Штамм bacillus subtilis, вырабатывающий пептид с противомикробной активностью, и способ ингибирования нежелательных микроорганизмов в материале с использованием штамма
Владельцы патента RU 2553547:
ИНВЕСТИГАСЬОН ДЕ ТЕКНОЛОГИЯ АВАНЗАДА, С.А. ДЕ К.В. (MX)
Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм Bacillus subtilis Maseca-1, вырабатывающий пептид, имеющий противомикробную активность против Micrococcus luteus, Bacillus cereus и Aspergillus flavus. Штамм депонирован в АТСС под номером РТА-8831. Штамм был выделен из перикарпия никстамализованной кукурузы. Предложен также способ ингибирования Micrococcus luteus, Bacillus cereus и Aspergillus flavus в материале, содержащем или подвергнутом действию указанных микроорганизмов. Способ включает воздействие эффективного количества указанного штамма на материал. Группа изобретений обеспечивает эффективное ингибирование роста патогенных микроорганизмов Micrococcus luteus, Bacillus cereus и Aspergillus flavus. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 13 ил., 7 табл.
Настоящее изобретение относится к выделенным биологически чистым культурам новых спорообразующих видов Bacillus, а более конкретно к изоляту Bacillus subtilis Maseca-1.
Предшествующий уровень техники
Исследование противомикробных пептидов идет уже больше четырех десятилетий. Эта область привлекает большое внимание, идет поиск среди микробных видов практически из всех уголков планеты для обнаружения микробов в качестве потенциального источника терапевтических агентов, которые могут быть подвергнуты скринингу на предмет противомикробной, противогрибковой, противовирусной, иммуномодулирующей, иммуносупрессирующей, противовоспалительной и противоопухолевой активностей. Такие малые пептиды или лантибиотики (<4 кДа) характеризуются высоким содержанием в них связанных с тиоэфиром аминокислотных остатков и ненасыщенных дегидрированных остатков.
Лантибиотики весьма активны против патогенных грамположительных бактерий (например, В. cereus) и грибов (например, A. flavus), которые напрямую ответственны за некоторые переносимые с пищей заболевания. Этот класс пептидов обладает потенциалом применения в качестве биоконсерванта для защиты скоропортящихся пищевых продуктов от патогенной контаминации, предотвращения порчи, ингибирования патогенов и предотвращения инфекций у людей и животных.
Также было показано, что различные микробные виды продуцируют различные представляющие интерес полезные вторичные метаболиты. Среди них есть малые пептидные молекулы, которые представляют очень большой и разнообразный подкласс биоактивных природных продуктов, имеющих уникальные структурные признаки, участвующих в морфологии, физиологии и выживании микроба. Существуют, например, амфифильные липопептиды, которые являются агентами, агрессивно снижающими поверхностное натяжение, такие как сурфактин и противогрибковый микосубтилизин. В этих соединениях, липозаместитель играет ключевую роль в разрушении клеточной мембраны, тогда как амфифильный компонент демонстрирует деструктивные гемолитические свойства. Эти свойства делают их очень сильными противовирусными и противобактериальными соединениями.
Было показано, что употребление некоторых живых микроорганизмов в некоторых случаях оказывает благоприятное воздействие на человека и животных. Разнообразную группу микробов оценивали по такой «пробиотической» активности, включая множество видов родов Lactobacilli и Bifidobacteria. Они являются наиболее распространенными в содержащих пробиотики пищевых продуктах. Менее широко для пробиотических продуктов питания предлагаются виды Enterococcus, Saccharomyces, непатогенные Escherichia, и спорообразующие Sporolactobacillus, Brevibacillus и непатогенные Bacillus.
Симбиотическая микрофлора кишечника является комплексной экосистемой с взаимодействиями между клетками-хозяевами, питательными веществами и микрофлорой. Тело взрослого человека содержит живую бактериальную биомассу больше чем 1014 и больше чем 400 различных видов. Пробиотические бактерии помогают держать патогенные бактерии в жестких рамках. Также «симбиотические» бактерии из промышленных и традиционных ферментируемых пищевых продуктов могут вносить вклад в развитие здоровой желудочно-кишечной микрофлоры (например, значительное обогащение бактериальным филумом Bacteriodetes и истощение бактериального филума Firmicutes в человеческой кишечной микробиоте).
«Гигиеническая гипотеза», предложенная в 1989 году David Strachan, говорит о том, что снижение воздействия микробов окружающей среды, что наблюдается в развитых странах, коррелирует с повышенным ростом аллергий. Развитые западные страны успешно контролировали инфекционные заболевания в течение второй половины 20 века посредством улучшения санитарных условий и использованием антибиотиков и вакцин. В то же самое время шел рост числа новых заболеваний, таких как аллергии, аутоиммунные заболевания и воспалительная болезнь кишечника (IBS) как у взрослых, так и у детей. Желудочно-кишечная микрофлора известна своей способностью играть важную роль в патогенезе IBS. Также с дисбалансом в нормальной кишечной микробиоте ассоциировано ожирение.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к выделенным биологически чистым культурам новых спорообразующих видов Bacillus, а более конкретно, к Bacillus subtilis Maseca-1, учетный номер АТСС РТА-8831. Настоящее изобретение также относится к пептидам, вырабатываемым Maseca-1, которые обладают противомикробной активностью. Настоящее изобретение дополнительно относится к пробиотическим композициям, которые содержат Maseca-1.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлено изображение вегетативных клеток Bacillus subtilis Maseca-1, полученное с помощью световой микроскопии.
На фиг.2А и 2В представлен фингерпринтинг-анализ геномной ДНК штаммов Bacillus subtilis Maseca 1-4. Паттерны фингерпринтинга основаны на (GTG)5-nHP в FIG. 2А и ERIC-ПЦР в FIG 2В.
На фиг.3 показан график, иллюстрирующий филогенетическое дерево Bacillus spp. и других видов, близкородственных штаммам Maseca 1-4 на основании анализа методом максимального правдоподобия нуклеотидных последовательностей 16S рРНК.
На фиг.4А, 4В, 4С и 4D приведены хроматограммы основных пиков ЖХ-МС надосадочных жидкостей образцов Bacillus subtilis Maseca-1 и стандарта с низином (D).
На фиг.5А приведена хроматограмма основных пиков ЖХ-МС надосадочной жидкости образца Bacillus subtilis Maseca-1, демонстрирующей пик при m/z 1701,8; фиг.5В является масс-спектрометрическим анализом этого пика.
На фиг.6А и 6В приведены хроматограммы Высокоэффективной Анионообменной Хроматографии с импульсным амперометрическим детектированием (HPAEC-PAD) образцов Bacillus subtilis Maseca-1 по фруктозе из фруктозилсополимера или левана (6А) и глюкозы из глюкозилполимера или декстрана (6В).
На фиг.7 приведена хроматограмма ВЭЖХ-анализа короткоцепочечных жирных кислот образца Bacillus subtilis Maseca-1.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к выделенной биологически чистой культуре нового спорообразующего вида Bacillus, а более конкретно, к Bacillus subtilis Maseca-1, выделенного из перикарпия никстамализованной цельной кукурузы.
