Способ получения концентрированных полифенольных экстрактов в результате процесса перемешивания

Настоящее изобретение относится к области разработки продуктов пивоваренной промышленности. Согласно изобретению способ получения экстракта полифенолов, образованных в результате процесса пивоварения, включает стадии: контактирование частично очищенного пива со смолой, которая адсорбирует полифенолы; десорбцию полифенолов, адсорбированных на смоле, контактировавшей с частично очищенным пивом; адсорбцию полифенолов на вторую смолу, отличную от первой, причем указанная вторая смола является гидрофобной и неионной; и десорбцию полифенолов, адсорбированных на второй смоле, с использованием органического растворителя, причем способ осуществляют без использования этилацетата. Также изобретение относится к способу получения экстракта полифенолов, образованных в результате процесса пивоварения, включающему следующие стадии: контактирование частично очищенного пива с гидрофобной и неионной смолой, которая адсорбирует полифенолы; и десорбцию полифенолов, адсорбированных на смоле, использованной на предыдущей стадии контактирования, с использованием органического растворителя, причем продукт десорбции содержит по меньшей мере 0,85 г полифенолов на грамм сухого материала. Изобретение также относится к экстракту полифенолов, полученному посредством указанных способов и содержащему катехин, эпикатехин, тирозол и феруловую кислоту. Изобретение относится также к косметическому продукту, функциональному продукту питания, добавке к пище, которые содержат указанный экстракт полифенолов в эффективном количестве. Также изобретением предусмотрено применение указанного косметического продукта для увлажнения кожи и/или предупреждения или замедления ее старения, применение экстракта полифенолов для получения антиоксидантной композиции. Изобретение обеспечивает получение экстрактов полифенолов без использования этилацетата и с высокой степенью чистоты продукта. 8 н. и 11 з.п. ф-лы, 23 ил., 22 табл., 6 пр.

 

Настоящее изобретение относится к области разработки совместно производимых продуктов пивоваренной промышленности. В частности, настоящее изобретение относится к способам получения концентрированных полифенольных экстрактов, образующихся в результате процесса пивоварения, а также к некоторым применениям этих экстрактов, которые демонстрируют достойные внимания свойства.

Пиво получают из злаков (в основном, из ячменя, к которому могут быть добавлены другие злаки, такие как пшеница, рис или кукуруза), которое подвергают различным обработкам. Производство пива главным образом включает следующие стадии:

- Производство солода:

Эта стадия служит для активации ферментов в ячмене, которые превращают крахмал в сахара во время пивоварения. Ячмень, который представляет собой твердый злак, зерно которого богато нерастворимым крахмалом, превращается в солод, который является рыхлым и богат растворимыми веществами, посредством последовательного осуществления следующих трех стадий: погружения, во время которого зерно впитывает воду, проращивания и сушки в печи, которая останавливает прорастание.

- Пивоварение:

Неочищенный солод перемешивают с 2-3 объемами воды в резервуарах, называемых “бродильными чанами”; эта операция называется “затиранием солода”. После термической обработки при различных температурных стадиях в течение от 2 до 6 часов, солод становится пивным суслом. Во время этой операции, крахмал, содержащийся в солоде, превращается в сахар.

Такую же операцию можно проводить одновременно в другом чане, если используется неосоложенное зерно (неочищенное зерно).

Все количество затем перемешивают, чтобы получить сусло. Профильтрованное первый раз и с удаленными зерновыми пленками в фильтрационном чане, сусло становится “заторной водой”. Затем все количество переносят в бак для кипячения сусла с хмелем, где сусло варят при 100°C в течение от 1 до 2 часов и добавляют хмель в пропорции от 1 до 2 г на литр. Хмель придает пиву горечь и аромат и облегчает хранение вследствие его антисептических свойств.

Как само собой разумеется, термин «пивоварение» зачастую означает полный процесс производства пива (включая брожение).

- Брожение:

В охлажденное в теплообменнике при желаемой температуре брожения сусло вносят дрожжи, которые будут превращать сахар в спирт, вкусовые вещества и диоксид углерода. Брожение длится несколько недель и проводится в больших бродильных чанах.

В зависимости от желаемого вида пива, различаются используемые дрожжи; для пива типа эля используют дрожжи верхового брожения типа Saccharomyces cerevisisae, тогда как для светлого пива используют штаммы низового брожения типа Saccharomyces uvarum.

- Выдерживание:

Затем смесь фильтруют, таким образом, чтобы получить «зеленое пиво», которое помещают в чаны для выдерживания пива при температуре 0°C. Пиво созревает в этих чанах в течение нескольких недель, таким образом, чтобы образовался выдержанный эль. Во время этой фазы, пиво медленно улучшается и приобретает свой аромат и вкус вследствие работы дрожжей и холода (N.B.: это второе брожение систематически не проводится в современном пивоварении).

- Фильтрация:

Целью фильтрации является улучшение чистоты и пива путем удаления последних дрожжей и коллоидных частиц, все еще остающихся в суспензии. Пиво фильтруют через диатомитовые фильтры, диатомит, представляющий собой минеральный порошок, полученный из окаменелых диатомовых водорослей (морских микроорганизмов).

Эта стадия фильтрации не является достаточной. Это происходит потому, что даже после этого фильтрования пиво может стать мутным на холоде и эта мутность может стать постоянной при хранении пива. Эта мутность образуется за счет ассоциации полифенолов с белками, что в результате приводит к образованию нерастворимых соединений. Для того, чтобы обойти эту проблему, нежелательные полифенолы могут быть удалены из пива путем пропускания его через смолу: PVPP (поливинилпирролидон). PVPP представляет собой произвольно поперечно сшитый поли[1-(2-оксо-1-пирролидинил)этилен]. Его получают путем полимеризации N-винил-2-пирролидона в присутствии каустического катализатора или N,N'-дивинилимидазолидона. Его химическая формула представляет собой (C₆H₉NO)_n. В настоящее время, его регенерируют путем промывания гидроксидом натрия и промывные воды отбрасывают.

Полифенолы (или полифенольные соединения) представляют собой молекулы, специфичные для царства растений. Основным структурным элементом является бензольное кольцо, с которым непосредственно связана одна или несколько свободных гидроксильных групп или гидроксильных групп, входящих в другую химическую функциональную группу. Более 8000 соединений соответствуют этому определению. Они разделяются на различные семейства, в соответствии с их характеристиками: фенольные кислоты, флавоноиды, таннины и лигнаны, которые, с изофлавонами, называют фитоэстрогенами. Эти соединения используют в промышленности, в частности, благодаря их красящим и антиоксидантным свойствам.

В этом контексте, авторы изобретения изучили возможность извлечения полифенолов, удаляемых из пива в конце его производства. Вследствие их общих биологических свойств (антиоксидантных, биоцидных, противовоспалительных, и так далее, свойств), полифенолы действительно могут представлять интерес в различных областях:

- косметике,

- пищевой промышленности/ в области нутрицевтиков,

- фитотерапии,

- ветеринарии,

- фармации.

Полифенольные экстракты, в настоящее время доступные на рынке, получают из следующих растительных веществ: оливок, кофе, какао, чая, винограда, вина, яблок, сои, водорослей, черной смородины или сосновой коры.

Авторы изобретения также изучили преимущества полифенолов, экстрагированных в результате процесса производства пива, после стадии брожения, в различных применениях. В особенности, фенольные соединения подвергались воздействию соложения, пивоварения и брожению, что, возможно, привело к модификациям в их структуре (связывание с белками, полисахаридами, частичное окисление и полимеризация). Существует риск, что эти модификации влияют на их свойства, в частности, их антиоксидантные свойства. Неожиданно авторы изобретения показали, что полифенолы, полученные в результате процесса пивоварения (взятого в широком смысле), демонстрируют прекрасные антиоксидантные свойства.

Настоящее изобретение, таким образом, относится, во-первых, к применению частично очищенного пива в качестве исходного материала для получения экстракта, богатого полифенолами. Термин «частично очищенное пиво» в настоящей заявке означает пиво, полученное после удаления дрожжей, растительного дебриса и коллоидных частиц, например, фильтрованием через диатомитовые фильтры (другие способы, в частности, основанные на центрифугировании, также были описаны для этой цели). «Экстракт, богатый полифенолами» или «полифенольный экстракт» или «полифенольный концентрат» означает растительный экстракт в любой форме (жидкой или твердой), суммарное содержание полифенолов которой составляет по меньшей мере 5%, предпочтительно по меньшей мере 10% для жидкой формы, и по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере от 60% до 80%, или даже больше, для твердой формы. Метод Фолин-Чокальтеу (Folin-Ciocalteu) (EBC стандарт) может, например, быть использован для определения содержания полифенолов в концентратах в соответствии с изобретением (Folin и Ciocalteu, 1927).

Способ получения экстракта полифенолов, в результате процесса пивоварения, предусматривает по меньшей мере одну стадию контактирования частично очищенного пива со смолой, которая адсорбирует полифенолы, с последующей стадией извлечения полифенолов, адсорбированных на указанной смоле, также является частью настоящего изобретения. Разумеется, выражение «процесс пивоварения» следует понимать в широком смысле, означающем процесс производства пива. Примером смолы, которая может быть использована для осуществления этого способа, является PVPP.

Стадия “извлечения” полифенолов, адсорбированных на смоле после ее контакта с частично очищенным пивом, включает эти полифенолы, десорбированные из указанной смолы, помещенные в условия, гарантирующие их стабильность и, где целесообразно, концентрацию и/или очистку. Эта стадия может, например, проводиться путем использования второй смолы для извлечения полифенолов после десорбции их из первой смолы. В одном предпочтительном варианте осуществления эта вторая смола является гидрофобной и неионной и позволяет проводить десорбцию полифенолов путем применения органического растворителя.

В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, проводятся следующие стадии:

(i) частично фильтрованное пиво приводят в контакт с полимером поливинилпирролидоном (PVPP);

(ii) PVPP промывают щелочным раствором;

(iii) промывочный раствор PVPP приводят в контакт со вторым полимером, который адсорбирует полифенолы;

(iv) полифенолы подвергают десорбции из второго полимера;

(v) полифенолы концентрируют.

Некоторые предпочтительные варианты осуществления этих различных стадий подробно описаны ниже. Эти конкретные варианты осуществления могут быть использованы независимо или в сочетании, в непрерывных или периодических способах.

На стадии (ii), PVPP может подвергаться двум промываниям гидроксидом натрия; в этом случае, только раствор гидроксида натрия от первого промывания или, когда это целесообразно, фракцию этого раствора, используют на стадии (iii). Предпочтительно, концентрация гидроксида натрия составляет от 1% до 2%; еще более предпочтительно концентрация составляет приблизительно 1,6%. Разумеется, другой щелочной раствор может быть использован вместо гидроксида натрия.

После десорбции полифенолов щелочным раствором, этот раствор предпочтительно будет быстро нейтрализован или даже подкислен, для предотвращения разрушения полифенолов. Это является особенно предпочтительным в случае периодического способа. Причина состоит в том, что в случае непрерывного способа, время, в течение которого полифенолы остаются в щелочном растворе, может быть сокращено, таким образом, чтобы покончить с проблемой разрушения полифенолов в щелочной среде, и, следовательно, необязательно, ликвидировать стадию нейтрализации или подкисления. Как описано в экспериментальном разделе, приведенном ниже, фосфорная кислота особенно подходит для нейтрализации или подкисления щелочного раствора в конце стадии (ii).

