Биомаркер для отбора пациентов и связанные с ним способы

Группа изобретений относится к медицине, а именно к способу анализа еx-vivo, будет ли больной раком субъект отвечать терапевтически на способ лечения. Для этого от пациента получают биологический образец, выбранный из группы, состоящей из образца общей крови, плазмы или сыворотки. Измеряют уровень IL10 и IFNγ в указанном биологическом образце, причем эти уровни определяются при использовании антител, специфических для IL10 и INFγ, соответственно. Проводят подсчеты соотношения IL10/IFNγ и сравнивают указанное соотношение IL10/IFNγ с пороговым уровнем. Соотношение IL10/IFNγ ниже 4 свидетельствует о том, что пациент будет развивать профилактический или терапевтический ответ на иммуногенную композицию. Группа изобретений относится также к применению IL10 и INFγ в качестве биомаркеров и набору для анализа вышеуказанного способа. Использование данного способа позволяет прогнозировать чувствительность больного раком к терапевтическому лечению, а также получить алгоритм для модификации лечения для улучшения ответа пациента на лечение. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

 

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и, в частности, к иммунотерапии пациентов против заболеваний, вызванных инфекцией или различными видами рака. Более конкретно, изобретение относится к способам для прогнозирования, является или не является ли пациент чувствительным к развитию профилактического или терапевтического ответа, предпочтительно иммунного ответа, после такой иммунотерапии. Настоящее изобретение относится к способам и композициям для повышения коэффициента выживания пациентов, которых подвергают лечению с помощью иммуногенной композиции, в частности терапевтической вакцины.

Традиционные методики вакцинации, вовлекающие введение в систему животного антигена (например, пептидов, белков), который может индуцировать иммунный ответ и, таким образом, защищать указанное животное, например, от инфекции, являются известными в течение многих лет. Такие методики дополнительно включают разработку как живых, так и инактивированных вакцин. Живые вакцины типично представляют собой аттенуированные непатогенные варианты инфекционного агента, которые являются способными стимулировать иммунный ответ, направленный против патогенного варианта инфекционного агента.

Многочисленные исследовательские группы также исследовали применение вакцин в качестве потенциального терапевтического средства при различных видах рака. Этот тип стратегии вакцинации обычно называется иммунотерапией.

В последние годы были достигнуты успехи в разработке рекомбинантных вакцин, в частности рекомбинантных живых вакцин, в которых чужеродные антигены, представляющие интерес, кодируются и экспрессируются из вектора. Среди них векторы на основе рекомбинантных вирусов были продемонстрированы как многообещающие и такие, которые играют важную роль в разработке вакцин. Многие вирусы были исследованы на их способность экспрессировать белки из чужеродных патогенов или опухолевой ткани, а также индуцировать специфические иммунологические ответы против этих антигенов in vivo. В общем случае, такие основанные на генах вакцины могут стимулировать мощные гуморальный и клеточный иммунные ответы, вирусные векторы могут также представлять собой эффективную стратегию как для доставки генов, кодирующих антиген, так и для того, чтобы способствовать и усиливать презентацию антигена. Для того чтобы использоваться в качестве носителя вакцины, идеальный вирусный вектор должен быть безопасным и позволять осуществлять эффективную презентацию необходимых специфических для патогена антигенов иммунной системе. Кроме того, векторная система должна соответствовать критерию, который позволяет осуществлять ее воспроизведение на промышленной основе. Таким образом, на сегодняшний день было получено несколько вирусных вакцинных векторов, все они обладают относительными преимуществами и ограничениями в зависимости от предложенного применения (для обзора рекомбинантных вирусных вакцин смотри, например, Harrop и Carroll, 2006, Front Biosci., 11, 804-817; Yokoyama и др., 1997, J Vet Med Sci., 59, 311-322).

В соответствии с наблюдением, сделанным в ранние 1990-е, которое заключается в том, что векторы на основе плазмидной ДНК могут непосредственно трансфицировать клетки животных in vivo, значительные усилия исследователей были направлены на разработку методик иммунотерапии, которые основываются на применении ДНК плазмид для индукции иммунного ответа, путем непосредственного введения в животных ДНК, которая кодирует антигены. Такие методики, которые также упоминаются как ДНК вакцинация или ДНК иммунотерапия, сейчас используются для того, чтобы вызвать защитный иммунный ответ в большом количестве моделей болезней. Для обзора ДНК вакцин смотри Reyes-Sandoval и Ertl, 2001 (Current Molecular Medicine, 1, 217-243).

Однако общая проблема в области вакцин представляла собой идентификацию средств для индукции достаточно сильного иммунного ответа у вакцинированных индивидуумов для защиты и/или лечения их от инфекции и заболевания, и, таким образом, продления выживания пациента, имеющего смертельное заболевание, например рак.

Таким образом, например, основное усилие в последние годы было направлено на открытие новых лекарственных соединений, которые действуют путем стимуляции определенных ключевых аспектов иммунной системы и которые будут служить для повышения иммунного ответа, индуцированного вакцинами. Большинство из этих соединений, называемых модификаторами иммунного ответа (IRM) или адъювантами, как выяснилось, оказывают воздействие посредством основных механизмов иммунной системы с помощью Toll-подобных рецепторов (TLR) для индукции биосинтеза различных важных цитокинов (например, интерферонов, интерлейкинов, фактора некроза опухоли и т.д., смотри, например, Schiller и др., 2006, Exp Dermatol., 15, 331-341). Эти соединения были продемонстрированы как такие, которые стимулируют быстрое высвобождение определенных цитокинов, имеющих происхождение от дендритных клеток, моноцитов/макрофагов, а также являются способными стимулировать В-клетки для секреции антител, которые играют важную роль в антивирусной и противоопухолевой активности IRM соединений.

Альтернативно, были предложены стратегии вакцинации, большинство из которых являются основанными на режиме вакцинации "примирования-повторной иммунизации". В соответствии с этими прописями вакцинации "примирования-повторной иммунизации" иммунная система сначала подвергается индукции путем введения пациенту примирующей композиции, а потом подвергается стимуляции путем введения второй композиции для повторной вакцинации (смотри, например, EP 1411974 или US 20030191076).

Кроме того, было продемонстрировано, что в контексте здравоохранения одна обработка может быть эффективной только в специфической группе пациентов. Таким образом, является желательным обеспечить врачей средствами и способами, которые будут позволять им сократить оптимальные персонализированные способы терапии пациента, то есть, назначать правильную терапию правильному пациенту в правильное время для обеспечения более высокого успеха лечения, для мониторинга ответа на такое лечение, для повышения эффективности лекарственного средства и безопасности, для устранения лечения, не являющегося необходимым в случае пациентов, для которых терапия не является приемлемой, для того чтобы уберечь пациента от токсичности, не являющейся необходимой, а также побочных эффектов, для снижения затрат пациентов и страховых агентств на не являющееся необходимым или опасное неэффективное лечение, а также для повышения качества жизни пациентов, в конечном счете, сделав рак контролируемым заболеванием, путем последовательного осуществления анализов в зависимости от необходимости.

В этой связи в литературе предлагаются различные средства и способы, такие, как например:

- Фармакогенетика, которая заключается в исследовании индивидуального ответа на лекарственные средства в качестве функции генетических различий. Эти ответы относятся к тому, как лекарственное средство функционирует у какого-либо данного индивидуума, как оно метаболизируется, его токсичности и необходимым дозировкам. С исследованиями в области генома человека фармакогенетика развилась в фармакогеномику. Фармакогеномика выходит за рамки фармакогенетики и имеет потенциал для обнаружения применений от открытия лекарственного средства, разработки, выявления цели и апробации до клинических испытаний;

- Метаболомика может также применяться в области предсказательной медицины. В отличие от фармакогенетики, которая является ограниченной генетическими факторами, фармакометаболомика является способной предсказать ответ индивидуума на лекарственное средство, основываясь не только на генетических факторах, но также и на негенетических факторах, таких, как другие лекарственные средства в организме пациента, состояние здоровья пациента в данный момент времени и т.д.

- Роль биомаркеров становится все более важной в клинической разработке терапевтических средств. Биомаркер может представлять собой индикатор нормальных биологических процессов, процессов заболевания или фармакологических ответов на терапевтическое вмешательство. Их роль колеблется от разделения популяции пациентов в отношении оказания помощи для идентификации пациентов, которые отвечают на лечение, против пациентов, не отвечающих на лечение, для определения эффективности терапевтического средства. Биомаркеры могут быть ценным средством в принятии лучших решений, которые будут снижать затраты на разработку лекарственного средства и позволят терапевтическим методам достичь правильной популяции пациентов быстрее.

Изобретение обеспечивает материалы и способы для прогнозирования эффективности лечения, вовлекающего введение иммуногенной композиции пациенту (то есть, иммунотерапевтическое лечение) при использовании биологических маркеров (биомаркеров), которые были определены как существенно надежная характеристика, которая коррелирует с желаемым иммунным ответом. Биомаркеры являются присутствующими в биологических образцах, полученных от пациента перед лечением с помощью указанной иммуногенной композиции. Способность прогнозирования клинического выхода лечения перед его началом позволит клиническим врачам и пациентам идентифицировать неэффективную терапию, принимать основанные на достоверной информации решения, относящиеся к курсу лечения, включая, стоит ли отказаться от или позволить осуществлять альтернативное терапевтическое вмешательство.

В настоящее время заявитель идентифицировал новое средство и стратегию вакцинации. В частности, настоящее изобретение относится к применению соотношения интерлейкин-10/интерферон гамма (IL10/IFNγ) в качестве биомаркера для прогнозирования, будет ли или нет пациент чувствительным к развитию профилактического или терапевтического ответа, предпочтительно иммунного ответа, путем введения иммуногенной композиции. Альтеранативно, соотношение интерферон гамма/интерлейкин-10 (IFNγ/IL10) может использоваться в качестве биомаркера в соответствии с настоящим изобретением, однако в этом случае выводы будут модифицированы.

Van den Boogaardt и др., 2006 (Transplantation, 82, 844-848), показали, что соотношение интерферон гамма/интерлейкин-10 (IFNγ/IL10) представляет собой ценное средство для различения между пациентами, отторгающими трансплантат, и пациентами, не отторгающими его, при пересадках почки.

Jamal и др., 2007 (Tuberculosis, 87, 279-287), продемонстрировали, что при легочной и внелегочной форме туберкулеза существует непосредственная взаимосвязь между соотношением интерферон гамма/интерлейкин-10 (IFNγ/IL10) и классификацией тяжести заболевания.

Подобно этому, Gomes-Silva и др., 2007, (Clinical and Experimental Immunology, 149, 440-444), показали, что высокий уровень IFNγ и низкий уровень IL10 ассоциируются с тяжестью лейшманиоза слизистой оболочки.

В соответствии с первым воплощением настоящее изобретение относится к способу лечения пациента от заболевания человека путем введения иммуногенной композиции, где указанный пациент является выбранным из популяции пациентов, которая состоит из пациентов, которые имеют низкое соотношение IL10/IFNγ.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу лечения пациента от заболевания человека путем введения иммуногенной композиции, где указанный способ включает следующие этапы:

- отбора одного пациента из популяции пациентов, которая состоит из пациентов, имеющих низкое соотношение IL10/IFNγ,

- введения указанному выбранному пациенту указанной иммуногенной композиции.

