Жидкий состав фолликулостимулирующего гормона
Группа изобретений относится к области фармацевтики и касается водного состава фолликулостимулирующего гормона (hFSH) для лечения бесплодия, содержащего один или несколько стабилизаторов, L-метионин, полисорбат 20, фосфатный буфер, обеспечивающий рН в диапазоне от 6,5 до 8, воду для инъекций, дополнительно содержит хлорид натрия в качестве термостабильного средства, а также касается применения хлорида натрия в качестве термостабильного средства в водном составе hFSH. Группа изобретений обеспечивает стабильность водного состава hFSH в течение длительного периода времени, и предотвращение диссоциации альфа- и бета-субъединиц FSH человека.2 н.и 7 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл., 4 пр.
РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка относится к индийской предварительной заявке 384/MUM/2010, поданной 12 февраля 2010 г., содержание которой включено ссылкой в данный документ.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новому водному составу фолликулостимулирующего гормона человека (FSH), который стабилен в течение длительного периода времени при окружающей температуре или температуре тела, что обеспечивает приемлемый срок годности. Более конкретно, оно относится к водному составу фолликулостимулирующего гормона человека, содержащему терапевтически эффективное количество FSH человека, стабилизированного в буфере, содержащем один или несколько стабилизаторов, неионогенных поверхностно-активных веществ, антиоксидантов, неорганических солей и один или несколько консервантов.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Фолликулостимулирующий гормон (FSH) человека является гормоном, который играет важную роль в репродуктивных функциях в сочетании с лютеинизирующим гормоном (LH) и хорионическим гонадотропином (hCG) человека. Структурально FSH является гетеродимерным гликопротеином, образованным путем нековалентной ассоциации альфа- и бета-субъединиц. Альфа-субъединица состоит из 92 аминокислотных остатков, в то время как бета-субъединица состоит из 111 аминокислотных остатков, каждая из них сохраняет два Asn-связанных сайта гликозилирования.
До 1980-х гг. основным источником FSH была моча беременных женщин. Затем в 1990-е гг. использовали очищенную форму FSH, полученную из мочи, а позже разработали рекомбинантный FSH, который широко используют с 1998 г. С приходом метода рекомбинантной ДНК стало возможным производить FSH человека в культурах клеток, трансфицированных последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими альфа- и бета-цепи. Последовательности ДНК, кодирующие альфа- и бета-цепи, и способы продуцирования рекомбинантного FSH были раскрыты в WO 88/10270, WO 86/04589 и ЕР 0735139. FSH стимулирует рост и созревание фолликулов яичников у женщин. Таким образом, FSH является важным гормоном, ответственным за овуляцию у женщин и используется в лечении бесплодия для ановуляторных бесплодных женщин.
В настоящее время на рынке существуют четыре продукта рекомбинантного FSH человека; Gonal - F® и Gonal-F RFF® от Merck Serono, Puregon® и Follistim AQ® от Organon (Sobering Plough), которые производят в клетках яичника китайского хомячка (СНО) с помощью методики рекомбинантной ДНК.
В целом белки имеют очень короткий период полужизни и подвергаются денатурации (такой как агрегации, диссоциации и адсорбции на поверхности сосудов) при воздействии различных факторов, таких как неблагоприятные температуры, граница раздела фаз вода-воздух, высокое давление, физический/механический стресс, органические растворители и микробное загрязнение. Таким образом, денатурированный белок теряет присущие ему физико-химические свойства и физиологическую активность. Денатурация белков часто является необратимой и, следовательно, белки, однажды денатурированные, могут не восстановить свои нативные свойства до исходного состояния.