Следующее описание, взятое в сочетании с указанными чертежами и/или таблицами, представлено для того, чтобы позволить специалистам в данной области осуществить и применить изобретение. Различные модификации будут явным образом очевидны специалистам в данной области, и общие принципы, определенные в данном документе, могут быть применены в широком диапазоне аспектов. Таким образом, настоящее изобретение не предназначено для ограничения представленных аспектов, но должно соответствовать самому широкому объему, в соответствии с принципами и новыми признаками, раскрытыми в данном документе. Более того, следует отметить, что если явно не указано иное, фигуры, прилагаемые к данному документу, иллюстрируют его качественно и без каких-либо конкретных рамок, и предназначены, главным образом, для представления концепции настоящего изобретения. Определения
Следующие определения предназначены для обеспечения читателя общим пониманием значений терминов, но не призваны передать идею всего объема каждого термина. Скорее описания предназначены для дополнения описания и более ясно объясняют термины.
16S рДНК - термин «16S рДНК» относится к коду малой субъединицы рибосомальной РНК. 16S рДНК является широко используемой информационной макромолекулой для систематических исследований бактерий на уровнях семейства, рода вида и подвида. 16S рДНК содержит несколько консервативных последовательностей, которые могут быть использованы для того, чтобы спрогнозировать естественные взаимосвязи между состоящими в дальнем родстве видами, и несколько вариабельных областей, которые могут быть использованы для разделения близкородственных видов.
Фингерпринтинг ДНК - термин «Фингерпринтинг ДНК» относится к методу, используемому для идентификации организма на основании его профиля ДНК. Как правило, используются молекулярные методы, основанные на ПЦР. В ПЦР повторяющихся элементов используют праймеры, комплементарные естественным высококонсервативным повторяющимся последовательностям ДНК. Эти некодирующие последовательности присутствуют во множестве копий в геномах большинства грамположительных и нескольких грамотрицательных бактерий. Примеры этих повторяющихся элементов являются энтеробактериальные повторяющиеся межгенные консенсусные (ERIC) последовательности и последовательность политринуклеотида (GTG)5.
Грамположительные - термин «Грамположительные» относится к бактериям, которые окрашиваются в темный синий цвет или фиолетовый цвет при окраске по Граму (кристаллическим фиолетовым), в противоположность грамотрицательным бактериям, которые не удерживают краситель кристаллический фиолетовый и вместо этого поглощают контрастный краситель (сафранин или фуксин), таким образом становясь красными или розовыми. Грамположительные организмы способны удерживать кристаллический фиолетовый из-за повышенного количества пептидогликана во внутренней клеточной стенке и из-за характерной утраты вторичной или внешней стенки и липосахаридного слоя, обнаруженных у грамотрицательных бактерий.
Пробиотик - термин «пробиотик» относится к бактериям, которые образуют, по меньшей мере, часть временной или эндогенной флоры и тем самым оказывают благоприятный профилактический и/или терапевтический эффект на организм-хозяин. Пробиотики, как правило, считаются безопасными специалистами в данной области. Не желая быть связанными каким-либо конкретным механизмом, профилактический и/или терапевтический эффект спорообразующей бактерии данного изобретения является результатом конкурентного исключения участков связывания патогенов, конкурентного ингибирования роста патогенов из-за лучшей колонизации, паразитирования на нежелательных организмах, выработки органической и карбоновой кислоты и/или выработки других внеклеточных продуктов, обладающих противомикробной активностью, или их комбинацией. Как правило, пробиотики используются для профилактики возникновения толстокишечного или системного заболевания, в противоположность большинству лекарственных средств, которые используются для лечения заболевания. Эти толстокишечные или кишечные патологии включают антибиотик-ассоциированный колит, воспалительные болезни кишечника (IBS), такие как язвенный колит и болезнь Крона, колоректальный рак, некротизирующий энтероколит и илеотифлит. Системные расстройства включают кишечный сепсис, панкреатит и множественную системную недостаточность.
Пребиотик - термин «пребиотик» относится к неперевариваемым пищевым ингредиентам, которые стимулируют рост и/или активность бактерий в пищеварительной системе, которые являются благоприятными в отношении здоровья организма. Как правило, пребиотиками являются углеводы (такие как некрахмальные полисахариды, олигосахариды, сахарные кислоты и спирты), но определение также включает неуглеводы (такие как лигнин и гликопротеины). Определение пребиотиков не выделяет конкретную бактериальную группу. В общем, пребиотик может повышать количество и/или активность групп бактерий, которые оказывают некоторые благоприятные воздействия на хозяина, особенно по части улучшения переваривания (включая усиление абсорбции минеральных веществ) и эффективности и внутренней стимуляции иммунной системы.
Синбиотики - термин «синбиотики» относится к пищевым добавкам, синергично объединяющим живые пробиотические микроорганизмы и конкретные пребиотические субстраты. Подобный подход может селективно стимулировать рост и/или активацию метаболизма одного или большего количества стимулирующих здоровье бактерий и таким образом, улучшать благополучие хозяина.
Функциональная пища - термин «функциональная пища» является пищей, обладающей стимулирующим здоровье и предотвращающим заболевание свойством, кроме основной функции обеспечения питательными веществами. Функциональные пищевые продукты включают пищевые продукты, обогащенные стимулирующими здоровье добавками, подобные «обогащенным витаминами» продуктам, и пищевые продукты с живыми пробиотическими культурами и/или пребиотическими ингредиентами.
Введение
В данном документе описаны штаммы Bacillus subtilis, выделенные из перикарпия никстамализованной цельной кукурузы. Штаммы Bacillus, выделенные и описанные в данном документе, были охарактеризованы на основе полифазного таксономического подхода, в котором проверяются их фенотипические и генотипические принадлежности. Для специалиста весьма очевидно, что в природе происходят различные модификации и вариации с тем или иным организмом, и что описание, данное в данном документе, может быть изменено для учета любой из этих модификаций или вариаций.
Штамм Bacillus subtilis Maseca-1 был депонирован в международном депозитории, в условиях, которые гарантируют, что доступ к культуре был доступен в ходе рассмотрения данной патентной заявки кому-либо, определенному Комиссаром по Патентам и Торговым Знакам, уполномоченным для этой цели согласно 37 C.F.R. 1.14 и 35 U.S.C. 122. Штамм Bacillus Maseca-1, раскрытый в данном описании, был депонирован в Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), 10801 University Blvd., Манассас, Виргиния, 20110 США, как РТА-8831. Депозит был получен АТСС 12 декабря 2007 года и ему Международным Депозитарным Органом был присвоен учетный номер РТА-8831. Депозит был осуществлен и получен Международным Депозитарным Органом согласно положениям Будапештского Договора, и все ограничения к публичном доступу к депозиту будут бесповоротно устранены после получения патента на эту заявку. Депозиты будут доступны как того требуют иностранные патентные законы в странах, в которых поданы аналоги рассматриваемой заявки, или происходящие из нее заявки. Следует понимать, однако, что доступность депозитов не является основанием для разрешения осуществления на практике рассматриваемой заявки в отступление от патентных прав, выданных решением государственной власти.