В соответствии с другим воплощением настоящее изобретение относится к способу прогнозирования, является ли или нет пациент чувствительным к развитию профилактического или терапевтического ответа, предпочтительно иммунного ответа, путем введения иммуногенной композиции, где указанный способ включает следующие этапы:

- получения образца крови от указанного пациента;

- измерения уровней IL10 и IFNγ в указанном образце крови, и

- подсчета соотношения IL10/IFNγ, где низкое соотношение IL10/IFNγ свидетельствует о том, что пациент прогнозируется как такой, который имеет повышенную чувствительность к развитию профилактического или терапевтического ответа, предпочтительно иммунного ответа.

В соответствии с другим воплощением настоящее изобретение относится к способу отбора пациента, чувствительного к развитию профилактического или терапевтического ответа, предпочтительно иммунного ответа, путем введения иммуногенной композиции, при этом указанный способ включает следующие этапы:

- получения образца крови от указанного пациента;

- измерения уровней IL10 и IFNγ в указанном образце крови, и

- подсчета соотношения IL10/IFNγ, где низкое соотношение IL10/IFNγ свидетельствует о том, что пациент имеет повышенную чувствительность к развитию профилактического или терапевтического ответа, предпочтительно иммунного ответа.

В соответствии с другим воплощением настоящее изобретение относится к способу прогнозирования, будет ли или нет пациент чувствительным к тому, чтобы позитивно отвечать на лечение, включающее введение иммуногенной композиции, при этом указанный способ включает следующие этапы:

- получения образца крови от указанного пациента;

- измерения уровней IL10 и IFNγ в указанном образце крови, и

- подсчета соотношения IL10/IFNγ, где низкое соотношение IL10/IFNγ свидетельствует о том, что пациент прогнозируется как такой, который имеет повышенную чувствительность к развитию профилактического или терапевтического ответа, предпочтительно иммунного ответа.

В соответствии с другим воплощением настоящее изобретение относится к способу отбора пациента, чувствительного к тому, чтобы позитивно отвечать на лечение, включающее введение иммуногенной композиции, при этом указанный способ включает следующие этапы:

- получения образца крови от указанного пациента;

- измерения уровней IL10 и IFNγ в указанном образце крови, и

- подсчета соотношения IL10/IFNγ, где низкое соотношение IL10/IFNγ свидетельствует о том, что пациент имеет повышенную чувствительность к развитию профилактического или терапевтического ответа, предпочтительно иммунного ответа.

В соответствии с другим воплощением настоящее изобретение относится к ex-vivo способу анализа, будет ли пациент отвечать терапевтически на способ лечения, включающий введение иммуногенной композиции, где указанный способ анализа включает этапы:

- получения образца крови от указанного пациента;

- измерения уровней IL10 и IFNγ в указанном образце крови, и

- подсчета соотношения IL10/IFNγ, где низкое соотношение IL10/IFNγ свидетельствует о том, что пациент будет развивать профилактический или терапевтический ответ, предпочтительно иммунный ответ, на иммуногенную композицию.

В соответствии с другим воплощением настоящее изобретение относится к ex-vivo способу анализа, будет ли пациент отвечать терапевтически на способ лечения рака, путем введения иммуногенной композиции, где указанный способ анализа включает этапы:

- получения образца крови от указанного пациента;

- измерения уровней IL10 и IFNγ в указанном образце крови, и

- подсчета соотношения IL10/IFNγ, где низкое соотношение IL10/IFNγ свидетельствует о том, что пациент будет отвечать терапевтически на способ лечения рака.

Настоящее изобретение дополнительно относится к ex vivo способу лечения, включающему введение иммуногенной композиции, где способ анализа включает этап измерения уровней IL10 и INFγ в биологическом образце, в частности образце крови, полученном от пациента, подсчет соотношения IL10/IFNγ, где низкое соотношение IL10/IFNγ свидетельствует о том, что пациент будет развивать профилактический или терапевтический ответ, в частности иммунный ответ, на иммуногенную композицию.

В соответствии с другим воплощением настоящее изобретение относится к способу индукции иммунного ответа (то есть, повышенного иммунного ответа) у пациента для лечения заболевания человека путем введения иммуногенной композиции, где указанный пациент является выбранным из популяции пациентов, которая состоит из пациентов, имеющих низкое соотношение IL10/IFNγ.

В соответствии с другим воплощением настоящее изобретение относится к способу индукции иммунного ответа, по крайней мере, на один антиген (то есть, повышенного иммунного ответа) у пациента для лечения заболевания человека путем введения иммуногенной композиции, где указанный пациент является выбранным из популяции пациентов, которая состоит из пациентов, имеющих низкое соотношение IL10/IFNγ.

В соответствии с другим воплощением настоящее изобретение относится к способу индукции иммунного ответа (то есть, повышенного иммунного ответа) у пациента для лечения заболевания человека путем введения иммуногенной композиции, где указанный пациент является выбранным из популяции пациентов, которая состоит из пациентов, имеющих низкое соотношение IL10/IFNγ, и где указанный повышенный иммунный ответ представляет собой врожденный иммунный ответ. Врожденный иммунный является исходной иммунной защитой организма от патогенов и вызывается разнообразием клеток, включая клетки, презентирующие антиген, или "АРС". Эти клетки экспрессируют поверхностные и цитоплазматические рецепторы, которые узнают молекулы, имеющее чужеродное происхождение (например, бактериальные и вирусные нуклеиновые кислоты, белки, углеводы). При определении таких сигналов дендритные клетки и макрофаги вызывают защитный ответ, который включает высвобождение цитокинов (включая интерфероны, TNF-альфа и IL-12) и хемокинов, которые служат для привлечения клеток, таких, как незрелые дендритные клетки, макрофаги, NK клетки и гранулоциты, к сайту заражения. Врожденный иммунный ответ, таким образом, обеспечивает неспецифическую защиту, в то время как организм генерирует адаптивный ответ.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу индукции иммунного ответа (то есть, повышенного иммунного ответа) у пациента для лечения заболевания человека путем введения иммуногенной композиции, где указанный способ включает следующие этапы:

- отбора одного пациента из популяции пациентов, которая состоит из пациентов, имеющих низкое соотношение IL10/IFNγ,

- введения указанному выбранному пациенту указанной иммуногенной композиции.

В соответствии с другим воплощением настоящее изобретение относится к способу индукции иммунного ответа, по крайней мере, на один антиген (то есть, повышенного иммунного ответа) у пациента для лечения заболевания человека путем введения иммуногенной композиции, где указанный способ включает следующие этапы:

- отбора одного пациента из популяции пациентов, которая состоит из пациентов, имеющих низкое соотношение IL10/IFNγ,

- введения указанному выбранному пациенту указанной иммуногенной композиции.

В соответствии с другим воплощением настоящее изобретение относится к способу индукции иммунного ответа (то есть, повышенного иммунного ответа) у пациента для лечения заболевания человека путем введения иммуногенной композиции, где указанный повышенный иммунный ответ представляет собой врожденный иммунный ответ, при этом указанный способ включает следующие этапы:

- отбора пациента из популяции пациентов, которая состоит из пациентов, имеющих низкое соотношение IL10/IFNγ,

- введения указанным выбранным пациентам указанной иммуногенной композиции.

В соответствии с другим воплощением настоящее изобретение относится к способу индукции иммунного ответа (то есть, повышенного иммунного ответа) у пациента для лечения заболевания человека путем введения иммуногенной композиции, где указанный способ включает следующие этапы:

- измерения у пациента уровней IL10 и IFNγ,

- подсчета соотношения IL10/IFNγ, и

- введения пациенту указанной иммуногенной композиции, если указанный пациент имеет низкое соотношение композиции IL10/IFNγ.

В соответствии с другим воплощением настоящее изобретение относится к способу индукции иммунного ответа, по крайней мере, на один антиген (то есть, повышенного иммунного ответа) у пациента для лечения заболевания человека путем введения иммуногенной композиции, где указанный способ включает следующие этапы:

- измерения у пациента уровней IL10 и IFNγ,

- подсчета соотношения IL10/IFNγ, и

- введения пациенту указанной иммуногенной композии, если указанный пациент имеет низкое соотношение IL10/IFNγ.

В соответствии с другим воплощением настоящее изобретение относится к способу индукции иммунного ответа (то есть, повышенного иммунного ответа) у пациента для лечения заболевания человека путем введения иммуногенной композиции, где указанный повышенный иммунный ответ представляет собой врожденный иммунный ответ, при этом указанный способ включает следующие этапы:

- измерения у пациента уровней IL10 и IFNγ,

- подсчета соотношения IL10/IFNγ, и

- введения пациенту указанной иммуногенной композиции, если указанный пациент имеет низкое соотношение IL10/IFNγ.

Как используется в данном случае по всей заявке, термины "любой" или "какой-либо" используются в смысле того, что они означают "по крайней мере, один", "по крайней мере, первый", "один или более" или "множество" из указанных соединений или этапов, если в контексте не указывается иное. Например, термин "клетка" включает множество клеток, включая их смеси. В частности, "по крайней мере, один" и "один или более" означает количество, которое составляет один или более одного, с особым предпочтением для одного, двух или трех.

Термин "и/или" при использовании где-либо в данной заявке включает значение "и", "или" и "все или какая-либо другая комбинация элементов, связанных с указанным термином".

Термин "приблизительно" или "около", как используется в данной заявке, имеет значение в пределах 20%, предпочтительно в пределах 10% и более предпочтительно в пределах 5%. Для обеспечения ясности, следует добавить, что "приблизительно х" является таким, которое включает указанное значение x.

Термины "пациент", "субъект" относятся к позвоночному животному, в частности представителю видов млекопитающих, и включают, но без ограничения, домашних животных, спортивных животных, приматов, включая людей.

Как используется в данной заявке, термин "лечение" или "процесс лечения" охватывает профилактику и/или терапию. В соответствии с этим иммуногенные композиции или способы настоящего изобретения не являются ограниченными терапевтическими применениями и могут использоваться с профилактической целью. Это охватывается в данной заявке термином "для развития профилактического или терапевтического иммунного ответа". "Профилактика" не является ограниченной предотвращением немедленного заболевания (например, инфекционного заболевания), этот термин дополнительно охватывает предотвращение долгосрочных последствий этих инфекций, таких, как цирроз или рак.

"Эффективное количество" или "достаточное количество" активного соединения представляет собой количество, достаточное для достижения выгодных или желательных результатов, включая клинические результаты. Эффективное количество может вводиться в один или более приемов. "Терапевтически эффективное количество" представляет собой количество, достаточное для достижения выгодных клинических результатов, включая, но без ограничения, ослабление одного или более симптомов, ассоциированных с развитием опухоли, вирусной инфекцией, а также предотвращение заболевания (например, предотвращение одного или более симптомов инфекции).