В частности, белки, которые имеют гетеродимерную структуру из двух различных субъединиц, такие как FSH, имеют тенденцию диссоциировать в водных растворах и адсорбироваться на внутренней поверхности сосудов. Диссоциированные белки теряют их собственную физиологическую активность, и диссоциированные мономеры легко поддаются диссоциации и агрегации. Кроме того, белки, адсорбированные на внутренней поверхности сосудов, чувствительны к агрегации из-за процесса денатурации. Когда их вводят в организм человека, агрегированные белки могут послужить причиной формирования антител к инъецированному белку, а также к белку природного происхождения в организме человека. Таким образом, белки, представляющие интерес, следует вводить в достаточно стабильном состоянии. С этой целью были проведены многочисленные исследования по разработке способа предотвращения денатурации белков в растворе.
Для преодоления проблемы стабильности белков некоторые из лекарственных продуктов на основе белка изготавливаются более стабильными путем лиофилизации (замораживания-высушивания). Так, например, US 5270057 раскрывает лиофилизированный состав, содержащий гонадотропин, стабилизированный с помощью многоосновной карбоновой кислоты, или ее соли, предпочтительно лимонной кислоты, и невосстанавливающийся дисахарид сахарозу. US 5650390 раскрывает лиофилизированный состав, содержащий FSH, LH или hCG, стабилизированные посредством сочетания сахарозы и глицина. Тем не менее, лиофилизированные продукты неудобны тем, что их приходится растворять в воде для инъекций (WFI) для восстановления перед их применением. Кроме того, процесс получения лиофилизированных продуктов включает этап замораживания-высушивания, который может приводить к повреждению, вызванному замораживанием, лиофилизированного белка.
US 5929028 раскрывает стабильный жидкий состав гонадотропина, который получают путем растворения гонадотропина [т.е. LH, TSH (тиреостимулирующий гормон), FSH и hCG], с использованием разбавителя, состоящего из стабилизирующего количества многоосновной карбоновой кислоты или ее соли, стабилизирующего количества тиоэфирного соединения, невосстанавливающегося дисахарида, подобного сахарозе, и неионогенного поверхностно-активного вещества. В соответствии с известным уровнем техники цитрат натрия описывается как наиболее предпочтительная форма многоосновной карбоновой кислоты или ее соли, и состав содержит 1,47% цитрата натрия. Эту композицию следует хранить охлажденной при 2-8°С до распределения. При распределении продукт может храниться пациентом при 2-8°С до даты истечения срока годности или при 25°С (77°F) или ниже в течение трех месяцев, в зависимости от того, что наступит раньше.
Заявка ЕР 1610822 описывает фармацевтические составы FSH, LH и смеси FSH и LH, а также способы получения таких составов. Изобретение описывает жидкий или замороженно-высушенный состав FSH или LH, или FSH и LH, содержащий поверхностно-активное вещество, выбранное из Pluronic®F77, Pluronic®F87, Pluronic®F88 и Pluronic®F68. Композиция, которая описана в этой патентной заявке, требует охлаждения при 2-8°С до распределения. При восстановлении с помощью разбавителя шприц-ручка, содержащий лекарственный продукт, может храниться пациентом при 2-8°С до даты истечения срока годности или при комнатной температуре 20-25°С в течение до трех месяцев или до даты истечения срока годности, в зависимости от того, что наступит раньше.
WO 2007/037607 раскрывает водный состав FSH, который стабилизирован для поддержания активности FSH в течение длительного периода времени. Патентная заявка заявляет водный состав, содержащий терапевтически эффективное количество FSH, стабилизированного в фосфатном буфере, содержащем глицин, метионин и неионогенное поверхностно-активное вещество, предпочтительно полисорбат 20, который способен поддерживать активность FSH в течение продолжительного периода времени. Композиция содержит глицин, метионин, полисорбат 20 в качестве стабилизатора и 90% чистого FSH, который стабилен при комнатной температуре до шести месяцев и подвергается меньшему окислению.