Вторая смола, используемая на стадии (iii), предпочтительно будет гидрофобной и неионной, адсорбирующей полимерной смолой, которая предпочтительно является ароматической. В качестве неограничивающих примеров таких смол, можно упомянуть смолу Amberlite™ XAD 1180 от компании Rohm & Haas S.A.S., а также ее пищевой вариант (Amberlite™ FPX 68), который предсталяет собой макропоперечносшитую адсорбирующую смолу, предназначенную для производства напитков, в особенности для экстракции флавоноидов. Также может быть использована смола Amberlite™ FPX66, которая делает возможным извлекать молекулы меньшего размера по сравнению с FPX 68.

Стадия промывания второй смолы водным раствором предпочтительно будет добавлена между стадиями (iii) и (iv).

Предпочтительно, десорбцию на стадии (iv) проводят путем пропускания раствора спирта или другого органического растворителя через смолу. Полифенолы затем могут быть концентрированы, например, путем выпаривания органического растворителя. Концентрированный раствор может быть лиофилизирован или высушен, с получением порошка и для улучшения стабильности полифенольного концентрата.

В настоящее время PVPP является единственным полимером, способным адсорбировать полифенолы и включенным в список технологических вспомогательных веществ, одобренных для производства пива в Европе. Однако, этот список подвержен модификации. Вариант способов, описанных выше, следовательно, предусмотренный в соответствии с настоящим изобретением, в котором частично профильтрованное пиво приводят в контакт непосредственно со смолой, которая адсорбирует полифенолы и дает возможность для их десорбции органическим растворителем. Для этого, предпочтительно может быть использована гидрофобная и неионная адсорбирующая смола, которая предпочтительно является ароматической, например, смолы XAD 1180, FPX 68 и FPX 66, упомянутые выше. Этот вариант дает возможность освободиться от стадий регенерации гидроксида натрия и нейтрализации кислоты, уменьшает количество солей и делает возможным улучшение выхода экстракции и чистоты полифенолов.

Другим аспектом настоящего изобретения является полифенольный концентрат, который может быть получен с помощью способа, описанного выше. Различные стадии процесса пивоварения, которым подвергаются эти полифенолы, придают им оригинальные свойства и, в частности, состав, богатый катехинами и эпикатехинами, и их полимерами. Концентрат, в соответствии с настоящим изобретением, может быть в твердой форме, например в форме порошка, или в жидкой форме, например в водном или спиртовом растворе или в глицерине.

Полифенольный концентрат в соответствии с настоящим изобретением может быть использован для получения антиоксидантной композиции, не зависимо от назначения этой композиции.

В частности, антиоксидантные свойства концентратов по настоящему изобретению делают их превосходными кандидатами в качестве компонентов для косметических продуктов. Эти концентраты, действительно могут быть добавлены в большое разнообразие косметических продуктов, таких как кремы или лосьоны для увлажнения кожи, растворы для умывания или промывания кожи или волос, маски, продукцию декоративной косметики и так далее. Концентраты по настоящему изобретению могут быть включены в косметические продукты в качестве активных продуктов, например, благодаря их антиоксидантным, увлажняющим и стимулирующим свойствам, а также в качестве средств для облегчения хранения косметических продуктов. Косметический продукт в соответствии с настоящим изобретением может, разумеется, быть составлен для местного применения, а также может быть составлен для перорального применения, в форме гелевых капсул, таблеток для рассасывания, сиропа или в любой другой форме. Авторы настоящего изобретения действительно продемонстрировали на модели кожи в культуре благоприятное действие полифенолов при контакте с эпидермальными клетками на качество кожи. Косметические продукты по настоящему изобретению, в частности, могут быть использованы для увлажнения кожи и/или предотвращения или замедления ее старения. Чтобы обратить внимание, косметические композиции, содержащие от 0,25% до 0,5% твердого экстракта, богатого полифенолами (содержащие приблизительно 80% полифенолов), могут быть предпочтительно использованы для этих показаний.

В соответствии с другим конкретным аспектом настоящего изобретения, полифенолы, полученные в результате процесса пивоварения, используют в нутрицевтической композиции, такой как функциональные продукты питания или пищевая добавка. Термин «функциональный продукт питания» означает продукт питания, употребляемый как обычная пища, хотя он приносит пользу, которая превосходит обычное питание. Функциональный продукт питания, содержащий полифенолы, который может быть получен в соответствии с настоящим изобретением, следовательно, является неотъемлемой частью настоящего изобретения. В качестве неограничивающих примеров функциональных продуктов питания в соответствии с настоящим изобретением, могут быть упомянуты фруктовые соки, тонизирующие прохладительные и другие безалкогольные напитки, продукты на основе круп, йогурты и молочные продукты, шоколад, маргарин и другие, легко намазывающиеся жиры, печенье и так далее.

Помимо благоприятных свойств для здоровья, полифенолы по настоящему изобретению могут быть использованы в продуктах питания в качестве консервантов, например, для замены некоторых синтетических продуктов, таких как витамин C, BHA (бутилгидроксианизол) и BHT (бутилгидрокситолуол).

Пищевые добавки, содержащие полифенольный концентрат, полученный в соответствии с настоящим изобретением, также являются частью настоящего изобретения. Эти добавки могут быть, например, в форме гелевых капсул, порошков или таблеток. Разумеется, они могут содержать другие активные ингредиенты, такие как антиоксидантные витамины (в частности, C и E), витамины группы B, витамин D, кальций, магний, омега-3 жирные кислоты, фосфолипиды, растительные экстракты и так далее.

Конкретное применение полифенольных концентратов по настоящему изобретению, проиллюстрированное в экспериментальных примерах, приведенных далее, представляет собой получение композиций, предназначенных для улучшения уровней когнитивной деятельности индивидуума. Термин «уровни когнитивной деятельности» в настоящем описании означает, в широком смысле, память, способность к обучению, логическому мышлению, но также способность к концентрации, вниманию, стрессоустойчивость, скорость реакции и так далее. Такая композиция может быть в форме пищевой добавки, а также в любой другой форме, в частности, галеновой форме.

В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение относится к применению полифенольного концентрата, который может быть получен с помощью описанного выше способа, для получения композиции против старения. В частности, такая композиция может быть использована для ограничения или задержки последствий старения головного мозга, таких как потеря памяти, деменция и так далее. Такая композиция против старения может быть предназначена для людей или для использования в ветеринарии. Все формы введения, описанные выше, могут быть предусмотрены для такой композиции.

В качестве примера, полифенолы по настоящему изобретению могут вводиться в пропорции от 100 до 400 мг в день для взрослого человека.

Помимо указанных выше средств, настоящее изобретение также включает другие средства, которые будут следовать из приведенных ниже экспериментальных примеров и из прилагаемых чертежей.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1: Схема принципа PVPP фильтрации/регенерации.

Фигура 2: Полифенолы, находящиеся в регенерационном растворе, в зависимости от pH.

Фигура 3: Изменение суммарных полифенолов с течением времени.

Фигура 4: Изменение антиоксидантной активности в зависимости от температуры.

Фигура 5: Изменение содержания полифенолов во время регенерации.

Фигура 6: Схема экспериментальной проверки.

Фигура 7: Содержание полифенолов в течение 5 регенераций.

Фигура 8: Схема принципа замены PVPP другой смолой, XAD.

Фигура 9: Изменение массы тела у крыс во время экспериментального периода (среднее ± SEM).

Фигура 10: Потребление пищи (г/кг/д) (среднее ± SEM).

Фигура 11: Потребление воды (г/кг/д) (среднее ± SEM).

Фигура 12: Общее число нажатий двух рычагов в течение 10 минут периода адаптации к испытанию (среднее ± SEM).

Фигура 13: Различие между активным рычагом и неактивным рычагом в течение 10 минут периода адаптации к испытанию (среднее ± SEM).

Фигура 14: Общее число нажатий двух рычагов в течение 20 минут периода испытания (среднее ± SEM).

Фигура 15: Различие между активным рычагом и неактивным рычагом в течение 20 минут периода испытания (среднее ± SEM).

Фигура 16: время задержки (с) до достижения зоны плато (среднее ± SEM).

Фигура 17: Наблюдение под микроскопом необработанных эксплантатов в D0 (A) и D6 (B).

Фигура 18: Наблюдение под микроскопом эксплантатов в D6, обработанных составом, содержащим ретинол (A) или эксципиентом (B).

Фигура 19: Наблюдение под микроскопом в D6 после окрашивания GAG: контроль (A), эталон (B), обработанные полифенолами в концентрации 0,5% местно (C), и обработанные полифенолами в концентрации 0,025% в среде.

Фигура 20: Наблюдение под микроскопом в D6, после иммуномечения ламинина-5: контроль (A), эталон (B), обработанный полифенолами в концентрации 0,5% местно (C), и обработанный полифенолами в концентрации 0,025% в среде.

Фигура 21: Наблюдение под микроскопом в D6, после иммуномечения коллагена III: контроль (A), эталон (B), обработанные полифенолами в концентрации 0,5% местно (C), и обработанные полифенолами в концентрации 0,025% в среде.

Фигура 22: Наблюдение под микроскопом в D6, после иммуномечения коллагена IV: контроль (A), эталон (B), обработанные полифенолами в концентрации 0,5% местно (C), и обработанные полифенолами в концентрации 0,025% в среде.

Фигура 23: Состав флаволола и фенолокислоты образцов (% по массе).

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Лабораторные испытания

1.1 Контекст

Процесс фильтрования пива проводят в две стадии:

1. Пропускание через диатомитовый фильтр и элиминация остаточных твердых частиц («частично фильтрованное» пиво),

2. Снижение приблизительно на 40%-50% концентрации полифенолов в пиве с использованием PVPP.

Фильтрованное пиво в дальнейшем хранят, а затем упаковывают.

PVPP добавляют к частично профильтрованному пиву по мере его выхода из диатомитового фильтра. PVPP адсорбирует полифенолы, а затем удерживается на PVPP фильтре. Промывание фильтра горячим гидроксидом натрия в концентрации 1,6% (две части по 120 гл) дает возможность удалить полифенолы и регенерировать PVPP для следующего использования. Первую порцию гидроксида натрия отправляют на очистительную установку, вторую извлекают и повторно используют во время следующей регенерации. Использование и регенерация PVPP представлены на Фигуре 1. В примерах, которые следуют далее, «регенерационный раствор» будет означать первую порцию гидроксида натрия (гидроксид натрия 1).

1.2 Стабильность полифенолов в регенерационном растворе

Стабильность полифенолов регенерационного раствора определяют в различных условиях (pH, время, температура). Суммарные полифенолы исследуют в различные периоды времени для каждого из условий, на 5 взятых образцах. Прошло два часа между взятием образца и первым измерением.

Фигура 2 демонстрирует влияние pH на сохранение полифенолов. Через 2 часа, потеря полифенолов составляет более 55% в неподкисленном гидроксиде натрия. Основной раствор должен быть нейтрализован или подкислен сразу же по мере выхода из PVPP фильтра для того, чтобы быть пригодным для использования. Температура не оказывает влияния между 3 и 80°C.