Термины "пациент, выбранный из популяции пациентов, которая состоит из пациентов, имеющих низкое соотношение IL10/IFNγ" будет пониматься как значение пациента, для которого уровни интерлейкина-10 и интерферона гамма были измерены так, как описано в данной заявке, и который имеет низкое соотношение IL10/IFNγ. Когда количество исследуемых пациентов больше 1, то указанные пациенты образуют популяцию пациентов.

В соответствии со специальными воплощениями термины "пациент будет отвечать терапевтически" или "пациент будет позитивно отвечать на лечение" означает, что указанный пациент имеет повышение коэффициента выживания (смотри раздел примеров).

В предпочтительном воплощении изобретения способ в соответствии с изобретением включает начальный этап, который состоит в измерении уровней интерлейкина-10 и интерферона гамма в биологических образцах, полученных от пациента, перед введением иммуногенной композиции.

В соответствии с настоящим изобретением уровни интерлейкина-10 и интерферона гамма измеряются в биологическом образце, полученном от пациента. Биологические образцы включают, но не являются ограниченными таковыми, кровь и другие жидкие образцы биологического происхождения, твердые образцы тканей, такие, как кусочки биопсии. В предпочтительном воплощении биологический образец представляет собой кровь, плазму или сыворотку, в случае которых получение образцов от пациента представляет собой относительно простую и неинвазивную процедуру. Способы получения крови или сыворотки являются хорошо известными в области техники и не являются частью изобретения.

Кроме того, являются известными многочисленные способы для определения и количественной оценки полипептидов, включая биомаркеры, в соответствии с настоящим изобретением. Такие способы включают, но без ограничения, способы при использовании антител, в частности способы на основе моноклональных антител. Частные способы для определения и количественной оценки биомаркеров не являются важными для данного изобретения. Например, материалы и способы настоящего изобретения могут использоваться с методикой Luminex (Luminex Corporation, Austin, Тех.) или иммуносорбентными ферментными анализами (ELISA, многочисленные наборы ELISA являются коммерчески доступными, например, от CliniScience, Diaclone, Biosource).

В соответствии с одним воплощением изобретения уровни интерлейкина-10 и интерферона гамма определяются при использовании антител.

В соответствии с одним специфическим воплощением изобретения указанное(ые) антитело(антитела) представляет(ют) собой специфические для IL10 или INFγ.

В соответствии с одним специфическим воплощением изобретения указанные антитела являются моноклональными антителами.

В соответствии с одним специфическим воплощением изобретения указанные антитела являются меченными, например, с помощью флуоресценции, радиометки, фермента, биотина или с помощью других способов, предназначенных для обеспечения клеток, меченных с помощью указанных антител. Эти методики широко используются и являются известными в области техники.

В связанных с этим аспектах способ включает определение уровней интерлейкина-10 и интерферона гамма у пациента перед введением иммуногенной композиции пациенту; подсчет соотношения IL10/IFNγ; сравнение указанного соотношения IL10/IFNγ с пороговым значением; и предсказание эффективности иммунотерапевтического лечения, основываясь на уровнях соотношения IL10/IFNγ по сравнению с пороговым значением.

В соответствии со специальным воплощением указанное пороговое значение составляет приблизительно 5, предпочтительно приблизительно 4, более предпочтительно приблизительно 3 и, в частности, приблизительно 2. В соответствии с одним предпочтительным воплощением указанное пороговое значение составляет приблизительно 3,7, и более предпочтительно составляет 3,7. В соответствии с предпочтительным воплощением "низкое соотношение IL10/IFNγ" в соответствии с настоящим изобретением определяется сооношениями IL10/IFNγ, которые ниже приблизительно 5, предпочтительно ниже приблизительно 4 и более предпочтительно ниже приблизительно 3 и, в частности, ниже приблизительно 2. В соответствии с одним предпочтительным воплощением указанное "низкое соотношение IL10/IFNγ" в соответствии с настоящим изобретением определяется соотношениями IL10/IFNγ ниже приблизительно 3,7, и более предпочтительно ниже 3,7. В соответствии с предпочтительным воплощением уровни интерлейкина-10 и интерферона гамма измеряются с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), с помощью Luminex® анализа, с помощью лабораторной системы на чипах, с помощью радиоиммунного анализа или с помощью других систем, которые основываются на специфическом молекулярном узнавании IL10 и IFNγ при использовании антител или других специфических молекул.

Как используется в данной заявке, термины "иммуногенная композиция", "вакцинная композиция", "вакцина" или подобные термины могут использоваться попеременно и означают агент, приемлемый для стимуляции/индукции/усиления иммунной системы субъекта для облегчения существующего состояния или для защиты от, или для снижения настоящего или будущего вреда или инфекций (включая вирусные, бактериальные, паразитарные инфекции), например сниженную пролиферацию опухолевых клеток или выживание, сниженную репликацию патогена или распространение в организме субъекта или способное к определению снижение нежелательного(ых) симптома(ов), ассоциированного(ых) с состоянием, продление выживания пациента. Указанная иммуногенная композиция может содержать (i) весь или часть, по крайней мере, одного целевого антигена и/или (ii) по крайней мере, один рекомбинантный вектор, экспрессирующий in vivo всю или часть, по крайней мере, одной гетерологичной нуклеотидной последовательности, в частности гетерологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей весь или часть, по крайней мере, одного целевого антигена. В соответствии с альтернативным воплощением иммуногенная композиция в соответствии с изобретением включает (iii) по крайней мере, один модификатор иммунного ответа, самостоятельно или в комбинации с (i) и/или (ii). Примеры таких модификаторов иммунного ответа (IRM) включают CpG олигонуклеотиды (смотри US 6,194,388; US 2006094683; WO 2004039829, например), липополисахариды, комплексы полиинозиновой:полицитидиловой кислоты (Kadowaki и др., 2001, J. Immunol. 166, 2291-2295), полипептиды и белки, известные для индукции продукции цитокинов дендритными клетками и/или моноцитами/макрофагами. Другие примеры таких модификаторов иммунного ответа (IRM) представляют собой малые органические молекулы, такие, как имидазохинолинамины, имидазопиридинамины, 6,7-слитые циклоалкилимидазопиридинамины, имидазонафтиридинамины, оксазолхинолинамины, тиазолхинолинамины и 1,2-соединенные мостиковой связью имидазолхинолинамины (смотри, например, US 4,689,338; US 5,389,640; US 6,110,929 и US 6,331,539).

В другом воплощении иммуногенная композиция включает клетки, которые стимулируют иммунный ответ пациента для лечения заболевания, такого, как рак. Указанные клетки могут представлять собой клетки, презентирующие антиген, такие, как дендритные клетки, объединенные с антигенной композицией (например, Provenge, разработанный Dendreon Corporation), опухолевыми клетками (например, GVAX, разработанный Cell Genesis) или лимфоцитами.

Как используется в данной заявке, термин "антиген" относится к любому веществу, включая комплексные антигены (например, опухолевых клеток, инфицированных вирусом клеток и т.д.), которые являются способными быть мишенью для иммунного ответа. Антиген может быть мишенью, например, для клеточного и/или гуморального иммунного ответа, возникающего у пациента. Термин "антиген" охватывает, например, все или часть вирусных антигенов, специфические для опухоли или связанные с опухолью антигены, бактериальные антигены, паразитарные антигены, аллергены и подобные им:

- Вирусные антигены включают, например антигены из вирусов гепатита A, B, C, D и E, ВИЧ, вирусов герпеса, цитомегаловируса, вируса ветряной оспы, папилломавирусов, вирусв Эпштейна-Барра, вирусов гриппа, вирусов парагриппа, аденовирусов, вирусов коксаки, пикорнавирусов, ротавирусов, респираторно-синцйтиальных вирусов, вирусов оспы, риновирусов, вируса краснухи, паповавируса, вируса эпидемического паротита, вируса кори; некоторые неограничивающие примеры известных вирусных антигенов включают следующие: антигены, имеющие происхождение от ВИЧ-1, такие, как tat, nef, gp120 или gp160, gp40, p24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev или их часть и/или комбинации; антигены, имеющие происхождение от вирусов герпеса человека, такие, как gH, gL gM gB gC gK gE или gD или их часть и/или комбинации или предранний белок, такой, как asICP27, ICP47, ICP4, ICP36 из HSV1 или HSV2; антигены, имеющие происхождение от цитомегаловируса, в частности, цитомегаловируса человека, такие, как gB или его производные; антигены, имеющие происхождение от вируса Эпштейна-Барра, такие, как gp350 или его производные; антигены, имеющие происхождение от вируса ветряной оспы, такие, как gpl, 11, 111 и IE63; антигены, имеющие происхождение от вируса гепатита, такие, как антиген вируса гепатита В, гепатита С или гепатита E (например, env белок Е1 или Е2, сердцевинный белок, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, p7, или их части и/или комбинации HCV); антигены, имеющие происхождение от папилломавирусов человека (например, HPV6, 11, 16, 18, например L1, L2, E1, Е2, Е3, Е4, Е5, Е6, Е7, или их части и/или комбинации); антигены, имеющие происхождение от других вирусных патогенов, таких, как респираторно-синцитиальный вирус (например, F и G белки или их производные), вируса парагриппа, вируса кори, вируса эпидемического паротита, флавивирусов (например, вируса желтой лихорадки, вируса Денге, вируса клещевого энцефалита, вируса японского энцефалита) или вируса гриппа (например, НА, NP, NA или М белки, или их части и/или комбинации);

- Специфические для опухоли или родственные антигены включают, но без ограничения, такие карциномы, лимфомы, бластомы, саркомы и лейкемии. В частности, примеры видов рака включают рак молочной железы, рак предстательной железы, рак толстого кишечника, рак чешуйчатых клеток, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, желудочно-кишечный рак, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак желчного пузыря, гепатому, колоректальный рак, эндометриальную карциному, карциному слюнных желез, рак почки, рак печени, рак женских наружных половых органов, рак щитовидной железы, печеночную карциному и различные виды рака головы и шеи, ренальный рак, злокачественную меланому, ларингеальный рак, рак предстательной железы. Раковые антигены представляют собой антигены, которые могут потенциально стимулировать очевидные специфические для опухоли иммунные ответы. Некоторые из этих антигенов кодируются, несмотря на то, что с необходимостью не экспрессируются, нормальными клетками. Эти антигены могут характеризоваться как такие, которые в норме являются молчащими (то есть, не экспрессируются) в нормальных клетках, такими, которые экспрессируются только на низких уровнях или на определенных стадиях дифференциации, и те, которые экспрессируются временно, такие, как эмбриогенные и фетальные антигены. Другие раковые антигены кодируются мутантными клеточными генами, такими, как онкогены (например, активированный ras онкоген), супрессорные гены (например, мутант р53), слитые белки, возникающие в результате внутренних делеций или хромосомных транслокаций. Другие раковые антигены могут кодироваться вирусными генами, например, такие, как те, которые имеют происхождение от РНК и ДНК опухолевых вирусов. Некоторые неограничивающие примеры специфических для опухоли или связанных с опухолью антигенов включают MART-1/Melan-A, gp100, дипептидилпептидазу IV (DPPIV), белок, связывающий аденозиндезаминазу (ADAbp), циклофилин b, колоректальный ассоциированный антиген (CRC)-C017-1 A/GA733, карциноэмбриональный антиген (СЕА) и его иммуногенные эпитопы САР-1 и САР-2, etv6, aml1, специфический антиген простаты (PSA) и его иммуногенные эпитопы PSA-1, PSA-2, и PSA-3, специфический мембранный антиген простаты (PSMA), Т-клеточный рецептор/СБ3-дзета цепь, MAGE-семейство опухолевых антигенов (например, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Хр3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), GAGE-семейство опухолевых антигенов (например, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, тирозиназа, р53, MUC семейство (например, MUC-1), HER2/neu, p21ras, RCAS1, альфа-фетобелок, Е-кадгерин, альфа-катенин, бета-катенин и гамма-катенин, pl20ctn, gpl00.sup.Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, белок, характерный для аденоматозного полипоза толстой кишки (АРС), фодрин, коннексин 37, Ig-идиотип, р15, gp75, GM2 и GD2 ганглиозиды, вирусные продукты, такие, как белки вируса папилломы человека, Smad семейство опухолевых антигенов, lmp-1, P1A, кодируемый EBV ядерный антиген (EBNA)-1, гликогенфосфорилазу мозга, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 и СТ-7 и c-erbB-2;