Заявка WO 2009/098318 раскрывает жидкую фармацевтическую композицию, содержащую полипептид FSH, бензалкония хлорид и бензиловый спирт в качестве консервантов. Композиция также необязательно включает один или несколько дополнительных фармацевтически приемлемых наполнителей. В одном варианте осуществления композиция содержит метионин в качестве антиоксиданта. Композиция показывает хорошую стабильность при хранении при 2-8°С. Этот водный состав FSH, содержащий полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества, маннит в качестве модификатора тоничности, фосфат в качестве буфера, метионин в качестве стабилизирующего средства, бензиловый спирт и бензалкония хлорид в качестве консервантов, предотвращает потерю белка, а также диссоциацию белка на составляющие мономеры, таким образом стабилизируя FSH в течение длительного периода времени.
Как видно из приведенного выше уровня техники, композицию FSH необходимо хранить охлажденной при 2-8°С до распределения. При распределении продукт может храниться пациентом при 2-8°С до даты истечения срока годности или ниже 25°С (77°F) в течение трех месяцев, в зависимости от того, что наступит раньше. Таким образом, существует необходимость в разработке нового термостабильного водного состава FSH, который стабилизирован для поддержания его активности даже при повышенных температурах (например, при температуре тела), поскольку FSH вводится самостоятельно, было бы удобно носить его с собой во время путешествия или хранить без необходимости содержания продукта в охлажденном состоянии (2-8°С).
Настоящее изобретение решает проблемы, с которыми сталкивается конечный пользователь, которому нужно носить продукт с собой в жидкой форме при комнатной температуре, окружающей температуре или при температуре тела без необходимости охлаждения в течение длительного периода времени, чтобы гарантировать приемлемый срок годности.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предусматривает новый водный состав фолликулостимулирующего гормона человека (FSH), который стабилен в течение длительного периода времени при температуре окружающей среды или тела, что тем самым обеспечивает приемлемый срок годности.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает водный состав FSH человека, содержащий терапевтически эффективное количество FSH человека, стабилизированного в буферной системе, содержащей один или несколько стабилизаторов, неионогенное поверхностно-активное вещество, антиоксидант, неорганическую соль и один или несколько консервантов.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает состав FSH человека или его вариант и неорганическую соль, выбранную из группы, состоящей из хлорида натрия, хлорида кальция и хлорида калия, которая действует как термостабильное средство.
В еще одном аспекте состав содержит полиол, который представляет собой сахарозу, трегалозу, мальтозу, маннит, сорбит, мальтит или ксилит или отдельно, или в их комбинации.
Состав FSH человека также состоит из неионогенного поверхностно-активного вещества на основе полисорбата или неионогенного поверхностно-активного вещества на основе полоксамера или их комбинации. В одном аспекте новый водный состав FSH человека также содержит антиоксидант, выбранный из группы, состоящей из L-метионина, бисульфита натрия, солей этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), бутилированного гидрокситолуола (ВНТ) и бутилированного гидроксиланизола (ВАН).
Настоящее изобретение также предусматривает добавление одного или нескольких консервантов к составу FSH человека, выбранных из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, алкилпарабена, бензетония хлорида, натрия дегидроацетата и тимерозала или их комбинации.
Новый водный состав FSH человека содержат при рН от около 6,5 до 7,2 в буферной системе, выбранной из группы буферов, состоящей из фосфата, сукцината, ацетата, цитрата, аргинина, TRIS и гистидина или их комбинации.
Настоящее изобретение предусматривает состав FSH человека, содержащий хлорид натрия, трегалозу, маннит, полисорбат 20, L-метионин, фенол, моногидрат одноосновного фосфата натрия и дигидрат двухосновного фосфата натрия и поддерживаемый при рН от около 6,5 до 7,2.
Настоящее изобретение также предусматривает состав FSH человека, содержащий сахарозу, L-метионин, полисорбат 20, фенол, моногидрат одноосновного фосфата натрия и дигидрат двухосновного фосфата натрия и поддерживаемый при рН от около 6,5 до 7,2.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фигура 1 показывает сравнение диссоциации альфа- и бета-субъединиц рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека в композиции, хранившейся при 40°С в течение 7 суток.
Дорожка 1: Предварительно окрашенный маркер.
Дорожка 2: Буфер для образца.
