Способ электрохимического иммуноанализа для определения вирусов/антигенов вирусов

Изобретение относится к биологи и медицине, а именно к иммуноанализу, в частности к электрохимическим способам определения содержания вирусов/антигенов вирусов кори. Изобретение включает образование иммунокомплекса по схеме «сэндвич» между антителами и вирусом/антигеном вируса кори с последующим присоединением конъюгата антител с сигналообразующей меткой, причем в качестве сигналообразующей метки используют магнитные нанокомпозитные частицы, которые перед стадией образования иммунокомплекса получают путем создания на поверхности магнитных наночастиц оксида переходного металла оксидкремниевого покрытия с последующим получением конъюгата с антителами, при этом формирование иммунокомплекса осуществляют путем его концентрирования на твердофазном химически инертном носителе за счет воздействия магнитным полем с последующим изъятием этого иммунокомплекса из среды, сформированной на носителе, а определение наличия и концентрации вируса/антигена вируса осуществляют по сигналу, генерируемому ионами переходного металла, образующимися в результате кислотной обработки иммунокомплекса. Настоящее изобретение направлено на упрощение процесса анализа, увеличение экспрессности и воспроизводимости. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.

 

Заявляемое изобретение относится к биологи и медицине, а именно к иммуноанализу, в частности к электрохимическим способам определения содержания вирусов/антигенов вирусов в различных объектах и может быть использовано для дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний.

Недостатками используемых в настоящее время способов иммуноанализа являются: необходимость создания специальных условий для их проведения, например способы анализа, основанные на полимеразной цепной реакции, а также высокая стоимость используемых реагентов и оборудования, например иммуноферментный анализ.

Из уровня техники известен способ многоаналитного иммуноанализа с использованием микрочастиц, включающий смешивание различных категорий микрочастиц, покрытых биоспецифическими реагентами для связывания различных искомых аналитов и меченных одним или несколькими флуорохромами в различных концентрациях, испускающими долгоживущую флуоресценцию, добавление к смеси микрочастиц исследуемого образца и биоспецифического проявляющего реагента, меченного детектирующим флуорохромом, проведение реакции для образования биоспецифических комплексов, возбуждение флуорохромов и измерение в режиме временного разрешения количества долгоживущей эмиссии флуоресценции для идентификации категорий микрочастиц и количества эмиссии флуоресценции детектирующего флуорохрома для измерения количества искомых аналитов, при этом образовавшиеся биоспецифические комплексы осаждают на твердосплавный носитель, эмиссию флуоресценции всех флуорохромов возбуждают источниками излучения в двух спектральных диапазонах, для мечения биоспецифического проявляющего реагента используют детектирующий флуорохром с короткоживущей флуоресценцией, область возбуждения и эмиссии флуоресценции которого находится вне областей возбуждения и эмиссии флуоресценции флуорохромов с долгоживущей флуоресценцией, при этом соотношение концентраций флуорохромов с долгоживущей флуоресценцией в микрочастицах для определения одного вида аналита постоянно, а для определения разных видов аналитов соотношение концентраций различается по крайней мере в два раза (см. патент РФ №2379691 на изобретение «Способ многоаналитного иммуноанализа с использованием микрочастиц», дата приоритета 07.07.2008 г., опубликовано 20.01.2010 г.)

Недостатки способа обусловлены необходимостью многостадийного проведения процесса, а также сложностью получения аналитического сигнала.

Известен способ многоаналитного иммуноанализа с использованием микрочастиц, включающий нанесение на поверхность пористой мембраны реакционной смеси, содержащей аналит, первые связывающие молекулы, связанные с детектирующим веществом и специфичные к аналиту, исследуемый образец и частицы, не способные пройти через поры мембраны, покрытые вторыми связывающими молекулами, также специфичными к аналиту, инкубирование смеси для образования биоспецифического комплекса, отмывание реакционной смеси от несвязавшихся реагентов и детектирование аналита в образце по световому сигналу детектирующего вещества, связанного с биоспецифическим комплексом, при этом используют, по крайней мере, два вида специфичных к искомым аналитам первых и вторых связывающих молекул, при этом каждый вид тех и других молекул специфичен только к одному искомому аналиту, каждый вид первой связывающей молекулы связан, по крайней мере, с двумя длительно люминесцирующими детектирующими веществами, соотношение концентраций которых в каждой первой связывающей молекуле выбрано заранее и соответствует определенному искомому аналиту, регистрируют в режиме временного разрешения сигналы фосфоресценции в спектральных диапазонах эмиссии детектирующих веществ, соответствующих постоянной времени затухания этих веществ, и определяют искомый аналит по соотношению фосфоресцентных сигналов, при этом пространственное разрешение системы детектирования Δ (µ2) определяют из следующего соотношения:

Δ≤S/10Nµ2, где

S - площадь адсорбции частиц на мембране, µ2;

N - заданное число латексных частиц в анализируемой пробе (см. патент РФ №2339953 на изобретение «Способ многоаналитного иммуноанализа с использование микрочастиц», дата подачи 13.06.2007 г., опубликовано 27.11.2008 г).