- бактериальные антигены включают, например, антигены, имеющие происхождение от Mycobacteria, которые вызывают TB и проказу, пневмококков, аэробных грам-негативных бацилл, микоплазм, стафилококковых инфекций, стрептококковых инфекций, сальмонелл, хламидий, нейссерий;

другие антигены включают, например, антигены, имеющие происхождение от возбудителей малярии, лейшманиоза, трипаносомоза, токсоплазмоза, шистосомоза, филяриоза;

аллергены относятся к веществам, которые могут индуцировать аллергический или астматический ответ у чувствительного субъекта. Список аллергенов является неисчислимым и может включать пыльцу, яды насекомых, пыль из шерсти животных, споры грибов и лекарственные средства (например, пенициллин). Примеры природных, животных и растительных аллергенов включают, но без ограничения, белки, специфические для следующих родов: Canine (Canis familiaris); Dermatophagoides (например, Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia; Lolium (например, Lolium perenne или Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris); Plantago (например, Plantago lanceolata); Parietaria (например, Parietaria officinalis или Parietaria judaica); Blattella (например, Blattella germanica); Apis (например, Apis multiflorum); Cupressus (например, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica и Cupressus macrocarpa); Juniperus (например, Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis и Juniperus ashei); Thuya (например, Thuya orientalis); Chamaecyparis (например, Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (например, Periplaneta americana); Agropyron (например, Agropyron repens); Seeale (например, Secale cereale); Triticum (например, Triticum aestivum); Dactylis (например, Dactylis glomerata); Festuca (например, Festuca elatior); Poa (например, Poa pratensis или Poa compressa); Avena (например, Avena sativa); Holcus (например, Holcus lanatus); Anthoxanthum (например, Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (например, Arrhenatherum elatius); Agrostis (например, Agrostis alba); Phleum (например, Phleum pratense); Phalaris (например, Phalaris arundinacea); Paspalum (например, Paspalum notatum); Sorghum (например, Sorghum halepensis); и Bromus (например, Bromus inermis).

В соответствии со специальным воплощением указанный антиген кодируется гетерологичной нуклеотидной последовательностью и экспрессируется in vivo с помощью рекомбинантного вектора.

В особенно предпочтительном воплощении гетерологичная нуклеотидная последовательность в соответствии с настоящим изобретением кодирует один или более из всех или части следующих антигенов HBV-PreSl, PreS2 и поверхностных env белков, сердцевинного и polHIV-gp120 gp40, gp160, р24, gag, pol, env, vif, vpr, vpu, tat, rev, nef; HPV-E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, LI, L2 (смотри, например, WO 90/10459, WO 98/04705, WO 99/03885); HCV env белка E1 или E2, сердцевинного белка, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, p7 (смотри, например, WO2004111082, WO2005051420); Muc-1 (смотри, например, US 5,861,381; US6,054,438; WO98/04727; WO98/37095).

В соответсвии с вариантами данного изобретения иммуногенная композиция содержит, по крайней мере, два антигена или гетерологичную нуклеотидную последовательность, которая кодирует, по крайней мере, два антигена, или, по крайней мере, гетерологичные нуклеотидные последовательности, которые кодируют, по крайней мере, два антигена, или любую их комбинацию.

В соответствии с другим специальным воплощением указанная гетерологичная нуклеотидная последовательность в соответствии с настоящим изобретением кодирует все или часть HPV антигены(ов), выбранных из группы, состоящей из Е6 раннего кодирующего участка HPV, Е7 раннего кодирующего участка HPV, их производных и комбинаций.

HPV антиген, кодируемый рекомбинантным вектором в соответствии с изобретением, является выбранным из группы, состоящей из Е6 полипептида HPV, Е7 полипептида HPV или как Е6 полипептида HPV, так и Е7 полипептида HPV. Настоящее изобретение охватывает применение любого Е6 полипептида HPV, связывание которого с р53 изменяется или, по крайней мере, значительно снижается, и/или применение любого Е7 полипептида HPV, связывание которого с Rb изменяется или, по крайней мере, значительно снижается (Munger и др., 1989, EMBO J. 8, 4099-4105; Crook и др., 1991, Cell 67, 547-556; Heck и др., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4442-4446; Phelps и др., 1992, J. Virol. 66, 2148-2427). Неонкогенный E6 вариант HPV-16, который является приемлемым для цели настоящего изобретения, имеет делецию одного или более аминокислотных остатков, которые размещаются от приблизительно положения 118 до приблизительно положения 122 (+1, который представляет собой первый остаток метионина нативного Е6 полипептида HPV-16), с особым предпочтением для полной делеции остатков от 118 до 122 (СРЕЕК). Неонкогенный Е7 HPV-16 вариант, который является приемлемым для цели настоящего изобретения, имеет делецию одного или более аминокислотных остатков, которые размещаются от приблизительно положения 21 до приблизительно положения 26 (+1 который представляет собой первый остаток метионина нативного Е7 полипептида HPV-16), с особым предпочтение для полной делеции остатков от 21 до 26 (DLYCYE). В соответствии с предпочтительным воплощением один или более ранний(их) полипептид(ов) HPV-16, которые используются в изобретении, является(являются) дополнительно модифицированным(и) так, что улучшают презентацию МНС класса I и/или МНС класса II, и/или стимулируют анти-HPV иммунитет E6 и Е7 полипептиды HPV представляют собой ядерные белки, и ранее было продемонстрировано, что мембранная презентация позволяет улучшить их терапевтическую эффективность (смотри, например, WO99/03885). Таким образом, может быть желательным модифицировать, по крайней мере, один из ранних полипептидов HPV так, чтобы прикрепить его к клеточной мембране. Прикрепление к мембране может быть легко достигнуто путем встраивания в ранний полипептид HPV последовательности прикрепления к мембране, и если в нативном полипептиде она отсутствует, то и последовательности секреции (то есть, сигнального пептида). Последовательности прикрепления к мембране и секреторные последовательности являются известными в области техники. Кратко, секреторные последовательности присутствуют на N-терминальном конце презентируемых на мембране или секретируемых полипептидов и инициируют их поступление в эндоплазматический ретикулум (ER). Они обычно включают от 15 до 35 существенно гидрофобных аминокислот, которые потом удаляются с помощью специфической размещенной на ER эндопептидазы с получением зрелого полипептида. Последовательности прикрепления к мембране обычно являются высоко гидрофобными по своей природе и служат для прикрепления полипептидов к клеточной мембране (смотри, например, Branden и Tooze, 1991, в Introduction to Protein Structure стр.202-214, NY Garland).

Выбор последовательностей прикрепления к мембране и секреторных последовательностей, которые могут использоваться в контексте настоящего изобретения, является обширным. Они могут быть получены из любого прикрепленного к мембране и/или секретируемого полипептида, включающего их (например, клеточных или вирусных полипептидов), таких, как гликопротеин вируса бешенства, гликопротеин оболочки ВИЧ или F белок вируса кори, или могут быть синтетическими. Последовательности прикрепления к мембране и/или секреторные последовательности, встроенные в каждый из ранних полипептидов HPV-16, используемых в соответствии с изобретением, могут иметь общее или отличное происхождение. Предпочтительный сайт встраивания секреторной последовательности представляет собой N-терминальный конец ниже от кодона инициации трансляции, а таковой для последовательности прикрепления к мембране представляет собой С-терминальный конец, например, непосредственно выше от стоп-кодона.

HPV Е6 полипептид для применения в настоящем изобретении предпочтительно является модифицированным путем встраивания секреторных сигналов и сигналов связывания с мембраной F белка вируса кори. Необязательно или в комбинации, HPV Е7 полипептид для применения в настоящем изобретении предпочтительно является модифицированным путем встраивания секреторных сигналов и сигналов связывания с мембраной гликопротеина вируса бешенства.

Терапевтическая эффективность рекомбинантных векторов может также быть улучшена путем использования одной или более нуклеиновыых кислот, кодирующих иммуностимуляторный(ые) полипептид(ы). Например, может быть предпочтительным связывать ранний(е) полипептид(ы) HPV с полипептидом, таким, как кальретикулин (Cheng и др., 2001, J. Clin. Invest. 108, 669-678), белок теплового шока 70 Mycobacterium tuberculosis (HSP70) (Chen и др., 2000, Cancer Res. 60, 1035-1042), убиквитин (Rodriguez и др., 1997, J. Virol. 71, 8497-8503) или транслокационный домен бактериального токсина, такой, как экзотоксин А Pseudomonas aeruginosa (ETA(dIII)) (Hung и др., 2001 Cancer Res. 61, 3698-3703).

В соответствии с другим воплощением рекомбинантный вектор в соответствии с изобретением включает нуклеиновую кислоту, кодирующую один или более ранний(их) полипептид(ов), как определено выше, и в частности, ранние полипептиды Е6 и/или Е7 HPV-16 и/или HPV-18.

В соответствии с другим специальным и предпочтительным воплощением указанная гетерологичная нуклеотидная последовательность в соответствии с настоящим изобретением кодирует весь или часть MUC 1 антигена или его производной.

