Способ выделения белков из клеток костного мозга

Изобретение относится к биохимии. Способ предусматривает извлечение клеток костного мозга, их суспендирование, фильтрацию суспензии и центрифугирование фильтрата. Осадки вместе с надосадочными жидкостями подвергают гомогенизации. Затем содержимое центрифужных пробирок фильтруют через капроновые фильтры. Белки раствора высаливают с помощью сульфата аммония при нагревании до 60°С, отстаивают 12 ч при температуре 4°C и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин. К надосадочной жидкости добавляют 1% раствор трихлоруксусной кислоты, затем также осадок от раствора отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 мин. Полученные осадки смывают спиртом и эфиром и высушивают на часовом стекле. К полученному порошку добавляют 0,9% раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают, затем раствор белка подвергают диализу проточной водой в течение 1-2 сут и дистиллированной водой в течение 1 ч. Раствор центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, полученные осадки смывают спиртом и эфиром, высушивают на часовом стекле. Изобретение обеспечивает упрощение способа выделения общего белка, повышение чистоты целевого продукта, сокращение времени экстракции белка, использование новых технологий, доступность, поскольку клетки костного мозга берут у сельскохозяйственных и диких животных. 3 пр.

 

Изобретение относится к биохимии, а именно, к выделению белков из клеток костного мозга трубчатых костей животных.

Описан способ получения белка, RU 2041716 C1, A61K 35/28, 20.08.1995, известного как миелопид, путем выделения клеток из костного мозга свиньи, их культивирования в питательной среде, отделения супернатанта центрифугированием, концентрирования и выделения целевого продукта гельхроматографией на колонке, заполненной сефадексом G-50. Фракции, элюированные в области выхода цитохрома G с молекулярной массой около 13000 Da, концентрируют лиофилизацией.

Известен также способ получения белка, RU 2298939 C2, A61K 35/28, 20.05.2007, путем выделения клеток их костного мозга лисиц, их суспендирование, фильтрацию, центрифугирование фильтрата, после которого осадки вместе с надосадочными жидкостями в центрифужных пробирках подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию в холодильной камере, фильтрации через капроновые фильтры и осаждению 10% раствором трихлоруксусной кислоты и последующему диализу проточной водой.

Недостатки данных способов заключаются в трудоемкости, длительности во времени и соблюдении особых условий белкового синтеза. Кроме того, конечный продукт получается недостаточно чистым.

Упрощение способа выделения общего белка из трубчатых костей костного мозга и повышение чистоты целевого продукта достигаются тем, что клетки костного мозга берут у сельскохозяйственных и диких животных. Трубчатые кости отделяют от плоти. Клетки костного мозга из бедренной или плечевой кости суспендируют путем вымывания через созданные отверстия с помощью шприца средой Игла М в колбу. Содержимое колбы тщательно перемешивают до однородного состава пипетированием. Полученные клетки суспензии пропускают через капроновые фильтры для тщательной очистки от желтого костного мозга и отмывают 3 раза охлажденной средой Игла М. Фильтрат подвергают центрифугированию в течение 5-7 мин при 3 тыс. об/мин, затем пипеткой с надосадочной жидкости снимают остатки желтого костного мозга. Далее осадки с надосадочными жидкостями подвергают гомогенизации, в результате которого достигается разрушение клеточных стенок осадка из костного мозга (который затем отбрасывают) и происходит дополнительное высвобождение белковых молекул в надосадочную жидкость, что влияет на выход конечного продукта. Для выделения белка и освобождения от обломков клеток содержимое центрифужных пробирок фильтруют через капроновые фильтры. Из осадка делают мазки, окрашивают по общепринятым методикам и просматривают под микроскопом - клетки в них не обнаруживаются (гомогенная масса), следовательно, все биологически активные вещества переходят в раствор.

Выделение общего белка проводят следующим образом.

В пробирки для центрифугирования с раствором белков добавляют раствор сульфата аммония из расчета 6 частей раствора белка 3 части раствора соли. Для лучшего осаждения белков содержимое стаканов нагревают до температуры 40-60°C (в том случае если белки осаждаются плохо). Экстракты для полного осаждения оставляют на 12 часов в холодильнике при температуре +4°C. К надосадочной жидкости добавляют 1% раствор трихлоруксусной кислоты, вследствие чего происходит дополнительное осаждение белка и увеличивается вес общего белка, выделенного из костного мозга. Осадок белков отделяют от раствора центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 минут - все перечисленные приемы, их экспозиции и режимы установлены экспериментально, благодаря которым осуществляется наиболее полноценно данный способ и конечный результат, т.е. более полное осаждение и отделение белка костного мозга от раствора. Осадки смывают небольшим количеством спирта, затем эфира и переносят на часовое стекло для высушивания. Полученные таким образом белки для дальнейшей очистки подвергают диализу с целью полного удаления растворов сульфата аммония и трихлоруксусной кислоты и восстановления гидратных оболочек пептида. Для этого раствор белка помещают в емкость, отделенную от низкомолекулярного раствора (проточная либо дистиллированная вода) коллодийной пленкой. Диализ проводят проточной водой в течение 1-2 суток при непрерывной подаче и дистиллированной водой в течение 1-2 часов. Отсутствие соли контролируют нейтральной реакцией с индикатором.