Кроме того, рассматриваемые культуральные депозиты будут храниться и станут доступными для общества в соответствии с положениями Будапештского Договора о Депонировании Микроорганизмов, т.е. они будут храниться со всей предосторожностью, необходимой для сохранения их живыми и незагрязненными в течение периода времени, по меньшей мере, пяти лет после наиболее недавнего запроса на предоставления образца депозита, и в любом случае в течение периода времени, по меньшей мере, тридцати (30) лет после даты депонирования или в течение обладающего правовой защитой периода существования любого патента, который может пустить в обращение описанные культуры. Депозитор подтверждает обязанность заменить депозит(ы) так, чтобы депозитарий был способен предоставить образец, запрашиваемый согласно условиям депозита(ов).
Способы
Способ сбора, выделения и характеризация, описанные в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей. Следует понимать, что вид В. subtilis может быть собран и выделен с любой поверхности, на которой присутствует бактерия, и что могут существовать другие способы описания вида. Следующие методы являются неограничивающими примерами для завершения описанного способа или метода.
Получение и выделение образца
Штаммы Bacillus subtilis Maseca выделяли из перикарпия никстамализованной цельной кукурузы, которая была выращена в Амарилло, Техас, и в Чихуахуа, Мексика. Изначально были выделены и обозначены как Maseca-1, Maseca-2, Maseca-3 и Maseca-4 четыре штамма.
Процесс никстамализации (щелочная варка) происходит, например, когда кукурузу готовят при 80°С-90°С в растворе извести (>0,2% гидроксида кальция) в течение 20-40 мин, отмачивают и отмывают при температурах окружающей среды, перемалывают, а затем сушат для получения муки никстамализованной цельной кукурузы или муки-масы (например, муки марки «MASECA®»). Отмачивание используется для описания процесса смягчения или гидратации (например, до влажности 30%-40%), который происходит, когда промышленно приготовленной в щелочи кукурузе (никстамалю) позволяют охладиться в условиях окружающей среды (например, 60-150 минут при 35°С-40°С) и когда отделение крахмала от кукурузы, как в промышленных операциях влажного помола, не является целью. С другой стороны выработка крахмала включает обработку кислотой (например, диоксидом серы) и молочнокислое брожение (например, эндогенными Lactobacillus spp.) в ходе погружения или замачивания цельных зерен кукурузы в противотоке (например, 24-48 часов, 45°С-50°С при влажности 50%-65%). Основным результатом является дисперсия белка эндосперма/зеина и высвобождение крахмала в ходе последующих влажного помола и фракционирования зародыша и перикарпия с настолько малой потерей эндосперма, насколько это возможно перед его конечной сушкой.
Эндогенный и эндофитный бактериальный штамм был идентифицирован из промышленного никстамализованного перикарпия цельной кукурузы и помещен в питательный агар при 30°С-35°С (pH 6,5-7,5) на 18-24 часов. Репрезенативные колонии с агаровых чашек были окрашены по Граму и проверены микроскопически для определения морфологии и подвижности штамма. Колонии также пересевали штрихом на скошенную среду с питательным агаром, инкубировали при 35°С в течение 24 ч и хранили при 5°С. Изоляты отбирали, очищали и хранили в растворе глицерина при температуре от - 25°С до - 80°С.
Биохимические тесты осуществляли для предположительной идентификации выделенных штаммов. Среды «АР1® 50 СНВ/Е» и «АРГ® М (motility))) («ВЮМЕШЕЦХ®») использовали для идентификации выделенных бактериальных штаммов как примерно на 98% идентичных Bacillus subtilis с положительной мобильностью роением.
Микроскопия
На фиг.1 представлено изображение вегетативных клеток Bacillus subtilis Maseca-1, полученное с помощью световой микроскопии. Штамм Maseca-1 является грамположительной, палочковидной, аэробной и факультативной, спорообразующей бактерией.
Выделенная бактерия является подвижным организмом в виде вытянутой палочки (от 3 до 5 мкм на от 0,5 до 1 мкм). Репрезентативные колонии, окрашенные 5% раствором малахитового зеленого, демонстрируют элипсоидальную эндоспору, который окрашивается в зеленый цвет, тогда как оставшаяся часть клетки окрашивается в светлокрасный. Эндоспора может быть образована при стрессе, вызванном нарушением питания (например, при стационарном росте). Бактерия способна расти роением на поверхности среды посредством выработки флагелл и обладает способностью экскретировать биопленки и экзополимерные вещества.
Рост
Штаммы Bacillus subtilis Maseca могут культивироваться в жидкой или твердой среде, содержащей источники углерода, источники азота, неорганические вещества, и т.п., широко используемые в средах для культивирования микроорганизмов. Может быть использован любой источник углерода, при условии, что он может быть метаболизирован Bacillus subtilis, например, глюкоза, фруктоза, сахароза, крахмал, жидкий кукурузный экстракт, щелочной экстракт и меласса. Примеры источника азота включают пептон, гидролизат казеина, экстракт мяса, жидкий кукурузный экстракт, щелочной экстракт и сульфат аммония. При необходимости среда дополнительно может содержать фосфорную кислоту, соли калия, магния, кальция, натрия, железа, марганца и т.п., витамины, аминокислоты, поверхностно-активные вещества и т.п. Предпочтительно, если при аэробном выращивании культуры ингибируется рост анаэробных организмов, таких как образующие эндоспоры клостридии. Что касается культуральных условий, то могут быть использованы жидкая среда, содержащаяся в баночном ферментере в условиях аэрации/перемешивания (например, при жидкофазной ферментации - LSF), твердая среда в чашках (например, при твердофазной ферментации, SSF) или в автоматическом ферментере для получения кодзи. Культивирование осуществляют при температуре от около 25°С до 42°С, предпочтительно от около 32°С до 40°С, в течение периода времени от 12 часов до около 3 дней при pH культуры от 5 до 9, предпочтительно при pH от 6 до 8.
Идентификация очищенных штаммов Maseca была проведена с помощью метода фингерпринтинга геномной ДНК на основе ПЦР-типирования повторяющихся последовательностей или с помощью секвенирования рибосомальной деоксирибонуклеиновой кислоты (рДНК).
Фингерпринтинг ДНК
Из штаммов Maseca 1-4 выделяли геномную ДНК. Амплификации ДНК полимеразной цепной реакцией осуществляли с использованием праймеров для (GTG)5-ПЦР и ERIC-ПЦР. Продукты ПЦР разделяли по размеру с помощью электрофореза в агарозном геле, окрашивали гели бромистым этидием и регистрировали цифровым образом в УФ-свете. Изображения гелей визуально сравнивали и анализировали.
На фиг.2 показан фингерпринтинг-анализ геномной ДНК штаммов Bacillus subtilis Maseca. На фиг.2-А показаны паттерны фингерпринтинга по (GTG)5-nn,P; на фиг.2-В показаны паттерны фингерпринтинга ERIC-ПЦР. Дорожки 1-4 соответствуют Maseca 1-4, соответственно. М является маркером молекулярных масс ДНК.
Maseca 1 и Maseca 4 имеют одинаковый фингерпринтинг-паттерн геномной ДНК и по (GTG)5-nnP и по ERIC-ПЦР, и были идентифицированы как один и тот же организм.