Фигура 3 представляет изменение суммарных полифенолов в регенерационном растворе на протяжении периода 9 дней. Регенерационный раствор отбирают непосредственно при выходе из PVPP фильтра. Образцы стандартизируют и сразу же подкисляют технической кислотой.

Были протестированы следующие условия:

- кислотность

- pH между 2 и 3 для подкисленных образцов,

- pH=13 для необработанных образцов гидроксида натрия

- природа используемой кислоты

* фосфорная кислота (H₃PO₄)

* соляная кислота (HCl)

- температура: -20°C, 4°C или 20°C.

На этой Фигуре показано, что:

1. Когда раствор подкисляют фосфорной кислотой, 88% полифенолов сохраняется вплоть до 9-го дня.

2. Предпочтительно использовать фосфорную кислоту, а не соляную кислоту.

3. Основной раствор следует нейтрализовать сразу же для сохранения полифенолов (уже упомянуто выше).

4. Независимо от условий, полифенолы подвергаются трансформации. Этот феномен был описан для полифенолов в вине (Tubaro et al., 1999). По-видимому, происходит димеризация полифенолов (Brouillard et al., 1997).

5. Влияние температуры (4°C в сравнении с 20°C) является очень небольшим.

Влияние температуры на стабильность полифенолов впоследствии измеряли через антиоксидантную активность раствора полифенолов (Фигура 4). Образцы того же раствора держали при различных температурах (между 35 и 75°C) в течение 10, 20 или 30 минут. Антиоксидантную активность измеряли с помощью DPPH метода (Brand-Williams et al., 1995).

На Фигуре 4 показано, что:

1. Антиоксидантная активность (2,11 г Тролокс экв./г полифенолов) является стабильной между 20 и 75°C.

2. Наблюдаемые варианты (± 5%) относятся к экспериментальным отклонениям и не являются значимыми.

NB: Эти результаты подтверждались в опытной партии между 40 и 70°C.

1.3 Лабораторное получение экстрактов, обогащенных полифенолами

Для того чтобы определить полифенольный состав пива, McMurrough et al. проводили экстракцию этилацетатом на дегазированном пиве, а затем анализировали экстракт с помощью ВЭЖХ (McMurrough et al., 1984). Первую экстракцию проводили по этой методике для того, чтобы экстрагировать полифенолы регенерационного раствора.

Полифенолы, таким образом, были экстрагированы из PVPP-регенерационного раствора гидроксида натрия путем применения следующего протокола:

1. подкисление раствора гидроксида натрия до pH 2 с использованием HCl,

2. добавление этилацетата (соотношение гидроксида натрия/этилацетата: 1/1,5, об/об),

3. перемешивание в течение 2 часов, скорость 300-500 об/мин, затем оставляют стоять в течение 2 часов и разделяют фазы,

4. извлечение органической фазы, упаривание или лиофилизация.

Характеристики полученных экстрактов суммированы в таблице 2 (колонка A).

Предыдущий способ дает возможность получать полифенолы с чистотой 77%. Выход экстракции, с другой стороны, является низким (приблизительно 37%). Другие условия были протестированы для повышения выхода экстракции. Модификация относится к:

- pH (между 1 и 7),

- растворителю для экстракции (простой эфир, дихлорметан),

- добавлению хлорида натрия для улучшения отделения органической и водной фаз.

Характеристики полученных экстрактов суммированы в таблице 2 (колонка B). В целом, при использовании этих вариантов, выход экстракции меняется до 32%. Полученные экстракты содержат больше солей, чем ранее, и титр полифенола составил только 42%. Различные варианты, следовательно, не сделали возможным улучшить эффективность методики экстракции.

Для разработки способа для извлечения полифенолов в большем количестве в условиях, более совместимых с промышленной эксплуатацией, подходящей для существующих предприятий, и с предусмотренной аппаратурой, были предусмотрены другие методики для обессоливания и концентрирования полифенолов. Эти возможности суммированы в таблице 1.

Таблица 1 Предложенные способы концентрирования и обессоливания
Задача	Способ	Прочая информация
Подкисление (быстро, при выходе из PVPP фильтра) и обессоливание	Непосредственное подкисление	Образование солей Требуется удаление соли
Катионообменная смола	Отсутствие дополнительной стадии обессоливания Регенерация смолы кислотой (HCl, H2SO4)
Концентрирование	Мембранная фильтрация	Удаление части воды, концентрирование в 5 раз Давление 40-50 бар
Адсорбция полифенолов на смоле	Регенерация спиртом Перегонка под пониженным давлением

Выбор остановился на смоле для адсорбции полифенола, разработанной компанией Rohm & Haas. Полифенолы, следовательно, были экстрагированы из нейтрализованного PVPP-регенерирующего гидроксида натрия путем применения следующего способа.

1. Пропускание раствора гидроксида натрия через колонку, содержащую смолу XAD1180, и адсорбция полифенолов. Адсорбционная способность смолы составляет 20 г полифенолов на литр смолы,

2. Промывание смолы водой для удаления следов солей и других примесей,

3. Элюция полифенолов этанолом,

4. Извлечение органической фазы, упаривание и лиофилизация.

150 мл воды и 150 мл спирта использовали на 100 мл смолы.

Характеристики полученных экстрактов суммированы в таблице 2 (колонка C).

Этот способ решает проблемы, связанные с применением этилацетата.

- Увеличивается экстракция имеющихся полифенолов (экстракция 65%),

- повышается чистота экстрактов до 85-90%,

- этанол используется или присутствует во многих производственных процессах (фармация) или общеупотребительных продуктах (пиво, противокашлевые средства).

1.4 Полифенольные экстракты, полученные в лаборатории

Характеристики экстрактов, полученных в лаборатории с помощью трех способов, описанных выше, суммированы в приведенной ниже таблице 2.

Таблица 2 Сравнение экстрактов, полученных различными способами на различных образцах
Серия экспериментов	A	B	C
Способ	Этилацетат	Варианты	Смола + спирт
Количество полученного сухого вещества (г)	9,3	29,6	17,5
Титр полифенолов (г/г DM)	0,77	0,42	0,85
Масса полифенолов (г)	7,2	12,4	14,9
Доступный выход экстракции полифенолов (%)	37	32	65
Антиоксидантная активность
мг DPPH/г DM	2,5-3,0	1,2-1,5	3,7-4,5
мг DPPH/г полифенолов	3,2-3,9	2,8-3,6	4,4-5,3
Эквивалентность Тролоксу (г/г DM)	1,08-1,31	0,50-0,67	1,62-1,96
Эквивалентность Тролоксу (г/г полифенолов)	1,4-1,7	1,2-1,6	1,9-2,3

Пример 2: Увеличение масштаба от лаборатории к производству

2.1 Контрольное испытание

Взятые образцы показали, что во время регенерации PVPP, только первое промывание гидроксидом натрия богато полифенолами. Кроме того, концентрация полифенолов варьирует во время регенерации PVPP. Представлено для одной регенерации на Фигуре 5.

Количество полифенолов оценивают путем интегрирования площади поверхности под кривой. В соответствии с видом кривой приблизительно 65% полифенолов, содержащихся в регенерирующем растворе, удалено на протяжении периода 2 минуты (заштрихованная часть на Фигуре 5). Следовательно, на протяжении этого периода времени, приблизительно 10 гл гидроксида натрия было взято в качестве образца для проведения контрольного испытания.

Подтверждение достоверности предложенного способа требует, чтобы контрольное испытание проводилось для получения приблизительно от 5 до 10 кг полифенолов.

Образец гидроксида натрия брали непосредственно на выходе из PVPP фильтра после приостановки последовательности стандартной регенерации на 3-й минуте (Фигура 5, заштрихованная часть). Раствор сразу же подкисляли 20 литрами фосфорной кислоты во время заполнения емкости, используемой для транспортировки.

Содержание полифенолов в образце гидроксида натрия (800 л) составило 19 г/л. Подкисленный гидроксид натрия (H₃PO₄, pH 5) обрабатывали частями приблизительно по 100 литров. Используемое устройство схематически представлено на Фигуре 6.

Разновидность этого устройства состоит из рециркулирующего органического растворителя (пунктирная стрелка, отмеченная звездочкой *). В этом случае, объем органического растворителя может быть уменьшен. Таким образом, например, 100 л спирта может быть использовано вместо 1000 л, как показано на Фигуре 6. Этот вариант имеет некоторые преимущества: (i) полифенолы могут быть получены в более высоких концентрациях; (ii) упаривание становится необязательным или даже излишним, и это возможно сделать без испарителя (это также верно в варианте, где используют одну смолу, как показано на Фигуре 8); (iii) устранение стадии упаривания, что в результате приводит к непосредственной лиофилизации продукта, делает этот процесс более экономичным.

Металлический фильтр помещали в контейнер Cornelius, циркуляцию жидкости вызывали со дна на верх во избежание проблем засорения.

Выход экстракции 60% может быть увеличен путем улучшения условий обработки гидроксида натрия.

Количество выделенных полифенолов составило приблизительно 9 кг и чистота была более 80%. Антиоксидантная активность полученного продукта была выше, чем в лабораторных испытаниях, поскольку выполнение пробного опыта позволило избежать попадания воздуха в циркуляцию во время перемещения между различными жидкостями и, следовательно, разрушения полифенолов.

Таблица 3 Сравнение экстрактов, полученных выбранным способом
Серия экспериментов	Лабораторное	Пробный опыт
Количество сухого вещества (полученное в лаборатории, рассчитанное для пробного опыта)	17,5 г	10,96 кг
Титр полифенолов (г/г DM)	0,85	0,81
Масса полифенолов	14,9 г	8,82 кг
Доступный выход экстракции полифенолов (%)	65	60
Антиоксидантная активность
мг DPPH/г DM	3,7-4,5	5,3
мг DPPH/г полифенолов	4,4-5,3	6,6
Эквивалентность Тролоксу (г/г DM)	1,62-1,96	2,24
Эквивалентность Тролоксу (г/г полифенолов)	1,9-2,3	2,8

2.2 Промышленные аспекты

Для установления воспроизводимости полученных выше результатов, эти операции повторяли в течение пяти регенераций (Фигура 7).

Вследствие промышленных ограничений, проводили 5 регенерацию, хотя было использовано только 75% доступного PVPP, и количества определяемых полифенолов были низкими.

Образцы гидроксида натрия, взятые на различных PVPP фильтрах, показали сходные характеристики (таблица 4):

- потенциал доступного полифенола приблизительно составляет от 55 до 65 кг на регенерацию,

- в соответствии с видом кривой 65% полифенолов, содержащихся в регенерационном растворе, концентрируется за период 2 минуты (заштрихованная область на Фигуре 5).

