA при комнатной температуре в течение ночи. Затем смолу обрабатывали ТФУ, для удаления Boc-защита, и промывали ДХМ, ДМФА. Наконец смолу обрабатывали 20% пиперидином в ДМФА, для удаления формильной группы на ²⁵Trp, и сушили в вакууме. Наконец, пептиды отщепляли путем взаимодействия с HF при 4°C в течение 1 часа и осаждали безводным этиловым эфиром. После фильтрования пептид собирали в 20% ацетонитриле (MeCN) в воде и подвергали лиофилизации, получая порошок. Пептид очищали препаративной ВЭЖХ (колонка C5; расход 10 мл/мин; буфер A 10% MeCN и 0,1% ТФУ в воде; буфер B: 0,1% ТФУ в ACN; линейный градиент B% 0-40% (0-80 мин)). Соединение проверяли, используя ESI-МС (3612,8 дальтон).

Полученный в результате пептид пегилировали, используя ПЭГ 40 кДа, функционализированный йодацетилом, по тиольной группе 24-Cys. Пептид растворяли в смеси 4М мочевина/50 нМ трис-буфер (pH 6,6) при 4°C в течение ночи. Пегилированный пептид очищали препаративной ВЭЖХ и идентичность подтверждали, используя MALDI-TOF-МС (44000-46000, широкий пик).

2) dK-Gly(N-гексил)-пептид B, где dK означает D-изоформу Lys, Gly(N-гексил) означает N-гексилглицин, и пептид B является аналогом глюкагона, содержащим 8 замен по сравнению с нативным глюкагоном (SEQ ID NO:701), C-концевой амид и пегилирование функционализированным малеимидом ПЭГ 40 кДа.

Последовательность пептида собирали, используя твердофазный синтез пептидов. Связанную с пептидом смолу подвергали взаимодействию с 5-кратным избытком бромуксусной кислоты, DIC и HOBT в ДМФА при комнатной температуре в течение 2 часов. После того, как был получен отрицательный результат нингидринового теста, смолу 3 раза промывали ДМФА и ДХМ, соответственно. Затем смолу подвергали взаимодействию с 10-кратным избытком н-гексиламина и DIEA в ДМФА при комнатной температуре в течение ночи. Затем связанный со смолой пептид подвергали взаимодействию с 5-кратным избытком Boc-dLys, DEPBT и DIEA при комнатной температуре в течение ночи. Затем смолу промывали 3 раза ДМФА и ДХМ. Связанный со смолой пептид дополнительно подвергали взаимодействию с 5-кратным избытком Boc-dLys, DEPBT и DIEA при комнатной температуре в течение 24 часов. Смолу обрабатывали ТФУ, для удаления Boc-защиты, и промывали ДХМ, ДМФА. Наконец, смолу обрабатывали 20% пиперидином в ДМФА, для удаления формильной группы на ²⁵Trp, и сушили в вакууме. Наконец, пептиды отщепляли путем взаимодействия с HF при 4°C в течение 1 часа и осаждали, используя безводный этиловый эфир. После фильтрования пептид повторно растворяли, используя 20% MeCN в воде, и подвергали лиофилизации, получая порошок. Пептид очищали препаративной ВЭЖХ (колонка C5; расход 10 мл/мин; буфер A 10% MeCN и 0,1% ТФУ в воде; буфер B: 0,1% ТФУ в MeCN; линейный градиент B% 0-40% (0-80 мин)). Соединение проверяли, используя ESI-МС, и оно имело массу 3677,0 дальтон.

Полученный в результате пептид пегилировали, используя ПЭГ 40 кДа, функционализированный малеимидом, по тиольной группе 24-Cys. Пептид растворяли в смеси 4М мочевина/50 нМ трис-буфер (pH 6,6) при 4°C в течение ночи. Пегилированный пептид очищали препаративной ВЭЖХ и идентичность подтверждали, используя MALDI-TOF-МС (44000-46000, широкий пик).

3) dK-F(N-Me)-пептид C, где dK означает D-изоформу Lys, F(N-Me) означает N-метил-Phe, и пептид C является аналогом глюкагона, содержащим 8 замен по сравнению с нативным глюкагоном (SEQ ID NO:701), C-концевой амид и пегилирование функционализированным йодацетилом ПЭГ 40 кДа.

Последовательность пептида собирали, используя твердофазный синтез пептидов. Связанную с пептидом смолу подвергали взаимодействию с 5-кратным избытком N-метилфенилаланина, DEPBT и DIEA в ДМФА при комнатной температуре в течение 6 часов. После того, как был получен отрицательный результат нингидринового теста, смолу 3 раза промывали ДМФА и ДХМ, соответственно. Затем смолу обрабатывали ТФУ, для удаления Boc-защиты, промывали ДХМ и ДМФА и нейтрализовали DIEA. Затем связанный со смолой пептид подвергали взаимодействию с 5-кратным избытком Boc-dLys, DEPBT и DIEA при комнатной температуре в течение ночи. Затем смолу обрабатывали ТФУ, для удаления Boc-защиты, и промывали ДХМ и ДМФА. Наконец смолу обрабатывали 20% пиперидином в ДМФА, для удаления формильной группы на ²⁵Trp, и сушили в вакууме. Наконец, пептид отщепляли путем взаимодействия с HF при 4°C в течение 1 часа и осаждали безводным этиловым эфиром. После фильтрования пептид повторно растворяли, используя 20% MeCN в воде, и подвергали лиофилизации, получая порошок. Пептид очищали препаративной ВЭЖХ. Условия ВЭЖХ: колонка C5; расход 10 мл/мин; буфер A 10% MeCN и 0,1% ТФУ в воде; буфер B: 0,1% ТФУ в MeCN; линейный градиент B% 0-40% (0-80 мин); ПЭГ-инсулин или аналоги собирали примерно при 33%B. Получение требуемого соединения подтверждали, используя ESI-МС, и оно имело массу 3701,0 дальтон.