Секвенирование 16S рДНК
Геномную ДНК из жидких культур использовали в качестве матрицы для амплификации ДНК. Очищенные ампликоны секвенировали и идентичность конкретного продукта ПЦР верифицировали с помощью секвенирования. Филогенетические взаимодействия организмов, охватываемых данным описанием, были определены сравнением индивидуальных 16S рДНК последовательностей с существующими последовательностями в публичных базах данных, таких как базы данных Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI). Эволюционные деревья, основанные на дистанции и анализах максимального правдоподобия были сконструированы с помощью филогенетических деревьев (дендрограмм) при использовании метода ближайшего связывания (Neighbor-Joining, NJ) и метода попарного внутригруппового невзвешенного среднего (Unweighted Pair Group Method Arithmetic Mean, UPGMA). Методы размножения выборок (бутстрепа) использовали для обеспечения оценок достоверности для топологии в методе NJ.
Итоговые анализы указывают на то, что штаммы Maseca 1-4 наиболее близкородственны представителям группы видов Bacillus subtilis subsp.subtilis (вариант штамма 168, штамм АТСС9799, штамм DSM10A или АТСС6051). Репрезентативное филогенетическое дерево максимального правдоподобия на основе последовательностей 16S рДНК нескольких палочковидных и спорообразующих бактерий показано на фиг.3. Показаны номер штамма и учетные номера базы данных GenBank (например, AL009126). Номера являются процентом бутстрепа или значениями идентичности последовательности (например, 85±0,01) данной ветви дерева.
В силу этого, настоящее изобретение относится к выделенным биологически чистым культурам бактерий, выделенным из перикарпа никстамализованной цельной кукурузы. В частности, бактериями являются Bacillus subtilis, а более конкретно, Bacillus subtilis Maseca-1, депонированные в АТСС с учетным номером РТА-8831.
Как вид Bacillus subtilis является грамположительным, непатогенным спорообразующим организмом, обычно обнаруживаемым в ризосфере почвы, в корнях и около корней растений (например, кукурузы и пшеницы) и в желудочно-кишечном тракте животных и людей. Организм является аэробным и факультативным, растет, как правило, в питательном бульоне (например, в среде NB) при температуре от около 32°С до около 40°С. Организм может быть индуцирован к споруляции при росте в среде для споруляции (например, в среде Лурия-Бертани или DSM), которые индуцируют образование спор при истощении питательных веществ. Прочная, защитная эндоспора позволяет организму переносить экстремальные условия окружающей среды. В. subtilis непатогенен и в общем считается безопасным (т.е. имеет классификацию GRAS согласно Управлению по контролю за продуктами и лекарствами США) или имеющий квалифицированную презумпцию безопасности (т.е. имеет статус QPS согласно Европейской Комиссии-SCAN, 2003).
Описание культуральной надосадочной жидкости
Было осуществлено описание биомолекул, присутствующих в надосадочной жидкости истощенной культуры Maseca-1. Был проведен метаболомный анализ пептидов лантибиотиков, EPS-экзополисахаридов (например, левана и декстрана), анализ органических кислот и протеаз.
Для получения образцов Maseca-1 культуры инкубировали в питательном бульоне (NB) или в среде Луриа-Бертани (LB) при 35°С, pH 6,8 с энергичным орбитальным перемешиванием (200 об./мин.) в течение 24-48 часов. Культуральные среды центрифугировали (4000 об./мин. в течение 20 мин.) для удаления клеток, а бесклеточную надосадочную жидкость затем фракционировали с помощью мембранного фильтра «Amicon® Centricon®» (MILLIPORE™).
В Образце 1 и Образце 2 надосадочную жидкость фракционировали с помощью мембранного фильтра, имеющего границу пропускания по молекулярной массе 3000 Дальтон. Были получены две фракции, верхний ретентат (FHMW), который не может пройти через мембрану, соответствующую веществу, больше чем 3000 Дальтон, и фракцию нижнего фильтрата (FLMW), соответствующую низкомолекулярному материалу, меньше чем 3000 Дальтон. Фракции FHMW и FLMW хранили замороженными при - 80°С.
В Образце 3, надосадочную жидкость дважды фильтровали, вначале с помощью мембранного фильтра «Amicon® Centricon® BioMax РВ» (MILLIPORE™) с границей пропускания по молекулярной массе 800 Дальтон. Нижнюю фильтрованную фракцию, соответствующую материалу меньше чем 8000 Дальтон дополнительно фильтровали с помощью мембранного фильтра с границей пропускания по молекулярной массе 3000 Дальтон. Были получены две фракции, верхний ретентат (FHMW), соответствующий материалу 3000-8000 Дальтон, и нижний фильтрат (FLMW), соответствующий материалу меньше чем 3000 Дальтон. Материал FHMW дополнительно обрабатывали, для того чтобы экстрагировать пептиды-лантибиотики посредством экстракции органическим растворителем.
Экстракция органическим растворителем
Двадцать пять (25) мл фракции FHMW из Образца 3 экстрагировали 12,5 мл хлороформа в течение около 20 минут. Таким образом получали коричнево-молочную смесь. Этот раствор ультрацентрифугировали при 10 400 g в течение 20 минут при 12°С. Получали несколько слоев, верхний слой, соответствующий органической (хлороформ) части, нижний водный слой, средний слой с преципитатом, плавающим между водной и органической фазами, соответствующий смеси пептидов-лантибиотиков. Этот преципитат удаляли и высушивали в течение ночи. Общее количество влажного осадка, полученного из 25 мл фильтрата было равно 975 мг. После сушки, осадок ресуспендировали в 2,5 мл 0,1 М Трис буфера, pH 7,0. Отбирали аликвоту этой органически экстрагированной неочищенной фракции (OECF). Оставшиеся 2,1 мл ресуспендировали в 50 мл наночистой воды молекулярно-биологического качества и хранили замороженными при - 80°С.
Анализ пептидов-лантибиотиков
Образцы надосадочной жидкости истощенной культуры (т.е. Образцы 1, 2 и 3) анализировали с помощью жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии (ЖХ-МС) на наличие пептидов-лантибиотиков (например, низина А, низина В, субтилизина, мутацина, эпидермина). Анализ ЖХ-МС проводили с помощью системы «Finnigan LTQ Orbitrap™» («Thermo Electron Corp.»). Детекцию МС осуществляли с помощью ионизации электрораспылением (ESI) в положительном режиме при полном MS сканировании событий в диапазоне m/z 200-2000. Разделения проводили в режиме обращенной фазы на колонке «ProSphere™ С4 300А» 150 х 3.2 мм, 5 мкм («Grace Alltech»). Все разделения проводили с использованием мобильной фазы вода в ацетонитрил с 0,1% муравьиной кислотой. Были протестированы различные градиенты.
Условия HPLC и выбранные градиенты были следующими:
Растворитель А: Вода MilliQ+0,1% муравьиная кислота
Растворитель В: Ацетонитрил+0,1% муравьиная кислота
Скорость потока: 400 мкл/мин (разделение перед МС)
Температура колонки: 30°С
Инъецируемый объем: 10 мкл
Градиент: линейный
| Время(мин) | % А | % В |
| 0 | 95 | 5 |
| 2 | 95 | 5 |
| 50 | 10 | 90 |
| 55 | 10 | 90 |
| 55.5 | 95 | 5 |
| 60 | 95 | 5 |
Полученные хроматограммы ЖХ-МС основных пиков трех образцов (Образцы 1, 2 и 3) показаны на фиг.4А, 4В и 4С, вместе со стандартом низином в фиг.4D (Sigma N5764, «Sigma-Aldrich®»). Три образца продемонстрировали относительно похожие паттерны пиков, т.е. пики высокой плотности с высокой интенсивностью при малом времени удерживания и некоторые низкие распространенные пики при большом времени удержания. Как видно из фигур, было обнаружено несколько пиков, но ни один из них не мог быть приписан низину.