Таблица 4 Данные, характеризующие регенерацию
	Прохождение гидроксида натрия 1	Период удержания	Относительное содержание (%)
Длительность (минут)	7	~ 2	25-30
Объем гидроксида натрия (гл)	120	~ 35	25-30
Доступные полифенолы (кг)	55-65	35-45	60-65

Пример 3: Вариант извлечения полифенолов, полученных из пива

Другая возможность извлечения полифенолов состоит в замене PVPP смолой, разработанной Rohm & Haas (Фигура 8). Поскольку десорбцию этой смолы проводят с использованием спирта, соли поступают только из пива, а не из гидроксида натрия, нейтрализованного кислотой (нулевое потребление гидроксида натрия и кислоты). Возможно предложить продукт, имеющий минимальный титр полифенолов 95%. Помимо чистоты, увеличивается количество извлекаемых полифенолов, и достигает 60 кг на регенерацию. Для осуществления в промышленных масштабах, этот вариант требует модификации перечня технологических вспомогательных веществ, разрешенных для обработки пива, а также развития исследования для установления влияния этих модификаций на физические и органолептические характеристики пива.

Пример 4: Изучение профилактического действия полифенолов, полученных из побочных продуктов пивоваренной промышленности, на антиоксидантную активность и на когнитивную сферу после теплового удара у взрослых самцов крыс Sprague Dawley

4.1 Введение

Профилактическое действие полифенолов, полученных из побочных продуктов пивоваренной промышленности, на антиоксидантную активность, а также на когнитивную сферу после теплового удара, оценивали у взрослых самцов крыс Sprague Dawley.

Животных различных групп подвергали воздействию полифенолов в течение трех недель (D1-D22), вводимых перорально в дозах 25 и 50 мг/кг, или носителя (родниковая вода). Антиоксидантную активность полифенолов оценивали в цельной крови в начале и в конце профилактического воздействия, а затем в день после теплового удара, проводимого на 16 день. Обучающие тесты проводили как на модели выработки условного оборонительного рефлекса на вызывающий отвращение световой стимул (эффекторный условный рефлекс) на 19 день, так и в тесте водного лабиринта Морриса (пространственная память) на 21 и 22 день, для оценки защитного действия полифенолов против когнитивных расстройств, индуцированных чрезмерной продукцией свободных радикалов после теплового удара.

4.2 Материалы и методы

Животные

Использовали шестьдесят четыре самца крыс Sprague Dawley (Harlan, Holland) с массой тела от 250 до 275 г. При получении, крыс метили и разделяли на группы по четыре в поликарбонатные клетки F типа (48×27×20 см, U.A.R., 91 - Epinay-Sur-Orge, France). Животных размещали в помещении для животных, оборудованном установкой для кондиционирования воздуха при температуре 22±1°C. Крысы получали обычный корм 2016 (Harlan, France) и питье без ограничения (ad libitum) и подвергались 12-часовому инвертированному циклу дня и ночи.

После ознакомления с лабораторными условиями в течение одной недели, крыс взвешивали и случайным образом разделяли на четыре испытуемые группы (n=16 крыс/группу):

- “BC” группа: пустой контроль, обработанный носителем и не подвергнутый тепловому удару;

- “HSC” группа: контроль с тепловым ударом, обработанный носителем и подвергнутый тепловому удару;

- “PP25” группа: обработана в дозе 25 мг/кг полифенолами и подвергнута тепловому удару;

- “PP50” группа: обработана в дозе 50 мг/кг полифенолами и подвергнута тепловому удару.

Для того чтобы избежать возможных взаимных влияний различных продуктов, крысы в одной и той же клетке все подвергались одинаковой обработке. Крысы различных групп содержались аналогичным образом и в тех же условиях.

Применение продуктов и тестов (таблица 5)

Полифенолы, солюбилизированные в родниковой воде (5 мл/кг) в дозах 25 и 50 мг/кг, и носитель вводили внутрижелудочно животным каждый день в течение трех недель. После осуществления воздействия животных всех групп кормили без ограничения (ad libitum) стандартным рационом питания.

Образцы пятисот микролитров цельной крови брали у 12 крыс на группу в D0 и на D15 для оценки антиоксидантной активности полифенолов. Образцы брали из хвостовой вены, используя иглу, и кровь непосредственно собирали в пробирку с EDTA. Этот способ дает возможность собрать небольшие объемы крови без сакрификации животного. Период времени для адаптации к устройству в тесте выработки оборонительного условного рефлекса на вызывающий отвращение световой стимул (ALSAT) составлял 10 минут на D15 для сравнения активности манипулирования животных четырех групп. Тепловой удар осуществляли на D16, и дополнительный образец крови брали на D17 для оценки защитного действия полифенолов от избыточной продукции свободных радикалов и для установления антиоксидантной активности у животных, которым предварительно вводили этот продукт. Через три дня после теплового удара (D19) животных тестировали в ALSAT для оценки уровней качества их обучения в зависимости от введенных продуктов. На 21 и 22 день крыс тестировали в водном лабиринте Морриса для оценки приобретенного пространственного обучения и кратковременной и долговременной памяти.

Животных взвешивали каждый второй день для того, чтобы привести в соответствие количество ежедневно вводимых им полифенолов в зависимости от их массы тела.

Потребление пищи и воды животными регистрировали в течение двух недель, предшествующих тепловому удару, и неделю после него.

Таблица 5 Продукт и протокол проведения испытания
Группы	n	Обработка (D1-D22)	Доза мг/кг/д	Тепловой удар (HS) (n = 16)	Измерение антиоксидантной активности (n = 12)	Адаптация ALSAT	ALSAT тест	Тест Морриса
BC	16	Родниковая вода	-	No	День 0, D15 и D17	D15	D19	D21 и D22
HSC	16	Родниковая вода	-	D16
PP25	16	Полифенолы	25	D16
PP50	16	Полифенолы	50	D16

Экспериментальные процедуры

Обоснование модели теплового удара

Экспериментальный тепловой удар воспроизводит эффекты длительного воздействия тепла. Существуют различные модели теплового удара на животных, наиболее широко распространенной является крысиная модель.

У анестезированных крыс, подвергаемых воздействию тепла, существует феномен терминальной церебральной ишемии с мощным высвобождением дофамина, серотонина, глутамина и монооксида азота (Yang and Lin, 2002; Canini et al., 2001). Следовательно, не удивительно обнаружить в этот момент повышение маркеров перикисного окисления мембран и повреждений головного мозга.

Бодрствующих крыс, подвергаемых воздействию тепла (Tdb=40°C), невозможно по этическим причинам доводить до терминальной ишемии. Тем не менее, возможно проследить трехфазное изменение центральной температуры: сразу же после начала воздействия температура повышается, а затем стабилизируется на плато терморегуляции, которое заканчивается повышением температуры тела и продолжается до гибели животного. Прерывание воздействия при температуре тела 41,5-42,0°C затем является хорошим компромиссом: животные находятся в конечной фазе повышения температуры тела и выживаемость является высокой (около 80%).

В этом контексте, поведенческие альтерации по типу манипуляторной гиперактивности и когнитивных расстройств оценивали через несколько дней после воздействия теплового удара в тесте выработки оборонительного условного рефлекса на вызывающий отвращение световой стимул, и в тесте водного лабиринта Морриса.

Тепловой удар

После получения исходной ректальной температуры крысы, животное помещали при 40°C в устройство для воспроизведения теплового удара. Когда температура тела крысы достигала 41,5°C, ее убирали из устройства и помещали обратно в клетку.

Антиоксидантная активность

Антиоксидантную активность измеряли, используя KRL тест (Kirial International, France) (Prost et al, 1992). Он состоит в том, что образец крови подвергают воздействию свободных радикалов в контролируемых и стандартизированных условиях. Все ферментные и химические системы образца мобилизуются для защиты целостности клеток, пока указанные клетки не лизируются. Измерение снижения поглощения дает возможность проследить постепенное исчезновение клеток. Устойчивость крови к воздействию свободных радикалов выражается временем, необходимым для лизиса 50% клеток крови (время полугемолиза).

Этот тест проводят с использованием набора KRL (Эталон KRLSPI101/103/105) в 96-луночных микропланшетах, и результаты анализируют с использованием программного обеспечения KRL (версия 3.02).

Анализ цельной крови дает возможность измерить внутриклеточные и внеклеточные защитные реакции, что указывает на физиологическое состояние крысы во время взятия образца крови.

Тестирование выработки оборонительного условного рефлекса на вызывающий отвращение световой стимул (ALSAT)

В этой модели используется отвращение крысы к условиям сильного освещения. Сначала, крыса обучается контролировать вызывающие отвращения условия освещения в контексте оборонительного условного рефлекса: животное обучается нажимать на активный рычаг для получения периодов темноты в качестве усиления положительной мотивации (Messaoudi et al, 1996; Messaoudi et al, 1999).

Экспериментальное устройство состоит из сильно освещенной (1200 люкс) изолированной клетки (50×40×37 см), содержащей два рычага: один активный, который дает 30 секунд темноты в качестве усиления положительной мотивации, когда его приводят в действие, и другой не активный. Нажатие на активный рычаг во время периода темноты не обеспечивает дополнительных периодов темноты.

Набор тестов, состоящий из четырех устройств предварительного формирования сигнала, является полностью автоматическим и компьютеризированным. Сеанс для привыкания к этому устройству проводили за день до теплового удара на D15. В день проведения испытания (D19) процедуру по приобретению навыков различения проводили на протяжении периода 20 минут, через три дня после теплового удара.

Зарегистрированные изменения представляли количество раз нажатий активного рычага (LA) и неактивного рычага (LI), а также количество полученных периодов темноты.

Количество нажатий на активный и неактивный рычаг дали возможность оценить уровень манипуляторной активности. Приобретение навыков обучения (различия двух рычагов) оценивали путем сравнения суммарного числа раз нажатий каждого из двух рычагов (LA по сравнению с LI).

Тест водного лабиринта Морриса: пространственная память

Крыса, помещенная в круглый резервуар (Ø 150 см), наполненный водой, плавает и стремится спастись от вызывающей отвращение водной среды, ища убежища на платформе, погруженной на 2 мм под поверхность воды. Период проведения испытания включает 5 последовательных испытаний, во время которых животное учится обнаруживать местонахождение погруженной платформы и отдыхать на ней. Время отдыха 30 секунд на платформе наблюдают между двумя испытаниями для того, чтобы дать возможность крысе найти пространственные ориентиры, необходимые для ориентации в этом устройстве.

На следующий день, крысу помещают в те же экспериментальные условия и проводят однократное испытание (повторный тест).

Этот тест дает возможность на 21 день оценить исследовательские уровни и уровни когнитивной деятельности в ситуации прогрессивного пространственного обучения (краткосрочная память) и во время повторного испытания (D22) для оценки долговременной памяти крысы.

Изучаемая переменная представляет собой время задержки до достижения положения погруженной платформы (Blokland et al., 2004; Morris et al., 1982).

Статистический анализ

В зависимости от распределения Гаусса или негауссовского распределения данных, использовали параметрические (P) или непараметрические (NP) статистические анализы: дисперсионный анализ факторных измерений (ANOVA) (P) или критерий Краскела-Уоллиса (NP), с последующим, где целесообразно, критерием Стьюдента для одной выборки (P) или критерием Манна-Уитни (NP) для сравнения испытуемых групп с контрольной группой. Для анализа повторных или парных измерений, использовали повторные изменения ANOVA (P) или тест Фридмана (NP), с последующими, где целесообразно, критериями парного сравнения: парный t-критерий (P) или критерий Уилкоксона (NP).