Дорожка 3: Композиция, приведенная в таблице 1 (4,4 мкг загруженного белка).
Дорожка 4: Эталонный медицинский продукт (Gonal F RFF - ручка) (4,4 мкг загруженного белка).
Дорожка 5: 0,22 мкг диссоциированного (посредством кипячения) FSH (5,0% из 4,4 мкг).
Дорожка 6: 0,11 мкг интактного FSH (2,5% из 4,4 мкг).
Дорожка 7: Буфер для образца.
Фигура 2 показывает сравнение диссоциации альфа- и бета-субъединиц рекомбинантного фолликулостимулирующого гормона человека в композиции, хранившейся при 2-8°С в течение 3 месяцев.
Дорожка 1: Предварительно окрашенный маркер.
Дорожка 2: Композиция, приведенная в таблице 1 (2,2 мкг загруженного белка).
Дорожка 3: 0,44 мкг диссоциированного (посредством кипячения) FSH (10,0% из 4,4 мкг).
Дорожка 4: 0,22 мкг диссоциированного (посредством кипячения) FSH (5,0% из 4,4 мкг).
Дорожка 5: 0,11 мкг диссоциированного (посредством кипячения) FSH (2,5% из 4,4 мкг).
Дорожка 6; 0,04 мкг диссоциированного (посредством кипячения) FSH (1,0% из 4,4 мкг).
Дорожка 7: 0,02 мкг интактного FSH (0,5% из 4,4 мкг).
Дорожка 8: 0,04 мкг интактного FSH (1,0% из 4,4 мкг).
Дорожка 9: Композиция, приведенная в таблице 1 (4,4 мкг загруженного белка).
Дорожка 10: Композиция, приведенная в таблице 1 (4,4 мкг загруженного белка).
Дорожка 11: Композиция, приведенная в таблице 1 (4,4 мкг загруженного белка).
Фигура 3 показывает сравнение диссоциации альфа- и бета-субъединиц рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека в композиции, хранившейся при 25°С в течение 3 месяцев
Дорожка 1: Предварительно окрашенный маркер.
Дорожка 2: Композиция, данная в таблице 1 (нанесенный белок 2,2 мкг).
Дорожка 3: 0,44 мкг диссоциированного (посредством кипячения) FSH (10,0% из 4,4 мкг).
Дорожка 4: 0,22 мкг диссоциированного (посредством кипячения) FSH (5,0% из 4,4 мкг).
Дорожка 5: 0,11 мкг диссоциированного (посредством кипячения) FSH (2,5% из 4,4 мкг).
Дорожка 6: 0,04 мкг диссоциированного (посредством кипячения) FSH (1,0% из 4,4 мкг).
Дорожка 7:0,04 мкг интактного FSH (1,0% из 4,4 мкг).
Дорожка 8: 0,02 мкг интактного FSH (0,5% из 4,4 мкг).
Дорожка 9: Композиция, приведенная в таблице 1 (4,4 мкг загруженного белка).
Дорожка 10: Композиция, приведенная в таблице 1 (4,4 мкг загруженного белка).
Дорожка 11: Композиция, приведенная в таблице 1 (4,4 мкг загруженного белка)
Фигура 4 показывает сравнительный профиль RP-HPLC композиции, приведенной в таблице 1 с эталонным медицинским продуктом.
Фигура 5 показывает сравнительный профиль SE-HPLC композиции, приведенной в таблице 1 (красная линия) с эталонным медицинским продуктом (синяя линия).
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новому водному составу FSH, который стабилизирован для поддержания его активности при повышенной температуре с диссоциацией менее 5% после 2 часов пребывания при 55°С.
В одном варианте осуществления водный состав настоящего изобретения включает рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон человека вместе с подходящими буферами, антиоксидантами, неионогенными поверхностно-активными веществами, одним или несколькими стабилизаторами, неорганическими солями и необязательно одним или несколькими консервантами.