Из-за отсутствия соответствующих эталонных соединений для микосубтилизина, субтилизина, мутактина и эпидермина, хроматограммы ЖХ-МС просматривались на предмет типичных значений массы к заряду (m/z) (см. таблицу I). Не было обнаружено никаких точных совпадений с ранее охарактеризованными лантибиотиками или бактериозинами; однако один пик, характеризующий лантибиотик, наблюдали во всех трех образцах (см. фиг.5А, пик при RT 38,96 и BP 1701,8). Время удерживания и масса, определенная для этого пика, находится в том же диапазоне, который ожидался для лантибиотиков. Более того, анализ масс-спектра этого пика показал типичные многозарядные ионы водорода, типичные для пептидов, когда двух и трехзарядные ионы являются наиболее распространенными (см. фиг.5 В). Пик не мог быть приписан к конкретному лантибиотику на основании информации, доступной в литературе. Известно, что лантибиотики демонстрируют некоторое различие в отношении молекулярной массы в зависимости от конкретного лантибиотика и экспериментальных условий, из-за окисления, метилирования или других модификаций.
| Таблица 1 | |||||||
| Возможные значения m/z в ESI положительном режиме для пептидов-лантибиотиков | |||||||
| 1+ | 2+ | 3+ | 4+ | 5+ | 6+ | ||
| Эпидермин | Н | 21666 | 1063,6 | 722,9 | 542,4 | 434,1 | 361 9 |
| 2188,6 | 1105,8 | 744,9 | 564,4 | 4 56, 1 | 383,9 | ||
| Н и Na | 1094,8 | 737,5 | 558,9 | 451,7 | 380,3 | ||
| 730,2 | 553,4 | 4 47,3 | 376,6 | ||||
| 547,9 | 442,9 | 372,9 | |||||
| 438,5 | 369,1 | ||||||
| 365,4 | |||||||
| Низин А | Н | 3055,0 | 1676,0 | 1119,0 | 839,5 | 671,8 | 500,0 |
| MW=3364 | Na | 3377,0 | 1700,0 | 1141,0 | 661,5 | 603,8 | 582,0 |
| HnNa | 1689,0 | 1133,7 | 356,0 | 689,4 | 578,3 | ||
| 1125,3 | 850,5 | 685,0 | 574,7 | ||||
| 845,0 | 680,6 | 571,0 | |||||
| 676,2 | 567,2 | ||||||
| 663,6 | |||||||
| Nisin Q | Н | 3328,0 | 1064 5 | 1110,0 | 832,8 | 666,4 | 555,5 |
| Na | 3350,0 | 1686,5 | 1132,0 | 854,8 | 688,4 | 577,5 | |
| Н и Na | 1675,5 | 1124,7 | 849,3 | 684,0 | 573,8 | ||
| 1117,3 | 843,8 | 879,8 | 570,2 | ||||
| 838,3 | 675,2 | 566,5 | |||||
| 670,6 | 562,7 | ||||||
| 559,0. | |||||||
| Низин Z | Н | 3332 0 | 1666,5 | 1111,3 | 833,8 | 667,2 | 556,2 |
| MW=3331 | Na | 3354 0 | 1688,5 | 1133,3 | 855,8 | 689,2 | 578,2 |
| Н и Na | 1677,5 | 1126,0 | 860,3 | 684,8 | 674,6 | ||
| 1118,7 | 844,8 | 680,4 | 570,8 | ||||
| 939,3 | 676,0 | 567,2 | |||||
| 671,6 | 563,3 | ||||||
| 559,7 | |||||||
| Мутации 1 | Н | 2365,0 | 1183,0 | 789,0 | 592,0 | 473,8 | 395,0 |
| MW=2364 | Na | 2387,0 | 1205,0 | 811,0 | 614,0 | 495,8 | 417,0 |
| Н и Na | 1194,0 | 603,7 | 608,5 | 401,4 | 413,3 | ||
| 796,3 | 603,0 | 487,0 | 409,7 | ||||
| 597,5 | 482,6 | 406,0 | |||||
| 478,2 | 402,2 | ||||||
| 398,5 | |||||||
| Мутации 1140 | Н | 2264,0 | 1132,5 | 755,3 | 566,8 | 453,8 | 376,2 |
| MW=2263 | 2286,0 | 1154,5 | 777,3 | 588,8 | 475,6 | 400,2 | |
| HnNa | 1143,5 | 770,0 | 583 3 | 471,2 | 396,5 | ||
| 762,7 | 577,8 | 466,8 | 392,8 | ||||
| 572,3 | 462,4 | 389,2 | |||||
| 458,0 | 385,3 | ||||||
| 361,7 |
| 1+ | 2+ | 3+ | 4+ | 5+ | 6+ | ||
| Мутации B-Ny266 | H | 2271,0 | 1136,0 | 767,7 | 568,5 | 455,0 | 379,3 |
| MW=2270 | Na | 2293,0 | 1158,0 | 779,7 | 590,5 | 477,0 | 401,3 |
| H и Na | 1147,0 | 772,3 | 585,0 | 472,6 | 397,7 | ||
| 579,5 | 579,5 | 468,2 | 394,0 | ||||
| 574,0 | 463,8 | 390,3 | |||||
| 459,4 | 386,5 | ||||||
| 382,8 | |||||||
| Субтилин | Н | 33220 | 1661,5 | 1108,0 | 831,3 | 665,2 | 554,5 |
| MW=3321 | Na | 3344,0 | 1683,5 | 1130,0 | 853,3 | 687,2 | 576,5 |
| Н и Na | 1672,6 | 1122,7 | 847,8 | 682,8 | 572,8 | ||
| 1115,3 | 842,3 | 675,4 | 569,2 | ||||
| 836,8 | 6740 | 565,5 | |||||
| 6696 | 561,7 | ||||||
| 558,0 |
Анализ экзополисахаридов (EPS)
Для приготовления образцов для анализа экзополисахаридов, фракции надосадочных жидкостей экстрагировали этанолом и преципитировали EPS. Фракции FHMW и FLMW объединяли и добавляли к образцу ледяной этанол (1,5 объема образца). Образцы аккуратно смешивали в течение 5 мин. После окончания процесса смешивания в верхнем слое начинал образовываться белый преципитат EPS, который постепенно осаждался и откладывался на дне контейнера. Раствор помещали на ночь при -20°С для продолжения осаждения. Затем прозрачную этанольную фазу сверху осторожно удаляли и осажденный EPS собирали для дальнейшего центрифугирования (9000 об./мин. в течение 15 мин.).
Для определения фруктозы осадок, содержащий EPS, инкубировали с 2 М трифторуксусной кислотой в течение 2 часов. В этих условиях мономеры фруктозы полностью высвобождались из EPS. Для определения глюкозы осадок, содержащий EPS, инкубировали с 2 М серной кислотой в течение 1 ч при 100°С. В этих условиях мономеры глюкозы полностью высвобождались из EPS. Затем образцы разводили и анализировали с помощью Высокоэффективной Анионообменной Хроматографии с Импульсным Амперометрическим детектированием (HPAEC-PAD). Инулин, обработанный трифторуксусной кислотой, картофельный крахмал, обработанный серной кислотой, и EPS из LB180, обработанный серной кислотой, были включены в качестве контролей качества гидролиза.