В соответствии с другим специальным воплощением указанная гетерологичная нуклеотидная последовательность в соответствии с настоящим изобретением кодирует один или более из всех или части приведенных ниже: белок оболочки E1 или Е2 HCV, сердцевинный белок, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, p7 или их производные. В соответствии с другим специальным воплощением указанная гетерологичная нуклеотидная последовательность в соответствии с настоящим изобретением кодирует один или более слитых белков, в которых конфигурация не является нативной в смысле того, что, по крайней мере, один из NS полипептидов оказывается расположенным в таком порядке, который отличается от такого для нативной конфигурации. Таким образом, если слитый белок включает NS3 полипептид, NS4A полипептид и NS5B полипептид, то нативная конфигурация будет представлять собой NS3-NS4A-NS5B с NS3 на N-терминальном конце и NS5B на С-терминальном конце. В противовес этому, ненативная конфигурация может представлять собой NS5B-NS3-NS4A, NS5B-NS4A-NS3, NS4A-NS3-NS5B, NS4A-NS5B-NS3 или NS3-NS5B-NS4A. В частности, слитый белок в соответствии с изобретением включает, по крайней мере, один из следующих:

- NS4A полипептид, слитый непосредственно или через линкер с N-терминальным концом NS3 полипептида;

- NS3 полипептид, слитый непосредственно или через линкер с N-терминальным концом NS5B полипептида;

- NS4B полипептид, слитый непосредственно или через линкер с N-терминальным концом NS5B полипептида;

- NS4A полипептид, слитый непосредственно или через линкер с N-терминальным концом NS3 полипептида, который сливается непосредственно или с помощью линкера с N-терминальным концом NS4B полипептида; и/или

- NS3 полипептид, слитый непосредственно или через линкер с N-терминальным концом NS4B полипептида, который сливается непосредственно или с помощью линкера с N-терминальным концом NS5B полипептида. В таких специфических частях слитого белка в соответствии с изобретением каждый из NS полипептидов может быть независимо нативным или модифицированным. Например, NS4A полипептид, содержащийся в NS4A-NS3 части, может быть нативным, в то время как NS3 полипептид включает, по крайней мере, одну модификацию, описанную ниже.

В случае необходимости, молекула нуклеиновой кислоты, которая используется в изобретении, может быть оптимизирована для обеспечения высокого уровня экспрессии нацеленного антигена (например, раннего(их) полипептида(ов)) HPV в частной хозяйской клетке или организме, например в хозяйской клетке или организме человека. Типично, оптимизацию по кодонам осуществляют путем замены одного или более "нативного(ых)" (например, HPV) кодона(ов), соответствующего(их) кодонам, не часто используемым в хозяйской клетке млекопитающих, одним или более кодоном(ами), который(ые) кодирует(ют) ту же аминокислоту, которая является более часто используемой. Этого можно достичь с помощью традиционного мутагенеза или с помощью методик химического синтеза (например, приводящих к получению синтетической нуклеиновой кислоты). Не является необходимым заменять все нативные кодоны, соответствующие редко используемым кодонам, поскольку повышенная экспрессия может быть достигнута даже при частичной замене. Кроме того, некоторые отклонения от строгого прикрепления для оптимизированного использования кодонов могут быть сделаны для согласования введения рестрикционного(ых) сайта(ов).

Как используется в данной заявке, термин "рекомбинантный вектор" относится к вирусным, а также невирусным векторам, включая экстрахромосомные (например, эписомные), мультикопийные и интегрирующие векторы (то есть, для встраивания в хозяйские хромосомы). Особенно важным в контексте изобретения являются векторы для применения в генной терапии (то есть, те, которые являются способными к доставке нуклеиновой кислоты в хозяйский организм), а также экспрессионные векторы для применения в различных экспрессионных системах. Приемлемые невирусные векторы включают плазмиды, такие, как pREP4, рСЕР4 (Invitrogene), pCI (Promega), pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329, 840), pVAX и pgWiz (Gene Therapy System Inc; Himoudi и др., 2002, J. Virol. 76, 12735-12746). Приемлемые вирусные векторы могут представлять собой такие, которые имеют происхождение от разнообразных вирусов (например, ретровирусов, аденовирусов, AAV, вируса оспы, вируса герпеса, вируса кори, пенистого вируса и подобных им). Как используется в данной заявке, термин "вирусный вектор" охватывает ДНК/РНК вектор, а также полученные из него вирусные частицы. Вирусные векторы могут быть репликационно компетентными, или могут быть генетически поврежденными для того, чтобы представлять собой такие с нарушенной репликацией. Термин "репликационно компетентные", как используется в данной заявке, охватывает селективные по репликации и условно репликативные вирусные векторы, которые являются сконструированными для лучшей или селективной репликации в специфических хозяйских клетках (например, опухолевых клетках).

В одном аспекте рекомбинантный вектор, который используется в изобретении, представляет собой рекомбинантный аденовирусный вектор (для обзора, смотри "Аденовирусные векторы для генной терапии", 2002, ред. D.Curiel и J.Douglas, Academic Press). Они могут быть получены из разнообразных человеческих и животных источников, при этом может использоваться любой серотип из серотипов аденовируса от 1 до 51. Особенно предпочтительными являются аденовирусы 2 (Ad2), 5 (Ad5), 6 (Ad6), 11 (Ad11), 24 (Ad24) и 35 (Ad35). Такие аденовирусы являются доступными из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Rockville, Md.), были также представлены многочисленные публикации, описывающие их последовательность, организацию и способы получения, что позволяет специалисту в данной области техники применять их (смотри, например, US 6,133,028; US 6,110,735; WO 02/40665; WO 00/50573; EP 1016711; Vogels и др., 2003, J. Virol. 77, 8263-8271).

Аденовирусный вектор, используемый в настоящем изобретении, может быть компетентным по репликации. Многочисленные примеры репликативно компетентных аденовирусных векторов являются легко доступными для квалифицированного специалиста в данной области техники (смотри, например, Hernandez-Alcoceba и др., 2000, Human Gene Ther. 11, 2009-2024; Nemunaitis и др., 2001, Gene Ther. 8, 746-759; Alemany и др., 2000, Nature Biotechnology 18, 723-727). Например, они могут быть сконструированы из генома аденовируса дикого типа путем делеции в Е1А CR2 домене (смотри, например WO00/24408) и/или путем замены нативных Е1 и/или Е4 промоторов специфическими для ткани, опухоли или состояния клетки промоторами (смотри, например US 5,998,205, WO99/25860, US 5,698,443, WO00/46355, WO00/15820 и WO01/36650).

Альтернативно, аденовирусный вектор, используемый в изобретении, является дефектным по репликации (смотри, например, WO 94/28152; Lusky и др., 1998, J. Virol 72, 2022-2032). Предпочтительные дефектные по репликации аденовирусные векторы представляют собой Е1-дефектный (смотри, например, US 6,136,594 и US 6,013,638), с Е1 делецией, которая размещается приблизительно от положения 459 до положения 3328 или приблизительно от положения 459 до положения 3510 (со ссылкой на последовательность аденовируса человека типа 5, раскрытого в GeneBank под депозитным номером М 73260 и у Chroboczek и др., 1992, Virol. 186, 280-285). Клонирующая способность может быть дополнительно улучшена путем делетирования дополнительной(ых) части(ей) аденовирусного генома (всего или части неэссенциального участка E3 или других эссенциальных участков Е2, Е4). Инсерция нуклеиновой кислоты в любом положении аденовирусного вектора может осуществляться посредством гомологичной рекомбинации, как описано у Chartier и др. (1996, J. Virol. 70, 4805-4810). Например, нуклеиновая кислота, кодирующая Е6 полипептид HPV-16, может быть встроена в замещение Е1 участка, а нуклеиновая кислота, кодирующая Е7 полипептид HPV-16, может быть встроена в замещение E3 участка или наоборот.

В другом предпочтительном аспекте вектор, используемый в изобретении, представляет собой вектор на основе поксвируса (смотри, например, Сох и др. в "Вирусы в генной терапии человека", ред. J. М.Hos, Carolina Academic Press). В соответствии с другим предпочтительным воплощением он является выбранным из группы, состоящей из вируса осповакцины, приемлемые вирусы осповакцины включают без ограничения штамм Copengagen (Goebel и др., 1990, Virol. 179, 247-266 и 517-563; Johnson и др., 1993, Virol. 196, 381-401), штамм Уайета и высоко аттенуированный вирус, который получен из него, включая MVA (для обзора смотри Мауг, А., и др., 1975, Infection 3, 6-14) и их производные (такие, как MVA вакцинный штамм 575 (ЕСАСС V00120707 - US 6,913,752), NYVAC (смотри WO 92/15672 - Tartaglia и др., 1992, Virology, 188, 217-232). Определение полной последовательности генома MVA и сравнение ее с геномом Copenhagen VV позволило осуществить точную идентификацию семи делеции (I-VII), которые возникают в геноме MVA (Antoine и др., 1998, Virology 244, 365-396), любая из которых может использоваться для встраивания кодирующей антиген нуклеиновой кислоты. Вектор может также быть получен из любого другого члена семейства поксвирусов, в частности вируса оспы кур (например, TROVAC, смотри Paoletti и др., 1995, Dev Biol Stand., 84, 159-163); оспы канареек (например, ALVAC, WO 95/27780, Paoletti и др., 1995, Dev Biol Stand., 84, 159-163); оспы поросят; оспы свиней и подобных им. В качестве примера, специалист в данной области техники может обратиться к WO 9215672 (является введенным в качестве ссылки), которая описывает получение экспрессионных векторов на основе поксвирусов, способных к экспрессии такой гетерологичной нуклеотидной последовательности, в частности, нуклеотидной последовательности, кодирующей антиген.

В соответствии со специальным воплощением указанный вирус может представлять собой репликационно компетентный поксвирус, в частности репликационно компетентный вирус осповакцины. Примеры таких вирусов обеспечиваются в WO9531105 (например, продукты JX594, VV ТК-GMCSF или JX963, VV ТК-VGF-GMCSF), WO0073479, WO2009/065547, WO2009/065546.

Основная методика для встраивания нуклеиновой кислоты и ассоциированных регуляторных элементов, необходимых для экспрессии в геноме вирусов оспы, описывается в многочисленных документах, доступных квалифицированному специалисту в данной области техники (Paul и др., 2002, Cancer gene Ther. 9, 470-477; Piccini и др., 1987, Methods of Enzymology 153, 545-563; US 4,769,330; US 4,772,848; US 4,603,112; US 5,100,587 и US 5,179,993). Обычно, это осуществляется путем гомологичной рекомбинации между перекрывающимися последовательностями (то есть, желаемого сайта инсерции), присутствующих в обоих вирусных генома, и плазмиды, несущей нуклеиновую кислоту, которая подлежит встраиванию.

Нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген в соответствии с изобретением, предпочтительно встраивают в неэссенциальном локусе генома поксвируса, для того чтобы рекомбинантный поксвирус оставался жизнеспособным и инфекционным. Неэссенциальные участки представляют собой некодирующие межгенные участки или любой ген, для которого инактивация или делеция в значительной степени не нарушает роста вируса, репликации или инфекции. Любой может также предусматривать инсерцию в эссенциальный локус вируса при условии, что дефектная функция предоставляется in trans в процессе получения вирусных частиц, например, при использовании хелперной линии клеток, которая несет комплементирующие последовательности, соответствующие таким, которые были делетированы из генома вируса оспы.

При использовании вируса осповакцины Copenhagen нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген, предпочтительно встраивают в ген тимидинкиназы (tk) (Hruby и др., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 3411-3415; Weir и др., 1983, J. Virol. 46, 530-537). Однако другие сайты инсерции также являются приемлемыми, например, в ген гемагглютинина (Guo и др., 1989, J. Virol. 63, 4189-4198), в локус K1L, в u ген (Zhou и др., 1990, J. Gen. Virol. 71, 2185-2190) или на левом конце вируса осповакцины, где в литературе было описано множество спонтанных или сконструированных делеций (Altenburger и др., 1989, Archives Virol. 105, 15-27; Moss и др. 1981, J. Virol. 40, 387-395; Panicali и др., 1981, J. Virol. 37, 1000-1010; Perkus и др., 1989, J. Virol. 63, 3829-3836; Perkus и др., 1990, Virol. 179, 276-286; Perkus и др., 1991, Virol. 180, 406-410).