Полученный в результате пептид пегилировали, используя ПЭГ 40 кДа, функционализированный йодацетилом, по тиольной группе 24-Cys. Пептид растворяли в смеси 4М мочевина/50 нМ трис-буфер (pH 6,6) при 4°C в течение ночи. Пегилированный пептид очищали препаративной ВЭЖХ, и идентичность подтверждали, используя MALDI-TOF-МС (44000-46000, широкий пик).

Сходные способы использовали для синтеза пролекарств, содержащих dLys-N-метилглицин, dLys-N-гексилглицин и dLys-N-метилфенилаланин, связанный с любой из SEQ ID NO:1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776 и 1801-1921.

ПРИМЕР 13

Три пролекарства, описанных в примере 12, тестировали в отношении их эффектов in vivo на мышах с ожирением, индуцированным потреблением пищи (DIO) (линия: C57B16). Мышам из девяти групп по восемь мышей (с начальной средней массой тела 44,5 г) подкожно инъецировали только наполнитель или 10 нмоль/кг пролекарственного пептида согласно примеру 12 или исходного пептида (непролекарственная форма, в которой отсутствует дипептидный пролекарственный остаток). Мыши имели возраст 5,5 месяцев и получали корм с высоким содержанием жира в течение примерно 2 месяцев. Уровни глюкозы в крови определяли во временных точках 0, 2, 4, 24 и 72 часа после инъекции (фиг.11). Массу тела наблюдали в течение недели после инъекции и измеряли в 0, 1, 3, 5 и 7 день, где день 0 является днем инъекции (фиг.12). Потребление пищи и массу жира также определяли в исследовании в течение одной недели.

Масса тела у мышей, получавших исходный пептид, dK-Sar-содержащее пролекарство или dK-Gly(N-гексил)-пролекарство непрерывно снижалась в ходе исследования, по сравнению с массой мышей, получавших контрольный наполнитель. Как предполагалось, исходный пептид давал наибольшее снижение массы тела, что свидетельствуют о том, что пролекарства, вводимые в более высоких дозах могут давать такие же эффекты, как и исходный пептид.

Изменения уровней глюкозы в крови (уровень 7 день - уровень 0 день) были наибольшими в случае исходного пептида, хотя пролекарства с dK-Sar и dK-Gly(N-гексилом) также вызывали значительное снижение, по сравнению с контрольным наполнителем.

ПРИМЕР 14

Скорость образования DKP модулировали заменой боковой цепи и/или альфа-амина аминокислоты «B» дипептидного пролекарства A-B. В таблице 7 показана скорость образования DKP с использованием пролекарств dK-Sar и dK-Gly(N-гексил), dK-F(N-Me) согласно примеру 12.

Таблица 7 Модулирование скорости образования DKP
dK-B-пептид глюкагонового надсемейства
Аминокислота «B» дипептидного пролекарства	t1/2 (час)	Пептид глюкагонового надсемейства
Gly-N(Me)	27	Пептид С
Gly-N(гексил)	14	Пептид В
Phe-N(Me)	60	Пептид С

ПРИМЕР 15

Активность связывания с рецептором следующих пептидов и пролекарств в 20% плазме человека определяли с течением времени, используя люциферазный анализ рецептора GLP, описанный в примере 5:

(A) GLP-1 (SEQ ID NO:703),

(B) пептид C,

(C) dLys^-1Sar⁰-химерный пептид C или

(D) dLys^-1Gly(N-гексил)⁰-пептид B.

Как показано в таблице 8, активности dLys^-1Sar⁰ и dLys^-1Gly(N-гексил)⁰-пролекарств постепенно возрастали с течением времени и совпадали с нативным GLP-1 в пределах 48 часов (фиг.13A и 13B).

Таблица 8 Влияние времени превращения пролекарства в активное лекарственное средство
	0 час*	24 час	48 час	72 час
пептид С	100%	77,3%	77,3%	81,0%
dLys-1 Sar° пептид С	5,7%	104,5%	287,5%	246,4%
dLys-1 Gly(N-гексил)u пептид В	21,1%	122,0%	277,2%	254,1%
* анализ 5-часовой инкубации

ПРИМЕР 16

Мышам худым, у которых было индуцировано ожирение потреблением пищи (N=14, линия: C57B16 WT)), подкожно инъецировали однократную недельную дозу 3, 10 или 30 нмоль/кг наполнителя или одного из следующих соединений:

(A) пептида C,

(B) dLys^-1Sar⁰-пептида C или

(C) dLys^-1Gly(N-гексил)⁰-пептида B.