Пример 1.

Бедренные кости от 6 коз отделяют от плоти, затем проводят распил кости с двух сторон в центре и вымывают костное содержимое средой Игла М в колбу. Клеточные суспензии фильтруют через капроновые фильтры, которые предварительно стерилизуют. Фильтрат центрифугируют в течение 7-10 минут при 3 тыс. об/мин. Осадок и надосадочную жидкость подвергают гомогенизации с помощью гомогенизатора типа Mini Mix 100VW в течение 12-15 минут. Впоследствии проводят подсчет клеток суспендированного осадка средой Игла М в разведении 1:10 в камере Горяева, в осадке обнаруживается гомогенная масса. Содержимое центрифужных пробирок вновь фильтруют через капроновые фильтры. Белки осаждают из раствора путем высаливания раствором сульфата аммония из расчета на 6 частей раствора белка 3 части сульфата аммония, оставляют отстаиваться на 12 часов. Осадок от раствора отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 минут. К надосадочной жидкости добавляют 1% раствор трихлоруксусной кислоты, затем также осадок от раствора отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 минут. Осадки смывают спиртом и эфиром, высушивают на часовом стекле, взвешивают.

Вес общего белка, выделенного из костного мозга коз, составляет 206±0,34 мг. Белок представляет собой сухой аморфный порошок светло-коричневого цвета.

Пример 2.

Трубчатые кости от 4 сибирских косуль отделяют от плоти. Подготовку костного содержимого к выделению белка проводят, как описано в предыдущем примере. Белки из раствора осаждают путем высаливания сульфатом аммония из расчета на 6 частей раствора белка 3 части сульфата аммония.

Содержимое колбы нагревают до температуры 40-60°C, оставляют на 12 часов в холодильнике при температуре +4°C. В колбе наблюдаются обильные хлопья осажденного белка. К надосадочной жидкости добавляют 1% раствор трихлоруксусной кислоты, затем также осадок от раствора отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 минут. Осадок обрабатывают и высушивают, как описано выше. Вес общего белка из мозгового вещества сибиркой косули, выделенных данным способом, составляет 208±0,28 мг. Белок представляет собой аморфный порошок красно-коричневого цвета.

(В примерах 1 и 2, так же как и в примере 3, технические операции по получению белков костного мозга одинаковы и процесс диализа в них также осуществляется для дополнительной очистки при их дальнейшем использовании, однако как проводится диализ описано только в третьем примере, чтобы не повторяться и разнообразить пример).

Пример 3.

Трубчатые кости от трех лосей отделяют от плоти. Вымывание клеточных популяций, избавление от жировых прослоек и выделение белка проводят, как описано в предыдущих примерах. Вес общего белка из костного мозга лося составляет 219±0,53 мг. Сухой кристаллический белок костного мозга лося переводят в раствор. Для этого берут 0,05 г белка и добавляют 0,45 мл 0,9% раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают. Раствор белка подвергают диализу, поместив в емкость с коллодийной пленкой. Данную емкость ставят в чашу с проточной водой, которая подается непрерывно через шланг. Диализ в проточной воде протекает сутки (pH 8,0-8,5). Затем в дистиллированной воде диализ протекает в течение двух часов (нейтральная реакция индикатора). Содержание общего белка определяют с помощью биохимического анализатора типа Chem-7.

Отличительным преимуществом предлагаемого способа выделения белков из трубчатых костей костного мозга является доступность, сокращение времени экстракции белка, использование новых технологий, увеличение веса целевого продукта.

Способ выделения белков из костного мозга, предусматривающий извлечение клеток костного мозга, их суспендирование, фильтрацию суспензии, центрифугирование фильтрата, осадки вместе с надосадочными жидкостями подвергают гомогенизации, затем содержимое центрифужных пробирок фильтруют через капроновые фильтры, белки раствора высаливают с помощью сульфата аммония при нагревании до 60°С, отстаивают 12 ч при температуре 4°C и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, к надосадочной жидкости добавляют 1% раствор трихлоруксусной кислоты, затем также осадок от раствора отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 мин, полученные осадки смывают спиртом и эфиром, затем высушивают на часовом стекле, к полученному порошку добавляют 0,9% раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают, затем раствор белка подвергают диализу проточной водой в течение 1-2 сут и дистиллированной водой в течение 1 ч, центрифугирование раствора при 2000 об/мин в течение 5 мин, полученные осадки смывают спиртом и эфиром, затем высушивают на часовом стекле.