Анализировали EPS, полученные из Образцов 1, 2 и 3, хроматограммы HPAEC-PAD для фруктозы и глюкозы показаны на фиг.6А и 6В, соответственно. Как видно из хроматограмм, время удерживания мономера может отличаться из-за pH гидролизованного образца.
Результаты также показаны в таблице II. Соотношение фруктозы/глюкозы основано на площадях пиков хроматограмм
| Таблица II | |
| Номер образца | Соотношение фруктозы/глюкозы |
| 1 | 5 |
| 2 | 20 |
| 3 | 10 |
Анализ ферментативной активности протеаз
Внеклеточную протеолитическую активность измеряли согласно процедуре, описанной Holm, К.A. (Automated colorimetric determination of acid proteinase activity in fermentation samples using a trinitrobenzenesulphonic acid reagent. (1980) Analyst, 105:18-24).
Процедура была полностью автоматизирована автоанализатором «Cobas Mira Plus». Протеолитическую активность культуральных надосадочных жидкостей определяли инкубацией образцов с 0,5% (масс/об.) N,N-диметилированным основанием в 0,25 М буфере MES ( pH 6) в течение 17,5 мин. при 37°С. В качестве холостой пробы образцы инкубировали без N,N-диметилированного казеина. Реакцию останавливали добавлением раствора, содержащего 0,5 г Na2SO3 1-1 в 0,1 М боратном буфере при pH 9,3. Одновременно добавляли 2,4,6-тринитробензол сульфоновую кислоту (TNBSA). TNBSA реагирует со свободными аминокислотными группами, что приводит к появлению желтой окраски, которую измеряли при 405 нм через 3 мин. В качестве стандарта использовали глицин. Одна единица активности протеаз была определена как количество фермента, которое в течение 1 мин в данных стандартных условиях дает абсорбцию при 405 нм, равную 1 мкМ глицину.
Результаты протеазной активности для трех образцов представлены в таблице III.
| Таблица III | ||
| Образец | pH образца | Протеазная активность ммоль л-1 мин-1 (pH 6) |
| 1 | 5,81 | 0 |
| 2 | 6,78 | 0,003 |
| 3 | 6,31 | 0,01 |
Как видно из таблицы III, протеазная активность не была измерена или была зафиксирована низкая протеазная активность. Образцы содержали высокий фон свободного или первично связанного аммиака. Соответственно, образцы протеазы разводили в 3-4 раза ниже фона до допустимого уровня. Протеазная активность была
одинаковой в разведенных образцах; следовательно, разведение не оказывает воздействия на протеазную активность.
Анализ наличия короткоцепочечных жирных кислот
Соединения детектировали с помощью связанной с ВЭЖХ детекции в ультрафиолете УФ и по показателю преломления RI с помощью колонки с органической кислотой («Aminex®», «ВЮ-RAD») с изократным потоком кислой воды, содержащей H2SO4. Анализ проводили на системе «Waters Alliance 2695 HPLC», связанной с детектором «Waters 996 PDA» и «2412 RI». Специфические короткоцепочечные жирные кислоты количественно оценивали с помощью внешних калибровочных кривых.
На фиг.7 представлена примерная хроматограмма ВЭЖХ-анализа короткоцепочечных жирных кислот из Образца 1. С помощью внешних калибровочных кривых определяли концентрацию специфических короткоцепочечных жирных кислот.
Концентрация короткоцепочечных жирных кислот, определенная с помощью ВЭЖХ, дана в таблице IV.
| Таблица IV | |||||
| Концентрация короткоцепочечных жирных кислот | |||||
| Образец | Янтарная кислота (мг/мл) | Молочная кислота (мг/мл) | Уксусная кислота (мг/мл) | Пропионовая кислота (мг/мл) | Масляная кислота (мг/мл) |
| 1 | <0,562 | 1,3 | 0,93 | <1,34 | <LODb |
| 2 | <LODl | 0,05 | 0,08 | <LODJ | <LOD5 |
| 3 | <0,562 | 0,62 | 0,73 | <1,34 | <LOD5 |
1Предел Обнаружения (LOD) для янтарной кислоты составлял 0,02 мг/мл;2 из-за отклонений LOD для этих образцов составляет 0,56 мг/мл; 3 LOD для пропионовой кислоты составил 0,05 мг/мл; 4 из-за отклонений LOD для этих образцов составляет 1,3 мг/мл; 5 LOD для масляной кислоты составлял 0,03 мг/мл
Результаты для короткоцепочечных жирных кислот демонстрируют похожие концентрации для Образцов 1 и 3, но в Образце 2 было обнаружено уменьшение концентраций.
Ингибирование Роста Микроорганизмов
Была проанализирована способность Bacillus subtilis Maseca-1 ингибировать рост грамположительного патогена Micrococcus luteus.
0,3 мл культуры М. luteus (АТСС 9341) добавляли к 500 мл расплавленного LB-агара, разливали в чашки Петри и ожидали застывания. На бумажные диски (6,0 мм в диаметре) наносили по 5 мкл образца и сушили. Затем диски помещали на поверхность агара и чашки инкубировали в течение ночи при 37°С. Ингибирование роста измеряли как диаметр чистой зоны вокруг каждого бумажного диска. Измерения были проведены на
чашках-дубликатах (4 диска/на чашку). Протестировали фракции OECF, полученные из Образца 3.
| Таблица V | |
| Ингибирования роста пептидными антибиотиками из Bacillus subtilis Maseca-1 1.2 | |
| Зона ингибирования М. luteus (мм) OECF 1 | Зона ингибирования М. luteus (мм) OECF 2 |
| 18,5 | 19 |
| 19,5 | 18,5 |
| 18 | 20 |
| 17,5 | 19,5 |
Данные являются средними двух повторных испытаний. 2 Дистанции ингибирования роста, измеренные как диаметр (мм) чистой зоны вокруг диска.
Способность Bacillus subtilis Maseca-1 ингибировать рост патогенов Micrococcus luteus, Bacillus cereus and Aspergillus flavus анализировали также, как описано выше.
| Таблица VI | |||||
| Ингибирование роста патогенов пептидными антибиотиками из Bacillus subtilis Maseca-1 1,2 | |||||
| Прогон | ML | ВС | AF | Контроль | |
| 1 | 16,1 | 34,75 | 10,5 | 6,5 | |
| 2 | 16,5 | 34,50 | 10,5 | 6,5 | |
| 3 | 21,0 | 35,10 | 10,5 | 6,5 | |
| 4 | 22,0 | 36,00 | 10,5 | 6,5 |
ML=Micrococcus luteus АТСС 9341; ВС=Bacillus cereus NRLL; AF=Aspergillus flavus NRLL
1 Данные являются средними двух повторных испытаний.
2 Дистанции ингибирования роста, измеренные как диаметр (мм) чистой зоны вокруг диска.
Изолят Maseca-1 демонстрировал способность секретировать пептиды, которые ингибируют рост патогенных микроорганизмов.
Согласно различным воплощениям изобретения предлагаются биологически чистые культуры Bacillus subtilis. Штамм Maseca-1 Bacillus subtilis был депонирован в АТСС под учетным номером РТА-8831.