Фолликулостимулирующий гормон человека (FSH) получают с помощью методики рекомбинантной ДНК. Для FSH, являющегося сложным гетеродимерным белком, линию эукариотических клеток отобрали для осуществления работы (клетки яичника китайского хомячка). Фармацевтический препарат рекомбинантного FSH человека (pFSH) отличается от такового человеческого менопаузального гонадотропина (hMG) и первого поколения мочевого FSH (мFSH) с точки зрения источника основной массы белка, чистоты, специфичной активности, адекватности характеристик разных партий и полного отсутствия активности лютеинизирующего гормона.
Для поддержания рН состава применяют буферы. В еще одном варианте осуществления буферная система, которую применяют в настоящем составе, включает фосфатный буфер, сукцинатный буфер, ацетатный буфер, цитратный буфер, аргинин, TRIS буфер, гистидин или отдельно, или в подходящей комбинации, дающей желаемый диапазон рН от 6,5 до 8. Предпочтительно используемым буфером является фосфатный буфер или отдельно, или в комбинации.
Антиоксидант, как используется в данном документе, относится к химическому реагенту, который уменьшает количество примеси/частиц окисленного FSH в растворе, содержащем FSH. Антиоксидант, используемый в настоящем изобретении, выбирают из группы, состоящей из L-метионина, бисульфита натрия, солей этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), бутилированного гидрокситолуола (ВНТ) и бутилированного гидроксиланизола (ВАН). Более предпочтительным антиоксидантом является L-метионин.
Неионогенное поверхностно-активное вещество применяют в настоящем изобретении для того, чтобы предотвратить адсорбцию FSH или варианта FSH на поверхности флакона, ампулы, карпулы, картриджа или шприца. Неионогенные поверхностно-активные вещества снижают поверхностное натяжение белкового раствора, таким образом предотвращая его адсорбцию или агрегацию белков на гидрофобной поверхности. Предпочтительные примеры неионогенного поверхностно-активного вещества, которое применяют в настоящем изобретении, могут включать неионогенное поверхностно-активное вещество на основе полисорбата и неионогенное поверхностно-активное вещество на основе полоксамера или отдельно, или в комбинации.
Стабилизаторы, используемые в настоящем изобретении, выбирают из группы, состоящей из аминокислот, таких как глицин и аланин, или отдельно, или в их комбинации, моносахарида, такого как глюкоза, фруктоза, ксилоза и маноза, или отдельно, или в комбинации, полиолов, таких как сахароза, трегалоза, мальтоза, маннит, сорбит, мальтит и ксилит, или отдельно, или в их комбинации. Присутствие полиолов защищает молекулы во время хранения при относительно высокой температуре.
Консерванты относятся к наполнителю или веществу, добавленному к составу, которое действует в качестве бактериостатического средства при наполнении как мультидоза.
Консервированный FSH или вариант FSH, содержащий состав настоящего изобретения, преимущественно отвечает предусмотренным законом или нормативным требованиям в отношении эффективности консервантов, являющихся коммерчески пригодным мультидозовым продуктом, предпочтительно для людей. Консерванты, используемые в настоящем изобретении, выбирают из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, алкилпарабена (метил, этил, пропил, бутил и т.д.), бензетония хлорида, натрия дегидроацетата и тимерозала, или отдельно, или в их комбинации.
Неорганические соли настоящего изобретения включают без ограничения хлорид натрия, хлорид кальция и хлорид калия. Эти соли действуют как термостабильные средства путем увеличения температуры плавления продукта, а также уменьшения неспецифичного взаимодействия молекулы, таким образом повышая стабильность продукта при более высоких температурах. Они также предотвращают диссоциацию интактного FSH на альфа- и бета-субъединицы.
Следующие примеры иллюстрируют фармацевтические композиции, описанные в настоящем изобретении, и средства осуществления настоящего изобретения для получения термически стабильного фармацевтического состава FSH человека. Данные примеры не следует, тем не менее, истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Пример 1. Получение рекомбинантного FSH человека с помощью методики рекомбинантной ДНК
Рекомбинантный FSH человека получают в трансфицированных хозяйских клетках СНО с помощью общепринятых способов.