Мыши имели среднюю массу тела 31,2 г и их взвешивали в 1, 3, 5 и 7 день. Уровни глюкозы определяли в крови, взятой внутрибрюшинно в 1, 3 и 5 день. Мыши имели возраст примерно 5 месяцев, и их кормили обычным кормом в течение примерно 5 месяцев.

Результаты исследования показаны на фиг.14-15. На фиг.14 изображен график, показывающий изменение массы тела у мышей DIO в 1, 3, 5 и 7 день. На фиг.15 изображен график, показывающий уровни глюкозы в крови в 1 день (фиг.15A), 3 день (фиг.15B) и 5 день (фиг.15C).

1. Пролекарство, содержащее структуру:
A-B-Q;
где Q означает пептид глюкагонового надсемейства; и
А-В содержит структуру:

где
(i) R₁, R₂, R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из Н, С₁-С₁₈алкила, С₂-С₁₈алкенила, (С₁-С₁₈алкил)ОН, (С₁-С₁₈алкил)SH, (С₂-С₃алкил)SCH₃, (С₁-С₄алкил)CONH₂, (С₁-С₄алкил)СООН, (C₁-С₄алкил)NH₂, (С₁-С₄алкил)NHC(NH₂ ⁺)NH₂, (С₀-С₄алкил)(С₃-С₆циклоалкила), (С₀-С₄алкил)(С₂-С₅гетероцикла), (С₀-С₄алкил)(С₆-С₁₀арил)R₇, (С₁-С₄алкил)(С₃-С₉гетероарила) и С₁-С₁₂алкил(W₁)C₁-С₁₂алкила, где W₁ означает гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, S и О, или R₁ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют С₃-С₁₂циклоалкил или арил; или R₄ и R₈ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют С₃-С₆циклоалкил;
R₃ означает С₁-С₆алкил, или R₄ и R₃ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;
R₅ означает NHR₆ или ОН;
R₆ означает Н, С₁-С₈алкил, или R₆ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и
R₇ выбран из группы, состоящей из Н и ОН, или
(ii) R₁, R₂, R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из Н, С₁-С₁₈алкила, С₂-С₁₈алкенила, (С₁-С₁₈алкил)ОН, (C₁-С₁₈алкил)SH, (С₂-С₃алкил)SCH₃, (С₁-С₄алкил)CONH₂, (С₁-С₄алкил)СООН, (С₁-С₄алкил)NH₂, (С₁-С₄алкил)NHC(NH₂ ⁺)NH₂, (С₀-С₄алкил)(С₃-С₆циклоалкила), (С₀-С₄алкил)(С₂-С₅гетероцикла), (С₀-С₄алкил)(С₆-C₁₀apил)R₇, (С₁-С₄алкил)(С₃-С₉гетероарила) и С₁-С₁₂алкил(W₁)С₁-С₁₂алкила, где W₁ означает гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, S и О, или R₁ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют С₃-С₁₂циклоалкил; или R₄ и R₈ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют С₃-С₆циклоалкил;
R₃ означает С₁-С₆алкил, или R₄ и R₃ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;
R₅ означает NHR₆ или ОН;
R₆ означает Н, С₁-С₈алкил, или R₆ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и
R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила, С₂-С₁₈алкенила, (С₀-С₄алкил)CONH₂, (С₀-С₄алкил)СООН, (С₀-С₄алкил)NH₂, (С₀-С₄алкил)ОН и галогена; где
В связана с Q амидной связью между А-В и амином Q;
где А, В или аминокислота Q, с которой связан А-В, представляет собой некодируемую аминокислоту, и кроме того, где время химического полуотщепления (t_1/2) А-В от Q составляет по меньшей мере примерно от 1 часа до примерно 1 недели в PBS в физиологических условиях; и
где A-B-Q не представляет собой Gly-(N-Methyl-Gly)F⁷-GLP(8-37).

2. Пролекарство по п. 1, где время полуотщепления А-В от Q в PBS в физиологических условиях составляет не более чем двукратное время полуотщепления А-В от Q в растворе, содержащем протеазу DPP-IV, где раствором, содержащим протеазу DPP-IV, является сыворотка.

3. Пролекарство по п. 1, где пептид глюкагонового надсемейства представляет собой родственный глюкагону пептид.