Статистическую обработку проводили, используя программное обеспечение Statview 5 (SAS Institute Inc.).

4.3. Результаты

Комментарий: во время этого исследования три крысы умерли до окончания эксперимента.

Изменение массы

С 0 дня до дня 16 анализ вариантности не показал какой-либо гетерогенности среди массы тела крыс различных групп.

Со дня 17 до дня 22 анализ вариантности показал значительную гетерогенность среди массы тела крыс различных групп (таблица 6).

Критерий Стьюдента для одной выборки показал, что на дни 17 и 22 масса тела крыс группы HSC была значительно ниже, чем крыс группы BC. В дни 18, 20 и 21 масса тела крыс группы HSC показала тенденцию быть ниже, чем масса тела крыс группы BC.

Со дня 17 до дня 22 масса тела крыс групп PP25 и PP50 была существенно ниже, чем масса тела крыс группы BC.

Масса тела крыс групп PP25 и PP50 значительно не отличалась от массы тела крыс группы HSC, за исключением 17 дня, где масса тела крыс группы PP50 показала тенденцию быть ниже, чем масса тела крыс группы HSC (таблица 7; Фигура 9).

Таблица 6 Дисперсионный анализ массы тела крыс четырех испытуемых групп
Дни	0	2	4	7	9	11	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22
ANOVA: F (3,57) Значимость	0,74 N.S.	1,05 N.S.	0,95 N.S.	1,27 N.S.	0,93 N.S.	0,50 N.S.	0,27 N.S.	0,47 N.S.	0,93 N.S.	1,57 N.S.	5,63 P<0,01	3,76 P<0,05	3,38 P<0,05	3,94 P<0,05	4,12 P<0,05	4,41 P<0,01

Таблица 7 Поперечное сравнение массы тела крыс различных групп (критерий Стьюдента для одной выборки)
Дни	17	18	19	20	21	22
HSC vs. BC	t=2,07 P<0,05	t=1,73 P<0,10	t=1,57 N.S.	t=1,82 P<0,10	t=1,80 P<0,10	t=2,14 P<0,05
PP25 vs. BC	t=3,32 P<0,05	t=2,70 P<0,05	t=2,76 P<0,01	t=3,04 P<0,01	t=3,28 P<0,01	t=3,45 P<0,01
PP50 vs. BC	t=4,61 P<0,0001	t=3,94 P<0,001	t=3,79 P<0,001	t=4,03 P<0,001	t=4,20 P<0,001	t=4,32 P<0,001
PP25 vs. HSC	t=0,77 N.S.	t=0,52 N.S.	t=0,51 N.S.	t=0,47 N.S.	t=0,54 N.S.	t=0,26 N.S.
PP50 vs. HSC	t=1,74 P<0,010	t=1,35 N.S.	t=1,26 N.S.	t=1,24 N.S.	t=1,22 N.S.	t=0,99 N.S.

Интерпретация: после 15 дней обработки полифенолами в дозах 25 и 50 мг/кг изменение массы тела в группах, обработанных полифенолами, соответствует таковому у крыс в контрольной группе. Токсических эффектов полифенолов не было отмечено.

Тепловой удар приводит к значительной потере массы тела в группах HSC, PP25 и PP50 по сравнению с BC контролем. Не было существенного различия между группой HSC и группами PP25 и PP50 после теплового удара, изменения массы тела у крыс этих групп были сходными.

Повторные определения ANOVA, применяемые к изменению массы тела у крыс каждой из четырех групп между D17 и D20, показали значительную гетерогенность после теплового удара (таблица 8).

Таблица 8 Сравнение массы тела крыс в различных группах между D17 и D20
Группы	BC (n=16)	HSC (n=15)	PP25 (n=15)	PP50 (n=15)
Повторы определения ANOVA с D17 по D20	F=20,22 P<0,0001	F=6,21 P<0,01	F=47,68 P<0,0001	F=4,83 P<0,01

Сравнение между D17 и D18 с использованием двустороннего критерия Стьюдента показало значительное повышение массы тела крыс в группах PP25 (t=5,97, p<0,0001) и PP50 (t=7,62, p<0,0001). Не наблюдалось существенного различия в массе тела крыс в группах BC (t=0,77, p=0,45) и HSC (t=1,26, p=0,23).

Сравнение между D18 и D19 показало значительное увеличение массы тела крыс в группах PP25 (t=3,06, p=0,008) и PP50 (t=2,97, p=0,010) и тенденцию в направлении увеличения массы тела крыс в группе BC (t=1,93, p=0,073). Существенных различий в массе тела крыс в группе HSC не наблюдалось (t=0,94, p=0,365).

Сравнение между D19 и D20 показало значительное увеличение массы тела крыс в группах BC (t=6,48, p<0,0001), HSC (t=4,69, p=0,0003) и PP25 (t=4,75, p=0,0003). Существенных различий в массе тела крыс в группе PP50 не наблюдалось (t=0,68, p=0,507).

Интерпретация: крысы BC следовали обычной кривой прибавки массы тела после голодания в день теплового удара, тогда как крысы, получившие полифенолы снова прибавляли массу тела со дня после теплового удара, это имело место в течение трех последующих дней для группы PP25 и двух дней для группы PP50; крысы группы HSC только начали снова прибавлять массу тела на третий день после теплового удара (D19).

Потребление пищи

Тепловой удар применяли у животных в начале 3 недели.

Критерий Крускала-Уоллиса не показал значительной гетерогенности для потребления пищи крысами в группах BC, HSC, PP25 и PP50 в течение 1, 2 и 3 недели.

Повторный анализ измерения с использованием теста Фридмана показал значительную гетерогенность в отношении потребления пищи в течение 1, 2 и 3 недели для крыс группы HSC (χ²=6; ddl=2; p=0,05). Потребление пищи крысами в группе HSC показало тенденцию к снижению между 2 неделей и 3 неделей (Критерий Уилкоксона: z=1,826; p=0,068) (таблица 9; Фигура 10).

Таблица 9 Сравнение потребления пищи крысами различных групп (г/кг/д); (среднее ± SEM)
	BC (n=4)	HSC (n=4)	PP25 (n=4)	PP50 (n=4)	Однофакторный анализ Крускала-Уоллиса
Неделя 1	61,80 ± 4,58	59,33 ± 1,28	58,15 ± 0,88	58,40 ± 3,19	H=1,853 ddl=3; N.S.
Неделя 2	59,36 ± 1,97	59,93 ± 0,49	58,82 ± 1,34	59,25 ± 0,91	H=2,934 ddl=3; N.S.
Неделя 3	52,29 ± 4,13	54,08 ± 1,49	50,93 ± 1,75	55,10 ± 2,33	H=1,588 ddl=3; N.S.
Тест Фридмана	χ2=4,50 ddl=2 N.S.	χ2=6,00 ddl=2 p<0,05	χ2=4,50 ddl=2 N.S.	χ2=3,50 ddl=2 N.S.	-
Критерий Уилкоксона Неделя 1 vs. Неделя 2	-	z=0 N.S.	-	-	-
Неделя 2 vs. Неделя 3	-	z=1,826 p<0,10	-	-	-

Интерпретация: крысы в группе HSC показали тенденцию к потреблению меньшего количества пищи после теплового удара, чем в течение первых двух недель исследования.

Потребление воды

Критерий Крускала-Уоллиса не показал какой-либо значимой гетерогенности в отношении потребления воды в различных группах в течение 1, 2 и 3 недели.

Тест Фридмана продемонстрировал значительное различие в отношении потребления воды в течение 1, 2 и 3 недели для крыс в группе HSC (χ²=6,50; ddl=2; p=0,039). Потребление воды крысами в группе HSC показало тенденцию к снижению между 2 неделей и 3 неделей (Критерий Уилкоксона: z=1,83; p=0,68) (таблица 10, Фигура 11).

Таблица 10 Потребление воды крысами в различных группах (г/кг/д) (среднее ± SEM)
	BC (n=4)	HSC (n=4)	PP25 (n=4)	PP50 (n=4)	Однофакторный анализ Крускала-Уоллиса
Неделя 1	92,91 ± 10,02	85,91 ± 2,14	73,66 ± 3,09	79,96 ± 9,10	H=4,301 ddl=3; N.S.
Неделя 2	88,10 ± 6,45	84,03 ± 2,94	74,16 ± 1,20	77,03 ± 4,28	H=4,985 ddl=3; N.S.
Неделя 3	81,44 ± 7,80	79,09 ± 3,57	65,70 ± 4,56	79,91 ± 10,41	H=3,728 ddl=3; N.S.
Тест Фридмана	χ2=4,50 ddl=2 N.S.	χ2=6,50 ddl=2 p<0,05	χ2=4,50 ddl=2 N.S.	χ2=0,50 ddl=2 N.S.	-
Критерий Уилкоксона Неделя 1 vs. Неделя 2	-	z=0,365 N.S.	-	-	-
Неделя 2 vs. Неделя 3	-	z=1,826 p<0,10	-	-	-

Интерпретация: крысы в группе HSC имеют тенденцию потреблять меньшее количество воды после теплового удара, чем в течение первых двух недель исследования.

Антиоксидантная активность

На 17 день факторные измерения ANOVA показали тенденцию в отношении гетерогенности между временем полугемолиза у крыс четырех групп.

Критерий Стьюдента для одной выборки не показал какого-либо значимого различия между группами.

Повторные измерения ANOVA показали тенденцию в направлении различия между временем полугемолиза в трех образцах от крыс группы BC. Двусторонний критерий Стьюдента не показал какого-либо значимого различия между различными образцами (таблица 11).

Таблица 11 Время полугемолиза в цельной крови (мин) между тремя образцами (среднее ± SEM)
	BC (n=12)	HSC (n=11)	PP25 (n=11)	PP50 (n=11)	Факторные измерения ANOVA
D0	67,28 ± 0,85	68,14 ± 1,08	70,86 ± 1,56	68,48 ± 0,93	F(3,41)=1,86 N.S.
D15	69,84 ± 1,18	69,86 ± 1,04	70,44 ± 1,41	70,05 ± 1,14	F(3,41)=0,05 N.S.
D17	65,23 ± 1,72	71,27 ± 2,22	69,44 ± 1,01	70,49 ± 1,56	F(3,41)=2,64 p<0,10
Повторные измерения ANOVA	F(2,22)=2,71 p<0,10	F(2,20)=1,37 N.S.	F(2,20)=1,07 N.S.	F(2,20)=2,03 N.S.

Интерпретация: эти три образца не дают возможности продемонстрировать модификацию антиоксидантной активности цельной крови между группами крыс. Исследование на эритроцитах, в дополнение к исследованию цельной крови, дало бы возможность установить антиоксидантную активность плазмы и получить более точную информацию об имеющейся антиоксидантной активности.

Между образцами D0 и D17 двусторонний критерий Стьюдента показал значительное увеличение времени полугемолиза у крыс группы PP50 (t=2,57, p=0,026) (таблица 12).