Пример 2. Получение водного состава hFSH с трегалозой и манпитом
Буфер состава, содержащий моногидрат однонатриевого дигидрофосфата и дигидрат двунатриевого гидрофосфата для приготовления фосфатного буфера рН 7,0. Маннит, трегалозу и хлорид натрия добавляют в фосфатный буфер в качестве модификатора тоничности и стабилизатора. L-Метионин добавляют в раствор в качестве антиоксиданта и полисорбат 20 в качестве стабилизатора для получения буфера состава, рН регулируют раствором фосфорной кислоты или раствором гидроксида натрия для получения рН 7,0±0,2. Достигают объема 100% с помощью WFI и перемешивают раствор до однородности. Требуемые количества буфера состава и фенол перемешивают для формирования однородной смеси. Рассчитанное количество лекарственного вещества rHu FSH добавляют с постоянным перемешиванием до полного формирования однородной смеси.
| Таблица 1 | ||
| Состав hFSH | ||
| № п/п | Компонент | Концентрация |
| 1. | Фоллитропин (hFSH) | 0,05 мг/мл |
| 2. | Трегалоза | 30 мг/мл |
| 3. | Маннит | 30 мг/мл |
| 4. | Хлорид натрия | 5,8 мг/мл |
| 5. | Моногидрат одноосновного фосфата натрия | 0,45 мг/мл |
| 6. | Дигидрат двуосновного фосфата натрия | 1,1 мг/мл |
| 7. | L-Метионин | 0,5 мг/мл |
| 8. | Полисорбат 20 | 0,1 мг/мл |
| 9. | Фенол | 3 мг/мл |
| 10. | Вода для инъекций |
Пример 3. Тест на стабильность водных составов hFSH
Биологические тесты проводили в соответствии с нормами Европейской фармакопеи.
Концентрация белка с помощью SE-HPLC
Состав из примера 1 оценивали на содержание белка по FSH с использованием способа эксклюзионной HPLC.
Содержание белка измеряли в нулевое время и через 1, 2, 3 и 6 месяцев хранения состава при 5±3°С, 25±2°С. Результаты перечислены в таблице 1 как микрограммы FSH на 1 грамм растворителя.
Анализ обращенно-фазовой HPLC по окислению
Водный состав примера 1 оценивали на содержание белка по FSH с использованием способа обращенно-фазовой HPLC.
Чистоту измеряли в нулевое время и через 1, 2, 3 и 6 месяцев хранения состава при 5±3°С, 25±2°С. Результаты перечислены в таблице 2.
Диссоциация
Для состава, приведенного в таблице 1, процентное соотношение свободной субъединицы оценивали с помощью SDS-PAGE. Измерения проводили в нулевое время и через 1, 2, 3 и 6 месяцев хранения при 5±3°С, 25±2°С. Результаты представлены в таблице 2.
Анализ in vivo no FSH
Состав таблицы 1 тестировали на активность FSH с использованием биоанализа in vivo в нулевое время и через 1, 2, 3 и 6 месяцев хранения при 5±3°С, 25±2°С. Результаты предоставлены в таблице 2 как международные единицы на 1 грамм растворителя.
РН
рН состава таблицы 1 измеряли в нулевое время и после 1, 2, 3 и 6 месяцев хранения при 5±3°С, 25±2°С. Результаты перечислены в таблице 2.