4. Пролекарство по п. 1, где
(i) R₁ и R₈ независимо означают Н или С₁-С₈алкил;
R₂ и R₄ независимо выбраны из группы, состоящей из Н, C₁-С₈алкила, С₂-С₈алкенила, (С₁-С₄алкил)ОН, (С₁-С₄алкил)SH, (С₂-С₃алкил)SCH₃, (C₁-C₄алкил)CONH₂, (С₁-С₄алкил)СООН, (C₁-С₄алкил)NH₂, (С₁-С₄алкил)NHC(NH₂ ⁺)NH₂, (С₀-С₄алкил)(С₃-С₆циклоалкила), (С₀-С₄алкил)(С₂-С₅гетероцикла), (С₀-С₄алкил) (С₆-С₁₀арил)R₇ и СН₂(С₃-С₉гетероарила), или R₁ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют С₃-C₁₂циклоалкил или арил;
R₅ означает NHR₆; и
R₆ означает Н или С₁-С₈алкил, или
(ii) R₁ и R₈ независимо означают Н или С₁-С₈алкил;
R₂ и R₄ независимо выбраны из группы, состоящей из Н, C₁-С₈алкила, С₂-С₈алкенила, (С₁-С₄алкил)ОН, (С₁-С₄алкил)SH, (С₂-С₃алкил)SCH₃, (С₁-С₄алкил)CONH₂, (С₁-С₄алкил)СООН, (С₁-С₄алкил)NH₂, (С₁-С₄алкил)NHC(NH₂ ⁺)NH₂, (С₀-С₄алкил)(С₃-С₆циклоалкила), (С₀-С₄алкил)(С₂-С₅гетероцикла), (С₀-С₄алкил)(С₆-С₁₀арил)R₇ и СН₂(С₃-С₉гетероарила), или R₁ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют С₃-С₁₂циклоалкил;
R₃ означает С₁-С₆алкил;
R₅ означает NHR₆;
R₆ означает Н или С₁-С₈алкил; и
R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила, С₂-С₁₈алкенила, (С₀-С₄алкил)CONH₂, (С₀-С₄алкил)СООН, (С₀-С₄алкил)NH₂, (С₀-С₄алкил)ОН и галогена.

5. Пролекарство по п. 1, где указанный первичный амин представляет собой альфа-аминогруппу N-концевой аминокислоты Q.

6. Пролекарство по п. 5, где А-В содержит структуру:

где
(i) R₁ и R₂ независимо означают С₁-С₁₈алкил или арил; или R₁ и R₂ связаны через -(СН₂)_p-, где p равно 2-9;
R₃ означает С₁-С₆алкил;
R₄ и R₈ каждый означают водород; и
R₅ означает амин, или
(ii) R₁ и R₂ независимо означают С₁-С₁₈алкил или (С₀-С₄алкил)(С₆-С₁₀арил)R₇; или R₁ и R₂ связаны через -(СН₂)_p-, где p равно 2-9;
R₃ означает С₁-С₆алкил;
R₄ и R₈, каждый, означают водород;
R₅ означает NH₂; и
R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила, С₂-С₁₈алкенила, (С₀-С₄алкил)CONH₂, (С₀-С₄алкил)СООН, (С₀-С₄алкил)NH₂, (С₀-С₄алкил)ОН и галогена.

7. Пролекарство по п. 5, где А-В содержит структуру:

где R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила и арила, или R₁ и R₂ связаны через -(СН₂)_p-, где p равно 2-9;
R₃ означает С₁-С₆алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 и 6-членное гетероциклическое кольцо;
R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С₁-С₈алкила и арила; и
R₅ означает амин;
при условии, что оба R₁ и R₂ не являются водородом, и при условии, что один из R₄ или R₈ является водородом.

8. Пролекарство по п. 5, где А-В содержит структуру:

где
(i) R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила, (С₁-С₄алкил)ОН, (С₁-С₄алкил)NH₂ и (С₀-С₄алкил)(С₆-С₁₀арил)R₇, или R₁ и R₂ связаны через (СН₂)_p, где p равно 2-9;
R₃ означает С₁-С₆алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 и 6-членное гетероциклическое кольцо;
R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С₁-С₈алкила и (С₀-С₄алкил)(С₆-С₁₀арил)R₇;
R₅ означает NH₂; и
R₇ выбран из группы, состоящей из Н, С₁-С₁₈алкила, С₂-С₁₈алкенила, (С₀-С₄алкил)CONH₂, (С₀-С₄алкил)СООН, (С₀-С₄алкил)NH₂, (С₀-С₄алкил)ОН и галогена;
при условии, что оба R₁ и R₂ не являются водородом, и при условии, что по меньшей мере один из R₄ или R₈ является водородом,
(ii) R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С₁-С₈алкила и (С₁-С₄алкил)NH₂, или R₁ и R₂ связаны через (СН₂)_p, где p равно 2-9;
R₃ означает С₁-С₆алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;
R₄ выбран из группы, состоящей из водорода и С₁-С₈алкила; и
R₅ означает NH₂; R₈ означает водород; при условии, что оба R₁ и R₂ не являются водородом,
(iii) R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С₁-С₈алкила и (С₁-С₄алкил)NH₂;
R₃ означает С₁-С₆алкил;
R₄ означает водород; и
R₅ означает NH₂;
R₈ означает водород;
при условии, что оба R₁ и R₂ не являются водородом, или
(iv) R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С₁-С₈алкила, (C₁-C₄алкил)NH₂, или R₁ и R₂ связаны через (СН₂)_p, где p равно 2-9;
R₃ означает С₁-С₆алкил;
R₄ означает (С₀-С₄алкил)(С₆-С₁₀арил)R₇;
R₅ означает NH₂; и
R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, С₁-С₈алкила и (С₀-С₄алкил)ОН; R₈ означает водород; при условии, что оба R₁ и R₂ не являются водородом.