При использовании MVA нуклеиновая кислота, кодирующая антиген, может быть встроена в место какой-либо одной из идентифицированных делеций I-VII, а также в D4R локусе, но инсерция в делеций II или III является предпочтительной (Meyer и др., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038; Sutter и др., 1994, Vaccine 12, 1032-1040).

При использовании вируса оспы кур, несмотря на то что инсерция в пределах гена тимидинкиназы может рассматриваться, нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген, предпочтительно вводят в межгенный участок, который размещается между ORF 7 и 9 (смотри, например, ЕР 314 569 и US 5,180,675).

В соответствии с одним специальным воплощением указанный рекомбинантный вектор представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК или рекомбинантный вирусный вектор.

В соответствии с другим специальным воплощением указанный рекомбинантный вирусный вектор представляет собой рекомбинантный вектор на основе вируса осповакцины.

В соответствии с одним предпочтительным воплощением указанный рекомбинантный вектор на основе осповакцины представляет собой рекомбинантный MVA вектор.

Предпочтительно, когда нуклеиновая кислота, кодирующая антиген, используемый в изобретении, находится в форме, приемлемой для ее экспрессии в хозяйской клетке или организме, что означает, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, помещают под контролем одной или более регуляторных последовательностей, необходимых для ее экспрессии в хозяйской клетке или организме. Как используется в данной заявке, термин "регуляторная последовательность" относится к любой последовательности, которая позволяет осуществлять, способствовать или модулировать экспрессию нуклеиновой кислоты в данной хозяйской клетке, включая репликацию, дупликацию, транскрипцию, сплайсинг, трансляцию, стабильность и/или транспорт нуклеиновой кислоты или одной из ее производных (то есть, мРНК) в хозяйской клетке. Специалист в данной области техники сможет оценить, что выбор регуляторных последовательностей может зависеть от факторов, таких, как хозяйская клетка, вектор и желаемый уровень экспрессии. Нуклеиновая кислота, кодирующая антиген, оперативно связывается с последовательностью экспрессии гена, которая направляет экспрессию нуклеиновой кислоты антигена в эукариотической клетке. Последовательность экспрессии гена представляет собой регуляторную нуклеотидную последовательность, такую, как последовательность промотора или комбинацию промотор-энхансер, которая способствует эффективной транскрипции и трансляции нуклеиновой кислоты антигена, с которой она является оперативно связанной. Последовательность экспрессии гена может, например, представлять собой промотор млекопитающих или вируса, такой, как конститутивный или индуцибельный промотор. Конститутивные промоторы млекопитающих включают, но без ограничения таковыми, промоторы для следующих генов: гипоксантинфосфорибозил трансферазы (HPRT), аденозиндезаминазы, пируваткиназы, промотор b-актина и другие конститутивные промоторы. Примеры вирусных промоторов, которые функционируют конститутивно в эукариотических клетках, включают, например, промоторы из цитомегаловируса (CMV), вакуолизирующего обезьяньего вируса (например, SV40), папилломавируса, аденовируса, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса саркомы Раусса, цитомегаловируса, длинных концевых повторов (LTR) вируса лейкемии Молоуни и других ретровирусов, а также промотора тимидинкиназы вируса простого герпеса. Другие конститутивные промоторы являются известными среднему специалисту в данной области техники. Промоторы, полезные в качестве последовательностей генной экспрессии в соответствии с изобретением, также включают индуцибельные промоторы. Индуцибельные промоторы экспрессируются в присутствии индуцирующего агента. Например, промотор металлотионеина индуцируется для промотирования транскрипции и трансляции в присутствии ионов определенных металлов. Другие индуцибельные промоторы являются известными среднему специалисту в данной области техники. В общем случае, последовательность экспрессии гена будет включать, при необходимости, 5' нетранскрибируемые и 5' нетранслируемые последовательности, вовлеченные в инициацию транскрипции и трансляции, соответственно, такие, как TATA бокс, кэппирующую последовательность, СААТ последовательность и тому подобное. В частности, такие 5' нетранскрибируемые последовательности будут включать промоторный участок, который содержит промоторную последовательность для транскрипционного контроля оперативно присоединенной нуклеиновой кислоты антигена. Последовательности экспрессии гена необязательно включают энхансерные последовательности или вышерасположенные последовательности активатора, если это является желательным. Предпочтительные промоторы для применения в векторах на основе поксвируса (смотри ниже) включают без ограничения промоторы осповакцины 75K, H5R, ТK, р28, p11 и K1L, химерные промоторы между ранними и поздними поксвирусными промоторами, а также синтетические промоторы, такие, как те, что описаны у Chakrabarti и др. (1997, Biotechniques 23, 1094-1097), Hammond и др. (1997, J. Virological Способы 66, 135-138) и Kumar и Boyle (1990, Virology 179, 151-158).

Промотор представляет особую важность, и настоящее изобретение охватывает применение конститутивных промоторов, которые направляют экспрессию нуклеиновой кислоты во многих типах хозяйских клеток, и те, которые направляют экспрессию только в определенных хозяйских клетках или в ответ на специфически события или экзогенные факторы (например, на температуру, пищевые добавки, гормон или другой лиганд). Приемлемые промоторы широко описываются в литературе и можно упомянуть, в частности, вирусные промоторы, такие, как RSV, SV40, CMV и MLP промоторы. Предпочтительные промоторы для применения в поксвирусном векторе включают без ограничения промоторы осповакцины 7.5K, H5R, ТK, р28, p11 и K1L, химерные промоторы между ранними и поздними поксвирусными промоторами, а также синтетические промоторы, такие, как те, что описаны у Chakrabarti и др. (1997, Biotechniques 23, 1094-1097), Hammond и др. (1997, J. Virological Methods 66, 135-138) и Kumar и Boyle (1990, Virology 179, 151-158).

Специалист в данной области техники сможет оценить, что регуляторные элементы, контролирующие экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением, могут дополнительно включать дополнительные элементы для собственной инициации, регуляции и/или терминации транскрипции (например, polyA последовательности терминации транскрипции), транспорта мРНК (например, сигнальные последовательности ядерной локализации), процессинга (например, сигналы сплайсинга) и стабильности (например, интроны и некодирующие 5' и 3' последовательности), трансляции (например, пептидный сигнал, пропептид, тройные лидерные последовательности, сайты связывания рибосомы, последовательности Шайна-Дальгарно и т.д.) в хозяйской клетке или организме.

Альтернативно, рекомбинантный вектор для применения в настоящем изобретении может дополнительно включать, по крайней мере, одну нуклеиновую кислоту, кодирующую, по крайней мере, один цитокин. Приемлемые цитокины включают без ограничения интерлейкины (например, IL-2, IL-7, IL-15, IL-18, IL-21) и интерфероны (например, IFNy, INFa), с особым предпочтением для интерлейкина IL-2. Когда рекомбинантная вакцина в соответствии с изобретением включает нуклеиновую кислоту для экспрессии цитокина, то указанная нуклеиновая кислота может обеспечиваться рекомбинантным вектором, кодирующим один или более антиген(ов) или независимым рекомбинантным вектором, который может иметь то же самое или отличное происхождение.

В соответствии с наиболее предпочтительным воплощением рекомбинантный вектор для применения в настоящем изобретении кодирует весь или часть MUC1 антигена и, по крайней мере, один из цитокинов, приведенных выше, и предпочтительно интерлейкин, в частности, IL2. Предпочтительно рекомбинантный вектор для применения в настоящем изобретении представляет собой MVA, кодирующий весь или часть MUC1 антигена и, по крайней мере, один из цитокинов, приведенных выше, и предпочтительно интерлейкин, в частности IL2.

Инфекционные вирусные частицы, включающие описанный выше рекомбинантный вирусный вектор, могут быть получены с помощью обычного процесса. Типичный процесс включает следующие этапы:

a. введения вирусного вектора в приемлемую линию клеток,

b. культивирования указанной линии клеток при приемлемых условиях так, чтобы позволить осуществлять продукцию указанной инфекционной вирусной частицы,

c. извлечения полученной вирусной частицы из культуры указанной линии клеток, и

d. необязательной очистки указанной извлеченной инфекционной вирусной частицы.

Клетки, приемлемые для размножения аденовирусных векторов, представляют собой, например 293 клетки, PERC6 клетки, HER96 клетки или клетки, как раскрыто в WO 94/28152, WO 97/00326, US 6,127,175.

Клетки, приемлемые для размножения поксвирусных векторов, представляют собой клетки птиц, и наиболее предпочтительно первичные фибробласты эмбрионов курей (CEF), приготовленные из куриных эмбрионов, полученных из оплодотворенных яиц.

Инфекционные вирусные частицы могут быть извлечены из супернатантов культуры или из клеток после их лизиса (например, с помощью химических средств, замораживания/оттаивания, осмотического шока, механического шока, обработки ультразвуком и подобных им). Вирусные частицы могут быть изолированы, с помощью последовательных циклов очистки бляшек и последующей очистки при использовании методик, известных в области техники (хроматографические способы, ультрацентрифугирование в градиенте хлорида цезия или сахарозы).

Если это является желательным, то способ или применение для лечения пациента от заболевания человека в соответствии с изобретением (то есть, путем введения иммуногенной композиции, включающей, по крайней мере, один антиген) может осуществляться у выбранных пациентов в сочетании с одним или более традиционным терапевтическим воздействием (например, облучением, химиотерапией и/или хирургией). Применение многочисленных терапевтических подходов обеспечивает выбранного пациента более широким вмешательством. В одном воплощении способ или применение для лечения пациента от заболевания человека в соответствии с изобретением может предваряться или продолжаться хирургическим вмешательством. В другом воплощении он может предваряться или продолжаться лучевой терапией (например, гамма-облучением). Специалист в данной области техники может легко составить приемлемые прописи лучевой терапии и параметры, которые могут использоваться (смотри, например, Perez и Brady, 1992, Принципы и практика радиационной онкологии, 2-е изд. JB Lippincott Со; при использовании приемлемых адаптации и модификаций, что будет легко понятным для специалиста в данной области техники). Еще в одном воплощении способ или применение в соответствии с изобретением ассоциируется с химиотерапией с помощью одного или более лекарственных средств (например, лекарственных средств, которые традиционно используются для лечения или предотвращения вирусных инфекций, ассоциированных с вирусом патологических состояний, рака и подобных им).

Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу для улучшения лечения ракового пациента, который подвергается химиотерапевтическому лечению с помощью химиотерапевтического агента, при этом указанный способ включает следующие этапы:

- отбора пациента из популяции пациентов, которая состоит из пациентов, имеющих низкое соотношение IL10/IFNγ,

- введения указанным выбранным пациентам иммуногенной композиции в соответствии с изобретением и химиотерапевтического агента.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу улучшения лечения ракового пациента, который подвергается химиотерапевтическому лечению с помощью химиотерапевтического агента, где указанный способ включает следующие этапы:

- измерения в биологическом образце (например, в крови или плазме крови, или сыворотке), полученном от пациента уровней IL10 и IFNγ,

- подсчета соотношения IL10/IFNγ, и

- введения пациенту указанной иммуногенной композиции, если указанный пациент имеет низкое соотношение IL10/IFNγ в соответствии с изобретением. В соответствии с одним воплощением введение указанного химиотерапевтического агента осуществляют перед введением указанной иммуногенной композиции.