Данный способ позволяет обнаружить и количественно детектировать низкие концентрации биологических аналитов в пробах при проведении исследований на твердой поверхности. Необходимость использования мембраны предъявляет высокие требования к составу пробы.

Недостатками способа являются необходимость многостадийного проведения процесса, а также сложность получения аналитического сигнала.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому изобретению, выбранным в качестве прототипа, является способ, осуществляемый с использованием электрохимического иммуносенсора, разработанного для обнаружения поверхностного антигена гепатита В. Сначала биотинилированные антитела к гепатиту В иммобилизируются на покрытых стрептавидином магнитных наночастицах. Затем добавляют антиген гепатита вируса B и после этого этапа вводят вторичные антитела, конъюгированные с сигналообразующей меткой, в качестве которой используют пероксидазу хрена. В результате происходит образование иммунокомплекса по схеме «сэндвич». После этого добавляют рабочий субстрат, в качестве которого применяют буферный раствор Бриттона-Робинсона,содержащий перекись водорода и ортоаминофенол, при этом пероксидаза хрена катализирует окисление аминофенола до 3-аминофеноксазона. Затем берут аликвоту пробы, переносят ее в электрохимическую ячейку и регистрируют циклическую вольтамперограмму. Величина тока пика окисления пропорциональна количеству 3-аминофеноксазона, которое, в свою очередь, пропорционально содержанию меченных пероксидазой хрена «сэндвич»-структур, а следовательно, и содержанию антигена вируса гепатита В. Данный способ иммуноанализа позволяет определить от 0,001 до 0,015 нг/мл антигена, предел обнаружения 0,9 мкг/мл при отношении сигнал/шум 1/3 (см. Magnetic nanoparticle-based immunosensor for electrochemical detection of hepatitis В surface antigen / Sara Nourani, Hedayatollah Ghourchian, Seyed Mehdi Boutorabi // Analytical Biochemistry, 2013, V.441, P.1-7).

К недостаткам данного способа следует отнести многостадийность процесса анализа (предварительное биотинилирование антител, конъюгация антител с пероксидазой хрена), высокую трудоемкость процесса, большие временные затраты, а также высокие требования, предъявляемые к квалификации специалистов-операторов.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое к защите техническое решение, является упрощение процесса анализа, увеличение экспрессности и воспроизводимости.

Указанный технический результат достигается тем, что заявляемый способ электрохимического иммуноанализа для определения вирусов/антигенов вирусов, включающий образование иммунокомплекса по схеме «сэндвич» между антителами и вирусом/антигеном вируса с последующим присоединением конъюгата антител с сигналообразующей меткой с целью определения наличия и концентрации вируса/антигена вируса путем получения электрохимического отклика за счет использования сигналообразующей метки, входящей в состав «сэндвич»-структуры, согласно изобретению в качестве сигналообразующей метки используют магнитные нанокомпозитные частицы, которые перед стадией образования иммунокомплекса получают путем создания на поверхности магнитных наночастиц оксида переходного металла оксидкремниевого покрытия с последующим получением конъюгата с антителами, при этом формирование иммунокомплекса (антитело - вирус/антиген вируса - антитело с сигналообразующей магнитной меткой) осуществляют путем его концентрирования на твердофазном химически инертном носителе за счет воздействия магнитным полем с последующим изъятием этого иммунокомплекса из среды, сформированной на носителе, а определение наличия и концентрации вируса/антигена вируса осуществляют по сигналу, генерируемому ионами переходного металла, образующимися в результате кислотной обработки иммунокомплекса, при этом в качестве переходного металла используют железо, а в качестве твердофазного химически инертного носителя - толстопленочный графитсодержащий электрод.

Для обеспечения взаимодействия между магнитными наночастицами и антителами магнитные наночастицы могут быть модифицированы аминопропилтриэтоксисиланом, формируя, тем самым, оксидкремниевое покрытие.

Для кислотной обработки, способствующей химическому разрушению иммунокомплекса, используют смесь азотной и серной кислот.

Время образования иммунокомплекса значительно сокращается за счет применения магнитного концентрирования иммунокомплекса на твердофазном носителе, что, в свою очередь, позволяет ускорить процедуру иммуноанализа. Кроме того, увеличивается чувствительность.