Определение олигомера с помощью SE-HPLC
Процентное соотношение олигомера для состава таблицы 1 измеряли в нулевое время и через 1, 2, 3 и 6 месяцев хранения при 5±3°С, 25±2°С с помощью SE-HPLC. Результаты предоставлены в таблице 2.
| Таблица 2 | ||||||||||
| Аналитические параметры для жидкого состава FSH в нулевое время и после хранения при 5±3°С, 25°С в течение 1, 2, 3 и 6 месяцев | ||||||||||
| Анализ | Нулевое время | 1 месяц | 2 месяца | 3 месяца | 6 месяцев | |||||
| 5±3°С | 25±2°С | 5±3°С | 25±2°С | 5±3°С | 25±2°С | 5±3°С | 25±2°С | 5±3°С | 25±2°С | |
| Концентрация белка с помощью SE-HPLC (мкг/мл) | 44,75 | 44,75 | 44,47 | 44,70 | не тестировано | не тестировано | не тестировано | не тестировано | не тестировано | не тестировано |
| Анализ обращенно-фазовой HPLC по окислению | 1,42% | 1,42% | 1,49% | 1,75% | 1,60% | 1,88% | 1,67% | 2,23% | 1,81% | 2,74% |
| Диссоциация | <1% | <1% | <1% | <1% | <1% | <1% | <1% | <2,5% | не тестировано | не тестировано |
| In vivo анализ по FSH (МЕ/мг) | 12319 | 12319 | не тестировано | не тестировано | не тестировано | не тестировано | не тестировано | не тестировано | не тестировано | 14708 |
| In vitro анализ по FSH (МЕ/мг) | 16169 | 16169 | 9179 | 13803 | 15406 | 9794 | 15616 | 13848 | 12340 | 13170 |
| рН | 6,89 | 6,89 | 7,00 | 7,00 | 6,98 | 7,00 | 7,06 | 7,04 | 7,08 | 7,09 |
| Определение олигомера (SE-HPLC) | 0,06% | 0,06% | 0,07% | 0,06% | 0,13% | 0,16% | 0,15% | 0,17% | 0,15% | 0,20% |
Пример 4. Тест на стабильность водных составов hFSH
Концентрация белка с помощью SE-HPLC
Состав, представленный в таблице 1, оценивали на содержание белка по FSH с использованием способа эксклюзионной HPLC. Содержание белка измеряли в нулевое время и через 1, 3, 7 и 15 суток хранения состава при 40°С. Результаты перечислены в таблице 3 как микрограммы FSH на 1 грамм растворителя.
Анализ обращенно-фазовой HPLC на чистоту
Водный состав примера 1 оценивали на содержание белка по FSH с использованием способа обращенно-фазовой HPLC. Чистоту измеряли в нулевое время и через 1, 3, 7 и 15 суток хранения состава при 40°С. Результаты перечислены в таблице 3.
Окисление
Процентное соотношение окисленных форм FSH измеряли с помощью способа обращенно-фазовой HPLC. Процентное соотношение окисленной формы FSH измеряли в нулевое время и через 1, 3, 7 и 15 суток хранения состава при 40°С. Результаты перечислены в таблице 3.
Диссоциация
Для состава таблицы 1 процентное соотношение свободной субъединицы оценивали с помощью SDS-PAGE. Измерения проводили в нулевое время и через 1, 3, 7 и 15 суток хранения состава при 40°С. Результаты предоставлены в таблице 3.
Анализ in vivo на FSH
Состав таблицы 1 тестировали на активность FSH с использованием биоанализа in vivo в нулевое время и через 1, 3, 7 и 15 суток хранения состава при 40°С. Результаты перечислены в таблице 2 как международные единицы на 1 грамм растворителя.
рН
рН состава примера 1 измеряли в нулевое время и через 1, 3, 7 и 15 суток хранения состава при 40°С. Результаты перечислены в таблице 3.