В соответствии с другим воплощением введение указанного химиотерапевтического агента осуществляют после введения указанной иммуногенной композиции.

В соответствии с другим воплощением указанного введение указанного химиотерапевтического агента осуществляют одновременно с введением указанной иммуногенной композиции.

В соответствии с одним воплощением указанный химиотерапевтический агент представляет собой цисплатин и/или гемцитабин или подобные им.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу улучшения цитотоксической эффективности цитотоксических лекарственных средств (например, химитерапевтического агента) или лучевой терапии, который включает сочетанное лечение пациента, выбранного из популяции пациентов, состоящей из пациентов, имеющих низкое соотношение IL10/IFNγ, с помощью иммуногенной композиции в соответствии с изобретением.

В другом воплощении способ или применение иммуногенной композиции в соответствии с изобретением осуществляют в соответствии с терапевтическим воздействием примирования-бустинга (повторной вакцинации), которое включает последовательное введение одной или более примирующей(их) композиции(ий) и одной или более композиции(ий) для повторной вакцинации. Обычно, примирующая композиция и композиция для повторной иммунизации используют различные носители, которые включают или кодируют, по крайней мере, антигенный домен в целом. Примирующая композиция изначально вводится в хозяйский организм, а композиция для повторной иммунизации последовательно вводится в тот же хозяйский организм спустя период времени, который варьирует от одного дня до двенадцати месяцев. Способ в соответствии с изобретением может включать от одного до десяти последовательных введений примирующей композиции, после чего осуществляют от одного до десяти последовательных введений композиции для бустинг-иммунизации. Является желательным, когда интервалы инъекции составляют приблизительно от одной недели до шести месяцев. Кроме того, примирующая композиция и композиция для повторной иммунизации могут вводиться в тот же сайт или в альтернативные сайты одним и тем же путем или с помощью различных путей введения.

В соответствии со специальным воплощением желательное клиническое преимущество является независимым от демонстрируемого иммунного ответа на вакцину.

В соответствии со специальным воплощением изобретение относится к способу, как описано выше, где указанное заболевание человека представляет собой рак.

В соответствии с предпочтительным воплощением указанный рак представляет собой, например, рак молочной железы, рак толстого кишечника, почечный рак, ректальный рак, рак легкого, рак головы и шеи, ренальный рак, злокачественную меланому, ларингеальный рак, рак яичника, цервикальный рак, простатический рак, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), гематологические виды рака, различные виды желудочного рака, миелому.

В соответствии с одним специальным воплощением изобретение относится к способу, как описано выше, где указанное заболевание человека представляет собой инфекционное заболевание.

В соответствии с предпочтительным воплощением указанное инфекционное заболевание представляет собой индуцированное вирусом заболевание, такое, как например, заболевание, которое индуцируется ВИЧ, HCV, HBV, HPV и подобными им.

В дополнительном воплощении обеспечивается применение иммуногенной композиции, включающей весь или часть целевого антигена для производства лекарственного средства для лечения пациента от заболевания человека в определенной популяции пациентов, где пациенты указанной популяции имеют низкое соотношение IL10/IFNγ.

В дополнительном воплощении обеспечивается применение иммуногенной композиции для производства лекарственного средства для повышения иммунного ответа (то есть, повышенного иммунного ответа) у пациента для лечения заболевания человека в определенной популяции пациентов, где пациенты указанной популяции имеют низкое соотношение IL10/IFNγ.

В другом воплощении обеспечивается применение иммуногенной композиции для производства лекарственного средства для повышения иммунного ответа, по крайней мере, на один антиген (то есть, повышенного иммунного ответа) у пациента для лечения заболевания человека в определенной популяции пациентов, где пациенты указанной популяции имеют низкое соотношение IL10/IFNγ.

В другом воплощении обеспечивается применение иммуногенной композиции для производства лекарственного средства для повышения иммунного ответа на целевой антиген (то есть, повышенного иммунного ответа) у пациента для лечения заболевания человека в определенной популяции пациентов, где пациенты указанной популяции имеют низкое соотношение IL10/IFNγ.

В другом воплощении обеспечивается применение иммуногенной композиции для производства лекарственного средства для повышения иммунного ответа (то есть, повышенного иммунного ответа) у пациента для лечения заболевания человека в определенной популяции пациентов, где пациенты указанной популяции имеют низкое соотношение IL10/IFNγ, и где указанный повышенный иммунный ответ представляет собой врожденный иммунный ответ.

В соответствии с одним специальным воплощением указанный "повышенный иммунный ответ" в указанной популяции пациентов является направленным на специфические для опухоли или связанные с опухолью антигены и/или вирусные антигены. В соответствии с одним воплощением указанный "повышенный иммунный ответ" в указанной популяции пациентов является направленным на различные антигены. В соответствии с одним специальным воплощением указанный "повышенный иммунный ответ" в указанной популяции пациентов является направленным на MUC1 антиген. В соответствии с другим специальным воплощением указанный "повышенный иммунный ответ" в указанной популяции пациентов представляет собой Т-клеточный иммунный ответ, и предпочтительно CD8+ (цитотоксические Т-лимфоциты) иммунный ответ. В соответствии с другим специальным воплощением указанный "повышенный иммунный ответ" в указанной популяции пациентов представляет собой неспецифический иммунный ответ. В соответствии с другим специальным воплощением указанный "повышенный иммунный ответ" в указанной популяции пациентов представляет собой стимуляцию врожденного иммунного ответа.

Способность к индукции или стимуляции иммунного ответа при введении в животный или человеческий организм может быть оценена либо in vitro, либо in vivo при использовании разнообразных анализов, которые являются стандартными в области техники. Для общего описания методик, доступных для оценки начала и активации иммунного ответа, смотри, например, Coligan и др. (1992 и 1994, Current Protocols in Immunology; ред. J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health). Измерение клеточного иммунитета может осуществляться путем измерения профилей цитокинов, которые секретируются активированными эффекторными клетками, включая те, которые имеют происхождение от CD4+ и CD8+ T-клеток (например, качественная оценка клеток, продуцирующих IL-10 или IFN гамма с помощью ELIspot), путем определения статуса активации иммунных эффекторных клеток (например, анализы пролиферации T-клеток с помощью классического поглощения [³Н] тимидина), путем анализа на специфические для антигена T-лимфоциты у сенсибилизированного субъекта (например, специфический для пептида лизис в цитотоксическом анализе) или путем определения специфических для антигена T-клеток с помощью флуоресцентных МНС и/или пептидных мультимеров (например, тетрамеров). Способность к стимуляции гуморального ответа может быть определена путем связывания антитела и/или конкуренции за связывание (смотри, например, Harlow, 1989, Antibody, Cold Spring Harbor Press). Способ в соответствии с изобретением может также проверяться на животных моделях, сенсибилизированных с помощью приемлемого агента, индуцирующего опухоль (например, ТС 1 клеток, экспрессирующих MUC1) для определения противоопухолевой активности, что отражает индукцию или повышение иммунного ответа, направленного против антигена.

Таким образом, настоящее изобретение дополнительно относится к способу для продления выживания пациента, подвергнутого лечению от заболевания человека путем введения иммуногенной композиции, при этом указанный способ включает следующие этапы:

- выбора пациента из популяции пациентов, которая состоит из пациентов, имеющих низкое соотношение IL10/IFNγ,

- введения указанным выбранным пациентам указанной иммуногенной композиции.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу для продления выживания пациента, подвергнутого лечению от заболевания человека, например рака, путем введения иммуногенной композиции, при этом указанный способ включает следующие этапы:

- измерения у пациента уровней IL10 и IFNγ,

- подсчета соотношения IL10/IFNγ, и

- введения пациенту указанной иммуногенной композиции, если указанный пациент имеет низкое соотношение IL10/IFNγ.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу для продления выживания пациента, подвергнутого лечению от заболевания человека, например рака, путем введения иммуногенной композиции и химиотерапевтического агента (смотри выше), при этом указанный способ включает следующие этапы:

- измерения у пациента уровней IL10 и IFNγ,

- подсчета соотношения IL10/IFNγ, и

- введения пациенту указанной иммуногенной композиции и химиотерапевтического агента, если указанный пациент имеет низкое соотношение IL10/IFNγ.

В соответствии с другим воплощением настоящее изобретение относится к применению соотношения IL10/IFNγ в качестве биомаркера для прогнозирования, является ли субъект или не является ли он чувствительным к развитию профилактического или терапевтического ответа, предпочтительно иммунного ответа, путем введения иммуногенной композиции.

В частности, настоящее изобретение относится к применению соотношения IL10/IFNγ в качестве биомаркера для прогнозирования, является ли субъект или не является ли он чувствительным к развитию профилактического или терапевтического ответа, предпочтительно иммунного ответа, путем введения иммуногенной композиции, где низкое соотношение IL10/IFNγ свидетельствует о том, что пациент прогнозируется как такой, который имеет повышенную чувствительность к развитию профилактического или терапевтического ответа, предпочтительно иммунного ответа.

Другими словами, настоящее изобретение относится к применению соотношения IL10/IFNγ в качестве биомаркера для прогнозирования, является ли субъект или не является ли он чувствительным к выживанию в течение более длительного периода времени после введения иммуногенной композиции, где низкое соотношение IL10/IFNγ свидетельствует о том, что субъект прогнозируется как такой, который имеет более высокий коэффициент выживаемости, по сравнению с подвергнутыми лечению пациентами, которые имеют более высокое соотношение IL10/IFNγ.

Другими словами, настоящее изобретение относится к ex-vivo способу прогнозирования, является ли субъект или не является ли он чувствительным к выживанию в течение более длительного времени после введения иммуногенной композиции, где способ анализа включает этап измерения уровней IL10 и INFγ в биологическом образце (например, крови или плазмы, или сыворотке), полученном от пациента, подсчет соотношения IL10/IFNγ, где низкое соотношение IL10/IFNγ свидетельствует о том, что пациент будет иметь более длительное выживание.