9. Пролекарство по п. 5, где А-В содержит структуру:

где
(i) R₁ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-С₈алкила и арила;
R₃ означает С₁-С₆алкил;
R₄ и R₈ каждый означают водород; и
R₅ означает амин или N-замещенный амин или гидроксил;
при условии, что если R₁ означает алкил или арил, то R₁ и R₅ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-11-членное гетероциклическое кольцо, или
(ii) R₁ выбран из группы, состоящей из водорода, С₁-С₈алкила и (С₀-С₄алкил)(С₆-С₁₀арил)R₇;
R₃ означает С₁-С₆алкил;
R₄ и R₈ каждый означают водород;
R₅ означает NHR₆ или ОН;
R₆ означает H, С₁-С₈алкил, или R₆ и R₁ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и
R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила, С₂-С₁₈алкенила, (С₀-С₄алкил)CONH₂, (С₀-С₄алкил)СООН, (С₀-С₄алкил)NH₂, (С₀-С₄алкил)ОН и галогена;
при условии, что если R₁ означает алкил или (С₀-С₄алкил)(С₆-C₁₀apил)R₇, то R₁ и R₅ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-11-членное гетероциклическое кольцо.

10. Пролекарство по п. 1, где указанный первичный амин является аминогруппой боковой цепи внутренней аминокислоты Q, где указанная внутренняя аминокислота содержит структуру формулы V:

где
n равно целому числу, выбранному из 1-4.

11. Пролекарство по п. 10, где А-В содержит структуру:

где
(i) R₁ и R₂ независимо означают С₁-С₈алкил или арил; или R₁ и R₂ связаны через -(СН₂)_p-, где p равно 2-9;
R₃ означает С₁-С₆алкил;
R₄ и R₈ каждый означают водород; и
R₅ означает амин, или
(ii) R₁ и R₂ независимо означают С₁-С₈алкил или (С₀-С₄алкил)(С₆-С₁₀арил)R₇; или R₁ и R₂ связаны через -(СН₂)_p-, где p равно 2-9;
R₃ означает С₁-С₆алкил;
R₄ и R₈ каждый означают водород;
R₅ означает NH₂; и
R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила, С₂-С₁₈алкенила, (С₀-С₄алкил)CONH₂, (С₀-С₄алкил)СООН, (С₀-С₄алкил)NH₂, (С₀-С₄алкил)ОН и галогена.

12. Пролекарство по п. 10, где А-В содержит структуру:

где
(i) R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С₁-С₈алкила и арила, или R₁ и R₂ связаны через -(СН₂)_p-, где р равно 2-9;
R₃ означает С₁-С₆алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 и 6-членное гетероциклическое кольцо;
R₄ и R₈ независимо означают С₁-С₁₈алкил или арил; и
R₅ означает амин или N-замещенный амин;
при условии, что оба R₁ и R₂ не являются водородом, и при условии, что один из R₄ или R₈ является водородом, или
(ii) R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С₁-С₈алкила и (С₀-С₄алкил)(С₆-С₁₀арил)R₇, или R₁ и R₂ связаны через -(СН₂)_p-, где p равно 2-9;
R₃ означает С₁-С₆алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 и 6-членное гетероциклическое кольцо;
R₄ и R₈ независимо означают водород, С₁-С₁₈алкил или (С₀-С₄алкил)(С₆-С₁₀арил)R₇;
R₅ означает NHR₆;
R₆ означает Н или С₁-С₈алкил, или R₆ и R₂ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и
R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила, С₂-С₁₈алкенила, (С₀-С₄алкил)CONH₂, (С₀-С₄алкил)СООН, (С₀-С₄алкил)NH₂, (С₀-С₄алкил)ОН, галогена;
при условии, что оба R₁ и R₂ не являются водородом, и при условии, что по меньшей мере один из R₄ или R₈ является водородом.

13. Пролекарство по п. 10, где А-В содержит структуру:

где
(i) R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила и арила;
R₃ означает С₁-С₆алкил;
R₄ и R₈ каждый означают водород; и
R₅ означает амин или N-замещенный амин или гидроксил;
при условии, что если R₁ и R₂ оба независимо означают алкил или арил, то либо R₁, либо R₂ связан через -(СН₂)_p- с R₅, где р равно 2-9, или
(ii) R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила и (С₀-С₄алкил)(С₆-С₁₀арил)R₇;
R₃ означает С₁-С₆алкил;
R₄ и R₈ каждый означают водород;
R₅ означает NHR₆ или ОН;
R₆ означает Н или С₁-С₈алкил, или R₆ и R₁ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и
R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила, С₂-С₁₈алкенила, (С₀-С₄алкил)CONH₂, (С₀-С₄алкил)СООН, (С₀-С₄алкил)NH₂ и (С₀-С₄алкил)ОН;
при условии, что если R₁ и R₂ оба независимо означают алкил или (С₀-С₄алкил)(С₆-С₁₀арил)R₇, то либо R₁, либо R₂ связан через (СН₂)_p с R₅, где р равно 2-9.

14. Пролекарство по п. 10, где аминокислота формулы V находится в Q в положении, соответствующем положению 12, 16, 17, 18, 20, 28 или 29 нативного глюкагона (SEQ ID NO:701).

15. Пролекарство по п. 1, где указанный первичный амин является заместителем на ариле ароматической аминокислоты в Q.

16. Пролекарство по п. 15, где указанная ароматическая аминокислота является внутренней аминокислотой Q.