Концентрацию вируса/антигена вируса определяют путем получения электрохимического отклика регистрируемого от ионов Fe3+, полученных в результате кислотной обработки углеродной подложки с иммобилизированным иммунокомплексом.

Технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «новизна».

Заявляемые существенные признаки, предопределяющие получение указанного технического результата, явным образом не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «изобретательский уровень».

Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примере конкретного осуществления.

Заявляемое изобретение поясняется чертежами, где

Фиг.1

а) вид спереди углеродной подложки - толстопленочного графитсодержащего электрода (ТГЭ);

б) - вид сбоку углеродной подложки - толстопленочного графитсодержащего электрода (ТГЭ);

Фиг.2 - циклические вольтамперограммы, зарегистрированные в модельных растворах, содержащих (а, 4-6) и не содержащих (б, 4-6) антиген вируса кори (NovO/96), где 4 - вольтамперограмма фонового электролита, 5 - вольтамперограмма модельного раствора, 6 - вольтамперограмма, зарегистрированная после введения в модельный раствор добавки ионов Fe3+;

Фиг.3 - циклические вольтамперограммы, зарегистрированные в пробах, содержащих (а, 7-9), и не содержащих (б, 7-9) вирус кори, где 7 - вольтамперограмма фонового электролита, 8 - вольтамперограмма пробы, 9 - вольтамперограмма, зарегистрированная после введения в пробу добавки ионов Fe3+.

Фиг.4 - циклические вольтамперограммы, зарегистрированные в пробах, содержащих (а, 10-12), и не содержащих (б, 10-12) вирус кори, где 10 - вольтамперограмма фонового электролита, 11 - вольтамперограмма пробы, 12 - вольтамперограмма, зарегистрированная после введения в пробу добавки ионов Fe3+.

Толстопленочный графитсодержащий электрод - твердосплавный носитель состоит из углеродной подложки 1 (электрода), выполненной из стеклотекстолита, на которой размещена дорожка из токопроводящего материала 2, в качестве которого используют, например, графитовую композицию, углеродные чернила. На дорожку 2 нанесен слой изолятора 3 или цементита.

Заявляемое изобретение подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Модельный раствор с антигеном вируса кори (NovO/96) инкубируют в течение 30 минут при температуре 37°C с магнитными нанокомпозитными частицами Fe3O4-SiO2, на поверхности которых иммобилизированы поликлональные IgG к вирусу кори. После инкубации в раствор помещают ТГЭ (фиг.1), модифицированный IgG, и выдерживают в течение 20 минут при температуре 37°C. Для ускорения доставки к поверхности ТГЭ нанокомпозитных частиц с иммобилизированным на поверхности иммунокомплексом используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в смесь азотной и серной кислот (0,36М H2SO4 и 0,28М HNO3) для последующего разрушения «сэндвича» и растворения нанокомпозитных частиц. В качестве сигнала, характеризующего содержание вирусов/антигенов вирусов в анализируемой пробе, используют электрохимический отклик железа, перешедшего в раствор при кислотном разрушении «сэндвича». Для проведения холостого опыта используют фосфатный буфер, не содержащий антигена вируса (NovO/96) (фиг.2). В модельном растворе обнаружено 8×10-2 мг/мл антигена.

Пример 2.

Пробу, содержащую смывы из носоглотки пациента, зараженного вирусом кори, инкубируют в течение 30 минут при температуре 37°C с магнитными нанокомпозитными частицами Fe3SO4-SiO2, на поверхности которых иммобилизированы поликлональные IgG к вирусу кори. После инкубации в раствор помещают ТГЭ (фиг.1) модифицированный IgG, и выдерживают в течение 20 минут при температуре 37°C. Для ускорения доставки к поверхности ТГЭ нанокомпозитных частиц с иммобилизированным на поверхности иммунокомплексом используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в смесь азотной и серной кислот (0,36М H2SO4 и 0,28М HNO3) для разрушения «сэндвича» и растворения нанокомпозитных частиц. В качестве сигнала, характеризующего содержание вирусов/антигенов вирусов в анализируемой пробе, используют электрохимический отклик железа, перешедшего в раствор при кислотном разрушении «сэндвича». Для проведения холостого опыта используют пробу, содержащую смывы из носоглотки здорового пациента (фиг.3). В пробе, взятой у зараженного пациента, обнаружена концентрация вируса, соответствующая 3×10-3 мг/мл антигена.

Пример 3.