Таблица 12 Время полугемолиза в цельной крови (мин) между образцами в D0 и на D17 (среднее ± SEM)
	BC (n=12	HSC (n=11)	PP25 (n=11)	PP50 (n=12)	Факторные измерения ANOVA
D0	67,28 ± 0,85	68,14 ± 1,08	70,86 ± 1,56	68,26 ± 0,88	F(3,41)=1,92 N.S.
D17	65,23 ± 1,72	71,27 ± 2,22	69,44 ± 1,01	70,75 ± 1,45	F(3,41)=2,81 p<0,10
Двусторонний критерий Стьюдента	t=1,05 N.S.	t=1,52 N.S.	t=1,36 N.S.	t=2,57 N.S.	-

Интерпретация: Обработка полифенолами в концентрации 50 мг/кг дает возможность увеличить время полугемолиза в цельной крови между D0 и D17, что является результатом более эффективной антиоксидантной активности. В этих условиях обработки (доза, длительность) и исследования (на цельной крови), этим способом было обнаружено только действие полифенолов, вводимых в концентрации 50 мг/кг.

Адаптация к исследованию выработки оборонительного условного рефлекса на вызывающий отвращение световой стимул

Комментарий: период адаптации к ALSAT проводили на D15, день перед тепловым ударом.

Манипуляторная активность в отношении рычага

В конце 10-минутного привыкания к этому тесту факторные измерения ANOVA показали, что общее число нажатий на два рычага крысами различных групп было статистически эквивалентным (таблица 13; Фигура 12).

Таблица 13 Общее число нажатий на два рычага во время периода нарастающей адаптации к тесту (среднее ± SEM)
	BC (n=16)	HSC (n=16)	PP25 (n=16)	PP50 (n=15)
LA + LI	30,06 ± 4,20	23,06 ± 3,14	25,81 ± 3,92	24,40 ± 3,38
Факторные измерения ANOVA	F(3,59)=0,86 N.S.

Интерпретация: до теплового удара, крысы различных групп демонстрировали одинаковую манипуляторную активность.

Различие между двумя рычагами

Для того чтобы оценить различие между активным и неактивным рычагами, только нажатия во время световой фазы были приняты во внимание. Только крысы, нажавшие каждый рычаг по меньшей мере один раз, были приняты во внимание в статистическом анализе.

На протяжении 10 минут привыкания к тесту ALSAT двусторонний критерий Стьюдента показал, что крысы из четырех испытуемых групп значимо различали активный рычаг и неактивный рычаг (таблица 14; Фигура 13).

Таблица 14 Различие между активным и неактивным рычагом во время периода привыкания к тесту (среднее ± SEM)
Группы	BC (n=16)	HSC (n=16)	PP25 (n=16)	PP50 (n=15)
LA	6,63 ± 0,79	5,76 ± 0,70	6,25 ± 0,57	6,20 ± 0,61
LI	4,63 ± 0,46	3,56 ± 0,51	3,88 ± 0,55	3,73 ± 0,45
Значимость двустороннего критерия Стьюдента	t=2,58 p<0,05	t=2,48 p<0,05	t=3,68 p<0,01	t=3,95 p<0,01

Интерпретация: до теплового удара крысы всех групп различали активный рычаг и неактивный рычаг.

Тест формирования оборонительного условного рефлекса на вызывающий отвращение световой стимул

ALSAT проводили на D19, через три дня после теплового удара.

Общее число нажатий на два рычага

В конце 20 минут проведения испытания факторные измерения ANOVA показали, что общее число нажатий на два рычага крысами различных групп было статистически эквивалентным (таблица 15, Фигура 14).

Таблица 15 Общее число нажатий на два рычага во время испытания (среднее ± SEM)
	BC (n=16)	HSC (n=15)	PP25 (n=15)	PP50 (n=15)
LA + LI	36,94 ± 7,41	30,00 ± 5,39	37,47 ± 4,31	38,40 ± 6,61
Факторные измерения ANOVA	F(3,57)=0,39 N.S.

Интерпретация: после теплового удара крысы различных групп демонстрировали одинаковую манипуляторную активность.

Различие между двумя рычагами

Для оценки различия между активным и неактивным рычагами только нажатия во время световой фазы были приняты во внимание. Только крысы, нажавшие каждый рычаг по меньшей мере один раз, были приняты во внимание в статистическом анализе.

В течение 20 минут испытания, двусторонний критерий Стьюдента показал, что крысы в группах BC, PP25 и PP50 в значительной степени различали активный рычаг и неактивный рычаг, тогда как крысы из группы HSC не демонстрировали какого-либо значимого различия (таблица 16; Фигура 15).

Таблица 16 Различие между активным и неактивным рычагом в течение 20 минутной экспериментальной сессии (среднее ± SEM)
Группы	BC (n=15)	HSC (n=14)	PP25 (n=14)	PP50 (n=15)
LA	10,40 ± 1,67	7,93 ± 1,23	9,71 ± 1,00	10,93 ± 1,53
LI	6,13 ± 0,81	6,43 ± 1,00	5,64 ± 0,87	5,27 ± 0,75
Значимость двустороннего критерия Стьюдента	t=3,37 p<0,01	t=1,59 N.S.	t=3,55 p<0,01	t=5,82 p<0,0001

Интерпретация: после теплового удара, только крысы из группы HSC нажимали на два рычага эквивалентным образом и, следовательно, больше не демонстрировали какого-либо различия двух рычагов. Крысы, которые подвергались тепловому воздействию и получали полифенолы, продолжали различать активный рычаг и неактивный рычаг.

Испытание в водном лабиринте Морриса

Испытание в водном лабиринте Морриса проводили на D20 и D21, через 4 и 5 дней после теплового удара.

В отношения испытаний 3, 4 и 5, среднего испытаний 3, 4 и 5 и повтора факторные измерения ANOVA не показали значительного различия в пределах времени задержки до достижения зоны платформы в четырех группах крыс (таблица 16).

Между средним испытаний 3, 4 и 5 и повтора двусторонний критерий Стьюдента показал значительное увеличение времени задержки до достижения зоны платформы для крыс в группе HSC. Наблюдалось значительное уменьшение времени задержки до достижения зоны платформы у крыс в группе PP50 и стабильность у крыс групп BC и PP25 (таблица 17, Фигура 16).

Таблица 17 Время задержки (с) до достижения зоны платформы (среднее ± SEM)
	BC (n=16)	HSC (n=15)	PP25 (n=15)	PP50 (n=15)	Факторные измерения ANOVA
Испытание 3	10,56 ± 1,96	7,87 ± 1,20	7,93 ± 0,85	10,33 ± 2,06	F(3,57)=0,84 N.S.
Испытание 4	6,44 ± 0,71	8,47 ± 1,21	6,67 ± 1,01	9,87 ± 1,75	F(3,57)=1,76 N.S.
Испытание 5	7,75 ± 1,29	6,00 ± 0,44	6,27 ± 1,21	8,07 ± 1,16	F(3,57)=0,91 N.S.
Повторные измерения ANOVA	F(2,30)=2,86 p<0,10	F(2,28)=2,03 N.S.	F(2,28)=0,79 N.S.	F(2,28)=0,48 N.S.	-
Среднее испытаний 3, 4 и 5 (среднее 3, 4, 5)	8,25 ± 0,98	7,44 ± 0,70	6,96 ± 0,66	9,42 ± 0,95	F(3,57)=1,62 N.S.
Повторное испытание	11,50 ± 2,09	15,73 ± 4,02	8,53 ± 2,70	7,00 ± 1,09	F(3,57)=2,04 N.S.
Двусторонний критерий Стьюдента Среднее 3, 4, 5 vs повторное испытание	t=1,53 N.S.	t=2,37 p<0,05	t=0,56 N.S.	t=2,18 p<0,05	-

Интерпретация: группа, которая подвергалась тепловому воздействию и не получала обработки, показала нарушение долговременной памяти, тогда как группы, получившие обработку полифенолами, не демонстрировали нарушения памяти. Крысы из группы, обработанной 50 мг/кг полифенолов, даже улучшили свои показатели в повторном испытании.

4.4 Заключение

Результаты, представленные выше, показывают, что введение, профилактическим образом, полифенолов побочных продуктов пивоварения, в дозах 25 и 50 мг/кг/д в течение 3 недель, демонстрирует защитные эффекты против когнитивных нарушений у крыс, подвергавшихся тепловому удару.

Пример 5: Исследование активности экстракта, богатого полифенолами, на сохранение эпидермальных и дермальных структур эксплантатов кожи человека

5.1 Цель

Целью исследования, представленного в этом примере, было исследование потенциальных активностей различных концентраций полифенолов, полученных в результате пивоваренного производства, в композиции или включенных в культуральную среду, на сохранение эпидермальных и дермальных структуры эксплантатов кожи человека.

Активности оценивали посредством гистологической оценки общей морфологии кожи после окрашивания трихромом по Массону, дополненной (в сериях экспериментов, представляющих особый интерес) визуализацией GAG и с иммуномечением коллагена III типа и IV типа и ламинина-5.

5.2 Материалы и методы

Тестируемый продукт

Тестируемый продукт представлял собой богатый полифенолами экстракт, полученный, как описано в примере 2, приведенном выше. Его тестировали путем местного нанесения, его включали в гидроцерин (основу для приготовленных по рецепту препаратов) в концентрации 0,25%, 0,50%, 0,75% и 1,00%. Он также был протестирован при включении в культуральную среду, в пропорции 0,025%, 0,050%, 0,075% и 0,100%. Два других продукта тестировали в качестве точек сравнения: положительный контроль, содержащий ретинол (Retin-Ox+ Nuit, RoC) и эксципиент (гидроцерин).

Модель ex vivo

Во время обработки, эксплантаты получали из остатков абдоминальной пластической хирургии у женщины европеоидной расы в возрасте 44 лет. Удаляли жировую ткань, а затем эксплантаты приблизительно 10 мм в диаметре получали с использованием циркулярного хирургического ножа. Затем эксплантаты сохраняли в обычных условиях для клеточной культуры в течение 10 дней.

Эксплантаты делили на 15 серий по 5 эксплантатов и одну контрольную серии по 3 эксплантата, в соответствии с приведенным ниже распределением:

Таблица 18
Серия		Количество эксплантатов
T0	Пластическая хирургия, контроль	3 эксплантата
T	Необработанный контроль	6 эксплантатов
R	Положительный контроль (Retin-Ox+ Nuit)	6 эксплантатов
E	Эксципиент (гидроцерин)	6 эксплантатов
P1T	Местное нанесение 0,25% PPH-BK	6 эксплантатов
P2T	Местное нанесение 0,50% PPH-BK	6 эксплантатов
P3T	Местное нанесение 0,75% PPH-BK	6 эксплантатов
P4T	Местное нанесение 1,00% PPH-BK	6 эксплантатов
P1M	PPH-BK в среде в концентрации 0,025%	6 эксплантатов
P2M	PPH-BK в среде в концентрации 0,050%	6 эксплантатов
P3M	PPH-BK в среде в концентрации 0,075%	6 эксплантатов
P4M	PPH-BK в среде в концентрации 0,1%	6 эксплантатов
P1TM	P1T и P1M	6 эксплантатов
P2TM	P2T и P2M	6 эксплантатов
P3TM	P3T и P3M	6 эксплантатов
P4TM	P4T и P4M	6 эксплантатов

Продукты, тестируемые местно, наносили на эксплантаты в пропорции 2 мг на эксплантат (1 мг для положительного контроля) в D0, D2, D4, D6 и D8. Продукты, тестируемые в культуральной среде, были включены в нее в указанных концентрациях. Половину культуральной среды обновляли на D2, D4, D6 и D8.