Культуры Bacillus subtilis Maseca-1 способны продуцировать секретируемые белки и/или пептидные антибиотики, которые обладают противомикробной активностью (например, лантибиотики). Эти секретируемые линейные или глобулярные по структуре пептиды и белки применимы в композициях по настоящему изобретению. Клеточные культуры из Maseca-1 могут быть собраны, а культуральные надосадочные жидкости собираются, например, фильтрацией (фильтрованная надосадочная жидкость), дифференциальной преципитацией, или центрифугированием (бесклеточная надосадочная жидкость), и полученная надосадочная жидкость может содержать противомикробные активности, применимые в противомикробной композиции.
Штамм Maseca-1 может секретировать один или несколько белков или пептидов, которые ингибируют рост микроорганизмов, включая грамположительные и грамотрицательные бактерии, плесень и дрожжи. Например, секретируемый белок или пептид может ингибировать рост грамположительных патогенов Micrococcus luteus и Bacillus cereus и Aspergillus flavus.
Bacillus subtilis Maseca-1 может быть активным против грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также плесени и дрожжей, которые являются обычной вызывающей порчу флорой в пищевых продуктах. Множество грамположительных бактерий, таких как Salmonella, Shigella, некоторые серологические типы Escherichia, и т.п.являются патогенами, переносимыми пищевыми продуктами. Грамположительные бактерии, такие как Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens и т.п.могут вызывать пищевое отравление.
Согласно различным воплощениям, настоящее изобретение также относится к способу ингибирования нежелательных микроорганизмов в материале, содержащем микроорганизмы. Способ включает контактирование материала с ингибитором нежелательных микроорганизмов, полученных из Bacillus subtilis Maseca-1 так, чтобы в материале ингибировались нежелательные микроорганизмы. Защищаемый материал, может быть, например, материалом, контактирующим с пищей. Пища может быть для любых животных, особенно для млекопитающих.
Bacillus subtilis Maseca-1 могут быть живыми или неживыми. Живые Maseca-1 могут быть заморожены или лиофилизированы, или, в другом случае, высушены для сохранения. Ингибирование роста микроорганизмов может быть получено компонентом Maseca-1 и, таким образом, Maseca-1 может быть неживым. Maseca-1 могут быть обработаны ультразвуком, или, в другом случае, разрушены для выделения фракции клеточных стенок и сохранения перед применением. Все эти вариации известны специалистам в данной области.
Согласно различным воплощениям изобретения, Bacillus subtilis Maseca-1 могут быть использованы для контроля роста плесени в зерне, например, в хранимом зерне, в бобовых и в подземных культурах, таких как арахис. Такая обработка может быть использована для предотвращения образования микотоксинов (например, афлатоксинов и фумонизинов) в различном зерне хлебных злаков, бобовых и арахиса.
Одна из основных проблем в дистрибьюции и маркетинге тортилья заключается в появлении пятен плесени и очагов плесневого обесцвечивания на упакованных тортильях. Согласно различным воплощениям, Maseca-1 могут быть добавлены в кукурузное и пшеничное тесто и применены для контроля плесневого и бактериального роста, например, в тортильях и в плоском хлебе. Подобные препараты могут быть использованы для различных видов хлеба, плоского хлеба, хлебобулочных изделий, в которых тесто является исходным материалом. Maseca-1 может быть использован для ингибирования плесеней и бактерий, удлинения срока годности и сохранения теста в ходе обработки и транспортировки в место выпечки. Maseca-1 также может быть использован для подавления плесени и бактерий и удлинения сроков годности молочных продуктов, таких как молоко, сливки, молочные пасты и сыр.
Bacillus subtilis Maseca-1 может быть применен для упаковочных материалов для супрессии микрофолоры в пищевых продуктах. Таким образом, Maseca-1 может быть использован для обработки пленок, упаковочной бумаги и других упаковочных материалов для контроля плесневого и бактериального роста на различных пищевых продуктах, таких как хлеб, сыры, соусы, овощи, фрукты и т.п.
Согласно различным воплощениям изобретения, Bacillus subtilis Maseca-1 может вырабатывать природные биополимеры, такие как высокомолекулярный и разветвленный фруктан, созданный из фруктозных единиц, связанных β-(2,6) фруктофуранозидными связями и инулин β-(2,1)соединениями.
Согласно различным воплощениям, Bacillus subtilis Maseca-1 может продуцировать фермент левансукразу, например, β-(2,6) фруктан-D: глюкозо-1-фруктозилтрансферазу (Е.С.2.4.1.10).
Настоящее изобретение также предполагает применение Bacillus subtilis Maseca-1 в качестве пробиотика для биологического контроля различных микробных инфекций в кишечном тракте. Из-за того, что В. subtilis образуют устойчивые к нагреванию споры, этот вид особенно полезен при изготовлении фармацевтических композиций для лечения микробных инфекций. Составы, которые включают жизнеспособные споры Maseca-1 в фармацевтически приемлемом носителе, могут быть использованы для изготовления и применения как профилактических, так и терапевтических композиций.
Согласно различным воплощениям пробиотическая композиция содержит жизнеспособные Bacillus subtilis Maseca-1. Композиция также может включать носитель, такой как фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для перорального введения в пищеварительный тракт объекта. Композиция также может включать Maseca-1 в виде вегетативных клеток и/или спор. В другом воплощении в изобретение предлагается для включения Maseca-1 в композицию в виде сухой клеточной массы, стабилизированной пасты или стабилизированного геля.
Из-за того, что споры Bacillus являются устойчивыми к нагреванию и давлению и могут храниться в виде сухого порошка, они особенно полезны в составлении и изготовлении продуктов, таких как различные хлебобулочные изделия (например, тортильи, плоский хлеб и т.п.). Bacillus subtilis Maseca-1 хорошо подходит для настоящего изобретения, обладая способностью образовывать споры, которые относительно устойчивы к нагреванию и другим условиям, что делает идеалом для улучшения хранения (т.е. срока годности) пищевых продуктов. Например, Bacillus subtilis Maseca-1 может увеличить хранение до двух или большего количества лет.
Согласно различным воплощениям, Bacillus subtilis Maseca-1 присутствует в пробиотической композиции или хлебобулочном продукте в концентрации 103-1012 жизнеспособных клеток/г, например, в концентрации 105-107 жизнеспособных клеток/г, 108-109 жизнеспособных клеток/г или 109-1010 жизнеспособных клеток/г.
В некоторых воплощениях пробиотическая композиция также содержит, по меньшей мере, один пищеварительный фермент, например, амилазу, пуллуланазу, протеазу, фитазу, ксиланазу, глюканазу, леваназу или галактозидазу.
В некоторых воплощениях пробиотической композиции вегетативные клетки и/или споры могут быть инкапсулированы или покрыты биодеградируемым или биоразлагаемым полимером для защиты их от пищеварительных ферментов и условий в пищеварительном тракте.
В другом воплощении предлагается композиция, которая включает внеклеточный продукт Bacillus subtilis Maseca-1 в фармацевтически приемлемом носителе, подходящем для перорального введения человеку. В одном воплощении внеклеточный продукт является надосадочной жидкостью или фильтратом культуры Maseca-1. Внеклеточный продукт может быть, например, леванами, ферментами и/или л антибиотиками.