Пробу, содержащую смывы из носоглотки пациента, зараженного вирусом кори, инкубируют в течение 30 минут при температуре 37°C с магнитными нанокомпозитными частицами Fe3O4-SiO2, на поверхности которых иммобилизированы поликлональные IgG к вирусу кори. После инкубации в раствор помещают ТГЭ (фиг.1) модифицированный IgG, и выдерживают в течение 20 минут при температуре 37°C. Для ускорения доставки к поверхности ТГЭ нанокомпозитных частиц с иммобилизированным на поверхности иммунокомплексом используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в смесь азотной и серной кислот (0,36М H2SO4 и 0,28М HNO3) для разрушения «сэндвича» и растворения нанокомпозитных частиц. В качестве сигнала, характеризующего содержание вирусов/антигенов вирусов в анализируемой пробе, используют электрохимический отклик железа, перешедшего в раствор при кислотном разрушении «сэндвича». Для проведения холостого опыта используют пробу, содержащую смывы из носоглотки здорового пациента (фиг.4). В пробе, взятой у зараженного пациента, обнаружена концентрация вируса, соответствующая 4×10-4 мг/мл антигена.

Предложенный способ позволяет значительно снизить материало- и трудозатраты, требуемые для проведения процесса, увеличить производительность и уменьшить себестоимость определения.

Кроме того, изобретение позволяет упростить процесс иммуноанализа, а также увеличить экспрессность и воспроизводимость, а также использовать его в различных средах.

1. Способ электрохимического иммуноанализа для определения вирусов/антигенов вирусов кори, включающий образование иммунокомплекса по схеме «сэндвич» между антителами и вирусом/антигеном вируса с последующим присоединением конъюгата антител с сигналообразующей меткой с целью определения наличия и концентрации вируса/антигена вируса путем получения электрохимического отклика за счет использования сигналообразующей метки, входящей в состав «сэндвич»-структуры, отличающийся тем, что в качестве сигналообразующей метки используют магнитные нанокомпозитные частицы, которые перед стадией образования иммунокомплекса получают путем создания на поверхности магнитных наночастиц оксида переходного металла оксидкремниевого покрытия с последующим получением конъюгата с антителами, при этом формирование иммунокомплекса (антитело -вирус/антиген вируса - антитело с сигналообразующей магнитной меткой) осуществляют путем его концентрирования на твердофазном химически инертном носителе за счет воздействия магнитным полем с последующим изъятием этого иммунокомплекса из среды, сформированной на носителе, а определение наличия и концентрации вируса/антигена вируса осуществляют по сигналу, генерируемому ионами переходного металла, образующимися в результате кислотной обработки иммунокомплекса, при этом в качестве переходного металла используют железо, а в качестве твердофазного химически инертного носителя - толстопленочный графитсодержащий электрод.

2. Способ электрохимического иммуноанализа для определения вирусов/антигенов вирусов кори по п. 1, отличающийся тем, что для обеспечения взаимодействия между магнитными наночастицами и антителами магнитные частицы покрывают аминопропилтриэтоксисиланом.

3. Способ электрохимического иммуноанализа для определения вирусов/антигенов вирусов кори по п. 1, отличающийся тем, что для кислотной обработки используют смесь азотной и серной кислот.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине и описывает способ идентификации модуляторов активности фермента катехол-O-метилтрансферазы (СОМТ), включающий а) получение 4-нитрокатехола, ковалентно связанного с Alexa Fluor® 488, б) приведение в контакт молекулы из этапа а) с ферментом катехол-O-метилтрансферазой (COMT), S-аденозилметионином (SAM) и соединением-кандидатом и в) измерение показателей флуоресценции смеси из этапа б), в котором измененные показатели флуоресценции в присутствии соединения-кандидата по сравнению с контролем являются признаком наличия модулятора фермента катехол-O-метилтрансферазы (COMT).

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины и предназначено для обнаружения модифицированных нуклеотидов в составе РНК. Осуществляют подбор подходящей для исследуемой области РНК пары олигонуклеотидных зондов, подбор пары донора и тушителя флуоресценции с подходящими оптическими свойствами.

Изобретение относится к способам определения эффективности лиганда ионного канала. Ex vivo способ определения эффективности лиганда ионного канала in vivo в зависимости от присутствия плазмы, включает стадии: a) приведение клетки, экспрессирующей ионный канал, в контакт с i) плазмой животного и ii) лигандом ионного канала и b) определение эффекта лиганда ионного канала на клетку, или a) приведение клетки, экспрессирующей ионный канал, в контакт с i) плазмой животного и ii) соединением, которое определяют как лиганд ионного канала, и b) определение эффекта соединения на клетку, или a) приведение клетки, экспрессирующей ионный канал, в контакт с плазмой животного, которому был введен лиганд ионного канала, и b) определение эффекта лиганда ионного канала на клетку.