В момент времени T0, три эксплантата контрольной серии удаляли и сразу же разрезали пополам. Одну половину фиксировали в стандартном растворе Боуина, другую половину замораживали при -80°C. На D6 и D10, эту операцию повторяли для трех эксплантатов каждой серии.

Через 48 часов фиксации в стандартном растворе Боуина, образцы дегидрировали и заключали в парафин, затем помещали в блоки, используя устройство для заливки образцов, для того, чтобы была возможность сделать срезы. Делали срезы 5 мкм и прикрепляли к предметным стеклам с целью проведения процедур окрашивания.

Срезы толщиной 7 мкм делали с замороженных образцов, а затем прикрепляли к силанизированным предметным стеклам для проведения процедур иммуномечения.

Окрашивание - иммуноокрашивание

Выживаемость клетки и общую морфологию наблюдали на срезах, окрашенных трихромом по Массону. Это окрашивание состоит в погружении срезов в последовательные ванны с красителями, таким образом, чтобы специфически окрасить определенные структуры (ядра черным, цитоплазму клетки розовым, коллаген зеленым), что дает возможность облегчить идентификацию этих структур во время наблюдения под микроскопом.

Глюкозаминогликаны (GAG) наблюдали на срезах, окрашенных альциановым синим-PAS. GAG представляют собой сложные полисахариды, обнаруженные в большом количестве на поверхности клеток, и составляют важный элемент внеклеточных матриксов. Нейтральные GAG, близкие к дермально-эпидермальному соединению (DEJ) являются резервуарами факторов роста; кислые GAG, локализованные в эпидермисе и сосочковом слое дермы, в основном состоят из гиалуроновой кислоты, вовлеченной в гидратацию кожи. In vivo, GAG участвуют в эластичности и гидратации кожи. Окрашивание альциановым синим-PAS дает возможность продемонстрировать экспрессию нейтральных GAG вдоль DEJ, в форме пурпурно-розовой полосы.

Иммуномечение коллагена III и иммуномечение коллагена IV проводили на замороженных срезах. Различные типы коллагена являются основными элементами внеклеточных матриксов. Коллаген III является компонентом фибриллярной дермы, а коллаген IV является компонентом DEJ. Ламинин-5 играет важную роль в адгезии кератиноцитов к базальной мембране путем участия в образовании якорных комплексов. In vivo, они участвуют в тонусе и механической прочности кожи.

Иммуномечение коллагена III было разработано с DAB, что демонстрирует коричневое окрашивание. Контрастное окрашивание гемалюном Массона (Masson's hemalun) проводили на клеточных ядрах, для того, чтобы они выглядели синими. Иммуномечение коллагена IV и ламинина-5 визуализировали с использованием FITC, флуоресцентной молекулы, которая, при возбуждении, испускает зеленый свет. Контрастное окрашивание пропидия йодидом проводили на клеточных ядрах для того, чтобы они выглядели красными.

Наблюдения под микроскопом

Наблюдения под микроскопом проводили с помощью оптической микроскопии, используя микроскоп с объективом ×40. Фотографии делали цифровой фотокамерой и хранили, используя архивирующее программное обеспечение.

5.3. Результаты и обсуждение

Здесь представлены только наиболее значимые результаты.

Наблюдение под микроскопом

В момент времени D0 общая морфология эксплантатов является нормальной. На D6 морфология необработанных эксплантатов сравнима с морфологией эксплантатов в D0, что является хорошим показателем выживаемости эксплантатов (Фигура 17).

На эксплантаты, обработанные контрольным составом, содержащим ретинол, акантоз (увеличение эпидермальной толщины) является очень отчетливым. На эксплантатах, обработанных эксципиентом, эпидермальные и дермальные структуры близки к тем, которые наблюдаются на необработанных эксплантатах (Фигура 18).

На эксплантаты, обработанные композициями P2T и P2M, эпидермальные акантозы являются отчетливыми, но менее, чем для эксплантатов, обработанных контролем, содержащим ретинол. Для других эксплантатов, эпидермальная структура близка к структуре эксплантатов, обработанных эксципиентом. Что касается коллагеновой сетки в сосочковом слое дермы, по-видимому:

- является очень плотной на эксплантатах в серии P1TM;

- является плотной, в частности вдоль дермально-эпидермального соединения, на эксплантатах серий P2TM и P4TM;

- является достаточно плотной на эксплантатах серий P4T, P2M, P3M, P4M и P3TM;

- близка к наблюдаемой на эксплантатах, обработанных эксципиентом и на эксплантатах серий P2T, P3T и P1M.

Наиболее отчетливые наблюдения были сделаны через 6 дней выживания.

На D10 на необработанных эксплантатах эпидермальная структура является нормальной. Сосочковый слой кожи является более или менее плотным. На эксплантатах, обработанных контрольной композицией, содержащей ретинол, эпидермальный акантоз является очень отчетливым. В сосочковом слое кожи коллаген образует более или менее плотную сеть вдоль дермально-эпидермального соединения. На эксплантатах, обработанных эксципиентом, эпидермальная и дермальная структура близка к структуре, наблюдаемой на необработанных эксплантатах.

На эксплантатах, обработаных композицией P4TM, эпидермис является отчетливо акантозным, но с очень явным явлением непереносимости. Для других тестируемых продуктов, эпидермальная структура близка к структуре эксплантатов, обработанных эксципиентом. Что касается коллагеновой сетки в сосочковом слое дермы, по-видимому:

- является плотной в сосочковом слое дермы на эксплантатах серии P2M;

- является достаточно плотной на эксплантатах, обработанных продуктами P2T, P3T, P4T, P3M и P4TM;

- является более или менее плотной, близкой к таковой, которая наблюдалась на необработанных эксплантатах, с продуктами P1M, P4M, P1TM, P2TM и P3TM.

Все параметры, оцениваемые во время микроскопического наблюдения морфологии, дают возможность выбрать две серии, на которых проводят остальную оценку активности. Эти серии отвечают нескольким требованиям:

- отсутствие токсичности:

* отсутствие непереносимости и клеточных альтераций;

- эффективность:

* увеличение толщины эпидермиса;

* улучшенная плотность коллагеновой сетки в сосочковом слое дермы;

- стоимость;

* низкая концентрация.

Окрашивание GAG

На необработанных эксплантатах, нейтральные GAG довольно умеренно визуализируются вдоль дермально-эпидермального соединения. Они незначительно гиперэкспрессируются на эксплантатах, обработанных положительным контролем.

Местное нанесение продукта PPH-BK в концентрации 0,5% индуцирует незначительную гиперэкспрессию. Включение продукта PPH-BK в концентрации 0,025% в среду для поддержания жизнедеятельности индуцирует явную гиперэкспрессию (Фигура 19).

Эти результаты указывают на то, что продукт PPH-BK, применяемый местно, в концентрации 0,5%, вызывает улучшение одного из параметров, связанных с гидратацией кожи, сравнимое с таковым, вызванным положительным контролем. При включении в среду в концентрации 0,025%, это улучшение значительно больше.

Иммуномечение ламинина-5

На необработанных эксплантатах ламинин-5 отчетливо визуализируется, образуя тонкую полоску фестонов вдоль дермально-эпидермального соединения. Он слегка гиперэкспрессируется на эксплантатах, обработанных положительным контролем.

Местное нанесение продукта PPH-BK в концентрации 0,5% индуцирует незначительную гиперэкспрессию вдоль дермально-эпидермального соединения и отчетливую экспрессию в базальных кератиноцитах. Включение продукта PPH-BK в концентрации 0,025% в среду для поддержания жизнедеятельности вызывает слабую гиперэкспрессию на уровне дермально-эпидермального соединения и базальных кератиноцитов (Фигура 20).

Эти результаты указывают на то, что продукт PPH-BK, применяемый местно в концентрации 0,5%, вызывает повышение экспрессии, которое значительно больше, чем вызванное положительным контролем. При включении в среду в концентрации 0,025%, повышение экспрессии несколько выше, чем наблюдается с контролем.

Иммуномечение коллагена III

На необработанных эксплантатах, коллаген III незначительно визуализируется, образуя не очень плотную сеть в сосочковом слое кожи, вдоль дермально-эпидермального соединения. Он незначительно гиперэкспрессируется на эксплантатах, обработаных положительным контролем.

Местное применение продукта PPH-BK в концентрации 0,5% индуцирует отчетливую гиперэкспрессию. Включение продукта PPH-BK в концентрации 0,025% в среду для поддержания жизнедеятельности, вызывает слабую гиперэкспрессию (Фигура 21).

Эти результаты указывают на то, что продукт PPH-BK, нанесенный местно в концентрации 0,5%, вызывает повышение экспрессии, которое выше, чем индуцированное положительным контролем. При включении в среду в концентрации 0,025%, повышение экспрессии сравнимо с повышением, полученным с контролем.

Иммуномечение коллагена IV

На необработанных эксплантатах коллаген IV отчетливо визуализируется вдоль дермально-эпидермального соединения. Он относительно неоднородный и умеренно присутствует в подлежащем сосочковом слое кожи. Он отчетливо гипреэкспрессируется на эксплантатах, обработанных положительным контролем.

Местное нанесение продукта PPH-BK в концентрации 0,5% вызывает отчетливую гиперэкспрессию, в особенности вдоль дермально-эпидермального соединения. Включение продукта PPH-BK в концентрации 0,025% в среду для поддержания жизнедеятельности вызывает отчетливую гиперэкспрессию, в особенности вдоль дермально-эпидермального соединения (Фигура 22).

Эти результаты указывают на то, что продукт PPH-BK, применяемый местно в концентрации 0,5% или включенный в среду в концентрации 0,025%, вызывает повышение экспрессии, сравнимое с повышением, вызванным положительным контролем.

5.4 Заключение

Результаты суммированы в приведенной ниже таблице.

Таблица 19
Серия опытов	Количество слоев эпидермальных клеток	Морфология эпидермиса	Плотность коллагена
	D6	D10	D6	D10	D6	D10
T	4/5	5/6	OK	OK	+/- плотный	+/- плотный
R	13/14	13/14	отек	Сильный отек	+/- плотный	+/- плотный
E	5/6	4/5	OK	OK	+/- плотный	Не очень плотный
P2T	7/8	3/4	OK	OK	+/- плотный	Достаточно плотный
P3T	5/6	4/5	OK	OK	+/- плотный	Достаточно плотный
P4T	7/8	4/5	OK	OK	Достаточно плотный	Достаточно плотный
P1M	5/6	5/6	OK	OK	+/- плотный	+/- плотный
P2M	4/5	4/5	OK	OK	Достаточно плотный	Плотный
P3M	5/6	4/5	OK	OK	Достаточно плотный	Достаточно плотный
P4M	4/5	4/5	OK	OK	Достаточно плотный	+/
P1TM	5/5	4/5	OK	OK	Очень плотный	+/
P2TM	5/6	4/5	OK	OK	Плотный	+/
P3TM	5/6	4/5	Достаточно хорошая	Достаточно хорошая	Достаточно плотный	+/
P4TM	5/6	7/8	Измененная	Сильно измененная	Достаточно плотный	Достаточно плотный

Эти результаты показывают, что используя эти два способа тестируемого применения (местное применение или включение в среду), продукт вызывает повышение экспрессии нескольких параметров, связанных с гидратацией, эластичностью и молодостью кожи, от 6 дней и далее. Более того, воздействие на эти параметры сравнимо или превосходит таковые эталонного крема, содержащего ретинол.