17. Пролекарство по п. 15, где указанная ароматическая аминокислота выбрана из группы, состоящей из амино-Phe, аминонафтилаланина, аминотриптофана, аминофенилглицина, аминогомо-Phe и аминотирозина.

18. Пролекарство по п. 15, где указанная ароматическая аминокислота содержит структуру формулы III:

где m равно целому числу от 0 до 3.

19. Пролекарство по п. 15, где А-В содержит структуру:

где
(i) R₁ и R₂ независимо означают С₁-С₁₈алкил или арил;
R₃ означает С₁-С₆алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 и 6-членное гетероциклическое кольцо;
R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила и арила; и
R₅ означает амин или гидроксил, или
(ii) R₁ и R₂ независимо означают С₁-С₁₈алкил или (С₀-С₄алкил)(С₆-С₁₀арил)R₇;
R₃ означает С₁-С₆алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 и 6-членное гетероциклическое кольцо;
R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила и (С₀-С₄алкил)(С₆-С₁₀арил)R₇;
R₅ означает NH₂ или ОН; и
R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила, С₂-С₁₈алкенила, (С₀-С₄алкил)CONH₂, (С₀-С₄алкил)СООН, (С₀-С₄алкил)NH₂, (С₀-С₄алкил)ОН и галогена.

20. Пролекарство по п. 15, где А-В содержит структуру:

где
(i) R₁ выбран из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила и арила, или R₁ и R₂ связаны через -(СН₂)_p-, где р равно 2-9;
R₃ означает С₁-С₆алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;
R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила и арила; и
R₅ означает амин или N-замещенный амин, или
(ii) R₁ выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-С₁₈алкила, (С₁-С₁₈алкил)ОН, (C₁-C₄алкил)NH₂ и (С₀-С₄алкил)(С₆-С₁₀арил)R₇;
R₃ означает С₁-С₆алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;
R₄ и R₈ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила и (С₀-С₄алкил)(С₆-С₁₀арил)R₇;
R₅ означает NHR₆;
R₆ означает Н, С₁-С₈алкил, или R₆ и R₁ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и
R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила, С₂-С₁₈алкенила, (С₀-С₄алкил)CONH₂, (С₀-С₄алкил)СООН, (С₀-С₄алкил)NH₂, (С₀-С₄алкил)ОН и галогена.

21. Пролекарство по п. 15, где А-В содержит структуру:

где
(i) R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С₁-С₈алкила и арила;
R₃ означает С₁-С₆алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;
R₄ и R₈ каждый означают водород; и
R₅ выбран из группы, состоящей из амина, N-замещенного амина и гидроксила, или
(ii) R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С₁-С₈алкила, (С₆-С₄алкил)СООН и (С₀-С₄алкил)(С₆-С₁₀арил)R₇, или R₁ и R₅ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-11-членное гетероциклическое кольцо;
R₃ означает С₁-С₆алкил, или R₃ и R₄ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;
R₄ означает водород или образует 4-6-членное гетероциклическое кольцо с R₃;
R₈ означает водород;
R₅ означает NHR₆ или ОН;
R₆ означает Н или С₁-С₈алкил, или R₆ и R₁ вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и
R₇ выбран из группы, состоящей из водорода, С₁-С₁₈алкила, С₂-С₁₈алкенила, (С₀-С₄алкил)CONH₂, (С₀-С₄алкил)СООН, (С₀-С₄алкил)NH₂, (С₀-С₄алкил)ОН и галогена.

22. Пролекарство по п. 15, где аминозамещенная ароматическая аминокислота находится в Q в положении, соответствующем положению 10, 13, 22 или 25 нативного глюкагона (SEQ ID NO:701).

23. Пролекарство по п. 1, дополнительно содержащее гидрофильный остаток, ковалентно связанный с пролекарством.

24. Пролекарство по п. 1, дополнительно содержащее ацильную группу или алкильную группу, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты.

25. Пролекарство по п. 1, где Q содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную нативному глюкагону (SEQ ID NO:701), которая сохраняет альфа-спиральную конформацию аминокислот, соответствующих аминокислотам 12-29 последовательности SEQ ID NO:701.

26. Пролекарство по п. 1, где А означает аминокислоту в D-стереохимической конфигурации.

27. Пролекарство по п. 1, где Q выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-564, 566-570, 573-575, 577, 579-580, 585-612, 616, 618-632, 634-642, 647, 657-684, 701-732, 801-878, 883-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1708, 1710, 1711, 1731-1734, 1738, 1740, 1741, 1745 и 1747-1776.

28. Стерильная фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество пролекарства по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель, для применения в лечении диабета или ожирения.

29. Способ лечения гипергликемии, лечения диабета, лечения или профилактики гипогликемии, подавления аппетита, снижения прироста массы или индукции потери массы, вызывающий временный паралич кишечного тракта у нуждающегося в этом пациента, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции по п. 28.