Изобретение относится к способу маркировки парных спиральных филаментов (PHF), включающему взаимодействие PHF с соединением и детектирование присутствия указанного соединения, где соединение имеет формулу , в которой -R- означает , -Q- выбран из: -NHC(O)-, -N=N-, -CH=CH-; -P выбран из: ; -T выбран из: ; X представляет собой N или CH; -W1-6, -G1-4, -Р1-5 являются такими, как указано в формуле изобретения.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицинской диагностики. Предложен способ детекции белков в амилоидном состоянии, в котором получают образец лизата культуры дрожжей или ткани млекопитающего, добавляют к образцу ионный детергент, концентрируют белки в амилоидной форме на ацетатцеллюлозной мембране и детектируют их с использованием аптамеров, их конъюгатов или антител, специфичных к амилоидной форме белков.

Изобретение относится к визуализирующим агентам, подходящим для оптической визуализации in vivo организма млекопитающего. .

Изобретение относится к биологии, а именно к цитометрическим методам анализа. .
Изобретение относится к области медицины, в частности к терапии, кардиологии, и касается способа прогнозирования риска развития критического стеноза в коронарных артериях у пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС).

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и описывает способ определения функциональной активности фактора B комплемента человека по его действию на клетки-мишени в бескальциевой среде, содержащей ионы магния, в присутствии реагента RB, являющегося сывороткой крови человека, избирательно лишенной активности фактора B, причем в качестве клеток-мишеней выбраны инфузории Tetrahymena pyriformis, суспензию которых вместе с испытуемым образцом, содержащим определяемый фактор B, и реагентом RB вносят в измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту, при этом совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемого образца и контрольного, представляющего пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей фактора B комплемента в этих образцах.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для снижения заболеваемости респираторными инфекциями детей младшего школьного возраста.
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования внутрибольничного инфицирования ребенка возбудителями кишечных инфекций.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии производства иммунопероксидазных конъюгатов, используемых для выявления антигенов возбудителей инфекционных болезней в твердофазном иммуноферментном анализе.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено полностью человеческое моноклональное антитело, которое связывает инсулиноподобный фактор роста-II (IGF-II) и имеет перекрестную реактивность к IGF-I, а также его антигенсвязывающий фрагмент.

Представленная группа изобретений касается слитых белков, нуклеиновых кислот, кодирующих такие белки, экспрессирующей кассеты, обеспечивающей экспрессию нуклеиновой кислоты, вектора, включающего такую кассету, способа диагностики in vitro-боррелиоза, набора для такой диагностики, в которых используют упомянутые белки, а также вакцинной композиции для профилактики боррелиоза, включающей такие белки.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложено устройство для забора нуклеиновой кислоты, применение устройства для забора нуклеиновой кислоты, набор для амплификации нуклеиновой кислоты, а также способ амплификации нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело, способное связываться с амплифицированным рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и с усеченным вариантом EGFR - de2-7 EGFR, и охарактеризованное последовательностями вариабельных доменов.

Группа изобретений относится к области медицины. Предложены способы диагностики хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) и проведения различия между стадией I/II и III/IV ХОБЛ у человека, включающие определение количества белков теплового шока 27 (HSP27), 70 (HSP70) и 90 альфа (HSP90 альфа) и определение количества рецептора 4 интерлейкина-1 (ST2) или гистон-связанных-ДНК-фрагментов в образце.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, репродуктологии, и может быть использовано для оптимизации программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) с учетом молекулярно-генетических характеристик гамет при селективном переносе эмбрионов (ПЭ). Способ заключается в том, что на основании данных ПЦР-амплификации исследуемых и референсных генов, полученных в день трансвагинальной пункции яичников (ТВП) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), об уровне экспрессии мРНК генов факторов роста (AREG, EREG, IGF1, IGFBP4), ингибитора апоптоза (BIRC5) в клетках фолликулярной жидкости, соотношения уровня экспрессии мРНК протаминов (PRM2:PRM1) в сперме получают значения пороговых циклов (Ср) накопления продуктов реакции, вычисляют значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ) по формуле, и если значение КЛДФ>0,22, делают заключение о благоприятном прогнозе наступления беременности. Изобретение позволяет выбирать эмбрион, имеющий высокий потенциал к имплантации, с целью снижения частоты многоплодных беременностей, а также прогнозировать наступление беременности в программе ЭКО при селективном переносе эмбрионов. 1 пр., 3 ил.
Наверх