Это указывает на то, что полифенолы, экстрагированные в результате процесса пивоварения, могут быть использованы в косметической промышленности по меньшей мере в следующих применениях:

- антиоксидантном,

- противовозрастном (увеличение толщины эпидермиса),

- увлажнении.

Пример 6: Композиция полученных полифенольных экстрактов

6.1 Выпаривание образцов

Цель исследований

- Провести наблюдение характера изменений продуктов, подвергнутых выпариванию, и определить задержку кипения.

- Определить коэффициенты обмена на различных стадиях концентрирования.

- Провести наблюдение их способности к концентрированию и прогнозировать качество конденсатов.

Способы проведения

Исследования проводили серийно, на промышленном испарителе с ниспадающей пленкой при незначительно пониженном давлении (P=0,25 бар абс., Teq=65°C).

Испытания проводили в трех различных сериях опытов: A, B, C. Каждая серия опытов представляет объем V=100 л.

Характеристики выходящего вещества

- сухое вещество неочищенного продукта 1,5%.

- описание черного с сильным запахом спирта.

Характер изменений во время выпаривания

Серия A:

- Начало концентрирования: объем контейнера = 100 л.

- Окончание концентрирования: объем в испарителе = 15 л.

- Фактор концентрирования по объему, следовательно, составляет 6,6.

- Время нахождения в испарителе: 2 ч.

- В конце испытания наблюдается осаждение сверху стенок испарителя.

Однако указанный испаритель может быть очень хорошо очищен раствором спирта.

Серия B:

- Начало концентрирования: объем контейнера = 95 л.

- Окончание концентрирования: объем в испарителе = 25 л.

- Фактор концентрирования по полученному объему, следовательно, составляет 3,8.

- Время нахождения в испарителе: 1 ч 40.

- В конце этого испытания отмечено, что отсутствует осаждение сверху стенок испарителя. Концентрат все еще имеет запах спирта.

Серия C:

- Начало концентрирования: объем контейнера = 100 л.

- Окончание концентрирования: объем в испарителе = 30 л.

- Фактор концентрирования по полученному объему, следовательно, составляет 3,3.

- Время нахождения в испарителе: 1 ч 45.

- В конце этого испытания отмечено, что отсутствует осаждение сверху стенок испарителя. Концентрат все еще имеет запах спирта.

6.2 Анализ образцов

Образцы, полученные выпариванием, впоследствии были лиофилизированы и проанализированы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Результаты представлены в приведенных ниже таблицах, а также на Фигуре 23.

Таблица 20 Анализ лиофилизированных образцов
		Порошок A	Порошок B	Порошок C
мг/г	Железо	0	0	0
	Медь	0,003	0,003	0,0005
	Кальций	2,848	1,094	1,227
	Магний	0,428	0,231	0,263
	Калий	0,436	0	0
	Натрий	3,469	0,585	0,687
	Цинк	0,011	0,009	0,007
	Хлориды (Cl)	5,73	0,609	0,4
	Сульфаты	1,555	0,557	0,801
	Нитраты	0	0	0
	Свободная щавелевая кислота	1,687	0	0,233
	Свинец	0	0	0
	Кадмий	0	0	0
	Хром	0	0	0
	Мышьяк	0	0	0
	Алюминий	0,002	0,002	0,002
	Нитрид титана	0	0	0
	Кобальт	0	0	0
	Ртуть	0	0	0
	Марганец	0	0	0
	Фосфор	1,73	1,66	1,8
Никель	0	0	0
	Всего минералов, мг/г	17,899	4,75	5,4205
	Всего минералов, %	1,7899	0,475	0,54205
	Всего сахаров, мг/г	0,47	0,33	0,33
Всего сахаров, %	0,047	0,033	0,033
	% Всего белков/WM	1,1	1,8	1,8
Содержание влаги, %	1	2,1	1,8
	Полифенолы, мг/г	697	735	865
EBC метод % Полифенолов EBC	69,7	73,5	86,5
	Полифенолы, мг/г Эквивалент галловой кислоты	320	338	399
	Полифенолы Фолин-Чокальтеу, мг/г	478	529	483
Эквивалент галловой кислоты, %	47,8	52,9	48,3
	DDPH антиоксидант Порошок,мг/г, полифенолов (EBC)	3796	3523	3244
После гидролиза	Фруктоза (масс./об.	0	0	0
	Глюкоза (масс./об.)	0	0	0
	Сахароза (масс./об.)	0	0	0
	Мальтоза (масс./об.)	0	0	0
Мальтотриоза (масс./об.)	0	0	0

Таблица 21 Композиции флаванола и фенолокислоты (% по массе)
	A	B	C
Катехин	38,75	30,77	27,68
Эпикатехин	34,62	22,70	24,83
Тирозол	11,79	11,13	8,86
Феруловая кислота	14,30	12,74	13,10
Суммарный % флаванолов + феруловая кислота	99,46	77,34	74,46

Таблица 22 Баланс масс
	A	B	C
Всего флаванолов и фенолокислот	99,46	77,34	74,46
Всего белков	1,10	1,80	1,80
Минералы	1,79	0,48	0,54
Сахара	0,05	0,03	0,03
Содержание влаги	1,00	2,10	1,80
Всего	103,40	81,75	78,64

ССЫЛКИ

Blokland A, Geraerts E, Been M. A detailed analysis of rats' spatial memory in a probe trial of a Morris task. Behavioral Brain Research. 2004, 154(1): 71-5.

Brand-Williams W., Cuvelier M. E. and Berset C., Use of a Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity. Lebensm. Wiss. Technol., 1995, 25(1), 25-30.

Brouillard R., George F. and Fougerousse A., Polyphenols produced during red wine ageing. BioFactors, 1997, 6(4), 403-410.

Canini F, Buguet A, Bourdon L. Inhibition of different types of nitric oxide synthase: effect on thermoregulation in the rat exposed to high ambient temperature. Neurosciences Letters, 2001, 316(1): 45-9.

Folin O. and Ciocalteu V., On Tyrosine and Tryptophane Determinations in Proteins. J. Biol. Chem., 1927, 73(2), 627-650.

McMurrough I., Roche G. P. and Cleary K. G., Phenolic acids in beers and worts. J. Inst. Brew., 1984, 90(3), 181-187.

Messaoudi M, Tricoire A, Lalonde R, Canini F, Minn A. Effects of MPTP on lever-pressing for light extinction in rats. European Journal of Pharmacology, 1996, 299: 17-20.

Messaoudi M, Desor D, Grasmuck V, Joyeux M, Langlois A, Roman FJ. Behavioral evaluation of visceral pain in a rat model of colonic inflammation. Neuroreport, 1999, 10:1137-1141.

Morris RG, Garrud P, Rawlins JN, O'Keefe J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature, 1982, 297(5868): 681-3.

Prost, M. Process for the determination by means of free radicals on the antioxidant properties of a living organism or potentially aggressive agents. US Patent, 1992, 5, 335, 850.

Tubaro F., Rapuzz i P. and Ursini A. F., Kinetic analysis of antioxidant capacity of wine BioFactors, 1999, 9(1), 37-47.

Yang CY, Lin MT. Oxidative stress in rats with heatstroke-induced cerebral ischemia. Stroke, 2002, 33: 790-794.

1. Способ получения экстракта полифенолов, образованных в результате процесса пивоварения, включающий следующие стадии:
(i) контактирование частично очищенного пива со смолой, которая адсорбирует полифенолы;
(ii) десорбцию полифенолов, адсорбированных на смоле, контактировавшей с частично очищенным пивом;
(iii) адсорбцию полифенолов на вторую смолу, отличную от первой, причем указанная вторая смола является гидрофобной и неионной; и
(iv) десорбцию полифенолов, адсорбированных на второй смоле, с использованием органического растворителя,
причем способ осуществляют без использования этилацетата.

2. Способ по п. 1, в котором по меньшей мере 65% доступных полифенолов собирают в конце стадии (iv).

3. Способ по п. 1, в котором продукт десорбции содержит по меньшей мере 0,85 г полифенолов на грамм сухого материала.

4. Способ по п. 1, включающий следующие стадии:
(i) частично профильтрованное пиво контактирует с поперечно сшитым поливинилпирролидоном (PVPP);
(ii) PVPP промывают щелочным раствором;
(iii) PVPP промывающий раствор приводят в контакт со второй смолой, которая адсорбирует полифенолы, причем указанная вторая смола является гидрофобной и неионной;
(iv) полифенолы подвергают десорбции из второй смолы;
(v) полифенолы концентрируют.

5. Способ по п. 4, в котором на стадии (ii) PVPP подвергают
двум промываниям гидроксидом натрия и в котором только раствор гидроксида натрия из первого промывания используют на стадии (iii).

6. Способ по п. 4, в котором щелочной раствор, используемый для промывания PVPP, нейтрализуют или подкисляют перед проведением стадии (iii).

7. Способ по п. 4, в котором вторая используемая смола представляет собой гидрофобную и неионную ароматическую адсорбирующую полимерную смолу.

8. Способ по п. 4, в котором вторую смолу промывают водным раствором между стадиями (iii) и (iv).

9. Способ получения экстракта полифенолов, образованных в результате процесса пивоварения, включающий следующие стадии:
(i) контактирование частично очищенного пива с гидрофобной и неионной смолой, которая адсорбирует полифенолы; и
(ii) десорбцию полифенолов, адсорбированных на смоле, использованной на стадии (i), с использованием органического растворителя,
причем продукт десорбции содержит по меньшей мере 0,85 г полифенолов на грамм сухого материала.

10. Способ по п. 9, в котором частично профильтрованное пиво контактирует со смолой, которая адсорбирует полифенолы и дает возможность для их десорбции органическим растворителем, причем указанная смола является гидрофобной и неионной ароматической адсорбирующей полимерной смолой.

11. Экстракт полифенолов, полученный посредством способа по любому из пп. 1-10 и содержащий катехин, эпикатехин, тирозол и феруловую кислоту.

12. Косметический продукт, содержащий экстракт полифенолов по п. 11 в эффективном количестве.

13. Функциональный продукт питания, содержащий экстракт полифенолов по п. 11 в эффективном количестве.

14. Добавка к пище, содержащая экстракт полифенолов по п. 11 в эффективном количестве.

15. Применение косметического продукта по п. 12 для увлажнения кожи и/или предупреждения или замедления ее старения.

16. Применение экстракта полифенолов по п. 11 для получения антиоксидантной композиции.

17. Применение по п. 16 для получения соединения, предназначенного для улучшения уровней когнитивной деятельности индивидуума.

18. Применение по п. 16 для получения антивозрастной композиции.

19. Применение по п. 17 или 18 для ограничения или задержки последствий старения головного мозга.