Настоящее изобретение предполагает способ для обработки, снижения, или контроля бактериальных желудочно-кишечных инфекций, с помощью профилактической и/или терапевтической композиции или системы, в состав которой включены Bacillus subtilis Maseca-1. Эти способы могут ингибировать рост бактериальных патогенов, ассоциированных с желудочно-кишечными инфекциями и также уменьшает симптомы таких патогенных инфекций. Из-за того, что Bacillus subtilis в общем считается безопасным специалистами в данной области, они очень подходят для проглатывания с продуктами питания или в виде пищевой добавки.
В другом воплощении изобретения предлагается способ модуляции пищеварения у людей или животных с помощью перорально вводимой человеку или животному пробиотической пищевой композиции с Bacillus subtilis Maseca-1 в количестве, достаточном для достижения искомого уровня модуляции. Модуляция может, например, улучшать всасывание питательных веществ, снижение патогенов или улучшение роста благотворных микроорганизмов-комменсалов.
Согласно различным воплощениям способ профилактики или лечения бактериальной желудочно-кишечной инфекции у человека или животного включает стадии перорального введения человеку или животному пищевого или питьевого состава, содержащего колониеобразующие единицы Bacillus subtilis Maseca-1, и роста бактерий в желудочно-кишечном тракте объекта. В одном воплощении жизнеспособные колониеобразующие единицы являются спорами Maseca-1. Maseca-1 может облегчать расстройства, вызванные инфекционными агентами, такими как виды Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes, Clostridium, включая С.perfingens, С.difficile, С.botulinum, С.tributrycum, и С.sporogenes, pathogenic-B. cereus, Gardnerella vaginalis, Propionibacterium acnes, Aeromonas hydrophilia, Aspergillus.sp.включая A. flavus и A. niger, Proteus, Klebsiella, Salmonella, Shigella, Yersinia и Campylobacter.
Пробиотические эффекты Bacillus subtilis Maseca-1 могут проявляться из-за того, что микроорганизм колонизирует слизистую пищеварительного канала и конкурентно выживает потенциальные патогены. Пробиотические Bacillus subtilis Maseca-1 также могут вырабатывать i) органические и карбоновые кислоты, такие как короткоцепочечные жирные кислоты, которые демонстрируют противомикробную активность по отношению к множеству микроорганизмов, и снижают pH и окислительно-восстановительный потенциал в пищеварительном канале, образуют субоптимальные условия для патогенов, ii) метаболиты, такие как белки (например, ферменты) и экзополисахариды (т.е. леваны и глюканы), которые являются антагонистами к некоторым патогенам посредством ингибирования их способности потреблять питательные вещества и ионы или их адгезии к клеткам слизистой кишечника, и iii) бактериоцины и бактериоцин-подобные продукты (т.е. лантибиотики), которые демонстрируют свои эффекты посредством разрушения систем выработки энергии, синтеза макромолекул и проницаемости мембран.
Как известно специалистам в данной области, пробиотический Bacillus subtilis Maseca-1 может быть обнаружен в виде спор, или сопровождаться микробными спорами. В целом, бактериальные споры являются толстостенными, спящими формами, которые способны выжить в неблагоприятных условиях. Эти диетические добавки или пробиотики могут полностью завершить свой полный жизненный цикл в желудочно-кишечном тракте, начиная с превращения споры в вегетативную клетку, которая опять спорулирует.
В другом воплощении изобретения предлагается новый состав пищевой добавки для животных или живой микробной добавки, основанной на синергических и/или дополнительных благоприятных эффектах, такие как пробиотические, пребиотические и другие ингредиенты, такие как ферменты, витамины и минералы. Состав может быть, например, пищевой добавкой в порошкообразной форме, содержащей пробиотическую систему Bacillus subtilis Maseca-1, пребиотические компоненты (например, неперевариваемые олигомеры фруктозы, глюкозы или галактозы или сахарные кислоты и спирты) и ферменты. Порошкообразная пищевая добавка может содержать около 103-1012 жизнеспособных организмов/грамм, например, около 108 жизнеспособных организмов/грамм.
Настоящее изобретение также включает способы улучшения перевариваемости в кишечнике, скорости роста, и способе конверсии различных видов животных путем включения вышеупомянутой пищевой добавки в диету животных. Виды животных включают, без ограничения перечисленным, коров, свиней, кур и индюшек. Кишечная микробиота животного-хозяина может модулироваться введением Bacillus subtilis Maseca-1 и/или стимуляцией эндогенного Maseca-1 пребиотиками.
Согласно другому воплощению, настоящее изобретение относится к синбиотической композиции, которая включает жизнеспособные Bacillus subtilis Maseca-1. Синбиотическая композиция может быть использована, например, в комбинации с бифидогенными и лактобациллогенными олигосахаридами, которые особенно полезны для предпочтительной стимуляции роста Bacillus subtilis Maseca-1. Эти олигосахариды включают фруктоолигосахариды (FOS) из разветвленного левана и линейного инуклина, галактоолигосахариды (GOS), ксилоолигосахариды (XOS), сахарные кислоты (глюкуроновая и галактуроновая кислота), сахарные спирты (лактитол и ксилитол) и другие длинноцепочечные полимеры (лигнин и гликопротеины), которые не могут быть легко расщеплены патогенными бактериями. Предпочтительный рост стимулируется из-за пищевых предпочтений Bacillus subtilis Maseca-1 по сравнению с патогенными бактериями. Вредоносные бактерии, такие как Clostridium, Staphylococcus, Salmonella и Е. coli не могут метаболизировать FOS, GOS, XOS, или другие бифидогенные и лактобациллогенные олигосахариды и, следовательно, применение этих олигосахаридов в комбинации с Bacillus subtilis Maseca-1 позволяет этим благотворным и пробиотическим бактериям расти и замещать нежелательные или патогенные микроорганизмы.
Бифидогенные и лактобациллогенные олигосахариды могут быть использованы либо отдельно, либо в комбинации с Bacillus subtilis Maseca-1 в симбиотической или профилактической и терапевтической композиции. То есть из-за ростстимулирующей активности бифидогенных и лактобациллогенных олигосахаридов, в изобретении рассматривается композиция, содержащая бифидогенный и лактобациллогенный олигосахарид в количестве, стимулирующем рост Bacillus. Эти количества могут широко варьировать, поскольку пробиотик будет соответствовать любому метаболическому количеству питательного олигосахарида, и, следовательно, изобретение не обязательно должно быть ограничено таким образом.
1. Штамм Bacillus subtilis Maseca-1, вырабатывающий пептид, имеющий противомикробную активность против Micrococcus luteus, Bacillus cereus и Aspergillus flavus, депонированный в АТСС под номером РТА-8831.
2. Штамм Bacillus subtilis Maseca-1 по п.1, в котором Maseca-1 является формой вегетативных клеток, спор или их комбинацией.
3. Способ ингибирования нежелательных микроорганизмов Micrococcus luteus, Bacillus cereus и Aspergillus flavus в материале, содержащем или подвергнутом действию микроорганизмов, включающий воздействие на материал эффективного количества штамма Bacillus subtilis Maseca-1 по п.1.
4. Способ по п.3, в котором материал является пищевым продуктом.
5. Способ по п.3, в котором материал является испеченным пищевым продуктом.