| Таблица 3 | |||||
| Результаты тестов стабильности по составу hFSH | |||||
| Нулевое время | 1 сутки | 3 суток | 7 суток | 15 суток | |
| Анализ | |||||
| 40°С | 40°С | 40°С | 40°С | 40°С | |
| Концентрация белка с помощью SE-HPLC (мкг/мл) | 44,75 | 44,15 | 42,48 | 42,45 | 41,67 |
| Анализ обращенно-фазовой HPLC по чистоте окисления | 1,42% | 1,57% | 1,6% | 1,74% | 2,11% |
| Диссоциация | <1% | <2,5% | <2,5% | <5% | не тестировано |
| Анализ in vivo по FSH | 12319 | не тестировано | не тестировано | 12055 | не тестировано |
| Анализ in vitro no FSH | 16169 | 9872 | 11163 | 10110 | 9402 |
| рН | 6,89 | 7,00 | 6,99 | 6,99 | 6,99 |
| Определение олигомера (SE-HPLC) | 0,06% | 0,08% | 0,09% | 0,16% | 0,18% |
Как видно из приведенных выше результатов, водный состав настоящего изобретения (который представлен в таблице 1), содержащий трегалозу и маннит в качестве стабилизатора, полисорбат в качестве поверхностно-активного вещества, метионин в качестве противоокисляющего средства и фенол в качестве консерванта, поддерживаемый при рН около 6,7 и 7,2 с использованием фосфата в качестве буферов, в соответствие с настоящим изобретением предотвращает диссоциацию, окисление, денатурацию и может стабильно сохранять активность rHu FSH в течение длительного периода времени.
Состав, полученный в соответствии с указанным настоящим изобретением, включает эффективное количество биологически активного фолликулостимулирующего гормона человека, который можно применять в лечении бесплодия людей. Их предпочтительно применяют в виде инъекционных водных растворов.
Новый термостабильный водный состав фолликулостимулирующего гормона человека, описанный в настоящем изобретении, обладает следующими преимуществами:
1) предусматривает простоту использования;
2) предусматривает применение неорганических солей, которые предотвращают диссоциацию альфа- и бета-субъединиц фолликулостимулирующего гормона человека;
3) предусматривает лучшую стабильность водного состава для сохранения его активности в течение длительного периода времени для обеспечения приемлемого срока годности;
4) предусматривает лучшую стабильность водного состава при повышенных температурах.
.
1. Водный состав фолликулостимулирующего гормона человека (FSH) для лечения бесплодия, содержащий один или несколько стабилизаторов, L-метионин, полисорбат 20, фенол, фосфатный буфер, обеспечивающий pH в диапазоне от 6,5 до 8, и воду для инъекций, отличающийся тем, что он дополнительно содержит хлорид натрия в качестве термостабильного средства.
2. Состав по п. 1, где хлорид натрия присутствует в концентрации примерно 5,8 мг/мл.
3. Состав по п. 1, содержащий один или несколько полиолов в качестве стабилизаторов.
4. Состав по п. 3, где полиол выбран из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, мальтозы, маннита, ксилита, мальтита и сорбита или их комбинации, и предпочтительно полиол представляет собой трегалозу и маннит.
5. Состав по п. 3 или 4, где каждый полиол присутствует в концентрации примерно 30 мг/мл.
6. Состав по п. 1, где поддерживается pH от 6,5 до 7,2.
7. Состав по п. 1, содержащий FSH человека, хлорид натрия в качестве термостабильного средства, трегалозу и маннит в качестве стабилизаторов, полисорбат 20 в качестве неионного поверхностно-активного вещества, L-метионин в качестве антиоксиданта, фенол в качестве консерванта, фосфатный буфер, обеспечивающий pH в диапазоне от 6,5 до 7,2, и воду для инъекций.
8. Состав по п. 7, содержащий FSH человека в концентрации 0,05 мг/мл, хлорид натрия в концентрации 5,8 мг/мл, трегалозу в концентрации 30 мг/мл, маннит в концентрации 30 мг/мл, L-метионин в концентрации 0,5 мг/мл, полисорбат 20 в концентрации 0,1 мг/мл, фенол в концентрации 3 мг/мл, фосфатный буфер в концентрации 1,55 мг/мл, обеспечивающий pH 7,0±0,2, и воду для инъекций.
9. Применение хлорида натрия, возможно в комбинации с одним или несколькими полиолами, в качестве термостабильного средства в водном составе для предотвращения диссоциации альфа- и бета-субъединиц FSH человека.