30. Пролекарство по п. 1, где Q содержит:
(i) аминокислотную последовательность:
X1-Х2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z (SEQ ID NO:839) с 1-3 модификациями аминокислот,
где X1 и/или Х2 означают ненативную (по сравнению с последовательностью SEQ ID NO:701) аминокислоту, которая уменьшает чувствительность глюкагонового пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP-IV),
где Z выбран из группы, состоящей из -СООН, -Asn-COOH, Asn-Thr-COOH и Y-COOH, где Y означает 1-2 аминокислоты, и
где (1) лактамовый мостик связывает боковые цепи аминокислоты в положении i и аминокислоты в положении i+4, где i равно 12, 16, 20 или 24, или (2) одна, две, три или все аминокислоты в положениях 16, 20, 21 и 24 глюкагонового пептида заменены α,α-дизамещенной аминокислотой;
и где Q проявляет активность агониста глюкагона,
(ii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:701 и содержит:
по меньшей мере, одну модификацию аминокислоты, выбранную из группы, состоящей из:
замены Asn в положении 28 заряженной аминокислотой;
замены Asn в положении 28 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты;
замены в положении 28 на Asn, Asp или Glu;
замены в положении 28 на Asp;
замены в положении 28 на Glu;
замены Thr в положении 29 заряженной аминокислотой;
замены Thr в положении 29 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты;
замены в положении 29 на Asp, Glu или Lys;
замены в положении 29 на Glu;
инсерции 1-3 заряженных аминокислот после положения 29;
инсерции после положения 29 Glu или Lys;
инсерции после положения 29 Gly-Lys или Lys-Lys;
или их комбинации;
и по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, выбранную из группы А или группы В, или их комбинации;
где группа А представляет собой модификацию аминокислоты, выбранную из группы, состоящей из замены Asp в положении 15 на Glu и замены Ser в положении 16 на Thr или AIB; и
где группа В представляет собой модификацию аминокислоты, выбранную из группы, состоящей из:
замены His в положении 1 ненативной аминокислотой, которая уменьшает чувствительность глюкагонового пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP-IV),
замены Ser в положении 2 ненативной аминокислотой, которая уменьшает чувствительность глюкагонового пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP-IV),
замены Туr в положении 10 на Phe или Val;
замены Lys в положении 12 на Arg;
замены Gln в положении 20 на Ala или AIB;
замены Asp в положении 21 на Glu;
замены Gln в положении 24 на Ala или AIB;
замены Met в положении 27 на Leu или Nle;
делеции аминокислот в положениях 27-29;
делеции аминокислот в положениях 28-29;
делеции аминокислоты в положении 29;
или их комбинацию;
и где Q проявляет активность агониста глюкагона;
(iii) родственный глюкагону пептид с последовательностью SEQ ID NO:701 со следующими модификациями:
(a) модификация аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP,
(b) (1) лактамовый мостик между боковыми цепями аминокислот в положениях i и i+4 или между боковыми цепями аминокислот в положениях j и j+3, где i равно 12, 13, 16, 17, 20 или 24 и где j равно 17, или (2) одна, две, три или все аминокислоты в положениях 16, 20, 21 и 24 аналога заменены α,α-дизамещенной аминокислотой,
(c) модификации аминокислот в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29, и
(d) 1-6 дополнительных модификаций аминокислот,
где ЕС₅₀ аналога для активации рецептора GIP составляет примерно 10 нМ или меньше;
(iv) последовательность SEQ ID NO:55 или аналог последовательности SEQ ID NO:55, где указанный аналог отличается от последовательности SEQ ID NO:55 1-3 модификациями аминокислот, выбранных из аминокислот в положениях 1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 24, 27, 28 и 29, где указанный глюкагоновый пептид проявляет активность, составляющую по меньшей мере 20% от активности нативного GLP-1 по отношению к рецептору GLP-1;
(v) аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности SEQ ID NO:701 не более чем десятью модификациями аминокислот, содержит одну или несколько аминокислотных замен на AIB в положениях 16, 20, 21 и/или 24, и модификацию аминокислоты в положении 1 и/или 2, которая обеспечивает пониженную чувствительность к расщеплению дипептидилпептидазой IV, где указанный глюкагоновый пептид проявляет активность, составляющую по меньшей мере 20% от активности нативного GLP-1 по отношению к рецептору GLP-1;
(vi) последовательность SEQ ID NO:1342 или ее оксипроизводное, и где Q проявляет активность антагониста глюкагона;
(vii) аминокислотную последовательность нативного глюкагона, модифицированную делецией двух-пяти аминокислотных остатков из N-конца последовательности SEQ ID NO:701 и заменой остатка аспарагиновой кислоты в положении девять последовательности SEQ ID NO:701 глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой, β-гомоглутаминовой кислотой, производным цистеина и сульфоновой кислоты или алкилкарбоксилатным производным цистеина, имеющим структуру:

где Х₅ означает С₁-С₄алкил, С₂-С₄алкенил или С₂-С₄алкинил, и где Q проявляет активность антагониста глюкагона;
(viii) общую структуру А-В-С, где А выбран из группы, состоящей из:
(i) фенилмолочной кислоты (PLA);
(ii) оксипроизводного PLA;
(iii) пептида из 2-6 аминокислот, где две следующих друг за другом аминокислоты пептида связаны сложноэфирной или простой эфирной связью;
В означает аминокислоты от i до 26 последовательности SEQ ID NO:701, где i равно 3, 4, 5, 6 или 7, необязательно содержащей одну или несколько модификаций аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:
(iv) замены Asp в положении 9 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:701) на Glu, производное Cys и сульфоновой кислоты, гомоглутаминовую кислоту, β-гомоглутаминовую кислоту или алкилкарбоксилатное производное цистеина, имеющее структуру:

где Х₅ означает С₁-С₄алкил, С₂-С₄алкенил или С₂-С₄алкинил;
(v) замены одной или двух аминокислот в положениях 10, 20 и 24 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:701) аминокислотой, ковалентно связанной с ацильной или алкильной группой сложноэфирной, простой эфирно, тиоэфирной, амидной или алкиламинной связью;
(vi) замены одной или двух аминокислот в положениях 16, 17, 20, 21 и 24 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:701) аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из: Cys, Lys, орнитина, гомоцистеина и ацетилфенилаланина (Ас-Phe), где аминокислота из группы ковалентно связана с гидрофильным остатком;
(vii) замены Asp в положении 15 (согласно нумерации в SEQ ID NO:701) цистеиновой кислотой, глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой и гомоцистеиновой кислотой;
(viii) замены Ser в положении 16 (согласно нумерации в SEQ ID NO:701) цистеиновой кислотой, глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой и гомоцистеиновой кислотой;
(ix) замены на AIB в одной или нескольких положениях 16, 20, 21 и 24 согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:701;
и С выбран из группы, состоящей из:
(x) X;
(xi) X-Y;
(xii) X-Y-Z; и
(xiii) X-Y-Z-R10,
где X означает Met, Leu или Nle; Y означает Asn или заряженную аминокислоту; Z означает Thr, Gly, Cys, Lys, орнитин (Orn), гомоцистеин, ацетилфенилаланин (Ac-Phe) или заряженную аминокислоту; где R10 выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1319-1321 и 1353; и
(xiv) любого из (х)-(xiii), где С-концевой карбоксилат заменен на амид;
и где Q проявляет активность антагониста глюкагона;
(ix) последовательность SEQ ID NO:1451, где аминокислоты в положениях 4 и 7, положениях 7 и 11, положениях 11 и 15, положениях 15 и 19 или положениях 19 и 23 последовательности SEQ ID NO:1451 связаны лактамовым мостиком, или содержит оксипроизводное, и где Q проявляет активность антагониста глюкагона и активность агониста GLP-1;
(x) Q содержит пептид, содержащий (1) внутримолекулярный мостик или α,α-дизамещенную аминокислоту или кислую аминокислоту в положении 16 (согласно нумерации в SEQ ID NO:701), или их сочетание, (2) С-концевой амид или сложный эфир вместо С-концевого карбоксилата, и (3) общую структуру А-В-С,
где А выбран из группы, состоящей из
(i) PLA;
(ii) оксипроизводного PLA; и
(iii) пептида из 2-6 аминокислот, где две следующих друг за другом аминокислоты пептида связаны сложноэфирной или простой эфирной связью;
где В означает аминокислоты от р до 26 последовательности SEQ ID NO:701, где р равно 3, 4, 5, 6 или 7, необязательно, содержащей одну или несколько модификаций аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:
(iv) замены Asp в положении 9 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:701) на Glu, производное Cys и сульфоновой кислоты, гомоглутаминовую кислоту, β-гомоглутаминовую кислоту или алкилкарбоксилатное производное цистеина, имеющее структуру:

где Х₅ означает С₁-С₄алкил, С₂-С₄алкенил или С₂-С₄алкинил;
(v) замены одной или двух аминокислот в положениях 10, 20 и 2 4 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:701) аминокислотой, ковалентно связанной с ацильной или алкильной группой сложноэфирной, простой эфирно, тиоэфирной, амидной или алкиламинной связью;
(vi) замены одной или двух аминокислот в положениях 16, 17, 20, 21 и 24 (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:701) аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из: Cys, Lys, орнитина, гомоцистеина и ацетилфенилаланина (Ас-Phe), где аминокислота из группы ковалентно связана с гидрофильным остатком;
(vii) замены Asp в положении 15 (согласно нумерации в SEQ ID NO:701) цистеиновой кислотой, глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой и гомоцистеиновой кислотой;
(viii) замены Ser в положении 16 (согласно нумерации в SEQ ID NO:701) цистеиновой кислотой, глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой и гомоцистеиновой кислотой;
(ix) замены Arg в положении 17 на Gln, замены Arg в положении 18 на Ala, замены Asp в положении 21 на Glu, замены Val в положении 23 на Не и замены Gln в положении 24 на Ala (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:701);
(x) замены Ser в положении 16 на Glu, замены Gln в положении 20 на Glu или замены Gln в положении 24 на Glu (согласно нумерации аминокислот в SEQ ID NO:701);
где С выбран из группы, состоящей из:
(vii) X;
(viii) X-Y;
(ix) X-Y-Z;
(x) X-Y-Z-R10;
где X означает Met, Leu или Nle; Y означает Asn или заряженную аминокислоту; Z означает Thr, Gly, Cys, Lys, орнитин (Orn), гомоцистеин, ацетилфенилаланин (Ac-Phe) или заряженную аминокислоту; где R10 выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1421, 1426, 1427 и 1450;
и где Q проявляет активность антагониста глюкагона и активность агониста GLP-1.