Таким образом, изобретение дополнительно относится к применению соотношения IL10/IFNγ в качестве биомаркера для прогнозирования, является ли пациент, подвергшийся химиотерапевтическому лечению с помощью химиотерапевтического агента, или не является ли он чувствительным к развитию профилактического или терапевтического иммунного ответа (например, к выживанию в течение более длительного периода времени) после введения иммуногенной композиции, где низкое соотношение IL10/IFNγ свидетельствует о том, что субъект прогнозируется как такой, который имеет повышенную чувствительность к развитию более высокого профилактического или терапевтического иммунного ответа.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу улучшения лечения ракового пациента, который подвергается химиотерапевтическому лечению с помощью химиотерапевтического агента, где указанный способ включает следующие этапы:

- измерения у пациента уровней IL10 и IFNγ,

- подсчета соотношения IL10/IFNγ, и

- введения пациенту указанной иммуногенной композиции и химиотерапевтического агента, если указанный пациент имеет низкое соотношение IL10/IFNγ в соответствии с изобретением. Изобретение также обеспечивает наборы, которые включают части для осуществления способов, описанных в данной заявке, и которые будут понятными из примеров, обеспечиваемых в данной заявке. Набор частей или наборы могут включать реагенты для сбора и/или измерения уровня sICAM-1 в общей крови, сыворотке или плазме. Такие реагенты могут включать антитела. Такие наборы могут дополнительно включать оборудование для сбора и/или обработки биологических образцов. Наборы также дополнительно приемлемым образом содержат инструкции для применения, пороговые значения и/или инструкции по их определению, а также инструкции по интерпретации данных, полученных в результате применения наборов.

Изобретение также обеспечивает наборы (то есть, сопутствующий анализ), которые включают части для осуществления способов, описанных в данной заявке, и которые будут понятными из примеров, обеспечиваемых в данной заявке. Набор частей или наборы могут включать реагенты для сбора и/или измерения сывороточных уровней IL10 и IFNγ. Такие реагенты могут включать антитела. Такие наборы могут дополнительно включать оборудование для сбора и/или обработки биологических образцов. Наборы также дополнительно приемлемым образом содержат инструкции для применения, пороговые значения (смотри выше) и/или инструкции по их определению, а также инструкции для интерпретации данных, полученных в результате применения таких наборов.

В соответствии с одним специальным воплощением указанный набор частей или наборы могут дополнительно включать иммуногенные композиции, как раскрыто выше, и/или как раскрыто в разделе "Примеры", приведенном ниже.

Изобретение дополнительно обеспечивает компьютерные программы и/или алгоритмы для мониторинга клинического исследования и уровней IL10 и IFNγ, а также соотношения IL10 и IFNγ, определения являются ли эти уровни выше или ниже порогового уровня, и/или рекомендуемые модификации к режиму лечения для улучшения ответа пациента на иммунотерапевтическое лечение. Компьютерные программы или алгоритмы могут обеспечиваться вместе с необходимым оборудованием, например, в форме набора или устройства, которое может также принимать биологические образцы и измерять относительные уровни IL10 и IFNγ, которые присутствуют в них, а также подсчитывать соотношение IL10 и IFNγ. Описанные выше компьютерные программы и/или оборудование типично обеспечивается для лечащих врачей или клинических лабораторий с приемлемыми инструкциями и реагентами, включая антитела.

Применение уровней IL10 и INFγ обеспечивается в получении алгоритма для предложенных модификаций к лечению для улучшения ответа пациента на иммунотерапевтическое лечение с помощью иммуногенной композиции.

Изобретение было описано иллюстративным образом и является понятным, что терминология, которая была использована, является предназначенной для того, чтобы больше соответствовать описанию, а не ограничению. Очевидно, что являются возможными множество модификаций и вариаций настоящего изобретения в свете приведенных выше идей. Таким образом, является понятным, что в пределах объема приложенных пунктов формулы изобретение может реализовываться путем, отличным от того, который является описанным в данной заявке.

Все приведенные выше раскрытия патентов, публикаций и номеров доступа к базам данных, являются специфически введенными в данную заявку в своей целостности в такой степени, как если бы такой индивидуальный патент, публикация или доступ были специфически и индивидуально указаны для введения в качестве ссылки.

Примеры

Фигура 1: Кривые выживания, описывающие вакцинную иммунотерапию при раке легких: пациенты с соотношением IL-10/IFNg в плазме крови ≤ или >3,7, перед началом лечения

― Группа 1: Вакцина (то есть, иммуногенная композиция)+химиотерапия у пациентов с низким соотношением IL-10/IFNγ в плазме крови. Низкое соотношение IL-10/IFNγ в плазме крови, определяемое как ≤3,7. 40 пациентов. Среднее значение выживания=21,2 месяца.

----- Группа 2: Вакцина+химиотерапия у пациентов с высоким соотношением

IL-10/IFNγ в плазме крови. Высокое соотношение IL-10/IFNγ в плазме крови, определяемое как >3,7. 21 пациент. Среднее значение выживания=5,6 месяца.

Достоверное отклонение, по степени логарифма: p=0,007.

O Полное+Цензурированное

Фигура 2: Кривые выживания, описывающие химиотерапию при раке легких: пациенты с соотношением IL-10/IFNg в плазме крови ≤ или >3,7, перед началом лечения.

― Группа 1: Химиотерапия у пациентов с низким соотношением IL10/IFNγ в плазме крови. Низкое соотношение IL-10/IFNγ в плазме крови, определяемое как ≤3,7. 57 пациентов. Среднее значение выживания=10,8 месяцев.

----- Группа 2: Химиотерапия у пациентов с высоким соотношением IL-10/IFNγ в плазме крови. Высокое соотношение IL-10/IFNγ в плазме крови, определяемое как ≤3,7. 11 пациентов. Среднее значение выживания=8,4 месяца.

Не является достоверно различным, по степени логарифма: p=0,92.

O Полное+Цензурированное

Среди пациентов с соотношением IL10/IFNg перед началом лечения, составляющим ≤3,7, те, которых подвергали лечению с помощью TG4010+химиотерапия, имели достоверно более высокое выживание (среднее значение выживания=21,2 месяца), чем пациенты, которых подвергали лечению только с помощью химиотерапии (среднее значение выживания=10,8 месяцев) (p=0,03 по степени логарифма анализа). Среднее значение выживания среди пациентов независимо от соотношения IL-10/IFNγ не было достоверно различным: 10,7 месяцев для пациентов, которых подвергали лечению с помощью TG4010 и химиотерапии; и 10,3 месяцев для пациентов, подвергнутых лечению только с помощью химиотерапии.

Пример 1: Иммуногенную композицию, обозначенную как вакцина TG4010, использовали для лечения пациентов с немелкоклеточным раком легких (NSCLC) в комбинации со стандартной химиотерапией.

TG4010 представляет собой рекомбинантный модифицированный вирус Анкара (MVA), экспрессирующий как IL2, так и ассоциированный с опухолью антиген MUC1 (смотри Rochlitz и др., 2003, J. Gene Med., 5, 690-699).

Сто сорок восемь пациентов распределяли в случайном порядке для получения:

- химиотерапии (Цисплатин 75 мг/м² в день 1 и Гемцитабин 1250 мг/м² в день 1 и день 8 каждые 3 недели в течение вплоть до 6 циклов), взятой отдельно (ветвь исследования 2) или

химиотерапии вместе с TG4010 (ветвь исследования 1). Опухоли оценивали (критерии ВОЗ) каждые 6 недель. Критические точки представляли собой выживаемость без прогрессирования заболевания (PFS) через 6 месяцев и общее выживание с целью анализа лечения.

Образцы крови брали перед лечением в день 1 (первый день лечения) и немедленно отправляли в центральную иммунологическую лабораторию, где изолировали плазму крови и хранили в замороженном виде до анализа.

Образцы плазмы крови оценивали в центральной лаборатории на цитокины с помощью мультианалитической профилирующей системы Luminex®.

Фигура 1 показывает, что пациенты [Ветвь 1 (TG4010+химиотерапии)] с соотношением в плазме крови концентраций интерлейкина-10/интерферона гамма ≤3,7 перед терапией имели более длительное выживание (среднее значение выживания=21,2 месяца), чем пациенты с соотношением в плазме крови концентраций интерлейкина-10/интерферона гамма >3,7 перед терапией (среднее значение выживания=5,6 месяцев).

Данные на Фигуре 2 демонстрируют, что эффект отбора пациентов на основе соотношения в плазме крови концентраций интерлейкина-10/интерферона гамма ≤3,7 перед терапией является ограниченным пациентами, получающими вакцину, в том, что Фигура 2 показывает, что пациенты с соотношением в плазме крови концентраций интерлейкина-10/интерферона гамма < или >3,7 перед терапией с помощью TG4010 и имеют такое же математическое ожидание выживания.

1. Ex-vivo способ анализа, будет ли больной раком субъект отвечать терапевтически на способ лечения, включающий введение иммуногенной композиции, где способ анализа включает этапы:
- получения от пациента биологического образца, выбранного из группы, состоящей из образца общей крови, плазмы или сыворотки;
- измерения уровней IL10 и IFNγ в указанном биологическом образце, причем эти уровни определяются при использовании антител, специфических для IL10 и INFγ, соответственно;
- подсчета соотношения IL10/IFNγ,
- сравнения указанного соотношения IL10/IFNγ с пороговым уровнем, где соотношение IL10/IFNγ ниже 4 свидетельствует о том, что пациент будет развивать профилактический или терапевтический ответ на иммуногенную композицию.

2. Способ по п. 1, где указанная иммуногенная композиция содержит, по крайней мере, один рекомбинантный вектор, экспрессирующий in vivo всю или часть, по крайней мере, одной гетерологической нуклеотидной последовательности.

3. Способ по п. 2, где указанный рекомбинантный вектор представляет собой вирусный вектор.

4. Способ по п. 3, где указанный вирусный вектор является компетентным по репликации.

5. Способ по п. 3, где указанный вирусный вектор является дефектным по репликации.

6. Способ по п. 3, где указанный вирусный вектор является аденовирусным.

7. Способ по п. 3, где указанный вирусный вектор является вектором на основе вируса коровьей оспы.

8. Способ по п. 3, где указанный вирусный вектор представляет собой MVA вектор.

9. Способ по п. 1, где указанный пациент представляет собой пациента, которого лечили с помощью химиотерапевтического агента.

10. Применение IL10 и IFNγ в качестве биомаркеров, где соотношение IL10/IFNγ используется для прогнозирования, является ли больной раком пациент или нет чувствительным к развитию профилактического или терапевтического иммунного ответа при введении иммуногенной композиции.

11. Набор для анализа, будет ли больной раком пациент отвечать терапевтически на способ лечения, включающий введение иммуногенной композиции, где набор включает:
- антитела для определения уровня IL10 и IFNγ в биологическом образце пациента; выбранном группы, которая состоит из образца общей крови, плазмы или сыворотки; и
- инструкции для интерпретации данных, которые говорят о том, что низкое соотношение IL10/IFNγ свидетельствует о том, что пациент будет развивать профилактический или терапевтический ответ на иммуногенную композицию, где низкое соотношение IL10/IFNγ представляет собой соотношение менее 4.

12. Ex-vivo способ прогнозирования, повысит или нет продолжительность жизни больного раком пациента введение иммуногенной композиции, где способ анализа включает этапы:
- получения от пациента биологического образца, выбранного из группы, состоящей из образца общей крови, плазмы или сыворотки;
- измерения уровней IL10 и IFNγ в указанном биологическом образце, причем эти уровни определяются при использовании антител, специфических для IL10 и INFγ, соответственно;
- подсчета соотношения IL10/IFNγ,
- сравнения указанного соотношения IL10/IFNγ с пороговым уровнем, где соотношение IL10/IFNγ ниже 4 свидетельствует о том, что продолжительность жизни пациента будет повышена.